Summary
Gestimuleerde Raman-verstrooiing (SRS) microscopie maakt labelvrije beeldvorming van biomoleculen mogelijk op basis van hun intrinsieke vibratie van specifieke chemische bindingen. In dit protocol wordt de instrumentele opstelling van een geïntegreerde SRS- en twee-fotonenfluorescentiemicroscoop beschreven om cellulaire structuren in het ruggenmerg van levende muizen te visualiseren.
Abstract
Gestimuleerde Raman-verstrooiingsmicroscopie (SRS) maakt labelvrije beeldvorming van de biologische weefsels in zijn natuurlijke micro-omgeving mogelijk op basis van intrinsieke moleculaire trillingen, waardoor een perfect hulpmiddel wordt geboden voor in vivo studie van biologische processen met subcellulaire resolutie. Door twee-foton geëxciteerde fluorescentie (TPEF) beeldvorming in de SRS-microscoop te integreren, kan de dual-modale in vivo beeldvorming van weefsels kritische biochemische en biofysische informatie vanuit meerdere perspectieven verkrijgen die helpt bij het begrijpen van de dynamische processen die betrokken zijn bij cellulair metabolisme, immuunrespons en weefselremodellering, enz. In dit videoprotocol wordt de opstelling van een TPEF-SRS microscoopsysteem en de in vivo beeldvormingsmethode van het dierlijke ruggenmerg geïntroduceerd. Het ruggenmerg, als onderdeel van het centrale zenuwstelsel, speelt een cruciale rol in de communicatie tussen de hersenen en het perifere zenuwstelsel. Myelineschede, overvloedig aanwezig in fosfolipiden, omringt en isoleert het axon om zoute geleiding van actiepotentialen mogelijk te maken. In vivo beeldvorming van myelinescheden in het ruggenmerg is belangrijk om de progressie van neurodegeneratieve ziekten en dwarslaesie te bestuderen. Het protocol beschrijft ook dierbereiding en in vivo TPEF-SRS-beeldvormingsmethoden om biologische beelden met hoge resolutie te verkrijgen.
Introduction
Raman microscopie1,2 is in opkomst als een krachtige labelvrije methode om biologische weefsels in beeld te brengen op basis van de karakteristieke frequenties van verschillende chemische bindingen in biomoleculen. Vanwege het niet-invasieve en goed adaptieve beeldvormingsvermogen is Raman-microscopie op grote schaal gebruikt voor het afbeelden van lipide-verrijkte componenten in biologische weefsels zoals myelineschede3,4,5, adipocyten6,7 en lipidedruppels8,9,10 . Gestimuleerd Raman-verstrooiingssignaal (SRS) verkregen als gestimuleerde Raman-versterking (SRG) of gestimuleerd Raman-verlies (SRL) is achtergrondvrij en vertoont perfecte spectrale gelijkenis met spontane Raman-verstrooiing11,12. Bovendien zijn SRL en SRG lineair afhankelijk van de analytconcentratie, waardoor kwantitatieve analyse van biochemische componenten mogelijk is9,11,13. Twee-foton geëxciteerde fluorescentiemicroscopie (TPEF) is veel gebruikt voor in vivo biologische beeldvorming vanwege het inherente optische sectioningvermogen, de diepe penetratiediepte en de lage fototoxiciteit14,15,16. De prestaties van TPEF-beeldvorming zijn echter afhankelijk van de kenmerken van fluorescerende tags en het aantal oplosbare kleuren is beperkt vanwege de breedbandfluorescentiespectraspray8,17,18,19. Labelvrije SRS-beeldvorming en op fluorescentie gebaseerde TPEF-beeldvorming zijn twee complementaire beeldvormingsmodaliteiten en hun combinatie kan overvloedige biofysische en biochemische informatie van weefsels bieden. Deze twee beeldvormingsmodaliteiten zijn beide gebaseerd op de niet-lineaire optische (NLO) processen, die eenvoudige integratie in één microscoopsysteem mogelijk maken. De combinatie van de SRS- en TPEF-beeldvorming, de zogenaamde dual-modale beeldvorming, maakt hoogdimensionale beeldvorming en profilering van cellen en weefsels mogelijk, waardoor een uitgebreid begrip van complexe biologische systemen wordt vergemakkelijkt. In het bijzonder kan picoseconde (ps) SRS-microscopie chemische bindingsbeeldvorming bereiken met een hoge spectrale resolutie in vergelijking met femtoseconde (fs) SRS-techniek11, waardoor meerdere biochemische componenten in biologisch weefsel kunnen worden onderscheiden, vooral in het overvolle vingerafdrukgebied20,21. Bovendien, in vergelijking met een ander veelgebruikt dual-modaal NLO-microscoopsysteem met integratie van coherente anti-Stokes-verstrooiingsmicroscoop (CARS), vertoont SRS superieure prestaties ten opzichte van CARS in termen van spectrale en beeldinterpretatie en detectiegevoeligheid11. De SRS-TPEF microscoop is gebruikt als een krachtig hulpmiddel om verschillende biologische systemen te bestuderen, zoals Caenorhabditis elegans9,22, Xenopus laevis kikkervis hersenen5, muizenbrein23,24, ruggenmerg25,26, perifere zenuw27 en vetweefsel7, enz.
Het ruggenmerg vormt samen met de hersenen het centrale zenuwstelsel (CZS). Het visualiseren van cellulaire activiteiten in het CZS in vivo onder fysiologische en pathologische omstandigheden is van cruciaal belang voor het begrijpen van de mechanismen van CZS-aandoeningen28,29,30 en voor het ontwikkelen van overeenkomstige therapieën31,32,33. Myelineschede, die axonen omwikkelt en isoleert voor snelle actiepotentiaalgeleiding, speelt een belangrijke rol in de ontwikkeling van het CZS. Demyelinisatie wordt gezien als een kenmerk bij wittestofstoornissen, zoals multiple sclerose34. Bovendien kan myeline-puin na ruggenmergletsel35 de activering van macrofagen moduleren, wat bijdraagt aan chronische ontsteking en secundair letsel36. Daarom is in vivo beeldvorming van myelineschede samen met neuronen en gliacellen in levende muismodellen van grote hulp om de dynamische processen bij CZS-aandoeningen te begrijpen.
In dit protocol worden de fundamentele installatieprocedures van een zelfgebouwde TPEF-SRS-microscoop beschreven en worden de dual-modale in vivo beeldvormingsmethoden voor het ruggenmerg van muizen geïntroduceerd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dierprocedures die in dit werk worden uitgevoerd, worden uitgevoerd volgens de richtlijnen van de Laboratory Animal Facility van de Hong Kong University of Science and Technology (HKUST) en zijn goedgekeurd door de Animal Ethics Committee van HKUST. Veiligheidstraining voor laserbehandeling is vereist om de TPEF-SRS-microscoop in te stellen en te bedienen. Draag altijd een laserveiligheidsbril met het juiste golflengtebereik bij het omgaan met laser.
1. Opstelling van de TPEF-SRS microscoop (voor het schema voor de installatie zie figuur 1)
- Gebruik een geïntegreerde optische parametrische oscillator (OPO) verbonden met een modus-vergrendelde Ytterbium fiberlaser als de ps-laserbron voor SRS-beeldvorming.
OPMERKING: OPO levert een Stokes-bundel (1031 nm) en een pompbundel (afstembaar van 780 nm tot 960 nm) met een pulsduur van 2 pk en een herhalingsfrequentie van 80 MHz. De Stokes-bundel wordt gemoduleerd op 20 MHz door een ingebouwde elektro-optische modulator (EOM) voor hoogfrequente fasegevoelige SRS-detectie op MHz-niveau. - Gebruik een fs titanium (Ti): saffierlaser als laserbron voor TPEF-beeldvorming.
- Gebruik een paar lenzen (L1 en L2) om te collimeren en de grootte van de fs-bundel aan te passen aan 3 mm.
- Gebruik een paar lenzen (L3 en L4) om de ps-laserstraal te collimeren en de diameter uit te breiden tot 3 mm.
- Verander de polarisatie van de fs-laserstraal van p-polarisatie naar s-polarisatie met behulp van een halvegolfplaat.
- Combineer de twee laserstralen met een polariserende bundelsplitser (PBS).
- Voeg een paar 3 mm XY-scan galvanometerspiegels achter de PBS toe voor het scannen van de bundel.
- Gebruik een telecentrische scanlens (L5) en een oneindig gecorrigeerde buislens (L6) om de scanningspiegel en de achterste pupil van de 25x objectieflens te conjugeren. Breid de laserstraal uit met de scanlens en buislens om het achterste diafragma van het objectief te vullen.
- Plaats een PBS- of dichroïsche spiegel (D2) tussen de buislens en de objectieflens voor SRS- of fluorescentiesignaalverzameling. Gebruik een gemotoriseerde flipper om te schakelen tussen PBS en D2.
OPMERKING: Een deel van het terugverstrooide SRS-signaal gaat verloren wanneer het door de PBS gaat als gevolg van de willekeurig verschoven polarisatie. - Gebruik een paar lenzen (L7 en L9) om de detectiestraal te verkleinen en de achterste pupil van de 25x objectieflens te conjugeren met een fotodiodesensor.
- Gebruik een paar lenzen (L8 en L10) om de detectiebundel te verkleinen en de achterste pupil van het 25x objectief te conjugeren met het detectieoppervlak van de fotomultiplicator (PMT).
- Gebruik een dichroïsche spiegel (D3) om het detectiepad van fluorescentie- en SRS-signalen te scheiden.
- Plaats een filterset (Fs1) voor de fotodiodedetector om de Stokes-laser te blokkeren en alleen de pompstraal door te geven.
- Plaats een filterset (Fs2) voor de PMT-detector om alleen het doelfluorescentiesignaal door te geven.
- Sluit de PMT aan op een stroomversterker voor signaalversterking.
- Sluit de fotodiode aan op een lock-in versterker.
- Sluit het synchronisatiesignaal van de ingebouwde EOM-uitgang aan op de referentie-ingang van de lock-in versterker voor SRS-signaaldemodulatie.
- Sluit de PMT-versterker en lock-in versterkeruitgangen aan op de data-acquisitiemodule.
2. TPEF-SRS microscoop systeem kalibratie
- Opstarten van de lasers
- Schakel de toetsschakelaar van Stand-by naar Aan om de Ti: saffierlaser in te schakelen en wacht 30 minuten tot de laser is opgewarmd.
- Schakel de OPO in door op de startknop op het OPO-bedieningspaneel te klikken en wacht 20 minuten tot de laser is opgewarmd.
- Nadat de ps-laser is opgewarmd, gebruikt u een snelle fotodetector om de modulatiediepte van de Stokes-straal te controleren. Open de lasersluiter voor de Stokes-straal. Klik op het vak OPO Power instellen en voer 20 in. Plaats de high-speed fotodetector bij de OPO-uitgang om de straal te detecteren. Sluit de uitgangspoort van de fotodetector aan op de ingangspoort van een oscilloscoop met behulp van een coaxkabel met Bajonet Neill-Concelman (BNC) connector om de laserpuls te bewaken.
- Open het venster EOM-besturing in de OPO-besturingssoftware. Pas het EOM-vermogen en de fase aan volgens het pulsintensiteitsdiagram dat op de oscilloscoop wordt weergegeven om een maximale modulatiediepte bij 20 MHz te bereiken.
OPMERKING: De prestaties van EOM's zijn meestal stabiel en hoeven alleen te worden gecontroleerd wanneer het SRS-signaal aanzienlijk is afgenomen.
- Optische uitlijning van de gecombineerde TPEF-SRS microscoop
- Voer optische uitlijning uit voor colokalisatie van de ps- en fs-bundels zoals beschreven in stappen 2.2.2 tot en met 2.2.13.
- Open de lasersluiter van de pomp terwijl u de Stokes-uitgang in de OPO-besturingssoftware stopt. Gebruik OPO-besturingssoftware om de golflengte van de pompbundel in te stellen op 796 nm door op het vak Signaal instellen te klikken en de golflengtewaarde 796 in te voeren. Klik op het vak OPO Power instellen en voer 20 in om het vermogen in te stellen op het minimum (~ 20 mW) voor optische uitlijning.
- Schakel de microscoopcomputer en alle bijbehorende elektronische componenten in, inclusief scanners, objectiefactuatoren, fotodiodes, PMT's, stroomversterkers, lock-in versterkers en gemotoriseerde flippers. Start de microscoopbesturingssoftware.
OPMERKING: De microscoopbesturingssoftware is een zelfgemaakte interface. - Plaats twee uitlijnplaten (P1 en P2 in figuur 1) op het optische pad. Plaats P1 achter PBS op een afstand van ongeveer 10 cm en plaats P2 achter P1 op een afstand van ongeveer 30 cm.
OPMERKING: De ps- en fs-balken worden gecombineerd met behulp van een PBS (figuur 1). De twee uitlijnplaten worden gebruikt om de uitlijning en de colocalisatie van de twee laserstralen te controleren. - Open de microscoopsluiter voor de ps laserstraal.
- Pas de spiegel M1 aan om het ps-laserstraalcentrum in het doorgaande gat van P1 te lokaliseren. Gebruik een infrarood (IR) scope om de positie van de bundelspot op P1 te observeren bij het afstellen van de spiegel M1.
- Pas de spiegel M2 aan om het ps-laserstraalcentrum in het doorgaande gat van P2 te lokaliseren. Gebruik de IR-scope om de positie van de bundelspot op P2 te observeren bij het afstellen van de spiegel M2.
- Herhaal stap 2.2.6 en 2.2.7 totdat het ps-straalcentrum zich bij het doorgaande gat van beide uitlijnplaten bevindt. Sluit de sluiter van de ps-bundel in de microscoopbesturingssoftware.
- Stel de golflengte van fs Ti: saffierlaser in op 740 nm en open de lasersluiter. Stel het laservermogen in op 5 mW (gemeten aan de ingangspoort van het microscoopsysteem) voor optische uitlijning.
- Open de microscoopsluiter voor de fs-laserstraal.
- Pas de spiegel M3 aan om het middelpunt van de fs-laserstraalvlek op het doorgaande gat van P1 te lokaliseren.
- Pas de spiegel M4 aan om het midden van de laserstraalvlek in het doorgaande gat van P2 te lokaliseren.
- Herhaal stap 2.2.11 en 2.2.12 totdat het fs-laserstraalcentrum zich bij de doorgaande gaten van twee uitlijnplaten bevindt. Sluit de microscoopsluiter voor de fs-bundel.
- Voer ruimtelijke overlappingen uit van de pomp- en Stokes-balken zoals beschreven in de stappen 2.2.15 tot en met 2.2.18.
OPMERKING: Hoewel de pomp- en Stokes-stralen ongeveer overlappen in de ps-laser, is fijnafstelling van de posities van de twee laserstralen vereist om optimale SRS-prestaties te bereiken. Omdat de pompbalk eerst wordt uitgelijnd zoals eerder beschreven, wordt vervolgens de Stokes-bundel aangepast om te colocaliseren met de pompstraal. - Plaats een camera op de positie van het doel om de locatie van twee bundelspots te visualiseren. Markeer de positie van de pompstraal op het camerascherm als referentie.
- Plaats een uitlijnplaat P0 vóór L3 (figuur 1). Gebruik een inbussleutel om de optische spiegel 1 (OM1) aan te passen, zodat het Stokes-straalcentrum het doorgaande gat van de uitlijningsplaat passeert en colocaliseert met de pompstraal op de laseruitgangspoort. Gebruik de IR-scope om de positie van de bundelvlek op P0 te bevestigen tijdens de aanpassing.
OPMERKING: OM1 en OM2 zijn twee spiegels in de OPO-kop om de positie van de 1031 nm Stokes-bundel aan te passen. - Verwijder de uitlijnplaat P0 en gebruik de inbussleutel om de OM2 zo aan te passen dat het midden van de Stokes-straal colocaliseert met het referentiemerk van de pompstraal op de camera.
- Herhaal de stappen 2.2.16 en 2.2.17 totdat de Stokes-bundel strikt overlapt met de pompbundel op zowel P0- als cameravlakken.
OPMERKING: Bij het visualiseren van de bundelvlekken op de camera moeten alle uitlijningsplaten uit het optische pad worden verwijderd.
- Optimaliseer de beeldvormingsomstandigheden
- Voer faseaanpassing van de lock-in versterker uit zoals beschreven in stap 2.3.2. tot 2.3.7.
OPMERKING: SRS-detectie is gebaseerd op een hoogfrequent fasegevoelig schema. Voor SRL-detectie wordt de intensiteit van de Stokes-bundel gemoduleerd op 20 MHz en wordt een lock-in versterker gebruikt om het signaal te demoduleren. De fase en offset van de lock-in versterker moeten worden aangepast om het optimale beeldcontrast te bereiken. - Open de besturingssoftware van de vergrendelingsversterker.
- Stel de golflengte van de pomplaser in op 796 nm en het vermogen van de pomp en de Stokes-straal op respectievelijk 15 mW en 25 mW op het monster.
OPMERKING: Gebruik hier olijfolie voor SRS-beeldvormingsoptimalisatie en -kalibratie. De Raman-piek van olijfolie in het koolstof-waterstofgebied ligt op 2863,5 cm-1, wat overeenkomt met de golflengte van de pompbundel bij 796 nm. - Sluit de olijfolie af in een dia en bevestig een gevouwen tissuepapier aan de onderkant van de dia om de signaalbackscattering te verbeteren voor epi-SRS-detectie. Plaats het olijfoliemonster op het podium en pas de focus van het 25x objectief aan op het monster.
- Gebruik de microscoopbesturingssoftware om de beeldparameters als volgt in te stellen: 512 x 512 pixels voor 500 μm x 500 μm gezichtsveld (FOV), 6,4 μs pixel verblijftijd. Gebruik de vergrendelingsversterkerbesturingssoftware om de tijdconstante waarde in te stellen op 10 μs, wat dicht bij de pixelverblijftijd ligt.
- Scan de laserstraal over het monster. Gebruik de lock-in versterkerbesturingssoftware om de fase (0-180°) af te stemmen met een stapgrootte van 22,5° totdat de SRS-signaalintensiteit het maximum bereikt.
OPMERKING: In deze volledig analoge lock-in versterker is de signaaluitgang de in-fase component, die afhankelijk is van de fase van het referentiesignaal. De fase kan worden aangepast door de lock-in versterkerbesturingssoftware met een resolutie van 11 °, waardoor het gedetecteerde signaal tot op ~ 2% 12 kan worden gemaximaliseerd. De lock-in versterker raakt uit fase zodra het synchronisatiesignaal wordt verstoord. De fase moet worden aangepast telkens wanneer het synchronisatiesignaal wordt hersteld. - Scan het monster met gesloten lasersluiter. Gebruik de lock-in versterkerbesturingssoftware om de offsetwaarde af te stemmen met een stapgrootte van 1 mV totdat het gemiddelde SRS-signaal dicht bij nul is.
OPMERKING: Het gemiddelde SRS-signaal wordt geschat als de gemiddelde intensiteit van alle pixels in het SRS-beeld, dat automatisch wordt berekend door de microscoopbesturingssoftware. Offsets zijn handig voor het annuleren van ongewenste fase-coherente signalen. - Voer temporele synchronisatieoptimalisatie uit zoals beschreven in stappen 2.3.9 tot en met 2.3.14.
- Open het dialoogvenster Delay Manager (afbeelding 2) in de OPO-besturingssoftware.
- Scan de olijfolie en stem de vertragingsfase af totdat het SRS-signaal van de olijfolie zijn maximum bereikt.
OPMERKING: Voor de eerste keer van SRS-beeldvorming, wanneer de fase van de lock-in-versterker niet is geoptimaliseerd, wordt temporele synchronisatie eerst ruwweg aangepast om het SRS-signaal van het monster te visualiseren voordat de fase van de lock-in-versterker wordt geoptimaliseerd. - Stop met scannen en klik op de knop Gegevens toevoegen in het dialoogvenster vertragingsbeheer om de huidige vertragingsgegevens vast te leggen.
- Herhaal stap 2.3. 10 en 2.3.11 voor verschillende chemische monsters op verschillende golflengten.
OPMERKING: Polystyreen kralen, zwaar water, 5-Ethynyl-2′-deoxyuridine, glycerol worden gebruikt om de vertragingsgegevens op verschillende trillingsbanden te meten. - Selecteer de gegevensopslag en order 5 in het dialoogvenster vertragingsbeheer om de huidige gegevenspunten aan te passen aan de polynomische functie van de vijfde orde. Pas de aangepaste gegevens toe door op de knop Gebruiken als aangepast te klikken en het selectievakje in te schakelen. De vertragingsfase wordt automatisch aangepast op verschillende golflengten volgens de aangepaste vertragingscurve.
- Sla alle vertragingsgegevens op in een tekstbestand, dat kan worden geladen voor toekomstig gebruik.
- Voer faseaanpassing van de lock-in versterker uit zoals beschreven in stap 2.3.2. tot 2.3.7.
3. Chirurgische voorbereiding van de muis voor in vivo fluorescentie en SRS-beeldvorming
- Steriliseer alle benodigde gereedschappen, waaronder scalpels, veerscharen, tangen, coverslips en gaasjes.
- Desinfecteer alle oppervlakken, die tijdens de operatie zouden worden aangeraakt, met 70% ethanol. Bedek het werkgebied van het tafelblad met steriele gordijnen. Leg een verwarmingskussen onder het gordijn.
- Gebruik Thy1-YFP-H (Tg(Thy1-YFP)HJrs/J)37 transgene muizen die versterkt geel fluorescentie-eiwit (EYFP) tot expressie brengen in dorsale wortelganglion afferente neuronen voor in vivo beeldvorming van het ruggenmerg. Weeg de muis en induceer verdoving door intraperitoneale (i.p.) injectie van het ketamine-xylazinemengsel (87,5 mg kg-1 en 12,5 mg kg-1).
- Knijp in de teen van de muis om diepe anesthesie te garanderen. Vul indien nodig aan met de helft van de oorspronkelijke dosis van de anesthetica. Breng zalf aan op de ogen van de muis om uitdroging van het hoornvlies te voorkomen.
- Scheer het haar op de rug boven de thoracale wervelkolom en verwijder het haar vervolgens volledig met ontharende crème. Desinfecteer het geschoren gebied met jodiumoplossing.
- Maak een kleine middellijnincisie (~ 1,5 cm) van de huid over de T11-T13-wervel met een scalpel.
- Insicuur spieren en pezen zowel aan de bovenkant als aan de zijkanten van de T11-T13 wervel met een veerschaar en een tang. Leg de drie aangrenzende wervels bloot. Gebruik steriele gaasjes en steriele zoutoplossing om het bloeden onder controle te houden en de operatieplaats schoon te maken.
- Stabiliseer de wervelkolom met behulp van de twee roestvrijstalen zijbalken op een speciaal ontworpen stabilisatietrap (figuur 2B).
- Gebruik een #2 tang om een laminectomie uit te voeren bij T12. Gebruik voorzichtig de tang om de lamina stuk voor stuk te breken totdat de hele lamina van de T12-wervel is verwijderd.
- Spoel het bloed boven het ruggenmerg weg met steriele zoutoplossing en gebruik het gaasje om overmatig vocht te absorberen. Oefen druk uit op de bloedingsplaats met een stuk gaasje om het bloeden onder controle te houden.
- Plaats een coverslip (22 x 22 mm) op de klemstang en vul de tussenruimte tussen de coverslip en het ruggenmerg met zoutoplossing.
4. In vivo TPEF-SRS beeldvorming van het ruggenmerg van muizen
- Monteer de stabilisatietrap op een vijfassige trap onder de TPEF-SRS-microscoop.
OPMERKING: De vijfassige trap maakt drieassige translatie en ±5° pitch- en roll flexure-beweging mogelijk. - Bevestig de muiskop met twee hoofdbalken en laat de houderplaat zakken om voldoende ruimte te bieden voor borstbewegingen tijdens het ademen, waardoor bewegingsartefacten worden verlicht.
- Plaats een verwarmingskussen onder de muis om de muis warm te houden tijdens het maken van de afbeelding.
- Pas de z-translatiefase aan om de focus af te stemmen totdat het heldere veldbeeld van de vasculatuur van het ruggenmerg kan worden waargenomen onder een 10x-objectief.
- Lokaliseer de ruggenmerg dorsale ader in het midden van de FOV door de tweeassige translationele fase van de vijfassige fase af te stemmen.
- Stem de rol- en toonhoogtehoeken van de vijfassige fase af om het ruggenmerg dorsale oppervlak loodrecht op de objectieve as aan te passen op basis van het heldere veldbeeld.
- Vervang de 10x door een 25x waterdompelingsobjectief voor TPEF-SRS-beeldvorming.
- Stel de golflengte van de fs-bundel in op 920 nm. Stem het fs-straalvermogen af op 10 mW op het monster.
- Stel de golflengte van de pompbundel in op 796 nm. Stem het vermogen van de pomp en de Stokes-straal af op respectievelijk 60 mW en 75 mW op het monster.
OPMERKING: SRS-beeldvorming van het ruggenmerg wordt uitgevoerd bij het golfnummer van 2863,5 cm-1, wat overeenkomt met de Raman-piek van myelinescheden in het koolstof-waterstofgebied op basis van de gemeten SRS-spectra7,9. Het laservermogen wordt bepaald om een hoge resolutie TPEF-SRS-beeldvorming van het ruggenmerg te garanderen. Weefselschade wordt niet waargenomen onder de huidige beeldvormingsomstandigheden. - Voor SRS-beeldvorming selecteert u PBS boven het doel met behulp van een gemotoriseerde flipper door op de Schakelknop te drukken die is aangesloten op de gemotoriseerde flipper.
- Stel de beeldparameters als volgt in: 512 x 512 pixels voor 150 μm x 150 μm FOV, 3,2 μs pixel verblijftijd, 2 μs tijdconstante.
- Begin met het scannen van het monster en stel de focus in op het dorsale oppervlak van het ruggenmerg.
- Stel de vertragingsfase nauwkeurig af met de OPO-besturingssoftware totdat het maximale SRS-signaal van het ruggenmerg is bereikt.
OPMERKING: Biologische monsters kunnen extra chromatische dispersie veroorzaken, de vertragingsfase moet mogelijk worden aangepast om de temporele synchronisatie te optimaliseren. Wanneer echter SRS-beeldvorming wordt uitgevoerd in de buurt van het bovenste weefseloppervlak, is het temporele verschil van de twee laserpulsen die door het biologische weefsel en het beeldvormingsvenster worden geïntroduceerd meestal klein (minder dan enkele honderden fs). - Voor TPEF-beeldvorming selecteert u dichroïsche spiegel D2 boven het objectief met behulp van een gemotoriseerde flipper door op de Switch-knop te drukken die is aangesloten op de gemotoriseerde flipper.
- Stel de beeldparameters in en begin met het scannen van het monster. Om de TPEF-SRS-beeldstapel vast te leggen, verwerft u de TPEF- en SRS-afbeeldingen achtereenvolgens met een interval van 1 s op dezelfde diepte voordat u naar de volgende diepte gaat. De beeldvormingsparameters voor TPEF-beeldvorming zijn 512 x 512 pixels, 150 μm x 150 μm FOV, 3,2 μs pixel verblijftijd.
- Verwijder het dier uit de stabilisatiefase nadat alle beelden zijn verzameld.
- Reinig het blootgestelde weefsel door zoutoplossing te spoelen en absorbeer het overtollige vocht met behulp van een gaasje. Breng siliconengel aan op het blootgestelde ruggenmerg en wacht ~ 5 minuten totdat het is uitgehard.
- Hecht de huid met #6-0 chirurgische hechting om de wond te sluiten. Breng brandwondencrème aan op de huid van de operatieplaats om infectie te voorkomen. Dien subcutaan een pijnstillende behandeling toe (0,1 mg/kg buprenorfine).
- Plaats het dier in een schone kooi en plaats de kooi op een verwarmingskussen totdat de muis volledig hersteld is van de anesthesie.
- Herhaal pijnstillende toediening om de 12 uur gedurende 3 dagen na de operatie.
- Sluit de sluiter van OPO en fs laser. Stel het vermogen van de pomp en Stokes-straal in op het maximum.
OPMERKING: Het instellen van maximaal vermogen voordat u de laser uitschakelt, is gunstig voor laseronderhoud. - Stel de golflengte van de pompstraal en de FS-laser in op 800 nm.
- Zet de twee lasers op stand-by, sluit alle elektronicabesturingssoftware en schakel alle bijbehorende apparatuur uit.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
In vivo dual-modale beeldvorming van spinale axonen en myelinescheden wordt uitgevoerd met behulp van de Thy1-YFPH transgene muizen, die EYFP tot expressie brengen in dorsale wortel ganglion afferente neuronen (figuur 3). Deze gelabelde afferente neuronen geven de sensorische informatie van de perifere zenuw door aan het ruggenmerg, met de centrale tak in de dorsale kolom van het ruggenmerg. Met de TPEF-SRS-microscoop kan een dicht verdeelde myelineschede duidelijk worden gevisualiseerd met behulp van labelvrije SRS-beeldvorming en kunnen schaars gelabelde YFP-axonen worden waargenomen met behulp van TPEF-beeldvorming. Uit de beeldvorming met twee modellen blijkt dat axonen nauw worden omwikkeld door een dikke laag myelinescheden (figuur 3C). Knopen van Ranvier (NR), waarbij het axolemma kaal is van de myelineschede, spelen een essentiële rol in de snelle zoutachtige voortplanting van actiepotentialen. Zoals te zien is in de TPEF-SRS-ruggenmergafbeelding (figuur 3C), toont NR een verminderde axonale diameter en axolemma direct blootgesteld aan de extracellulaire matrix. Het is essentieel om de axonen samen met de omringende myelinescheden in beeld te brengen om het bestaan en de locatie van NR te bevestigen. Daarom stelt TPEF-SRS-microscopie ons in staat om de dynamische veranderingen van axonen en myelinescheden te observeren bij de ontwikkeling van ruggenmergaandoeningen, wat belangrijk is om de mechanismen van cellulaire dynamica te begrijpen.
Figuur 1: Het schematische diagram van het TPEF-SRS microscoopsysteem. De pomp en Stokes-stralen worden gecombineerd met een dichroïsche spiegel (D1) in de picoseconde (ps) laser. De ps-bundel en femtoseconde (fs) bundel worden gecollimeerd en uitgebreid / versmald door een paar lenzen (respectievelijk L3, L4 en L1, L2) om overeen te komen met de 3 mm XY-scan galvanometerspiegels. De fs-bundel wordt gedraaid van horizontale naar verticale polarisatie door een halfgolfplaat (HWP) en vervolgens gecombineerd met de ps-bundel door een polariserende bundelsplitser (PBS). De scanningspiegels en de achterste pupil van de objectieflens worden geconjugeerd door een telecentrische scanlens L5 en een oneindig gecorrigeerde buislens L6. De laserstraal wordt uitgebreid door de scan- en buislens om het achterste diafragma van het 25x objectief te vullen. Voor gestimuleerde Raman-verstrooiing (SRS) beeldvorming wordt de backscattered pompstraal die door het objectief wordt verzameld, gereflecteerd door een PBS en gericht op een groot gebied (10 mm x 10 mm) siliciumfotodiode (PD). Voor beeldvorming met twee fotonen wordt het twee-foton geëxciteerde fluorescentiesignaal (TPEF) gereflecteerd door een dichroïsche bundelsplitser D2 naar de fotodetectie-eenheid. Een current photomultiplier (PMT) module wordt gebruikt om het TPEF signaal te detecteren. Afkortingen-L1-L10: lenzen; OL: objectief objectief; D1-D3: dichroïsche spiegels; Fs1, Fs2: filtersets; M: spiegels; OM1, OM2: optische spiegels; P0-P2: uitlijnplaten. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: De interface van de delay manager op de OPO besturingssoftware. De rode pijl geeft het selectievakje aan voor het toepassen van de gekalibreerde vertragingsgegevens. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: In vivo TPEF-SRS beeldvorming van het ruggenmerg van muizen. (A) Schematisch diagram van de chirurgische voorbereiding van het ruggenmerg van de muis en het heldere veldbeeld van het ruggenmerg. (B) Montageschema voor muizen voor in vivo beeldvorming van het ruggenmerg. (C) Maximale z projectiebeelden van axonen en myelinescheden in het ruggenmerg van muizen. Witte pijlpunten geven de locatie van een knooppunt van Ranvier aan. SRS-beelden van myeline zijn gemaakt bij de Raman-shift van 2863,5 cm-1. Figuur A is gemaakt met BioRender (https://biorender.com/). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In dit protocol wordt de basisopstelling van de TPEF-SRS microscoop in detail beschreven. Voor SRS-beeldvorming zijn de pomp- en Stokes-stralen tijdelijk en ruimtelijk overlapt in de OPO. Deze overlapping kan echter worden verstoord na het passeren van het microscoopsysteem. Daarom is zowel ruimtelijke als temporele optimalisatie van de colocalisatie van de pomp en Stokes-balken noodzakelijk en cruciaal voor het bereiken van optimale SRS-beeldvorming. De temporele vertraging tussen de pomp en de Stokes-bundel is gerelateerd aan het optische padverschil van de twee bundels, dat wordt bepaald door de dispersie van optische elementen in het microscoopsysteem38. Wanneer de golflengte van de pompbundel wordt afgestemd op SRS-beeldvorming bij verschillende Raman-verschuivingen, verandert de optische padlengte van de pompbundel dienovereenkomstig omdat de brekingsindex van de optische lenzen afhankelijk is van de golflengte38. Daarom verandert de temporele vertraging tussen de pomp en de Stokes-laserpuls met de golflengte van de pompstraal en moet dus worden gekalibreerd. De OPO is uitgerust met een softwaregestuurde vertragingslijn voor temporele synchronisatie van de pomp en Stokes-bundel. Voor dezelfde optische opstelling blijven de vertragingsgegevens stabiel en hoeven ze slechts één keer te worden gekalibreerd. Hierdoor kunnen de vertragingsgegevens op verschillende golflengten van de pompbundel bij de eerste meting worden opgeslagen voor toekomstig gebruik. De gekalibreerde vertragingsgegevens kunnen automatisch worden toegepast door de OPO-besturingssoftware wanneer de golflengte van de pompbundel wordt gewijzigd, wat handig is voor SRS-beeldvorming bij verschillende Raman-verschuivingen of hyperspectrale SRS-beeldvorming. Voor TPEF-SRS-beeldvorming is strikte ruimtelijke overlapping van de ps- en fs-bundels na de combinatie een kritieke stap om een FOV-verschuiving tussen de twee beeldvormingsmodellen te voorkomen. Ten eerste zijn de ps-pompbundel en de fs-bundel uitgelijnd om ervoor te zorgen dat ze zich beide op de optische as van het microscoopsysteem bevinden, wat van cruciaal belang is om FOV-verschuiving te voorkomen bij het schakelen tussen de twee beeldvormingsmodellen. Vervolgens wordt, met behulp van de pompbundel als referentie, de Stokes-bundelpositie dienovereenkomstig aangepast om een strikte ruimtelijke colocalisatie te bereiken. Elke uitlijningsprocedure vereist verschillende proeven om het optimum te bereiken.
Als het SRS-signaal aanzienlijk afneemt, moet eerst de fasewaarde van de lock-in versterker en tijdvertragingsgegevens worden gecontroleerd. Omdat de lock-in versterker uit fase raakt zodra het synchronisatiesignaal is verstoord, moet de fasewaarde elke keer opnieuw worden aangepast nadat de voeding of het EOM-synchronisatiesignaal is onderbroken. De temporele synchronisatie van de pomp en stokesbundel kan snel worden gecontroleerd door de vertragingslijn in de OPO enigszins aan te passen. Als de gekalibreerde tijdvertragingsgegevens ver verwijderd zijn van de optimale waarde, moet een nulscan worden uitgevoerd om de vertragingsverschuiving opnieuw te kalibreren door op de knop Nulscan in het dialoogvenster vertragingsbeheer te klikken. De hele zero scan procedure duurt ongeveer 10 min. Als het SRS-signaal niet herstelt na optimalisatie van de fase- en tijdvertragingswaarde, moet de EOM-modulatie van de Stokes-bundel worden gecontroleerd zoals beschreven in stappen 2.1.3-2.1.4. Als de extinctieverhouding veel minder dan 10 dB is met de waarneming van kleine pulspieken op de uit-positie van de Stokes-pulstrein, moet de EOM opnieuw worden gestart en moeten het modulatievermogen en de fase opnieuw worden aangepast om maximale modulatiediepte te bereiken. Meestal kan het modulatieprobleem worden opgelost door de EOM opnieuw in te stellen. Zo niet, dan moet technische ondersteuning van de fabrikant vereist zijn.
Voor in vivo beeldvorming van dik weefsel moet de epi-SRS-detectiemodus worden gebruikt. In dit protocol wordt een PBS gebruikt om de excitatielaser door te geven en het terugverstrooide SRS-signaal naar de detector te reflecteren. Het gedetecteerde SRL-signaal is afhankelijk van de backscattering van de voorwaartse pompstraal door weefsels. De excitatielasers hebben lineaire polarisatie en kunnen volledig door de PBS gaan, terwijl de teruggekaatste straal een verschoven polarisatie heeft en dus slechts gedeeltelijk door de PBS kan worden gereflecteerd. Daarom laat het huidige signaalverzamelingsschema een lagere efficiëntie zien in vergelijking met de strategie die een ringvormige fotodetector direct voor de doelstelling plaatst12. Niettemin, als gevolg van de sterke verstrooiing van de lipiderijke weefsels39, kunnen SRS-beelden met een hoge signaal-ruisverhouding (512 x 512 pixels) van het ruggenmerg worden verkregen met een integratietijd van 1-2 s, waardoor dit op PBS gebaseerde verzamelschema een geschikte benadering is voor beeldvorming van het ruggenmerg. Aan de andere kant beperkt de sterke weefselverstrooiing de lichtpenetratiediepte. Voor zowel SRS- als TPEF-beeldvorming is de beelddiepte voor het ruggenmerg beperkt tot ongeveer 50 μm.
De sequentiële beeldvormingsprocedure voor SRS- en TPEF-beeldvorming is de belangrijkste beperking van de huidige dual-modale beeldvormingsmethode. In het protocol worden TPEF- en SRS-beeldvorming achtereenvolgens op dezelfde locatie uitgevoerd met een interval van 1 s door de gemotoriseerde flipper automatisch te schakelen. Bewegingsartefacten kunnen een onvolmaakte samensmelting van de TPEF- en SRS-beelden veroorzaken, wat het vermogen van deze methode beperkt voor het in beeld brengen van zeer dynamische processen of weefsels die grotendeels worden beïnvloed door de ademhaling en hartslag van dieren. Een mogelijke oplossing is om de ps laser-geëxciteerde twee-foton fluorescentie gelijktijdig te verzamelen tijdens SRS-beeldvorming9. Deze methode is echter alleen van toepassing op de biologische structuren met sterke fluorescentiesignalen, omdat de ps-puls een veel lagere fluorescentie-excitatie-efficiëntie heeft in vergelijking met de fs-puls14. Als alternatief kan het probleem worden opgelost door gebruik te maken van een fs-SRS-systeem22,40, waarbij de fs-laserbron gelijktijdige excitatie van de SRS- en TPEF-signalen effectief mogelijk maakt, ten koste van de lage spectrale resolutie van de SRS-beeldvorming. Een andere oplossing is om de ps laser-geëxciteerde fluorescentie verkregen tijdens SRS-beeldvorming te gebruiken als referentie om de fs-fluorescentiebeelden te registreren. Zoals te zien is in figuur 3, werkt deze registratiestrategie goed als er geen significante beweging optreedt tijdens de SRS- en fluorescentiebeeldvorming.
SRS vertoont unieke voordelen in biologische beeldvorming omdat het chemische informatie van biomoleculen biedt op basis van het specifieke labelvrije contrastmechanisme41. Vergeleken met CARS, dat ook is gecombineerd met TPEF voor multimodale NLO-beeldvorming, toonde SRS een beter spectraal- en beeldinterpretatievermogen11. Daarom is het op grote schaal toegepast voor beeldvorming lipide9,11, eiwit42,43, DNA44 en bio-orthogonale componenten die alkyn (C ≡ C)13,45, koolstof-deuterium (C−D)9,46 en zuurstof-deuterium (O-D) bindingen bevatten47,48 in biologische weefsels. In dit protocol gebruikten we een ps-laserbron voor SRS-beeldvorming en een fs-laserbron voor TPEF-beeldvorming, die de voordelen van efficiënte fluorescentie-excitatie en hoge Raman-spectrale resolutie combineert, waardoor effectieve differentiatie van diverse biomoleculen mogelijk is42,44. In het ruggenmerg dragen complexe cel-micro-omgevingsinteracties waarbij gliacellen, neuronen en gerekruteerde immuuncellen betrokken zijn bij aan de progressie van letsel49 en ziekten50. In combinatie met verschillende fluorescentie- en SRS-beeldvormingssondes kan TPEF-SRS-microscopie gelijktijdige beeldvorming van verschillende cellulaire structuren en hun verschillende biomolecuulcomponenten bereiken, wat ons begrip van het begin en de ontwikkeling van ruggenmergaandoeningen aanzienlijk kan vergemakkelijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen en hebben geen concurrerende financiële belangen.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door de Hong Kong Research Grants Council door middel van subsidies 16103215, 16148816, 16102518, 16102920, T13-607/12R, T13-706/11-1, T13-605/18W, C6002-17GF, C6001-19E, N_HKUST603/19, de Innovation and Technology Commission (ITCPD/17-9), het Area of Excellence Scheme van de University Grants Committee (AoE/M-604/16, AOE/M-09/12) en de Hong Kong University of Science & Technology (HKUST) door middel van subsidie RPC10EG33.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| #2 Forceps | Dumont | 11223-20 | For laminectomy |
| 10X objective | Nikon | CFI Plan Apo Lambda 10X | |
| 25X objective | Olympus | XLPLN25XSVMP2 | |
| Burn cream | Betadine | ||
| Camera | Sony | α6300 | |
| Current amplifier | Stanford research | SR570 | |
| Current photomultiplier modules | Hamamatsu | H11461-01 | |
| D2 665 nm long-pass dichroic mirror | Semrock | FF665-Di02-25x36 | For directing epi-fluorescence signal to the detection module |
| D3 700 nm short-pass dichroic mirror | Edmund | 69-206 | For separating SRS from TPEF detection path |
| Depilating cream | Veet | ||
| FS1 975 nm short-pass filter | Edmund | 86-108 | For blocking stokes beam |
| FS1 Bandpass filter | Semrock | FF01-850/310 | For blocking stokes beam |
| Fs2 Bandpass filter | Semrock | FF01-525/50 | For selecting YFP signal |
| Fs2 Shortpass filter | Semrock | FF01-715/SP-25 | For blocking fs excitation laser beam |
| Half-wave plate | Thorlabs | SAHWP05M-1700 | |
| High-speed photodetector | MenloSystems | FPD 310-F | For checking Stokes beam modulation |
| Iodine | Betadine | ||
| IR Scope | FJW | FIND-R-SCOPE Infrared Viewer 2X Kit Model 84499C2X | |
| Iris | Thorlabs | CPA1 | |
| L1 | Thorlabs | AC254-060-B-ML | |
| L10 | Thorlabs | LA4052-A | |
| L2 | Thorlabs | LA1422-B | |
| L3 | Thorlabs | AC254-050-B | |
| L4 | Thorlabs | AC254-060-B-ML | |
| L7 | f=100 mm, AB coating | ||
| L8 | Thorlabs | LA4874-A | |
| L9 | Thorlabs | AC254-035-B-ML | |
| Lock-in amplifier | APE | ||
| Mirror | Thorlabs | PF10-03-P01 | |
| Motorized flipper | Thorlabs | MFF101/M | |
| multifunctional acquisition card | National Instrument | PCIe-6363 | |
| Oscilloscope | Tektronix | TDS2012C | |
| Photodiode | APE | For detecting SRS signal | |
| Picosecond laser source | APE | picoEmerald | |
| Polarizing beam splitter | Thorlabs | CCM1-PBS252/M | |
| Power meter | Newport | 843-R | |
| Saline | Braun | ||
| Scan lens L5 | Thorlabs | SL50-CLS2 | |
| Scanning mirror | Cambridge Technology | 6215H | |
| Silicone gel | World Precision Inc. | KWIK-SIL | |
| Ti:sapphire fs laser | Coherent | Chameleon Ultra II | |
| Tube lens L6 | Thorlabs | TTL200-S8 |
References
- Raman, C. V., Krishnan, K. S. The optical analogue of the compton effect. Nature. 121 (3053), 711 (1928).
- Turrell, G., Corset, J. Raman Microscopy: Developments and Applications. , Academic Press. (1996).
- Tian, F., et al. Monitoring peripheral nerve degeneration in ALS by label-free stimulated Raman scattering imaging. Nature Communications. 7 (1), 13283 (2016).
- Shi, Y., et al. Longitudinal in vivo coherent anti-Stokes Raman scattering imaging of demyelination and remyelination in injured spinal cord. Journal of Biomedical Optics. 16 (10), 106012 (2011).
- Hu, C. R., Zhang, D., Slipchenko, M. N., Cheng, J. -X., Hu, B. Label-free real-time imaging of myelination in the Xenopus laevis tadpole by in vivo Stimulated Raman Scattering Microscopy. Journal of Biomedical Optics. 19 (8), 086005 (2014).
- Den Broeder, M. J., et al. Altered adipogenesis in Zebrafish larvae following high fat diet and chemical exposure is visualised by Stimulated Raman Scattering Microscopy. International Journal of Molecular Sciences. 18 (4), 894 (2017).
- He, S., et al. In vivo metabolic imaging and monitoring of brown and beige fat. Journal of Biophotonics. 11 (8), (2018).
- Wang, M. C., Min, W., Freudiger, C. W., Ruvkun, G., Xie, X. S. RNAi screening for fat regulatory genes with SRS microscopy. Nature Methods. 8 (2), 135-138 (2011).
- Li, X., et al. Quantitative imaging of lipid synthesis and lipolysis dynamics in Caenorhabditis elegans by Stimulated Raman Scattering Microscopy. Analytical Chemistry. 91 (3), 2279-2287 (2019).
- Zhang, C., Li, J., Lan, L., Cheng, J. -X. Quantification of lipid metabolism in living cells through the dynamics of lipid droplets measured by Stimulated Raman Scattering Imaging. Analytical Chemistry. 89 (8), 4502-4507 (2017).
- Freudiger, C. W., et al. Label-free biomedical imaging with high sensitivity by Stimulated Raman Scattering Microscopy. Science. 322 (5909), 1857-1861 (2008).
- Saar, B. G., et al. Video-rate molecular imaging in vivo with Stimulated Raman Scattering. Science. 330 (6009), 1368-1370 (2010).
- Li, X., Jiang, M., Lam, J. W. Y., Tang, B. Z., Qu, J. Y. Mitochondrial imaging with combined fluorescence and Stimulated Raman Scattering Microscopy using a probe of the aggregation-induced emission characteristic. Journal of the American Chemical Society. 139 (47), 17022-17030 (2017).
- Helmchen, F., Denk, W.
- Pawlicki, M., Collins, H. A., Denning, R. G., Anderson, H. L. Two-photon absorption and the design of two-photon dyes. Angewandte Chemie International Edition. 48 (18), 3244-3266 (2009).
- König, K.
- Dean, K. M., Palmer, A. E. Advances in fluorescence labeling strategies for dynamic cellular imaging. Nature Chemical Biology. 10 (7), 512-523 (2014).
- Tsurui, H., et al. Seven-color fluorescence imaging of tissue samples based on fourier spectroscopy and singular value decomposition. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 48 (5), 653-662 (2000).
- Niehörster, T., et al. Multi-target spectrally resolved fluorescence lifetime imaging microscopy. Nature Methods. 13 (3), 257-262 (2016).
- Zhang, X., et al. Label-free live cell imaging of nucleic acids using Stimulated Raman Scattering (SRS) Microscopy. Chemphyschem: A European Journal of Chemical Physics and Physical Chemistry. 13 (4), 1054-1059 (2012).
- Ji, M., et al. Label-free imaging of amyloid plaques in Alzheimer's disease with stimulated Raman scattering microscopy. Science Advances. 4 (11), 7715 (2018).
- Li, X., et al. Integrated femtosecond stimulated Raman scattering and two-photon fluorescence imaging of subcellular lipid and vesicular structures. Journal of Biomedical Optics. 20 (11), 110501 (2015).
- Imitola, J., et al. Multimodal coherent anti-Stokes Raman scattering microscopy reveals microglia-associated myelin and axonal dysfunction in multiple sclerosis-like lesions in mice. Journal of Biomedical Optics. 16 (2), 021109 (2011).
- Uckermann, O., et al. Label-free multiphoton microscopy reveals altered tissue architecture in hippocampal sclerosis. Epilepsia. 58 (1), 1-5 (2017).
- Tamosaityte, S., et al. Inflammation-related alterations of lipids after spinal cord injury revealed by Raman spectroscopy. Journal of Biomedical Optics. 21 (6), 061008 (2016).
- Uckermann, O., et al. Endogenous two-photon excited fluorescence provides label-free visualization of the inflammatory response in the rodent spinal cord. BioMed Research International. 2015, 859084 (2015).
- van Hameren, G., et al. In vivo real-time dynamics of ATP and ROS production in axonal mitochondria show decoupling in mouse models of peripheral neuropathies. Acta Neuropathologica Communications. 7 (1), 1-16 (2019).
- Davalos, D., et al. Fibrinogen-induced perivascular microglial clustering is required for the development of axonal damage in neuroinflammation. Nature Communications. 3 (1), 1-15 (2012).
- Ylera, B., et al. Chronically CNS-injured adult sensory neurons gain regenerative competence upon a lesion of their peripheral axon. Current Biology. 19 (11), 930-936 (2009).
- Wake, H., Moorhouse, A. J., Jinno, S., Kohsaka, S., Nabekura, J. Resting microglia directly monitor the functional state of synapses in vivo and determine the fate of ischemic terminals. Journal of Neuroscience. 29 (13), 3974-3980 (2009).
- Lau, S. -F., et al. IL-33-PU.1 transcriptome reprogramming drives functional state transition and clearance activity of microglia in Alzheimer's Disease. Cell Reports. 31 (3), 107530 (2020).
- Tang, P., et al. In vivo two-photon imaging of axonal dieback, blood flow, and calcium influx with methylprednisolone therapy after spinal cord injury. Scientific Reports. 5, 9691 (2015).
- Yang, Z., Xie, W., Ju, F., Khan, A., Zhang, S. In vivo two-photon imaging reveals a role of progesterone in reducing axonal dieback after spinal cord injury in mice. Neuropharmacology. 116, 30-37 (2017).
- Dobson, R., Giovannoni, G. Multiple sclerosis - a review. European Journal of Neurology. 26 (1), 27-40 (2019).
- Totoiu, M. O., Keirstead, H. S. Spinal cord injury is accompanied by chronic progressive demyelination. Journal of Comparative Neurology. 486 (4), 373-383 (2005).
- Kopper, T. J., Gensel, J. C. Myelin as an inflammatory mediator: Myelin interactions with complement, macrophages, and microglia in spinal cord injury. Journal of Neuroscience Research. 96 (6), 969-977 (2018).
- Feng, G., et al. Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP. Neuron. 28 (1), 41-51 (2000).
- Pedrotti, F. L., Pedrotti, L. M., Pedrotti, L. S. Introduction to Optics. , Higher Education from Cambridge University Press. (2017).
- Jacques, S. L. Optical properties of biological tissues: a review. Physics in Medicine and Biology. 58 (11), 37-61 (2013).
- Zhang, D., Slipchenko, M. N., Cheng, J. -X. Highly sensitive vibrational imaging by Femtosecond Pulse Stimulated Raman Loss. The Journal of Physical Chemistry Letters. 2 (11), 1248-1253 (2011).
- Hu, F., Shi, L., Min, W. Biological imaging of chemical bonds by stimulated Raman scattering microscopy. Nature Methods. 16 (9), 830-842 (2019).
- Ji, M., et al. Rapid, label-free detection of brain tumors with Stimulated Raman Scattering Microscopy. Science Translational Medicine. 5 (201), (2013).
- Freudiger, C. W., et al. Multicolored stain-free histopathology with coherent Raman imaging. Laboratory Investigation. 92 (10), 1492-1502 (2012).
- Lu, F. K., et al. Label-free DNA imaging in vivo with stimulated Raman scattering microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (37), 11624-11629 (2015).
- Yamakoshi, H., et al. Imaging of EdU, an Alkyne-tagged cell proliferation probe, by Raman Microscopy. Journal of the American Chemical Society. 133 (16), 6102-6105 (2011).
- van Manen, H. -J., Lenferink, A., Otto, C. Noninvasive imaging of protein metabolic labeling in single human cells using stable isotopes and Raman Microscopy. Analytical Chemistry. 80 (24), 9576-9582 (2008).
- Zhang, L., et al. Spectral tracing of deuterium for imaging glucose metabolism. Nature Biomedical Engineering. 3 (5), 402-413 (2019).
- Shi, L., et al. Optical imaging of metabolic dynamics in animals. Nature Communications. 9 (1), 2995 (2018).
- Ahuja, C. S., et al.
- Lassmann, H.
