Summary
هنا نصف عزل وتضخيم وتمايز الخلايا الظهارية الأنفية البشرية الأولية (HNE) في واجهة الهواء السائل وبروتوكول البنوك الحيوية الذي يسمح بتجميد ومن ثم إذابة HNE المضخمة بنجاح. يحلل البروتوكول الخصائص الكهروفسيولوجية لخلايا HNE المتباينة وتصحيح إفراز الكلوريد المرتبط ب CFTR على علاجات معدلة مختلفة.
Abstract
من السهل جمع الخلايا الظهارية الأنفية البشرية (HNE) عن طريق تنظيف الأنف بالفرشاة البسيطة وغير الغازية. يمكن تضخيم خلايا HNE الأولية المشتقة من المريض وتمييزها إلى ظهارة طبقية زائفة في ظروف الواجهة الهوائية السائلة لتحديد كمية نقل الكلوريد الدوري بوساطة AMP (Cl-) كمؤشر لوظيفة منظم التوصيل عبر الغشاء للتليف الكيسي (CFTR). إذا تم تنفيذ الخطوات الحاسمة مثل جودة تنظيف الأنف بالفرشاة وكثافة الخلايا عند الحفظ بالتبريد بكفاءة ، فيمكن إجراء خلايا HNE بنجاح في البنوك الحيوية. علاوة على ذلك، تظهر دراسات تيار الدائرة القصيرة أن ذوبان الجليد لا يعدل بشكل كبير الخصائص الكهروفسيولوجية لخلايا HNE واستجابتها لمعدلات CFTR. في ظروف الثقافة المستخدمة في هذه الدراسة ، عندما يتم تجميد أقل من 2 × 106 خلايا لكل تبريد ، يكون معدل الفشل مرتفعا جدا. نوصي بتجميد ما لا يقل عن 3 × 106 خلايا لكل تبريد. لقد أظهرنا أن العلاجات المزدوجة التي تجمع بين مصحح CFTR و CFTR المقوي لها فعالية تصحيح مماثلة لنشاط CFTR في خلايا HNE F508del-homozygous. العلاج الثلاثي VX-445 + VX-661 + VX-770 زاد بشكل كبير من تصحيح نشاط CFTR مقارنة بالعلاج المزدوج VX-809 + VX-770. يعد مقياس نشاط CFTR في خلايا HNE مؤشرا حيويا واعدا قبل السريرية مفيدا لتوجيه العلاج بمغير CFTR.
Introduction
التليف الكيسي (CF) هو اضطراب صبغي جسدي متنحي ناتج عن طفرات في جين منظم التوصيل عبر الغشاء للتليف الكيسي (CFTR) مما يؤدي إلى غياب أو خلل وظيفي في بروتين CFTR ، وهي قناة أنيون تقع على السطح القمي للظهارة 1,2. أدت التطورات الحديثة في علاج CFTR إلى تحسين تشخيص المرض ، وأدت آخر الأدوية المعتمدة التي تجمع بين مصححات CFTR ومحفزات CFTR إلى تحسينات كبيرة في وظائف الرئة ونوعية الحياة لمرضى CF الذين يحملون الطفرة الأكثر شيوعا p.Phe508del طفرة (F508del)3,4. على الرغم من هذا التقدم العلاجي الواعد ، فإن حوالي 10٪ من مرضى التليف الكيسي غير مؤهلين لأنهم يحملون طفرات لا يمكن إنقاذها بواسطة معدلات CFTR هذه. بالنسبة لهؤلاء المرضى ، هناك حاجة لاختبار أدوية أخرى أو مجموعات أدوية للعثور على التركيبة الأكثر كفاءة لطفرات محددة ، مما يسلط الضوء على أهمية العلاجات الشخصية.
من السهل جمع الخلايا الظهارية الأنفية البشرية (HNE) عن طريق تنظيف الأنف بالفرشاة البسيطة وغير الغازية وتسمح بتحديد كمية انتقال الكلوريد الدوري بوساطة AMP (Cl−) كمؤشر لوظيفة CFTR. تنتج خلايا HNE نموذجا دقيقا للمجرى الهوائي البشري ، لكن عمرها محدود في الثقافة. بفضل تحسين تقنيات الاستزراع، يمكن إعادة برمجة خلايا HNE الأولية المشتقة من المريض بشكل مشروط باستخدام مثبط كيناز المرتبط ب Rho (ROCKi)، وتضخيمها، وتمييزها إلى ظهارة طبقية زائفة في ظروف الواجهة البينية السائلة الهوائية (ALI) على المرشحات المسامية الدقيقة 5,6. توجد العديد من بروتوكولات الاستزراع لزراعة HNE (متاحة تجاريا ، خالية من المصل ، "محلية الصنع" ، زراعة مشتركة مع الخلايا المغذية ، وما إلى ذلك) ، وقد تم وصف اختيار الوسائط وظروف الثقافة للتأثير على النمو ، وتمايز عدد الخلايا والوظيفة الظهارية 7,8. يقدم البروتوكول هنا طريقة تضخيم ROCKi مبسطة وخالية من وحدة التغذية تسمح بالحصول بنجاح على عدد كبير من خلايا HNE التي يتم تمييزها بعد ذلك في ALI لفحوصات وظيفة CFTR.
لقد أثبتنا أنه في خلايا HNE المتباينة ، يكفي العلاج لمدة 48 ساعة باستخدام معدلات CFTR للحث على التصحيح الكهروفسيولوجي لتيار Cl- الحالي المعتمد على CFTR وأن التصحيح الذي لوحظ في المختبر قد يكون مرتبطا بالتحسن السريري للمريض9. وبالتالي ، تمثل خلايا HNE نموذجا مناسبا ليس فقط لأبحاث CF الأساسية ولكن للدراسات قبل السريرية مع اختبار معدل CFTR الخاص بالمريض. في هذا السياق من العلاج الشخصي ، كان الهدف من البروتوكول هو التحقق من أن خلايا HNE المحفوظة بالتجميد من مرضى التليف الكيسي ، والتي نمت في ظروفنا ، كانت نموذجا مناسبا لدراسات تصحيح CFTR ، ويمكن توقع نتائج مماثلة عند مقارنة نقل Cl المعتمد على CFTR من الخلايا الطازجة والمجمدة المذابة. كما قيمت الدراسة فعالية مختلف معدلات CFTR عند استخدام العلاجات المزدوجة والثلاثية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
أجريت جميع التجارب وفقا للمبادئ التوجيهية واللوائح الموضحة في إعلان هلسنكي وقانون هوريت-سيروسكلات بشأن أخلاقيات البحوث البشرية.
1. إعداد القوارير والوسائط المختلفة
- قم بإعداد التضخيم والهواء السائل ووسط التجميد كما هو موضح في الجدول 1.
- تحضير محلول مخزون من الكولاجين البشري الرابع عن طريق إذابة 50 ملغ من الكولاجين في 100 مل من 0.2 ٪ من حمض الخليك الجليدي. اخلطي على مقلب مغناطيسي لمدة 1 ساعة على الأقل ، وقم بتصفية تعقيم المحلول. يخزن في درجة حرارة 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى 6 أشهر في زجاجة زجاجية محمية من الضوء.
- قم بإعداد محلول عملي من الكولاجين IV عن طريق تخفيف محلول المخزون 1: 5 في الماء المقطر المزدوج. يخزن على درجة حرارة 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى 6 أشهر.
- قم بتغطية قوارير زراعة الخلايا البلاستيكية أو مرشحات transwell باستخدام محلول عمل الكولاجين. توزيع بالتساوي 100 ميكرولتر ل 0.33 سم 2 مرشحات transwell ، 500 ميكرولتر ل 25 سم 2 قوارير ، و 1 مل ل 75 سم2 قوارير على كامل سطح النمو من قارورة.
ملاحظة: يمكن تحقيق ذلك عن طريق إمالة القارورة بلطف من جانب إلى آخر. بدلا من ذلك ، لتسهيل طلاء القوارير ، يمكن استخدام حجم متزايد ، وعندما يتم تغطية السطح بأكمله بالتساوي ، يتم شفط محلول الكولاجين لترك الحجم المشار إليه فقط. يمكن بعد ذلك استخدام محلول الكولاجين المستنشق على الفور لتغطية القارورة التالية (أي لثلاث قوارير 75 سم 2 ، قم بتوزيع 3 مل من محلول الكولاجين بالتساوي في القارورة الأولى ، وشفط2 مل ، والتي يتم استخدامها بعد ذلك للقارورة التالية ، وما إلى ذلك). - اترك قوارير زراعة الخلايا في الحاضنة لمدة لا تقل عن 2 ساعة أو بين عشية وضحاها. استنشق الكولاجين جيدا واترك القوارير لتجف في الحاضنة أو تحت غطاء المحرك لمدة لا تقل عن 20 دقيقة أو بين عشية وضحاها.
- يغسل ب 10 مل من DPBS الخالي من Mg 2 + و Ca2 + ، ويترك ليجف في الحاضنة ، ويخزن في رقائق الألومنيوم للحماية من الضوء. قم بتخزين القوارير لمدة تصل إلى 6 أشهر في درجة حرارة الغرفة (RT).
2. تنظيف الأنف بالفرشاة
ملاحظة: تأكد من إجراء تنظيف الأنف بالفرشاة بينما لا يعاني المشارك من عدوى حادة. إذا كان مرضى التليف الكيسي يعانون من عدوى رئوية ، فراجع المضاد الحيوي للمريض وأضف مضادات حيوية إضافية إلى وسط التضخيم. تم جمع الخلايا الظهارية الأنفية البشرية عن طريق تنظيف الأنف بالفرشاة من مرضى F508del / F508del كما هو موضح سابقا9.
- اطلب من المريض نفخ أنفه ، ثم تخدير الغشاء المخاطي لكلا الخياشيم موضعيا باستخدام شبكات قطنية غارقة في xylocaine 5٪ بمحلول نافازولين.
- قم بتنظيف الجدار الإنسي والتوربينات السفلية لكلا الفتحتين برفق باستخدام فرشاة علم الخلايا. انقع الفرشاة في أنبوب 15 مل مع 2 مل من وسط التنظيف المتاح تجاريا ؛ رج بلطف لفصل الخلايا. كرر تنظيف الأسنان بالفرشاة في فتحة الأنف الثانية.
- أضف المضادات الحيوية التالية إلى وسط التنظيف: البنسلين (100 U / mL) ، الستربتومايسين (100 ميكروغرام / مل) ، Tazocillin (10 ميكروغرام / مل) ، الأمفوتريسين B (2.5 ميكروغرام / مل) والكوليميسين (16 ميكروغرام / مل).
ملاحظة: يمكن شحن فرشاة الأنف في RT إلى مختبرات مخصصة للتوسع والثقافة ويمكن بذورها حتى 72 ساعة بعد تنظيف الأسنان بالفرشاة.
3. عزل ال HNE
ملاحظة: تم عزل HNE من فرشاة علم الخلايا ، وغسلها باستخدام DPBS الخالي من Mg2 + و Ca 2+ ، وفصلها مع 0.25٪ Trypsin ، وزرعها على قارورة بلاستيكية 25 سم2 كما هو موضح سابقا10.
- افصل الخلايا عن فرشاة علم الخلايا عن طريق تمرير الفرشاة بشكل متكرر من خلال مخروط ماصة 1000 ميكرولتر وشطفها ب 2 مل من DPBS الخالي من Mg2 + و Ca2+. جهاز طرد مركزي عند 500 × g لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية وتخلص من supernatant.
- أعد تعليق الكريات في 0.25٪ تريبسين لمدة 8-12 دقيقة لفصل الخلايا. أوقف التفاعل الإنزيمي بإضافة 5 مل من وسط التضخيم.
- جهاز طرد مركزي عند 500 × g لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية وتخلص من supernatant. أعد تعليق الكريات في 8 مل من وسط التضخيم والبذور على قارورة مغلفة بالكولاجين25 سم 2 . تنمو عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2. وهذا يتوافق مع المقطع 0.
- في اليوم التالي ، استبدل الوسط ب 5 مل من وسط التضخيم الطازج وراقب الخلايا يوميا للتعلق ، والتشكل (يجب أن يكون للخلايا مظهر مرصوف بالحصى متماسك) ، والعدد.
ملاحظة: تختلف كثافة البذر الأولية اعتمادا على جودة تنظيف الأنف بالفرشاة ونسبة الخلايا الظهارية. عادة ما تصل خلايا HNE المعزولة حديثا إلى 80٪ -90٪ من الالتقاء في غضون 3-10 أيام. يشير معدل النمو البطيء إلى عدم كفاية الخلايا الظهارية في العينة ويجب التخلص منها.
4. تضخيم وتمرير الخلايا الظهارية الأنفية البشرية
- تنمو الخلايا الظهارية الأنفية البشرية في وسط التضخيم عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2 على قوارير مغلفة بالكولاجين حتى 80٪ -90٪ التقاء ، مع تغيير الوسط كل 48-72 ساعة. بالنسبة للقوارير25 سم 2 ، استخدم 5 مل من وسط التضخيم و 10 مل لقوارير 75 سم2 .
- عندما تصل الخلايا إلى 80٪ -90٪ من الالتقاء ، اغسل الخلايا ب 10 مل من DPBS الخالي من Mg2 + و Ca2 + ، وقم بالشفط ، وتخلص منه.
- أضف 1 مل من التريبسين بنسبة 0.25٪ لقارورة25 سم 2 (أو 2 مل من التربسين لقارورة 75 سم 2) والعودة إلى الحاضنة (37 درجة مئوية ، 5٪ CO2) لمدة 8-12 دقيقة.
- اضغط على القارورة بإحكام ، براحة اليد ، لمساعدة الخلايا على الانفصال.
- أضف 10 مل من وسط التضخيم لإيقاف التفاعل الإنزيمي. اشطف القارورة بقوة، باستخدام ماصة سعة 10 مل لسحب وطرد وسط التضخيم فوق سطح القارورة لشطف الخلايا وفصلها.
- جهاز طرد مركزي عند 500 × g لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية وتخلص من supernatant.
- أعد تعليق الكريات في 5-10 مل من وسط التضخيم.
- عد الخلايا باستخدام مقياس الدم.
ملاحظة: يمكن تجميد الخلايا في هذه المرحلة (راجع الخطوات من 5.1 إلى 5.3). إذا كانت هناك حاجة إلى مزيد من التضخيم ، فأعد البذر على قوارير مغلفة بالكولاجين (يمكن توسيع قارورة25 سم 2 إلى ثلاث قوارير 75 سم2 ، ولا ينصح بتخفيف أكبر).
5. الحفظ بالتبريد للخلايا الظهارية الأنفية الأولية
ملاحظة: تنمو خلايا HNE حتى المرور 1 قبل البنوك الحيوية للحصول على ما يكفي من الخلايا لتسهيل نمو الخلايا عند إذابتها. ومع ذلك ، فإن البنوك الحيوية ممكنة في المقطع الأولي 0 أو المقطع 2. يتم تكييف خطوات الحفظ بالتبريد التالية مع جميع المقاطع.
- بعد عد الخلايا ، قم بجهاز طرد مركزي عند 500 × g لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية ، وتخلص من supernatant
- أعد تعليق الكريات في وسط التجميد المخصب (الجدول 1) للحصول على 3 × 10 6-5 × 106 خلايا لكل مل ولكل تبريد.
- قم بتجميد الخلايا ببطء عن طريق تقليل درجة الحرارة عند ~ 1 درجة مئوية في الدقيقة في حاوية تجميد مناسبة بالتبريد عند -80 درجة مئوية. في اليوم التالي ، انقل العينة المحفوظة إلى حاوية تخزين النيتروجين للتخزين على المدى الطويل (تقتصر هذه الدراسة على تخزين 17 شهرا).
6. إذابة خلايا HNE المضخمة المجمدة
- قم بتسخين الحمام المائي إلى 37 درجة مئوية. تحضير وسط التضخيم كما هو موضح في الجدول 1 وتسخين الوسط إلى 37 درجة مئوية.
- قم بإزالة الكريوفيات من خزان تخزين النيتروجين ووضعها بسرعة في الحمام المائي ، مع الحرص على عدم غمر القارورة بأكملها في الماء. قم بإزالة الكريوفيالات من الحمام المائي عندما تبقى قطرة صغيرة مجمدة فقط. امسح القارورة بالكحول بنسبة 70٪ ، وجففها ، وضعها تحت غطاء المحرك.
- باستخدام ماصة 1 مل ، انقل الخلايا المذابة إلى أنبوب فارغ سعة 15 مل.
- بطريقة قطرة ، أضف 1 مل من وسط التضخيم الدافئ. بعد 1 دقيقة ، أضف 1 مل أخرى من وسط التضخيم وانتظر دقيقة إضافية.
- أضف 10 مل من وسط التضخيم وأجهزة الطرد المركزي لمدة 2 دقيقة عند 500 × جم.
- شفط والتخلص من supernatant. أعد تعليق بيليه الخلية في حجم وسط التضخيم المطلوب لتحقيق كثافة خلية لا تقل عن 1 × 106 خلايا/مل.
- زرع الخلايا على قارورة مغلفة بالكولاجين تحتوي على وسط التضخيم.
- إذا كان التبريد يحتوي على أكثر من 4 × 106 خلايا، البذور على قارورة 75 سم2 ، في 10 مل من وسط التضخيم
- إذا كان التبريد يحتوي على أقل من 4 × 106 خلايا، فإن خلايا البذور على قارورة25 سم 2 ، في 5 مل من وسط التضخيم
- احتضان في 37 درجة مئوية ، 5 ٪ CO2 ، ومراقبة بصريا توسع الخلايا على مدى 2-3 أيام القادمة.
- ثم قم بإجراء تضخيم الخلية كما هو مفصل في القسم 4.
ملاحظة: إذا تم حصاد عدد قليل من الخلايا في الخطوة 4.7. (أي إذا تجمد عند المقطع 0 قبل التوسع)، الخطوات 6.5. و 6.6. يمكن حذفها ، ويمكن زرع الخلايا مباشرة على قارورة مغلفة بالكولاجين25 سم 2 دون طرد مركزي. يجب بعد ذلك تغيير الوسط في اليوم التالي لإزالة ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO).
7. تمايز الخلايا الظهارية الأنفية البشرية في واجهة الهواء السائل
ملاحظة: تم تمييز HNE في واجهة الهواء السائل كما هو موضح سابقا10.
- زرع الخلايا بكثافة 330000 خلية / مرشح على 0.33 سم2 مرشحات مسامية مغلفة بالكولاجين واستكمال مع 300 ميكرولتر من وسط التضخيم في الجانب القمي و 900 ميكرولتر من الوسط السائل الهوائي في الجانب القاعدي.
- بعد 3 أيام ، قم بشفط الوسط القمي واستزرع الخلايا في واجهة الهواء السائل لمدة 3-4 أسابيع في الوسط السائل الهوائي لإنشاء ظهارة متباينة. تغيير الوسط القاعدي كل 48-72 ساعة.
8. معدلات CFTR
- تحضير وسط الهواء السائل الذي يحتوي على معدلات CFTR. استخدم VX-445 و VX-661 و VX-809 بتركيز نهائي قدره 3 ميكرومتر و VX-770 عند 100 نانومتر. استخدم المصحح ABBV-2222 عند التركيز النهائي 1 ميكرومتر والمقوي ABBV-974 عند 10 ميكرومتر.
- تحضير وسط الهواء السائل يحتوي على نفس الكمية من DMSO 100٪ كما هو الحال في وسط المصحح.
- أضف الوسط الذي يحتوي على أدوية أو DMSO إلى الجانب القاعدي لخلايا HNE المستقطبة المزروعة في واجهة هوائية سائلة واحتضنها لمدة 24 ساعة في 5٪ CO2 عند 37 درجة مئوية.
- بعد 24 ساعة ، قم بشفط الوسط والتخلص منه واستبداله بوسط طازج تم إعداده كما هو الحال في الخطوات 8.1-8.2 ، واحتضان لفترة 24 ساعة في 5٪ CO2 عند 37 درجة مئوية.
9. استخدام دراسات الغرفة
- قم بقياس قياسات تيار الدائرة القصيرة (Isc) تحت ظروف مشبك الجهد كما هو موضح سابقا9.
ملاحظة: تم قياس المقاومة الكهربائية عبر الظهارية (TEER) للمزارع باستخدام فولتميتر عيدان تناول الطعام، ولم يتم النظر إلا في الثقافات التي تصل إلى 200 Ω سم2 على الأقل للتجارب التالية. تم تركيب مرشحات خلايا HNE المستقطبة في غرف Ussing ، وتم قياس قياسات تيار الدائرة القصيرة (Isc) في ظل ظروف الجهد المشبك.
10. الكيمياء المناعية
- إجراء الكشف المناعي كما هو موضح سابقا9.
ملاحظة: تم إجراء الكشف المناعي CFTR باستخدام الجسم المضاد أحادي النسيلة المضاد ل CFTR C-terminal (24-1) بين عشية وضحاها عند تخفيف 1/100. تم إجراء تلطيخ Zona-occludens-1 (ZO-1) (تخفيف 1/500) ، ألفا توبولين (تخفيف 1/300) ، Muc 5AC (تخفيف 1/250) و cytokeratin 8 (تخفيف 1/250) على مرشحات إضافية. بعد الغسيل باستخدام PBS-Triton-X100 0.1٪ ، تمت إضافة الأجسام المضادة الثانوية للماعز المترافقة مع Alexa 488 أو 594 لمدة 30 دقيقة في مصل الماعز بنسبة 10٪ (تخفيف 1/1000). بعد الغسيل النهائي ، تم قطع المرشحات من الدعم وتركيبها مع وسيط تركيب Vectashield يحتوي على DAPI. تم استخدام مجهر متحد البؤرة (63x / 1.4 تباين التداخل التفاضلي للنفط λ Blue PL APO الهدف) لالتقاط الصور ، والتي تم تحليلها باستخدام برنامج ImageJ.
11. التحليل الإحصائي
- إجراء التحليل الإحصائي باستخدام البرامج المناسبة.
ملاحظة: تم إجراء التحليل الإحصائي باستخدام برنامج S.A.S. نظرا لأنه تم الحصول على العديد من مرشحات HNE لكل مريض ولكل حالة ، تم التعبير عن المعلمات الكمية كقيم وسيطة (± SEM) لكل مريض. تم إجراء المقارنات (متوسط ± SD) باستخدام اختبار الرتبة الموقعة على أزواج Wilcoxon أو اختبار t غير المقترن.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
تعرض خلايا HNE الطازجة المستزرعة في واجهة الهواء السائل ميزات نموذجية للظهارة التنفسية المستقطبة والمتباينة كما تم تقييمها بواسطة التلطيخ المناعي (الشكل 1). تعيد خلايا HNE التمايز إلى طبقة غير متجانسة من الخلايا الظهارية (تلطيخ مناعي إيجابي للكيراتين 8) تحاكي الوضع الحي لظهارة تنفسية شبه طبقية تتكون من السيليثيلات (تلطيخ ألفا توبولين إيجابي) وخلايا كأس غير هدبية منتجة للمخاط (تلطيخ مناعي إيجابي Muc5Ac). تقدم الظهارة الكلية تقاطعات ضيقة (تم تقييمها بواسطة تلطيخ ZO-1 ، zona-occludens-1). يظهر تلطيخ CFTR القمي القوي في خلايا HNE من النوع البري (WT) ، ولوحظ انخفاض تلطيخ CFTR على السطح القمي وفي السيتوبلازم في F508del / F508del HNE.
لقد نظرنا إلى النتائج الإيجابية كعينات لا تتوسع بنجاح فحسب ، بل تتمايز أيضا بنجاح إلى ظهارة طبقية زائفة بعد 3 أسابيع في واجهة الهواء السائل وتقديم TEER أعلى من 200 Ω · سم2 ، مما يسمح بقياسات تيار الدائرة القصيرة. نظرا لأن عددا قليلا فقط من المختبرات المخصصة تقوم بإجراء اختبارات إفراز Cl المتعلقة ب CFTR عن طريق قياسات تيار الدائرة القصيرة ، فغالبا ما تتطلب العينات النقل من المستشفيات إلى المرافق المخصصة.
في 78 عينة جديدة من خلايا HNE ، تمت مقارنة معدلات النجاح في تنظيف الأنف بالفرشاة على الفور وفي الفرشاة التي تم زرعها بعد 1-7 أيام من النقل في وسط التنظيف في درجة حرارة الغرفة. تم زرع غالبية العينات (55٪) بعد 1 يوم من التنظيف بالفرشاة ، وتم زرع 82٪ من العينات في غضون 48 ساعة. وبلغ متوسط النسبة المئوية للمزارع الناجحة في جميع العينات ال 78 82 في المائة وبلغ 87 في المائة في العينات المبذرة بين اليوم 0 واليوم 5 (الجدول 2).
وتمت مقارنة معدلات النجاح والفشل للعينات المتطابقة المتباينة في كل من الظروف الطازجة والظروف المذابة بالتجمد. 83٪ من العينات التي تميزت بنجاح في ظروف جديدة كانت ناجحة أيضا في العينات المحفوظة بالتبريد. وبالمثل ، في العينات التي فشلت في التمييز في ظروف جديدة ، لم ينجح 71٪ أيضا في ظروف التجميد والذوبان (الجدول 2). كل هذه البيانات تشير إلى أن جودة تنظيف الأنف بالفرشاة هي العامل الرئيسي لثقافة ناجحة.
أردنا أيضا تحديد العدد الأمثل للخلايا لكل تبريد. العينات المجمدة في الممر 0 ، من واحد 25 سم2 عموما تسمح فقط للوصول إلى 1-1.5 × 106 خلايا لكل قارورة. العينات المجمدة في الممر 1 وتضخيمها إلى ثلاث قوارير 75 سم2 يسمح لها عموما بالوصول إلى 10 × 10 6 خلايا ، مما يسمح بتجميد عدة قوارير تحتوي على 3 × 106 خلايا على الأقل. في ظروف الاستزراع الموصوفة في هذا البروتوكول ، فشلت 50٪ من العينات المجمدة بين 2 × 10 6 و 3 × 10 6 خلايا لكل خلية مبردة في النمو عند إذابتها ، حيث وصلت إلى 80٪ عندما تكون أقل من 2 × 106 خلايا لكل مبرد (الجدول 2).
يعكس إفراز Cl- المرتبط ب CFTR وظيفة CFTR ويمكن قياسه بواسطة تجارب تيار الدائرة القصيرة (Isc) في غرف Ussing. إن تباين ISC استجابة ل Forskolin (ΔIscForskolin) ومثبط CFTR inh172 (ΔIscCFTRinh172) هي نقاط النهاية الرئيسية لتقييم فعالية مصحح CFTR.
تم إجراء تجارب تيار الدائرة القصيرة إما على HNE الطازج ، وتوسيعها في وسط التضخيم وزرعها على مرشحات عند الممر 2 ونمت في واجهة الهواء السائل لمدة 3 أسابيع في وسط الهواء السائل ، أو من HNE التي تم تجميدها سابقا في الممر 1 في وسط التجميد المخصب ، وإذابتها ، وتوسيعها ، وبذرها على مرشحات مسامية عند الممر 3. وتراوحت أوقات الحفظ بالتبريد بين 3 أشهر و16 شهرا، بمتوسط 9.8 أشهر. في ظروف الاستزراع والحفظ بالتبريد المفصلة في هذه الدراسة، لم تلاحظ أي تغييرات كبيرة في النمو أو التشكل بين الممرات المختلفة أو مزارع F508del/F508del HNE الطازجة أو المذابة المجمدة.
بالنسبة لكل من متوسط ΔIscForskolin (الشكل 2A) ومتوسط ΔIscCFTRinh172 (الشكل 2B) في خلايا HNE المعالجة ب DMSO ، لم يلاحظ أي فرق كبير بين HNE الطازج أو المذاب المجمد. لتقييم ما إذا كان التصحيح الوظيفي ل CFTR قد تأثر بالحفظ بالتبريد، تم قياس متوسط التغيرات في ISC في الخلايا المعالجة VX-809 + VX-770 مقارنة بخلايا HNE المعالجة ب DMSO في الخلايا الطازجة (خلايا HNE المشتقة من n = 78 مريضا) أو HNE المذابة المجمدة (خلايا HNE المشتقة من n = 9 مرضى) (الشكل 2). أظهرت كل من الخلايا المذابة المجمدة والطازجة تصحيحا كبيرا عند العلاج ، مع زيادة كبيرة في ΔIscForskolin (p < 0.05) (الشكل 2A) ، وانخفاض كبير في ΔIscCFTRinh172 (p < 0.05) (الشكل 2B)". بلغ متوسط زيادة الأضعاف ل ΔIsc Forskolin (ΔIsc Forskolin VX-809 + VX-770 / ΔIscForskolin DMSO) 2.9 ± 1.6 في خلايا HNE المذابة المجمدة ولم يكن مختلفا اختلافا كبيرا عن زيادة الأضعاف في خلايا HNE الطازجة (2.5 ± 2.0). وبالمثل ، فإن انخفاض الأضعاف في ΔIsc CFTRinh172 (ΔIsc CFTRinh172 VX-809 + VX-770 / ΔIscCFTRinh172 DMSO) لم يتأثر بشكل كبير بالحفظ بالتبريد: 1.49 ± 0.9 في HNE المذاب المجمد مقارنة ب 2.5 ± 3.7 في HNE الطازج.
تم إجراء مزيد من التحقيق في نشاط التصحيح الوظيفي للعديد من العلاجات المعدلة لتقييم ما إذا كان نموذج خلية HNE هذا يمكن أن يميز بين العلاجات المختلفة. تجمع النتائج هنا بين خلايا HNE من كل من الظروف الطازجة والمجمدة المذابة حيث لم تتغير الاستجابة للعلاج بشكل كبير عن طريق الحفظ بالتبريد (الشكل 2).
قمنا أولا بتقييم الاستجابة المصححة لاثنين من علاجات تعديل CFTR المعتمدة على Cl- Transfer بعد علاج 48 ساعة إما مع VX-809 (3 ميكرومتر) + VX-770 (100 نانومتر) أو VX-661 (3 ميكرومتر) + VX-770 (100 نانومتر) في خلايا HNE من 10 مرضى F508del / F508del (الشكل 3). بالمقارنة مع خلايا HNE المعالجة ب DMSO ، تم تحسين ΔIscForskolin (الشكل 3A) و ΔIscCFTRinh172 (الشكل 3B) بشكل كبير بواسطة كل من VX-809 + VX-770 و VX-661 + VX-770. قام كلا العلاجين وظيفيا بتصحيح إفراز Cl- المرتبط ب CFTR إلى مستوى مماثل ، مع زيادة كبيرة في متوسط الأضعاف في ΔIscForskolin من 1.75 ± 1.39 ل VX-809 + VX-770 (p < 0.001) و 0.97 ± 0.93 ل VX-661 + VX-770 (p < 0.01). كان متوسط الانخفاض بالأضعاف ΔIsc CFTRinh172 1.79 ± 2.04 ل VX-809 + VX-770 (p < 0.001) ولم يكن مختلفا اختلافا كبيرا عن متوسط انخفاض ΔIscCFTRinh172 بمقدار 1.16 ± 1.44 ل VX-661 +VX-770 (p < 0.001 مقابل DMSO).
تمت مقارنة ثلاثة علاجات مختلفة لمغير CFTR في HNE من ستة مرضى F508del / F508del (الشكل 4). تجمع النتائج هنا بين خلايا HNE من كل من الظروف الطازجة والمجمدة المذابة. وعند استخدام كل من معدلي Vertex و Abbvie CFTR كمزيج من مصحح CFTR ومحفز CFTR ، قاموا بتصحيح ΔIscForskolin (الشكل 4A) و ΔIscCFTRinh172 (الشكل 4B) إلى حد مماثل. تم تأكيد التصحيح الجزئي الذي لوحظ في الشكل 3 بواسطة VX-809 + VX-770 في خلايا HNE هذه مع زيادة أضعاف ΔIscForskolin المتوسطة من 2.87 ± 1.67 (p < 0.05). أدى علاج ABBV-2222 (1 ميكرومتر) + ABBV-974 (10 ميكرومتر) إلى تصحيح مماثل يمثل 91٪ من تصحيح VX-809 + VX-770 ل ΔIsc Forskolin (متوسط زيادة أضعاف ΔIscForskolin من 2.6 ± 1.4 ، p < 0.05 مقابل DMSO) و 85٪ من VX-809 + VX-770 ل ΔIsc CFTRinh172 (متوسط ΔIsc CFTRinh172 انخفاض أضعاف 4.2 ± 5.7 ، p < 0.05 مقابل DMSO).
ومن المثير للاهتمام أنه عندما عولجت HNE بالتركيبة الثلاثية VX-445 (3 ميكرومتر) + VX-661 (3 ميكرومتر) + VX-770 (100 نانومتر) ، تحسنت فعاليةالتصحيح بشكل كبير ، حيث وصلت إلى 312٪ من تصحيح VX-809 + VX-770 ΔIsc Forskolin (متوسط زيادة أضعاف ΔIscForskolin من 9.0 ± 4.1 ، p < 0.05 مقابل VX-809 + VX-770) و 372٪ من ΔIsc CFTRinh172 (متوسط انخفاض أضعاف ΔIscCFTRinh172 من 15.5 ± 10.5 ، p < 0.05 مقابل VX-809 + VX-770).
الشكل 1: علامات التمايز في ثقافات HNE. صور مجهرية تمثيلية متحدة البؤرة لتلطيخ الفلورسنت المناعي ل CFTR (أخضر) ، Zona-Occludens-1 (ZO-1 ، أحمر) ، ألفا توبولين (أخضر) ، Muc5AC (أحمر) و cytokeratin 8 (K8 ، أخضر) في النوع البري (WT) (اللوحة الأولى) و F508del (الألواح 2-4) خلايا HNE المزروعة في واجهة الهواء السائل لمدة 3 أسابيع. كانت النوى ملطخة باللون الأزرق مع DAPI. إسقاطات الصور المجهرية متحدة البؤرة، والرؤية العلوية (الألواح العلوية) والرؤية الجانبية (اللوحات السفلية) لمكدسات Z ثلاثية الأبعاد (3D) تعيد تشكيلها. ينطبق شريط المقياس (20 ميكرومتر) على كل من الألواح العلوية والسفلية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: تأثير ذوبان الجليد على إفراز Cl- المرتبط ب CFTR في خلايا HNE. ملخص تسجيلات تيار الدائرة القصيرة (Isc) (متوسط ± SD) في مزارع HNE المستمدة من مرضى F508del/F508del والتي نمت في واجهة الهواء السائل لمدة 3 أسابيع. عولجت الخلايا لمدة 48 ساعة باستخدام السيارة وحدها (DMSO) أو VX-809 (3 ميكرومتر) + VX-770 (100 نانومتر) في خلايا HNE جديدة (رمادية فاتحة ، مشتقة من المريض من 78 مريضا) أو مجمدة مذابة (رمادية داكنة ، خلايا HNE مشتقة من المريض من 9 مرضى). تمثل البيانات متوسط الاستجابة (± SD) للإضافة الحادة (A) Forskolin (10 μM) / 3-isobutyl-1-methylxanthine (IBMX ، 100 μM) أو ΔIscForskolin أو (B) مثبط CFTR inh172 (5 μM) ΔIscCFTRinh172. تم تحليل ما لا يقل عن اثنين من المرشحات لكل مريض ولكل حالة. تشير العلامات النجمية إلى الفرق الإحصائي بين المصححات والتحكم (DMSO-treatmented) * p < 0.05 (اختبار t غير المقترن). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: تصحيح وظيفة CFTR عن طريق العلاجات المزدوجة. ملخص تسجيلات تيار الدائرة القصيرة (Isc) (متوسط ± SD) في مزارع HNE المستمدة من 10 مرضى F508del/F508del والتي نمت في واجهة الهواء السائل لمدة 3 أسابيع (النتائج مجتمعة من كل من الثقافات الطازجة والمجمدة المذابة). عولجت الخلايا لمدة 48 ساعة مع السيارة وحدها (DMSO) ؛ VX-809 (3 ميكرومتر) + VX-770 (100 نانومتر) أو VX-661 (3μM) + VX-770 (100 نانومتر). تمثل البيانات متوسط الاستجابة (± SD) ل (A) Forskolin (10 μM) / IBMX (100 μM) أو ΔIscForskolin أو (B) مثبط CFTR inh172 (5 μM) أو ΔIscCFTRinh172. تم تحليل ما لا يقل عن اثنين من المرشحات لكل مريض ولكل حالة. تشير العلامات النجمية إلى وجود فرق إحصائي بين المصححات والتحكم (DMSO-treatmented) ** p < 0.01 ، *** p < 0.001 ، **** p < 0.0001 (Wilcoxon مطابقة الأزواج الموقعة اختبار الرتبة). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: كفاءة العلاج الثلاثي مقابل العلاجات المزدوجة في تصحيح CFTR. ملخص تسجيلات تيار الدائرة القصيرة (Isc) (متوسط ± SD) في مزارع HNE المستمدة من 6 مرضى F508del/F508del والتي نمت في واجهة الهواء السائل لمدة 3 أسابيع (النتائج مجتمعة من كل من الخلايا الطازجة والمجمدة المذابة). عولجت الخلايا لمدة 48 ساعة مع السيارة وحدها (DMSO) ؛ VX-809 (3 ميكرومتر) + VX-770 (100 نانومتر) ؛ ABBV-2222 (1 ميكرومتر) + ABBV-974 (10 ميكرومتر) ؛ أو VX-661 (3 ميكرومتر) + VX-445 (3 ميكرومتر) + VX-770 (100 نانومتر). تمثل البيانات متوسط الاستجابة (± SD) لمثبطات CFTR المضافة بشكل حاد (A) Forskolin (10 μM) / IBMX (100 μM) أو ΔIscForskolin أو (B) مثبطات CFTR inh172 (5 μM) أو ΔIscCFTRinh172. تم تحليل ما لا يقل عن اثنين من المرشحات لكل مريض ولكل حالة. تشير العلامات النجمية إلى وجود فرق إحصائي بين العلاجات. * p < 0.05 (Wilcoxon مطابقة الأزواج الموقعة اختبار الرتبة). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
| مكون الوسائط | التركيز النهائي |
| متوسط التضخيم | |
| خليط متقدم من المغذيات DMEM/F-12 | 86% |
| مصل الجنين البقري | 10% |
| بنسلين | 100 يو/مل |
| ستربتومايسين | 100 ميكروغرام/مل |
| تازوسيلين | 10 ميكروغرام/مل |
| الأمفوتريسين ب | 2.5 ميكروغرام/مل |
| كوليميسين | 16 ميكروغرام/مل |
| سيبروفلوكساسين | 3 ميكروغرام/مل |
| الهيدروكورتيزون | 0.2 ميكرومتر |
| إنسولين | 5 ميكروغرام/مل |
| ادرينالين | 0.5 ميكروغرام/مل |
| إي جي إف | 10 نانوغرام/مل |
| Y-27632 (مثبط كيناز مرتبط ب Rho) | 10 ميكرومتر |
| وسط الهواء السائل | |
| خليط متقدم من المغذيات DMEM/F-12 | 94% |
| أولتروسرج | 2% |
| بنسلين | 100 يو/مل |
| ستربتومايسين | 100 ميكروغرام/مل |
| تازوسيلين | 10 ميكروغرام/مل |
| الأمفوتريسين ب | 2.5 ميكروغرام/مل |
| كوليميسين | 16 ميكروغرام/مل |
| وسط تجميد مخصب | |
| F12 خليط المغذيات | 77% |
| هيبس | 3% |
| مصل الجنين البقري | 10% |
| DMSO | 10% |
الجدول 1: التضخيم ، الهواء السائل ، والتركيب المتوسط المتجمد المخصب. قائمة الكواشف والتركيزات النهائية المقابلة.
| طول فترة حفظ تنظيف الأنف بالفرشاة قبل البذر (n = 78) | |
| أيام قبل البذر | معدلات النجاح (٪) |
| 0 | 83 |
| 1 | 84 |
| 2 | 67 |
| 3 | 100 |
| 4 | 89 |
| 5 | 100 |
| 7 | 0 |
| نتائج نفس تنظيف الأنف الأولي بالفرشاة المزروع في كل من الظروف الطازجة والمجمدة المذابة (n = 13) | |
| النتيجة في ظروف جديدة | معدلات النجاح عند ذوبان الجليد (٪) |
| نجاح | 83 |
| فشل | 29 |
| تأثير رقم الخلية على معدلات النجاح (n = 36) | |
| عدد الخلايا لكل تبريد | معدلات النجاح عند ذوبان الجليد (٪) |
| <2 × 106 | 20 |
| 2-3 × 106 | 50 |
| 3-4 × 106 | 67 |
| >4 × 106 | 79 |
الجدول 2: البارامترات التي تؤثر على معدلات النجاح في مزارع خلايا HNE الطازجة والمجمدة المذابة. تم تعريف معدلات النجاح على أنها فرشاة الأنف التي توسعت بنجاح وتميزت إلى ظهارة طبقية زائفة بعد 3 أسابيع في واجهة الهواء السائل وقدمت TEER أعلى من 200 Ω · سم2. قبل البذر ، تم شحن العينات في درجة حرارة الغرفة في وسط التنظيف بالمضادات الحيوية. وتمثل النتائج بيانات من 78 عينة جديدة و 36 عينة مجمدة مذابة. تم تحليل 13 فرشاة أنفية في كل من الظروف الطازجة والمجمدة المذابة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
تم اقتراح استخدام الخلايا الظهارية الأنفية المشتقة من المريض كبدائل للخلايا الظهارية للشعب الهوائية البشرية (HBE) لقياس نشاط CFTR في سياق الطب الشخصي حيث تقوم HNE بإعادة إنتاج خصائص الخلايا في الثقافة 9,11. الميزة القوية ل HNE على مزارع خلايا HBE هي أنه يتم أخذ عينات منها بسهولة ودون غاز. تمكن قياسات تيار الدائرة القصيرة في مزارع خلايا HNE من تقييم انتقال Cl المعتمد على CFTR عبر الظهارة ، والذي ثبت أنه يرتبط ارتباطا كبيرا ب CFTR في نشاط الجسم الحي الذي تم تقييمه من خلال فرق الجهد الأنفي في المرضى الذين يعانون من أنماط وراثية مختلفة9. كما ارتبط إنقاذ نشاط CFTR في خلايا HNE عند علاج VX-809 ارتباطا كبيرا بتحسين النتائج السريرية FEV1 في مرضى Lumacaftor-ivacaftor المعالجين F508del متماثلي الزيجوت12.
الأهم من ذلك ، تظهر هذه الدراسة أن خلايا HNE التي تم حصادها حديثا تتحمل بسهولة ظروف النقل والشحن القياسية ، (أي أنها تعيش 72 ساعة في درجة حرارة الغرفة) مما يسمح باختبار خلايا المريض الناشئة من مواقع جغرافية مختلفة. العوامل الحاسمة للزراعة الناجحة هي أساسا جودة تنظيف الأنف بالفرشاة وعدد الخلايا الحية في أخذ العينات. وقد نشر عدد من البروتوكولات بشأن زراعة خلايا HNE وتمييزها؛ بعضها بدون إعادة برمجة مشروطة خلال مرحلة التوسع 13,14,15,16,17,18,19,20 ، وبعضها مع إعادة برمجة شرطية في وحدة التغذية 9,11,12,21,22,23,24,25 ، 26 أو خالية من وحدة التغذية5،8،27،28،29 الظروف ، والعديد من طرق المقارنة المختلفة7،8. وكلها تسمح بالحصول على عدد كبير نسبيا من ثقافات ALI مع التمايز الصحيح والاستقطاب بالإضافة إلى قيم TEER الجيدة. على غرار هذه الدراسة ، استخدم الكثيرون خلايا HNE المحفوظة بالتجميد المجمدة عند الممر 113,28. ومن المثير للاهتمام أن العديد من المؤلفين أفادوا بأن ROCKi يمكن أن يحسن البقاء على قيد الحياة بعد الحفظ بالتبريد عند إضافته إلى وسط زراعة ما بعد ذوبان الجليد وزيادة عدد الخلايا التي تظل متصلة 5,29 ، مما يشير إلى أن وسيط التضخيم المستخدم في هذه الدراسة مناسب بشكل خاص للحفظ بالتبريد.
هنا ، تظهر الدراسة أن خلايا HNE يمكن أن يتم بناؤها بيولوجيا بنجاح ، والعامل الحاسم مرة أخرى هو جودة تنظيف الأنف بالفرشاة. وتظهر علاقة جيدة بين نتائج العينات الطازجة والعينات المذابة المجمدة، مما يشير إلى أنه من أجل تحسين نوعية خلايا HNE التي سيتم تمويلها بيولوجيا لإجراء مزيد من الدراسات، يمكن إجراء دراسة أولية على العينات الطازجة إذا فشلت في تحقيق التمايز الصحيح ل ALI وقيمة TEER المقبولة؛ سيكون تنظيف الأنف بالفرشاة الثانية أفضل من تجميد الخلايا التي لديها احتمال كبير لنتائج سيئة. العامل الحاسم الثاني للحفظ بالتبريد هو عدد الخلايا. في ظروف الثقافة المستخدمة في هذه الدراسة ، عندما يتم تجميد أقل من 2 × 106 خلايا لكل تبريد ، يكون معدل الفشل مرتفعا جدا. يوصى بتجميد ما لا يقل عن 3 × 106 خلايا لكل خلايا تبريدية.
تشير النتائج في هذه الدراسة إلى أن ذوبان الجليد لا يعدل بشكل كبير الخصائص الكهروفسيولوجية لخلايا HNE أو الاستجابة لمعدلات CFTR. لم يكن نطاق التدابير في مزارع خلايا HNE من نفس المريض F508del-homozygous الذي تم الحصول عليه دون تجميد أو بعد ذوبان الجليد مختلفا عند علاج VX-809 + VX-770. تم الإبلاغ سابقا عن نتائج مماثلة لخلايا HBE حيث كان Isc المحفز بفورسكولين مستقرا بعد عدة دورات ذوبان / زراعة لخلايا F508del30 غير المعالجة. وهذا يوفر دليلا على أن خلايا HNE يمكن تجميدها وتخزينها في بنك حيوي ودراستها لاحقا.
يظهر عدد متزايد من الدراسات أنه يمكن استخدام مزارع خلايا HNE لاختبار فعالية العلاجات المختلفة في سياق الطب الشخصي. أظهر التحليل أن العلاجات المزدوجة التي تجمع بين المصحح والمقوي جميعها لها فعالية تصحيح مماثلة لإفراز Cl- المعتمد على CFTR في خلايا HNE المتجانسة F508del-homozygous. ومع ذلك ، لوحظ تباين مهم بين المرضى ، مما يؤكد النتائج المنشورة9،12،20،25. على النقيض من ذلك ، تضاعف VX-445 + VX-661 + VX-770 ثلاثة أضعاف تصحيح نشاط CFTR مقارنة ب VX-809 + VX-770. كما لوحظ مستوى مماثل من تصحيح F508del-CFTR في خلايا HNE عند الجمع الثلاثي بواسطة Laselva et al.28. وكما أفاد Veit et al.26، كان تصحيح دالة قناة Cl على معالجة VX-445 + VX-661 + VX-770 أعلى من ذلك، حيث وصل إلى 62٪ من متوسط نشاط WT-CFTR (نطاق 19-36 μA/cm 2 في F508del-HNE المصحح و 14-50 μA/cm2 في WT-HNE)26.
عملت مزارع خلايا HNE أيضا على اختبار فعالية معدلات CFTR للطفرات الأخرى من الفئة الثانية. لوحظ تحسن مهم في نشاط CFTR على VX-445 + VX-661 + VX-770 في مزارع HNE ALI التي تؤوي G85E / G85E و V520F / 1717-1G >A و Y569 / Y569D و M1101K / M1101K و N1303K / N1303K26. وبالمثل ، أظهر Laselva et al.28 تصحيحا كبيرا ل CFTR مع طفرات M1101K و N1303K ولكن لم يكن هناك تصحيح كبير في خلايا G85E HNE. تم تقييم مصححات Galapagos/AbbVie لهذه الطفرات المقاومة ل lumacaftor-ivacaftor31. قام مصحح AbbVie AC2-1 وخاصة المصحح الثنائي AC1 + AC2-1 بتحسين إفراز Cl بشكل فعال في خلايا M1101K و G85E HNE ، في حين تم تصحيح الخلايا المشتقة من N1303K بواسطة مزيج من AC1 + AC2-2.
تعد مقاييس نشاط CFTR في خلايا HNE مؤشرات حيوية واعدة قبل السريرية تنبؤية لاستجابة المريض للعلاج المختبر. الأدلة على أن دورات التجميد والذوبان لا تغير مستوى التصحيح توفر دليلا على أن هذه الخلايا يمكن أن تكون مخزنة بيولوجيا وتستخدم كأداة قوية في سياق برامج الطب الشخصي. وبالتالي فإن تنظيف الأنف بالفرشاة الفريد يمكن أن يسمح بمواد كافية لمقارنة فعالية الأدوية ، ويمكن إذابة خلايا HNE للمريض مع توفر أدوية جديدة دون الحاجة إلى إعادة أخذ عينات من المرضى ؛ هذا مثير للاهتمام بشكل خاص عند الرضع.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
لم يبلغ المؤلفون عن أي مصالح مالية متنافسة تتعلق بهذا المنشور أو إنتاج الفيديو العلمي.
Acknowledgments
نشكر بحرارة جميع المرضى وعائلاتهم على المشاركة في الدراسة. وقد تم دعم هذا العمل من خلال منح من الرابطة الفرنسية Vaincre la Mucoviscidose. الجمعية الفرنسية ABCF 2 وجوائز فيرتكس للابتكار في مجال الأدوية.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ABBV-2222 | Selleckchem | S8535 | |
| ABBV-974 | Selleckchem | S8698 | |
| Advanced DMEM/F-12 | Life Technologies | 12634010 | |
| Alexa 488 goat secondary antibody | Invitrogen | A11001 | |
| Alexa 594 goat secondary antibody | Invitrogen | A11012 | |
| Amphotericin B | Life Technologies | 15290026 | |
| Anti-alpha-tubulin antibody | Abcam | ab80779 | |
| Anti-CFTR monoclonal antibody (24-1) | R&D Systems | MAB25031 | |
| Anti-cytokeratin 8 antibody | Progen | 61038 | |
| Anti-Muc5AC antibody | Santa Cruz Biotech | sc-20118 | |
| Anti-ZO-1 antibody | Santa Cruz Biotech | sc-10804 | |
| Ciprofloxacin | provided by Necker Hospital Pharmacy | ||
| Colimycin | Sanofi | provided by Necker Hospital Pharmacy | |
| Collagen type IV | Sigma-Aldrich Merck | C-7521 | |
| cytology brush | Laboratory GYNEAS | 02.104 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich Merck | D2650 | |
| EGF | Life Technologies | PHG0311 | |
| Epinephrin | Sigma-Aldrich Merck | E4375 | |
| F12-Nutrient Mixture | Life Technologies | 11765054 | |
| FBS | Life Technologies | 10270106 | |
| Ferticult | Fertipro NV | FLUSH020 | |
| Flasks 25 | Thermo Scientific | 156.367 | |
| Flasks 75 | Thermo Scientific | 156.499 | |
| Glacial acetic acid | VWR | 20104.298 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich Merck | H3375 | |
| Hydrocortisone | Sigma-Aldrich Merck | SLCJ0893 | |
| Insulin | Sigma-Aldrich Merck | I0516 | |
| Mg2+ and Ca2+-free DPBS | Life Technologies | 14190094 | |
| Penicillin/Streptomycin | Life Technologies | 15140130 | |
| Tazocillin | Mylan | provided by Necker Hospital Pharmacy | |
| Transwell Filters | Sigma-Aldrich Merck | CLS3470-48EA | |
| Triton-X100 | Sigma-Aldrich Merck | T8787 | |
| Trypsin 0,25% | Life Technologies | 25200056 | |
| Vectashield mounting medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | |
| VX-445 | Selleckchem | S8851 | |
| VX-661 | Selleckchem | S7059 | |
| VX-770 | Selleckchem | S1144 | |
| VX-809 | Selleckchem | S1565 | |
| Xylocaine naphazoline 5% | Aspen France | provided by Necker Hospital Pharmacy | |
| Y-27632 | Selleckchem | S1049 |
References
- Kim, S. J., Skach, W. R. Mechanisms of CFTR folding at the endoplasmic reticulum. Frontiers in Pharmacology. 3, 201 (2012).
- Lukacs, G. L., Verkman, A. S. CFTR: folding, misfolding and correcting the ΔF508 conformational defect. Trends in Molecular Medicine. 18 (2), 81-91 (2012).
- Wainwright, C. E., et al. Lumacaftor-Ivacaftor in patients with cystic fibrosis homozygous for Phe508del CFTR. The New England Journal of Medicine. 373 (3), 220-231 (2015).
- Griese, M., et al. Safety and efficacy of elexacaftor/tezacaftor/ivacaftor for 24 weeks or longer in people with cystic fibrosis and one or more F508del alleles: Interim results of an open-label phase 3 clinical trial. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 203 (3), 381-385 (2021).
- Horani, A., Nath, A., Wasserman, M. G., Huang, T., Brody, S. L. Rho-associated protein kinase inhibition enhances airway epithelial basal-cell proliferation and lentivirus transduction. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 49 (3), 341-347 (2013).
- Liu, X., et al. Conditional reprogramming and long-term expansion of normal and tumor cells from human biospecimens. Nature Protocols. 12 (2), 439-451 (2017).
- Saint-Criq, V., et al. Choice of differentiation media significantly impacts cell lineage and response to CFTR modulators in fully differentiated primary cultures of cystic fibrosis human airway epithelial cells. Cells. 9 (9), 2137 (2020).
- Bukowy-Bieryłło, Z. Long-term differentiating primary human airway epithelial cell cultures: how far are we. Cell Communication and Signaling: CCS. 19 (1), 1-18 (2021).
- Pranke, I. M., et al. Correction of CFTR function in nasal epithelial cells from cystic fibrosis patients predicts improvement of respiratory function by CFTR modulators. Scientific Reports. 7 (1), 7375 (2017).
- Noel, S., et al. Correlating genotype with phenotype using CFTR-mediated whole-cell Cl− currents in human nasal epithelial cells. The Journal of Physiology. , (2021).
- Brewington, J. J., et al. Brushed nasal epithelial cells are a surrogate for bronchial epithelial CFTR studies. JCI Insight. 3 (13), 99385 (2018).
- Pranke, I., et al. Might brushed nasal cells be a surrogate for cftr modulator clinical response. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 199 (1), 123-126 (2019).
- de Courcey, F., et al. Development of primary human nasal epithelial cell cultures for the study of cystic fibrosis pathophysiology. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 303 (11), 1173-1179 (2012).
- Devalia, J. L., Sapsford, R. J., Wells, C. W., Richman, P., Davies, R. J. Culture and comparison of human bronchial and nasal epithelial cells in vitro. Respiratory Medicine. 84 (4), 303-312 (1990).
- McDougall, C. M., et al. Nasal epithelial cells as surrogates for bronchial epithelial cells in airway inflammation studies. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 39 (5), 560-568 (2008).
- Mosler, K., et al. Feasibility of nasal epithelial brushing for the study of airway epithelial functions in CF infants. Journal of Cystic Fibrosis: Official Journal of the European Cystic Fibrosis Society. 7 (1), 44-53 (2008).
- Tosoni, K., Cassidy, D., Kerr, B., Land, S. C., Mehta, A. Using drugs to probe the variability of trans-epithelial airway resistance. PLOS One. 11 (2), 0149550 (2016).
- Schögler, A., et al. Characterization of pediatric cystic fibrosis airway epithelial cell cultures at the air-liquid interface obtained by non-invasive nasal cytology brush sampling. Respiratory Research. 18 (1), 215 (2017).
- Müller, L., Brighton, L. E., Carson, J. L., Fischer, W. A., Jaspers, I. Culturing of human nasal epithelial cells at the air liquid interface. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (80), e50646 (2013).
- Awatade, N. T., et al. Measurements of functional responses in human primary lung cells as a basis for personalized therapy for cystic fibrosis. EBioMedicine. 2 (2), 147-153 (2014).
- Brewington, J. J., et al. Generation of human nasal epithelial cell spheroids for individualized cystic fibrosis transmembrane conductance regulator study. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (134), e57492 (2018).
- Wiszniewski, L., et al. Long-term cultures of polarized airway epithelial cells from patients with cystic fibrosis. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 34 (1), 39-48 (2006).
- Reynolds, S. D., et al. Airway progenitor clone formation is enhanced by Y-27632-dependent changes in the transcriptome. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 55 (3), 323-336 (2016).
- Suprynowicz, F. A., et al. Conditionally reprogrammed cells represent a stem-like state of adult epithelial cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (49), 20035-20040 (2012).
- Awatade, N. T., et al. Significant functional differences in differentiated Conditionally Reprogrammed (CRC)- and Feeder-free Dual SMAD inhibited-expanded human nasal epithelial cells. Journal of Cystic Fibrosis. 20 (2), 364-371 (2021).
- Veit, G., et al. Allosteric folding correction of F508del and rare CFTR mutants by elexacaftor-tezacaftor-ivacaftor (Trikafta) combination. JCI Insight. 5 (18), 139983 (2020).
- Dale, T. P., Borg D'anastasi, E., Haris, M., Forsyth, N. R. Rock Inhibitor Y-27632 enables feeder-free, unlimited expansion of Sus scrofa domesticus swine airway stem cells to facilitate respiratory research. Stem Cells International. 2019, 1-15 (2019).
- Laselva, O., et al. Rescue of multiple class II CFTR mutations by elexacaftor+tezacaftor+ivacaftor mediated in part by the dual activities of elexacaftor as both corrector and potentiator. The European Respiratory Journal. 57 (6), 2002774 (2021).
- Li, X., Krawetz, R., Liu, S., Meng, G., Rancourt, D. E. ROCK inhibitor improves survival of cryopreserved serum/feeder-free single human embryonic stem cells. Human Reproduction. 24 (3), 580-589 (2008).
- Neuberger, T., Burton, B., Clark, H., Van Goor, F. Use of primary cultures of human bronchial epithelial cells isolated from cystic fibrosis patients for the pre-clinical testing of CFTR modulators. Methods in Molecular Biology. 741, Clifton, N.J. 39-54 (2011).
- Laselva, O., et al. Emerging pre-clinical modulators developed for F508del-CFTR have the potential to be effective for ORKAMBI resistant processing mutants. Journal of Cystic Fibrosis. 20 (1), 106-119 (2021).
