Summary
Qui descriviamo l'isolamento, l'amplificazione e la differenziazione delle cellule epiteliali nasali umane primarie (HNE) all'interfaccia aria-liquido e un protocollo di biobanking che consente di congelare e quindi scongelare con successo l'HNE amplificato. Il protocollo analizza le proprietà elettrofisiologiche delle cellule HNE differenziate e la correzione della secrezione di cloruro correlata al CFTR su diversi trattamenti modulatori.
Abstract
Le cellule epiteliali nasali umane (HNE) sono facili da raccogliere con una spazzolatura nasale semplice e non invasiva. Le cellule HNE primarie derivate dal paziente possono essere amplificate e differenziate in un epitelio pseudo-stratificato in condizioni di interfaccia aria-liquido per quantificare il trasporto ciclico di cloruro mediato da AMP (Cl-) come indice della funzione CFTR (Transmembrane Conductance Regulator) della fibrosi cistica. Se passaggi critici come la qualità della spazzolatura nasale e la densità cellulare dopo la crioconservazione vengono eseguiti in modo efficiente, le cellule HNE possono essere biobancate con successo. Inoltre, studi di corrente di cortocircuito dimostrano che lo scongelamento da congelamento non modifica significativamente le proprietà elettrofisiologiche delle cellule HNE e la risposta ai modulatori CFTR. Nelle condizioni di coltura utilizzate in questo studio, quando meno di 2 x 106 cellule sono congelate per crioviale, il tasso di fallimento è molto alto. Si consiglia di congelare almeno 3 x 106 cellule per crioviale. Mostriamo che le terapie duali che combinano un correttore CFTR con un potenziatore CFTR hanno un'efficacia di correzione comparabile per l'attività CFTR nelle cellule HNE F508del-omozigoti. La tripla terapia VX-445 + VX-661 + VX-770 ha aumentato significativamente la correzione dell'attività CFTR rispetto alla doppia terapia VX-809 + VX-770. La misura dell'attività del CFTR nelle cellule HNE è un promettente biomarcatore pre-clinico utile per guidare la terapia con modulatori CFTR.
Introduction
La fibrosi cistica (CF) è una malattia autosomica recessiva derivante da mutazioni nel gene CFTR (Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator) che portano all'assenza o alla disfunzione della proteina CFTR, un canale anionico situato sulla superficie apicale dell'epitelio 1,2. I recenti progressi nella terapia CFTR hanno migliorato la prognosi della malattia e gli ultimi farmaci approvati che combinano correttori CFTR e potenziatori CFTR hanno portato a importanti miglioramenti nella funzione polmonare e nella qualità della vita per i pazienti CF portatori della mutazione più frequente p.Phe508del mutazione (F508del)3,4. Nonostante questo promettente progresso terapeutico, circa il 10% dei pazienti con FC non è idoneo in quanto porta mutazioni che non sono salvabili da questi modulatori CFTR. Per questi pazienti, c'è la necessità di testare altri farmaci o combinazioni di farmaci per trovare la combinazione più efficiente per mutazioni specifiche, evidenziando l'importanza di terapie personalizzate.
Le cellule epiteliali nasali umane (HNE) sono facili da raccogliere con una spazzolatura nasale semplice e non invasiva e consentono la quantificazione del trasporto ciclico di cloruro mediato da AMP (Cl−) come indice della funzione CFTR. Le cellule HNE producono un modello accurato delle vie aeree umane, ma la loro durata è limitata in coltura. Grazie all'ottimizzazione delle tecniche di coltura, le cellule HNE primarie derivate dal paziente possono essere riprogrammate condizionatamente con inibitore della chinasi rho-associata (ROCKi), amplificate e differenziate in un epitelio pseudo-stratificato in condizioni di interfaccia aria-liquido (ALI) su filtri microporosi 5,6. Esistono numerosi protocolli di coltura per la coltura HNE (disponibili in commercio, senza siero, "fatti in casa", co-colture con cellule feeder, ecc.), E la scelta dei mezzi e delle condizioni di coltura sono state descritte per influenzare la crescita, la differenziazione della popolazione cellulare e la funzione epiteliale 7,8. Il protocollo qui presenta un metodo di amplificazione ROCKi semplificato, privo di alimentatore, che consente di ottenere con successo un gran numero di cellule HNE che vengono poi differenziate in ALI per i saggi di funzione CFTR.
Abbiamo dimostrato che, nelle cellule HNE differenziate, un trattamento di 48 ore con modulatori CFTR è sufficiente per indurre la correzione elettrofisiologica della corrente Cl-dipendente da CFTR e che la correzione osservata in vitro può essere correlata al miglioramento clinico del paziente9. Le cellule HNE, quindi, rappresentano un modello appropriato non solo per la ricerca fondamentale sulla FC, ma anche per gli studi pre-clinici con test del modulatore CFTR specifico per il paziente. In questo contesto di terapia personalizzata, l'obiettivo del protocollo era quello di convalidare che le cellule HNE crioconservate di pazienti CF, cresciute nelle nostre condizioni, fossero un modello appropriato per gli studi di correzione CFTR e risultati simili potevano essere attesi quando si confrontava il trasporto di Cl- CFTR dipendente da cellule fresche e congelate-scongelate. Lo studio ha anche valutato l'efficacia di diversi modulatori CFTR quando si utilizzano terapie doppie e triple.
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Protocol
Tutti gli esperimenti sono stati eseguiti seguendo le linee guida e i regolamenti descritti dalla Dichiarazione di Helsinki e dalla legge Huriet-Serusclat sull'etica della ricerca umana.
1. Preparazione di palloni e mezzi diversi
- Preparare l'amplificazione, l'aria-liquido e il mezzo di congelamento come descritto nella Tabella 1.
- Preparare una soluzione madre di collagene umano IV sciogliendo 50 mg di collagene in 100 ml di acido acetico glaciale allo 0,2%. Mescolare su un agitatore magnetico per almeno 1 ora e filtrare sterilizzare la soluzione. Conservare a 4 °C per un massimo di 6 mesi in una bottiglia di vetro, al riparo dalla luce.
- Preparare una soluzione di lavoro di collagene IV diluendo la soluzione madre 1:5 in acqua a doppio distillato. Conservare a 4 °C per un massimo di 6 mesi.
- Rivestire i palloni di coltura cellulare in plastica o i filtri transwell con la soluzione di lavoro del collagene. Distribuire uniformemente 100 μL per 0,33 cm2 filtri transwell, 500 μL per 25 cm2 palloni e 1 mL per 75 cm2 palloni su tutta la superficie di crescita del pallone.
NOTA: Questo può essere ottenuto inclinando delicatamente il pallone da un lato all'altro. In alternativa, per facilitare il rivestimento dei palloni, è possibile utilizzare un volume maggiore e, quando l'intera superficie è coperta uniformemente, la soluzione di collagene viene aspirata per lasciare solo il volume indicato. La soluzione di collagene aspirato può quindi essere utilizzata immediatamente per rivestire il pallone successivo (ad esempio, per tre palloni da 75 cm2 , distribuire uniformemente 3 ml di soluzione di collagene nel primo matraccio, aspirare 2 ml, che vengono poi utilizzati per il pallone successivo e così via). - Lasciare i palloni di coltura cellulare nell'incubatrice per un minimo di 2 ore o durante la notte. Aspirare accuratamente il collagene e lasciare asciugare i palloni nell'incubatrice o sotto il cofano per un minimo di 20 minuti o durante la notte.
- Lavare con 10 ml di DPBS senza Mg2+ e Ca2+, lasciare asciugare nell'incubatrice e conservare in un foglio di alluminio per proteggere dalla luce. Conservare i palloni per un massimo di 6 mesi a temperatura ambiente (RT).
2. Spazzolatura nasale
NOTA: Assicurarsi che la spazzolatura nasale venga eseguita mentre il partecipante non ha un'infezione acuta. Se i pazienti con FC presentano un'infezione polmonare, fare riferimento all'antibiogramma del paziente e aggiungere ulteriori antibiotici al mezzo di amplificazione. Le cellule epiteliali nasali umane sono state raccolte mediante spazzolatura nasale da pazienti F508del/F508del come descritto in precedenza9.
- Chiedere al paziente di soffiarsi il naso, quindi anestetizzare localmente la mucosa di entrambe le narici usando maglie di cotone imbevute di xilocaina al 5% con soluzione di nafazolina.
- Spazzolare delicatamente la parete mediale e il turbinato inferiore di entrambe le narici usando un pennello citologico. Immergere la spazzola in un tubo da 15 ml con 2 mL di mezzo di lavaggio disponibile in commercio; agitare delicatamente per staccare le cellule. Ripetere la spazzolatura nella seconda narice.
- Aggiungere i seguenti antibiotici al mezzo di lavaggio: penicillina (100 U / mL), streptomicina (100 μg / mL), tazocillina (10 μg / mL), amfotericina B (2,5 μg / mL) e colimicina (16 μg / mL).
NOTA: le spazzolature nasali possono essere spedite a RT a laboratori dedicati per l'espansione e la coltura e possono essere seminate fino a 72 ore dopo la spazzolatura.
3. Isolamento dell'HNE
NOTA: gli HNE sono stati isolati dal pennello citologico, lavati con DPBS privo di Mg2+ e Ca2+, dissociati con tripsina allo 0,25% e seminati su un pallone di plastica da25 cm 2 come descritto in precedenza10.
- Staccare le cellule dal pennello citologico facendo passare ripetutamente il pennello attraverso un cono di pipetta da 1000 μL e risciacquando con 2 ml di DPBS privo di Mg2+ e Ca2+. Centrifugare a 500 x g per 5 minuti a 4 °C ed eliminare il surnatante.
- Risospese il pellet in tripsina allo 0,25% per 8-12 minuti per dissociare le cellule. Arrestare la reazione enzimatica aggiungendo 5 ml del mezzo di amplificazione.
- Centrifugare a 500 x g per 5 minuti a 4 °C ed eliminare il surnatante. Risospesciare il pellet in 8 mL del mezzo di amplificazione e seminare su un pallone rivestito di collagene di 25 cm2 . Crescere a 37 °C e 5% di CO2. Questo corrisponde al passaggio 0.
- Il giorno seguente, sostituire il mezzo con 5 ml di terreno di amplificazione fresco e monitorare quotidianamente le cellule per l'attaccamento, la morfologia (le cellule dovrebbero avere un aspetto coeso di ciottoli) e il numero.
NOTA: La densità iniziale di semina varia a seconda della qualità della spazzolatura nasale e della proporzione di cellule epiteliali. Le cellule HNE appena isolate di solito raggiungono l'80% -90% di confluenza entro 3-10 giorni. Un tasso di crescita più lento è indicativo di cellule epiteliali insufficienti nel campione e deve essere scartato.
4. Amplificazione e passaggio di cellule epiteliali nasali umane
- Coltivare cellule epiteliali nasali umane nel mezzo di amplificazione a 37 °C e 5% di CO2 su palloni rivestiti di collagene fino all'80%-90% di confluenza, cambiando mezzo ogni 48-72 ore. Per i palloni da25 cm 2 , utilizzare 5 mL di terreno di amplificazione e 10 mL per 75 cm2 palloni.
- Quando le cellule raggiungono l'80% -90% di confluenza, lavare le cellule con 10 ml di DPBS privo di Mg 2+ e Ca2+, aspirare e scartare.
- Aggiungere 1 mL di tripsina allo 0,25% per un matraccio da25 cm 2 (o 2 ml di tripsina per un matraccio da 75 cm2 ) e riportare all'incubatrice (37 °C, 5% CO2) per 8-12 min.
- Picchiettare saldamente il pallone, con il palmo della mano, per aiutare le cellule a staccarsi.
- Aggiungere 10 ml del mezzo di amplificazione per fermare la reazione enzimatica. Risciacquare energicamente il matraccio, utilizzando la pipetta da 10 ml per aspirare ed espellere il mezzo di amplificazione sulla superficie del pallone per risciacquare e staccare le cellule.
- Centrifugare a 500 x g per 5 minuti a 4 °C ed eliminare il surnatante.
- Risospendare il pellet in 5-10 ml del mezzo di amplificazione.
- Contare le cellule usando un emocitometro.
NOTA: le celle possono essere congelate a questo punto (vedere i passaggi 5.1-5.3). Se è necessaria un'ulteriore amplificazione, riseminare su palloni rivestiti di collagene (un pallone da25 cm 2 può essere espanso in tre palloni da 75 cm2 , non è raccomandata una maggiore diluizione).
5. Crioconservazione delle cellule epiteliali nasali primarie
NOTA: Far crescere le cellule HNE fino al passaggio 1 prima del biobanking per ottenere abbastanza cellule per facilitare la crescita cellulare quando scongelate. Il biobanking è, tuttavia, possibile al passaggio iniziale 0 o al passaggio 2. Le seguenti fasi di crioconservazione sono adattate a tutti i passaggi.
- Dopo il conteggio delle cellule, centrifugare a 500 x g per 5 minuti a 4 °C ed eliminare il surnatante
- Risospesere il pellet nel mezzo di congelamento arricchito (Tabella 1) per ottenere 3 x 106-5 x 106 celle per mL e per crioviale.
- Congelare lentamente le cellule riducendo la temperatura a ~ 1 °C al minuto in un contenitore di criogelaggio appropriato a -80 °C. Il giorno successivo, spostare il campione conservato in un contenitore di stoccaggio dell'azoto per la conservazione a lungo termine (il presente studio è limitato a 17 mesi di conservazione).
6. Scongelamento delle cellule HNE amplificate congelate
- Riscaldare il bagno d'acqua a 37 °C. Preparare il mezzo di amplificazione come descritto nella Tabella 1 e riscaldare il mezzo a 37 °C.
- Rimuovere i crioviali dal serbatoio di stoccaggio dell'azoto e posizionarli rapidamente a bagnomaria, facendo attenzione a non immergere l'intera fiala nell'acqua. Rimuovere i crioviali dal bagno d'acqua quando rimane solo una piccola goccia congelata. Pulire il flaconcino con alcool al 70%, asciugare e posizionarlo sotto il cofano.
- Utilizzando una pipetta da 1 mL, trasferire le celle scongelate in un tubo vuoto da 15 ml.
- In modo a goccia, aggiungere 1 mL di terreno di amplificazione caldo. Dopo 1 min, aggiungere un altro 1 mL di mezzo di amplificazione e attendere un minuto aggiuntivo.
- Aggiungere 10 ml del mezzo di amplificazione e centrifugare per 2 minuti a 500 x g.
- Aspirare e scartare il surnatante. Risospesso il pellet di cella in un volume di mezzo di amplificazione necessario per raggiungere una densità cellulare di almeno 1 x 106 celle/ml.
- Seminare le cellule su un pallone rivestito di collagene contenente il mezzo di amplificazione.
- Se la crioviale contiene più di 4 x 106 cellule, seminare su un matraccio di 75 cm2 , in 10 ml del mezzo di amplificazione
- Se crioviale contiene meno di 4 x 106 cellule, cellule di semi su un matraccio di 25 cm2 , in 5 ml del mezzo di amplificazione
- Incubare a 37 °C, 5% CO2 , e osservare visivamente l'espansione cellulare nei prossimi 2-3 giorni.
- Quindi, eseguire l'amplificazione cellulare come descritto nella sezione 4.
NOTA: se sono state raccolte poche cellule nel passaggio 4.7. (cioè, se si congela al passaggio 0 prima dell'espansione), passaggi 6.5. e 6.6. può essere omessa e le cellule possono essere seminate direttamente su un pallone rivestito di collagenedi 25 cm 2 senza centrifugazione. Il mezzo deve quindi essere cambiato il giorno seguente per rimuovere il dimetilsolfossido (DMSO).
7. Differenziazione delle cellule epiteliali nasali umane all'interfaccia aria-liquido
NOTA: gli HNE sono stati differenziati all'interfaccia aria-liquido come precedentemente descritto10.
- Seminare le cellule ad una densità di 330.000 cellule/filtro su 0,33 cm2 filtri porosi rivestiti di collagene e integrare con 300 μL del mezzo di amplificazione sul lato apicale e 900 μL del mezzo aria-liquido sul lato basolaterale.
- Dopo 3 giorni, aspirare il mezzo apicale e coltivare le cellule all'interfaccia aria-liquido per 3-4 settimane nel mezzo aria-liquido per stabilire un epitelio differenziato. Cambiare il mezzo basale ogni 48-72 ore.
8. Modulatori CFTR
- Preparare un mezzo aria-liquido contenente modulatori CFTR. Utilizzare VX-445, VX-661 e VX-809 a una concentrazione finale di 3 μM e VX-770 a 100 nM. Utilizzare il correttore ABBV-2222 alla concentrazione finale di 1 μM e il potenziatore ABBV-974 a 10 μM. Utilizzare il DMSO al 100% per sciogliere tutti i modulatori CFTR.
- Preparare un mezzo aria-liquido contenente la stessa quantità di DMSO al 100% del mezzo correttore.
- Aggiungere il mezzo contenente farmaci o DMSO sul lato basolaterale delle cellule HNE polarizzate coltivate a un'interfaccia aria-liquido e incubare per 24 ore nel 5% di CO2 a 37 °C.
- Dopo 24 ore, aspirare e scartare il mezzo e sostituirlo con un mezzo fresco preparato come nei passaggi 8.1-8.2., e incubare ulteriormente per un periodo di 24 ore in 5% CO2 a 37 °C.
9. Studi della camera di Ussing
- Misurare le misure di corrente di cortocircuito (Isc) in condizioni di tensione-morsetto come descritto in precedenza9.
NOTA: La resistenza elettrica transepiteliale (TEER) delle colture è stata misurata con un voltmetro a bacchetta e solo le colture che raggiungevano almeno 200 Ω·cm2 sono state prese in considerazione per i seguenti esperimenti. I filtri delle celle HNE polarizzate sono stati montati in camere Ussing e le misurazioni della corrente di cortocircuito (Isc) sono state misurate in condizioni di tensione-morsetto.
10. Immunocitochimica
- Eseguire l'immuno-rilevamento come descritto in precedenza9.
NOTA: l'immuno-rilevazione CFTR è stata eseguita utilizzando l'anticorpo monoclonale anti-CFTR C-terminale (24-1) durante la notte a una diluizione di 1/100. La colorazione zona-occludens-1 (ZO-1) (diluizione 1/500), alfa-tubulina (diluizione 1/300), Muc 5AC (diluizione 1/250) e citocheratina 8 (diluizione 1/250) sono state eseguite su filtri aggiuntivi. Dopo il lavaggio con PBS-Triton-X100 0,1%, gli anticorpi secondari di capra coniugati ad Alexa 488 o 594 sono stati aggiunti per 30 minuti in siero di capra al 10% (diluizione 1/1000). Dopo un lavaggio finale, i filtri sono stati tagliati dal supporto e montati con il mezzo di montaggio Vectashield contenente DAPI. Un microscopio confocale (63x/1.4 oil differential interference contrast λ blue PL APO objective) è stato utilizzato per catturare immagini, che sono state analizzate con il software ImageJ.
11. Analisi statistica
- Eseguire analisi statistiche utilizzando software appropriato.
NOTA: L'analisi statistica è stata eseguita utilizzando il software S.A.S. Poiché sono stati ottenuti diversi filtri HNE per paziente e per condizione, i parametri quantitativi sono stati espressi come valori mediani (± SEM) per paziente. I confronti (media ± SD) sono stati effettuati utilizzando il test di rango firmato a coppie abbinate a Wilcoxon o il t-test non accoppiato.
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Representative Results
Le cellule HNE fresche coltivate all'interfaccia aria-liquido mostrano le caratteristiche tipiche dell'epitelio respiratorio polarizzato e differenziato valutate mediante immunocolorazione (Figura 1). Le cellule HNE si ri-differenziano in uno strato eterogeneo di cellule epiteliali (immunocolorazione positiva cheratina 8) che imitano la situazione in vivo di un epitelio respiratorio pseudo-stratificato composto da cellule caliciate (colorazione alfa-tubulina positiva) e cellule caliciate produttrici di muco non ciliate (immunocolorazione Muc5Ac positiva). L'epitelio complessivo presenta giunzioni strette (valutate mediante colorazione ZO-1, zona-occludens-1). Una forte colorazione APICAL CFTR è visibile nelle cellule HNE wild-type (WT) e una diminuzione della colorazione CFTR sia sulla superficie apicale che nel citoplasma è osservata in F508del/F508del HNE.
Abbiamo considerato i risultati positivi come campioni non solo espandendosi con successo, ma anche differenziandosi con successo in un epitelio pseudo-stratificato dopo 3 settimane all'interfaccia aria-liquido e presentando un TEER superiore a 200 Ω·cm2, consentendo misurazioni di corrente di cortocircuito. Poiché solo pochi laboratori dedicati eseguono saggi di secrezione di Cl correlati al CFTR mediante misurazioni di corrente di cortocircuito, i campioni spesso richiedono il trasporto dagli ospedali alle strutture dedicate.
Nei 78 campioni di cellule HNE fresche, i tassi di successo sono stati confrontati in spazzolature nasali seminate immediatamente e in spazzolature seminate dopo 1-7 giorni di trasporto in mezzo di lavaggio a temperatura ambiente. La maggior parte dei campioni (55%) sono stati seminati 1 giorno dopo la spazzolatura e l'82% dei campioni è stato seminato entro 48 ore. La percentuale media di colture di successo in tutti i 78 campioni è stata dell'82% e ha raggiunto l'87% nei campioni seminati tra il giorno 0 e il giorno 5 (Tabella 2).
Sono stati confrontati i tassi di successo e di fallimento per campioni identici differenziati sia in condizioni fresche che congelate. L'83% dei campioni che si sono differenziati con successo in condizioni fresche hanno avuto successo anche in campioni crioconservati. Allo stesso modo, nei campioni che non sono riusciti a differenziarsi in condizioni fresche, il 71% non ha avuto successo anche in condizioni di congelamento-scongelamento (Tabella 2). Tutti questi dati suggeriscono che la qualità della spazzolatura nasale è il fattore chiave per una cultura di successo.
Volevamo anche determinare il numero ottimale di cellule per crioviale. I campioni congelati al passaggio 0, da un singolo 25 cm2 generalmente consentono di raggiungere solo 1-1,5 x 106 celle per pallone. I campioni congelati al passaggio 1 e amplificati a tre palloni da 75 cm2 generalmente permettevano di raggiungere 10 x 106 celle, permettendo così di congelare diverse fiale contenenti almeno 3 x 106 cellule. Nelle condizioni di coltura descritte in questo protocollo, il 50% dei campioni congelati tra 2 x 106 e 3 x 106 cellule per crioviale non è riuscito a crescere quando scongelato, raggiungendo l'80% quando inferiore a 2 x 106 cellule per crioviale (Tabella 2).
La secrezione di Cl correlata al CFTR riflette la funzione CFTR e può essere misurata mediante esperimenti di corrente di cortocircuito (Isc) nelle camere di Ussing. La variazione Isc in risposta a Forskolin (ΔIscForskolin) e all'inibitore CFTR inh172 (ΔIscCFTRinh172) sono i principali endpoint per la valutazione dell'efficacia del correttore CFTR.
Esperimenti di corrente di cortocircuito sono stati eseguiti su HNE fresco, espanso in mezzo di amplificazione e seminato su filtri al passaggio 2 e coltivato all'interfaccia aria-liquido per 3 settimane in mezzo aria-liquido, o da HNE che era stato precedentemente congelato al passaggio 1 in mezzo di congelamento arricchito, scongelato, espanso e seminato su filtri porosi al passaggio 3. I tempi di crioconservazione variavano da 3 mesi a 16 mesi, con una media di 9,8 mesi. Nelle condizioni di coltura e crioconservazione descritte in questo studio, non sono stati osservati cambiamenti significativi nella crescita o nella morfologia tra diversi passaggi o colture HNE F508del/F508del fresche o congelate-scongelate.
Sia per la ΔIscForskolin media (Figura 2A) che per la media ΔIscCFTRinh172 (Figura 2B) nelle cellule HNE trattate con DMSO, non è stata osservata alcuna differenza significativa tra HNE fresco o congelato-scongelato. Per valutare se la correzione funzionale del CFTR è stata influenzata dalla crioconservazione, le variazioni medie dell'Isc sono state misurate nelle cellule trattate con VX-809 + VX-770 rispetto alle cellule HNE trattate con DMSO in cellule HNE fresche (cellule HNE derivate da n = 78 pazienti) o HNE scongelate congelate (cellule HNE derivate da n = 9 pazienti) (Figura 2). Sia le cellule congelate-scongelate che quelle fresche hanno mostrato una correzione significativa al momento del trattamento, con un aumento significativo di ΔIscForskolin (p < 0,05) (Figura 2A) e una significativa diminuzione del ΔIscCFTRinh172 (p < 0,05) (Figura 2B). L'aumento medio di piega per ΔIscForskolin (ΔIscForskolin VX-809 + VX-770/ΔIscForskolin DMSO) ha raggiunto 2,9 ± 1,6 nelle cellule HNE congelate-scongelate e non è stato significativamente diverso dall'aumento di piega nelle cellule HNE fresche (2,5 ± 2,0). Allo stesso modo, la diminuzione di piega in ΔIscCFTRinh172 (ΔIscCFTRinh172 VX-809 + VX-770 / ΔIscCFTRinh172 DMSO) non è stata significativamente influenzata dalla crioconservazione: 1,49 ± 0,9 nell'HNE congelato-scongelato rispetto a 2,5 ± 3,7 nell'HNE fresco.
L'attività di correzione funzionale di diverse terapie modulatrici è stata ulteriormente studiata per valutare se questo modello cellulare HNE potesse discriminare tra diversi trattamenti. I risultati qui combinano cellule HNE provenienti da condizioni sia fresche che congelate-scongelate poiché la risposta al trattamento non è stata significativamente alterata dalla crioconservazione (Figura 2).
Abbiamo prima valutato la risposta correttore di due terapie modulatrici CFTR approvate sul trasporto di Cl- dopo un trattamento di 48 ore con VX-809 (3 μM) + VX-770 (100 nM) o VX-661 (3 μM) + VX-770 (100 nM) in cellule HNE da 10 pazienti F508del/F508del (Figura 3). Rispetto alle cellule HNE trattate con DMSO, ΔIscForskolin (Figura 3A) e ΔIscCFTRinh172 (Figura 3B) sono stati significativamente migliorati sia da VX-809 + VX-770 che da VX-661 + VX-770. Entrambi i trattamenti hanno corretto funzionalmente la secrezione di Cl-correlata al CFTR a un livello simile, con un significativo aumento medio di ΔIscForskolin di 1,75 ± 1,39 per VX-809 + VX-770 (p < 0,001) e 0,97 ± 0,93 per VX-661 + VX-770 (p < 0,01). La diminuzione media di ΔIscCFTRinh172 è stata di 1,79 ± 2,04 per VX-809 + VX-770 (p < 0,001) e non è stata significativamente diversa dalla diminuzione media di ΔIscCFTRinh172 di 1,16 ± 1,44 per VX-661 + VX-770 (p < 0,001 vs DMSO).
Tre diverse terapie modulatrici CFTR in HNE da sei pazienti F508del/F508del (Figura 4) sono state ulteriormente confrontate. I risultati qui combinano cellule HNE provenienti da condizioni fresche e congelate-scongelate. Entrambi i modulatori Vertex e Abbvie CFTR, quando usati come combinazione di un correttore CFTR e di un potenziatore CFTR, hanno corretto ΔIscForskolin (Figura 4A) e ΔIscCFTRinh172 (Figura 4B) in misura simile. La correzione parziale osservata in Figura 3 da VX-809 + VX-770 è stata confermata in queste cellule HNE con un aumento medio della piega di ΔIscForskolin di 2,87 ± 1,67 (p < 0,05). Il trattamento ABBV-2222 (1 μM) + ABBV-974 (10 μM) ha indotto una correzione simile che rappresenta il 91% della correzione VX-809 + VX-770 per ΔIscForskolin (aumento medio della piega ΔIscForskolin di 2,6 ± 1,4, p < 0,05 vs DMSO) e l'85% di VX-809 + VX-770 per ΔIscCFTRinh172 (diminuzione media di ΔIscCFTRinh172 di 4,2 ± 5,7, p < 0,05 vs DMSO).
È interessante notare che, quando hNE sono stati trattati con la tripla combinazione VX-445 (3 μM) + VX-661 (3 μM) + VX-770 (100 nM), l'efficacia della correzione è migliorata significativamente, raggiungendo il 312% della correzione VX-809 + VX-770 ΔIscForskolin (aumento medio della piega ΔIscForskolin di 9,0 ± 4,1, p < 0,05 vs VX-809 + VX-770) e il 372% di ΔIscCFTRinh172 (diminuzione media della piega ΔIscCFTRinh172 di 15,5 ± 10,5, p < 0,05 vs VX-809 + VX-770).
Figura 1: Marcatori di differenziazione nelle colture HNE. Immagini rappresentative al microscopio confocale di colorazione immuno-fluorescente di CFTR (verde), Zona-Occludens-1 (ZO-1, rosso), alfa-tubulina (verde), Muc5AC (rosso) e citocheratina 8 (K8, verde) in wild-type (WT) (primo pannello) e F508del (pannelli 2 -4) cellule HNE coltivate all'interfaccia aria-liquido per 3 settimane. I nuclei sono stati colorati di blu con DAPI. Proiezioni di immagini al microscopio confocale, vista dall'alto (pannelli superiori) e vista laterale (pannelli inferiori) di ricostituzioni tridimensionali (3D) Z stacks. La barra della scala (20 μm) si applica sia ai pannelli superiore che a quelli inferiori. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Effetto del congelamento-scongelamento sulla secrezione di Cl-correlata al CFTR nelle cellule HNE. Riassunto delle registrazioni di corrente di cortocircuito (Isc) (± SD media) in colture HNE derivate da pazienti F508del/F508del e coltivate all'interfaccia aria-liquido per 3 settimane. Le cellule sono state trattate per 48 ore con il solo veicolo (DMSO) o VX-809 (3 μM) + VX-770 (100 nM) in cellule HNE fresche (grigio chiaro, derivate dal paziente da 78 pazienti) o congelate-scongelate (grigio scuro, cellule HNE derivate dal paziente da 9 pazienti). I dati rappresentano la risposta media (± SD) a Forskolin (10 μM)/3-isobutil-1-metilxantina (IBMX, 100 μM) con aggiunta acuta (A)Forskolin o (B) inibitore CFTR inh172 (5 μM) ΔIscCFTRinh172. Sono stati analizzati almeno due filtri per paziente e per condizione. Gli asterischi indicano la differenza statistica tra correttori e controllo (dmso-trattato) * p < 0,05 (t-test non accoppiato). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Correzione della funzione CFTR mediante terapie duali. Riassunto delle registrazioni di corrente di cortocircuito (Isc) (± SD media) in colture HNE derivate da 10 pazienti F508del/F508del e coltivate all'interfaccia aria-liquido per 3 settimane (risultati combinati da colture fresche e congelate-scongelate). Le cellule sono state trattate per 48 ore con il solo veicolo (DMSO); VX-809 (3 μM) + VX-770 (100 nM) o VX-661 (3μM) + VX-770 (100 nM). I dati rappresentano la risposta media (± SD) all'aggiunta acuta (A) di Forskolin (10 μM)/IBMX (100 μM), di ΔIscForskolin o (B) di un inibitore CFTR inh172 (5 μM), di ΔIscCFTRinh172. Sono stati analizzati almeno due filtri per paziente e per condizione. Gli asterischi indicano una differenza statistica tra correttori e controllo (trattati con DMSO) ** p < 0,01, *** p < 0,001, **** p < 0,0001 (Wilcoxon matched pairs signed rank test). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Efficienza della tripla terapia rispetto alle terapie duali sulla correzione CFTR. Riassunto delle registrazioni di corrente di cortocircuito (Isc) (± SD media) in colture HNE derivate da 6 pazienti F508del/F508del e coltivate all'interfaccia aria-liquido per 3 settimane (risultati combinati da cellule fresche e congelate-scongelate). Le cellule sono state trattate per 48 ore con il solo veicolo (DMSO); VX-809 (3 μM) + VX-770 (100 nM); ABBV-2222 (1 μM) + ABBV-974 (10 μM); o VX-661 (3 μM) + VX-445 (3 μM) + VX-770 (100 nM). I dati rappresentano la risposta media (± SD) all'aggiunta acuta di (A) Forskolin (10 μM)/IBMX (100 μM), ΔIscForskolin o (B) inibitore CFTR inh172 (5 μM), ΔIscCFTRinh172. Sono stati analizzati almeno due filtri per paziente e per condizione. Gli asterischi indicano una differenza statistica tra i trattamenti. * p < 0,05 (Wilcoxon ha abbinato coppie firmate test di rango). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| Componente multimediale | Concentrazione finale |
| MEZZO DI AMPLIFICAZIONE | |
| Miscela avanzata di nutrienti DMEM/F-12 | 86% |
| Siero bovino fetale | 10% |
| Penicillina | 100 U/mL |
| Streptomicina | 100 μg/ml |
| Tazocillina | 10 μg/mL |
| Amfotericina B | 2,5 μg/mL |
| Colimicina | 16 μg/mL |
| Ciprofloxacina | 3 μg/mL |
| Idrocortisone | 0,2 μM |
| Insulina | 5 μg/mL |
| Epinefrina | 0,5 μg/mL |
| FEG | 10 ng/ml |
| Y-27632 (inibitore della chinasi rho-associata) | 10 μM |
| MEZZO ARIA-LIQUIDO | |
| Miscela avanzata di nutrienti DMEM/F-12 | 94% |
| Ultroserg | 2% |
| Penicillina | 100 U/mL |
| Streptomicina | 100 μg/ml |
| Tazocillina | 10 μg/mL |
| Amfotericina B | 2,5 μg/mL |
| Colimicina | 16 μg/mL |
| MEZZO DI CONGELAMENTO ARRICCHITO | |
| F12 Miscela di nutrienti | 77% |
| HEPES · | 3% |
| Siero bovino fetale | 10% |
| DMSO | 10% |
Tabella 1: Amplificazione, aria-liquido e composizione del mezzo di congelamento arricchito. Elenco dei reagenti e delle corrispondenti concentrazioni finali.
| Durata della conservazione della spazzolatura nasale prima della semina (n = 78) | |
| Giorni prima della semina | Tassi di successo (%) |
| 0 | 83 |
| 1 | 84 |
| 2 | 67 |
| 3 | 100 |
| 4 | 89 |
| 5 | 100 |
| 7 | 0 |
| Risultati della stessa spazzolatura nasale iniziale coltivata sia in condizioni fresche che congelate-scongelate (n = 13) | |
| Risultato in condizioni nuove | Tassi di successo dopo il congelamento-scongelamento (%) |
| successo | 83 |
| fallimento | 29 |
| Impatto del numero di celle sulle percentuali di successo (n = 36) | |
| Numero di cellule per crioviale | Tassi di successo dopo il congelamento-scongelamento (%) |
| <2 x 106 | 20 |
| 2–3 x 106 | 50 |
| 3–4 x 106 | 67 |
| >4 x 106 | 79 |
Tabella 2: Parametri che influenzano i tassi di successo nelle colture cellulari HNE fresche e congelate-scongelate. Le percentuali di successo sono state definite come spazzolature nasali che si sono espanse e differenziate con successo in un epitelio pseudo-stratificato dopo 3 settimane all'interfaccia aria-liquido e hanno presentato un TEER superiore a 200 Ω·cm2. Prima della semina, i campioni venivano spediti a temperatura ambiente in mezzo di lavaggio con antibiotici. I risultati rappresentano i dati di 78 campioni freschi e 36 campioni congelati-scongelati. 13 spazzolature nasali sono state analizzate sia in condizioni fresche che congelate-scongelate.
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Discussion
L'uso di cellule epiteliali nasali derivate dal paziente come surrogati di cellule epiteliali bronchiali umane (HBE) per misurare l'attività CFTR nel contesto della medicina personalizzata è stato proposto come HNE riprodurre le proprietà delle cellule in coltura 9,11. Il forte vantaggio dell'HNE rispetto alle colture cellulari HBE è che vengono campionate facilmente e in modo non invasivo. Le misurazioni della corrente di cortocircuito nelle colture cellulari HNE consentono di valutare il trasporto di Cl- CFTR-dipendente attraverso l'epitelio, che ha dimostrato di essere significativamente correlato all'attività in vivo di CFTR valutata dalla differenza di potenziale nasale in pazienti con vari genotipi9. Il salvataggio dell'attività della CFTR nelle cellule HNE dopo il trattamento con VX-809 è anche significativamente correlato al miglioramento dell'esito clinico FEV1 nei pazienti omozigoti F508del trattati con lumacaftor-ivacaftor12.
È importante sottolineare che questo studio dimostra che le cellule HNE appena raccolte tollerano facilmente le condizioni di trasporto e di spedizione standard (cioè sopravvivono 72 ore a temperatura ambiente) che consente il test delle cellule del paziente provenienti da varie posizioni geografiche. I fattori critici per una coltura di successo sono principalmente la qualità della spazzolatura nasale e il numero di cellule viventi al momento del campionamento. Sono stati pubblicati numerosi protocolli sulla crescita e la differenziazione delle colture cellulari HNE; alcuni senza riprogrammazione condizionale durante la fase di espansione 13,14,15,16,17,18,19,20, alcuni con riprogrammazione condizionale in feeder 9,11,12,21,22,23,24,25 ,26 o senza alimentatore 5,8,27,28,29 condizioni, e diversi che confrontano diversi metodi 7,8. Tutti consentono di ottenere un numero relativamente elevato di colture ALI con corretta differenziazione e polarizzazione e buoni valori TEER. Simile a questo studio, molti hanno utilizzato cellule HNE crioconservate congelate al passaggio 113,28. È interessante notare che diversi autori riferiscono che ROCKi può migliorare la sopravvivenza dopo la crioconservazione quando aggiunto al terreno di coltura post-disgelo e aumentare il numero di cellule che rimangono attaccate 5,29, suggerendo che il mezzo di amplificazione utilizzato in questo studio è particolarmente appropriato per la crioconservazione.
Qui, lo studio mostra che le cellule HNE possono essere biobanked con successo, il fattore critico è ancora una volta la qualità della spazzolatura nasale. Viene mostrata una buona correlazione tra l'esito dei campioni freschi e quelli congelati-scongelati, suggerendo che al fine di ottimizzare la qualità delle cellule HNE che saranno biobanked per ulteriori studi, uno studio preliminare potrebbe essere eseguito su campioni freschi se non riescono a raggiungere la corretta differenziazione ALI e il valore TEER accettabile; una seconda spazzolatura nasale sarebbe preferibile piuttosto che congelare le cellule che hanno un'alta probabilità di scarso esito. Un secondo fattore critico per la crioconservazione è il numero di cellule; nelle condizioni di coltura utilizzate in questo studio, quando meno di 2 x 106 cellule sono congelate per crioviale, il tasso di fallimento è molto alto. Si raccomanda di congelare almeno 3 x 106 cellule per crioviale.
I risultati di questo studio suggeriscono che lo scongelamento del congelamento non modifica significativamente le proprietà elettrofisiologiche delle cellule HNE o la risposta ai modulatori CFTR. La gamma di misure in colture cellulari HNE dello stesso paziente omozigote F508del ottenute senza congelamento o dopo scongelamento non era diversa con il trattamento con VX-809 + VX-770. Risultati simili sono stati precedentemente riportati per le cellule HBE in cui l'Isc stimolato da Forskolin era stabile dopo diversi cicli di disgelo / coltura di cellule F508del non trattate30. Ciò fornisce la prova che le cellule HNE possono essere congelate e conservate in una biobanca e studiate in seguito.
Un numero crescente di studi dimostra che le colture cellulari HNE possono essere utilizzate per testare l'efficacia di diverse terapie nel contesto della medicina personalizzata. L'analisi ha mostrato che le terapie duali che combinano un correttore con un potenziatore hanno tutte un'efficacia di correzione comparabile per la secrezione di Cl-CFTR-dipendente nelle cellule HNE F508del-omozigoti. Tuttavia, è stata notata un'importante variabilità interpaziente, confermando i risultati pubblicati 9,12,20,25. Al contrario, VX-445 + VX-661 + VX-770 hanno triplicato la correzione dell'attività CFTR rispetto a VX-809 + VX-770. Un livello simile di correzione di F508del-CFTR nelle cellule HNE su tripla combinazione è stato osservato anche da Laselva et al.28. Come riportato da Veit et al.26, la correzione della funzione del canale Cl- sul trattamento VX-445 + VX-661 + VX-770 è stata ancora più elevata, raggiungendo il 62% dell'attività media WT-CFTR (intervallo di 19-36 μA / cm2 in F508del-HNE corretto e 14-50 μA / cm2 in WT-HNE) 26.
Le colture cellulari HNE sono servite anche a testare l'efficacia dei modulatori CFTR per altre mutazioni di classe II. Un importante miglioramento dell'attività CFTR su VX-445 + VX-661 + VX-770 è stato osservato in colture HNE ALI che ospitano genotipi G85E/G85E, V520F/1717-1G>A, Y569/Y569D, M1101K/M1101K e N1303K/N1303K26. Allo stesso modo, Laselva et al.28 hanno mostrato una correzione significativa del CFTR con mutazioni M1101K e N1303K, ma nessuna correzione significativa nelle cellule HNE G85E. I correttori Galapagos/AbbVie sono stati valutati per questi mutanti resistenti a lumacaftor-ivacaftor31. Il correttore AbbVie AC2-1 e in particolare il correttore bi-correttore AC1+AC2-1 hanno migliorato efficacemente la secrezione di Cl- nelle cellule HNE M1101K e G85E, mentre le cellule derivate da N1303K sono state corrette da una combinazione di AC1+AC2-2.
Le misure dell'attività cftr nelle cellule HNE sono promettenti biomarcatori pre-clinici predittivi per la risposta del paziente al trattamento testato. La prova che i cicli di congelamento-scongelamento non alterano il livello di correzione fornisce la prova che queste cellule possono essere biobancate e utilizzate come un potente strumento nel contesto di programmi di medicina personalizzata. Una spazzolatura nasale unica potrebbe quindi consentire materiale sufficiente per confrontare l'efficacia dei farmaci e le cellule HNE del paziente potrebbero essere scongelate man mano che nuovi farmaci diventano disponibili senza necessità di ricampionare i pazienti; questo è particolarmente interessante nei neonati.
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Disclosures
Gli autori non riportano interessi finanziari concorrenti relativi a questa pubblicazione o produzione di video scientifici.
Acknowledgments
Ringraziamo calorosamente tutti i pazienti e le loro famiglie per la partecipazione allo studio. Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni dell'Associazione francese Vaincre la Mucoviscidose; Associazione francese ABCF 2 e Vertex Pharmaceuticals Innovation Awards.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ABBV-2222 | Selleckchem | S8535 | |
| ABBV-974 | Selleckchem | S8698 | |
| Advanced DMEM/F-12 | Life Technologies | 12634010 | |
| Alexa 488 goat secondary antibody | Invitrogen | A11001 | |
| Alexa 594 goat secondary antibody | Invitrogen | A11012 | |
| Amphotericin B | Life Technologies | 15290026 | |
| Anti-alpha-tubulin antibody | Abcam | ab80779 | |
| Anti-CFTR monoclonal antibody (24-1) | R&D Systems | MAB25031 | |
| Anti-cytokeratin 8 antibody | Progen | 61038 | |
| Anti-Muc5AC antibody | Santa Cruz Biotech | sc-20118 | |
| Anti-ZO-1 antibody | Santa Cruz Biotech | sc-10804 | |
| Ciprofloxacin | provided by Necker Hospital Pharmacy | ||
| Colimycin | Sanofi | provided by Necker Hospital Pharmacy | |
| Collagen type IV | Sigma-Aldrich Merck | C-7521 | |
| cytology brush | Laboratory GYNEAS | 02.104 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich Merck | D2650 | |
| EGF | Life Technologies | PHG0311 | |
| Epinephrin | Sigma-Aldrich Merck | E4375 | |
| F12-Nutrient Mixture | Life Technologies | 11765054 | |
| FBS | Life Technologies | 10270106 | |
| Ferticult | Fertipro NV | FLUSH020 | |
| Flasks 25 | Thermo Scientific | 156.367 | |
| Flasks 75 | Thermo Scientific | 156.499 | |
| Glacial acetic acid | VWR | 20104.298 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich Merck | H3375 | |
| Hydrocortisone | Sigma-Aldrich Merck | SLCJ0893 | |
| Insulin | Sigma-Aldrich Merck | I0516 | |
| Mg2+ and Ca2+-free DPBS | Life Technologies | 14190094 | |
| Penicillin/Streptomycin | Life Technologies | 15140130 | |
| Tazocillin | Mylan | provided by Necker Hospital Pharmacy | |
| Transwell Filters | Sigma-Aldrich Merck | CLS3470-48EA | |
| Triton-X100 | Sigma-Aldrich Merck | T8787 | |
| Trypsin 0,25% | Life Technologies | 25200056 | |
| Vectashield mounting medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | |
| VX-445 | Selleckchem | S8851 | |
| VX-661 | Selleckchem | S7059 | |
| VX-770 | Selleckchem | S1144 | |
| VX-809 | Selleckchem | S1565 | |
| Xylocaine naphazoline 5% | Aspen France | provided by Necker Hospital Pharmacy | |
| Y-27632 | Selleckchem | S1049 |
References
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