Summary
La microscopie à diffusion Raman stimulée (SRS) permet une imagerie sans étiquette des biomolécules en fonction de leur vibration intrinsèque de liaisons chimiques spécifiques. Dans ce protocole, la configuration instrumentale d’un SRS intégré et d’un microscope à fluorescence à deux photons est décrite pour visualiser les structures cellulaires dans la moelle épinière de souris vivantes.
Abstract
La microscopie à diffusion Raman stimulée (SRS) permet une imagerie sans étiquette des tissus biologiques dans son microenvironnement naturel basée sur la vibration moléculaire intrinsèque, fournissant ainsi un outil parfait pour l’étude in vivo des processus biologiques à résolution subcellulaire. En intégrant l’imagerie par fluorescence excitée à deux photons (TPEF) dans le microscope SRS, l’imagerie in vivo bimodale des tissus peut acquérir des informations biochimiques et biophysiques critiques à partir de multiples perspectives qui aident à comprendre les processus dynamiques impliqués dans le métabolisme cellulaire, la réponse immunitaire et le remodelage des tissus, etc. Dans ce protocole vidéo, la configuration d’un système de microscope TPEF-SRS ainsi que la méthode d’imagerie in vivo de la moelle épinière animale sont introduites. La moelle épinière, en tant que partie du système nerveux central, joue un rôle essentiel dans la communication entre le cerveau et le système nerveux périphérique. La gaine de myéline, abondante en phospholipides, entoure et isole l’axone pour permettre la conduction saltatoire des potentiels d’action. L’imagerie in vivo des gaines de myéline dans la moelle épinière est importante pour étudier la progression des maladies neurodégénératives et des lésions de la moelle épinière. Le protocole décrit également la préparation animale et les méthodes d’imagerie TPEF-SRS in vivo pour acquérir des images biologiques à haute résolution.
Introduction
La microscopie Raman1,2 est en train de devenir une puissante méthode sans étiquette pour imager les tissus biologiques en fonction des fréquences caractéristiques de diverses liaisons chimiques dans les biomolécules. En raison de sa capacité d’imagerie non invasive et bien adaptative, la microscopie Raman a été largement utilisée pour l’imagerie de composants enrichis en lipides dans des tissus biologiques tels que la gaine de myéline3,4,5, les adipocytes6,7 et les gouttelettes lipidiques8,9,10 . Le signal de diffusion Raman stimulée (SRS) acquis sous forme de gain Raman stimulé (SRG) ou de perte Raman stimulée (SRL) est sans arrière-plan, montrant une ressemblance spectrale parfaite avec la diffusion Raman spontanée11,12. De plus, le SRL et le SSR dépendent linéairement de la concentration de l’analyte, ce qui permet une analyse quantitative des composants biochimiques9,11,13. La microscopie à fluorescence excitée à deux photons (TPEF) a été largement utilisée pour l’imagerie biologique in vivo en raison de sa capacité de sectionnement optique inhérente, de sa profondeur de pénétration profonde et de sa faible phototoxicité14,15,16. Cependant, les performances de l’imagerie TPEF dépendent des caractéristiques des étiquettes fluorescentes, et le nombre de couleurs résolvables est limité en raison des spectres de fluorescence à large bande8,17,18,19. L’imagerie SRS sans étiquette et l’imagerie TPEF basée sur la fluorescence sont deux modalités d’imagerie complémentaires, et leur combinaison peut fournir des informations biophysiques et biochimiques abondantes sur les tissus. Ces deux modalités d’imagerie sont toutes deux basées sur les processus optiques non linéaires (NLO), ce qui permet une intégration simple dans un système de microscope. La combinaison de l’imagerie SRS et TPEF, appelée imagerie dual-modale, permet l’imagerie et le profilage de haute dimension des cellules et des tissus, facilitant ainsi une compréhension complète des systèmes biologiques complexes. Plus précisément, la microscopie SRS picoseconde (ps) permet d’obtenir une imagerie de liaison chimique avec une résolution spectrale élevée par rapport à la technique SRS femtoseconde (fs)11, permettant de différencier plusieurs composants biochimiques dans les tissus biologiques, en particulier dans la région d’empreintes digitales encombrée20,21. En outre, par rapport à un autre système de microscope NLO bimodal couramment utilisé avec intégration d’un microscope à diffusion anti-Stokes cohérente (CARS), SRS montre des performances supérieures à CARS en termes d’interprétation spectrale et d’image ainsi que de sensibilité de détection11. Le microscope SRS-TPEF a été utilisé comme un outil puissant pour étudier divers systèmes biologiques, tels que Caenorhabditis elegans9,22, Xenopus laevis tadpole brain5, cerveau de souris23,24, moelle épinière25,26, nerf périphérique27 et tissu adipeux7, etc.
La moelle épinière et le cerveau constituent le système nerveux central (SNC). La visualisation des activités cellulaires dans le SNC in vivo dans des conditions physiologiques et pathologiques est essentielle pour comprendre les mécanismes des troubles du SNC28,29,30 et pour développer des thérapies correspondantes31,32,33. La gaine de myéline, qui enveloppe et isole les axones pour une conduction potentielle d’action à grande vitesse, joue un rôle important dans le développement du SNC. La démyélinisation est considérée comme une caractéristique dans les troubles de la substance blanche, tels que la sclérose en plaques34. De plus, après une lésion de la moelle épinière35, les débris de myéline peuvent moduler l’activation des macrophages, contribuant ainsi à l’inflammation chronique et aux lésions secondaires36. Par conséquent, l’imagerie in vivo de la gaine de myéline avec les neurones et les cellules gliales dans des modèles murins vivants est d’une grande aide pour comprendre les processus dynamiques dans les troubles du SNC.
Dans ce protocole, les procédures de configuration fondamentales d’un microscope TPEF-SRS construit à la maison sont décrites et les méthodes d’imagerie in vivo bimodales pour la moelle épinière de souris sont introduites.
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Protocol
Toutes les procédures animales effectuées dans ce travail sont menées conformément aux directives du Laboratory Animal Facility de l’Université des sciences et technologies de Hong Kong (HKUST) et ont été approuvées par le Comité d’éthique animale de HKUST. Une formation à la sécurité pour la manipulation laser est nécessaire pour configurer et utiliser le microscope TPEF-SRS. Portez toujours des lunettes de sécurité laser avec une plage de longueurs d’onde appropriée lorsque vous traitez avec un laser.
1. Configuration du microscope TPEF-SRS (pour le schéma de configuration, voir La figure 1)
- Utilisez un oscillateur paramétrique optique (OPO) intégré connecté à un laser à fibre d’ytterbium à verrouillage de mode comme source laser ps pour l’imagerie SRS.
REMARQUE: OPO émet un faisceau Stokes (1031 nm) et un faisceau de pompe (accordable de 780 nm à 960 nm) avec une durée d’impulsion de 2 ps et un taux de répétition de 80 MHz. Le faisceau stokes est modulé à 20 MHz par un modulateur électro-optique (EOM) intégré pour la détection SRS sensible à la phase haute fréquence au niveau MHz. - Utilisez un laser fs titane (Ti) : saphir comme source laser pour l’imagerie TPEF.
- Utilisez une paire d’objectifs (L1 et L2) pour collimater et ajuster la taille du faisceau fs à 3 mm.
- Utilisez une paire de lentilles (L3 et L4) pour collimater le faisceau laser ps et étendre son diamètre à 3 mm.
- Changez la polarisation du faisceau laser fs de la polarisation p à la polarisation s à l’aide d’une plaque demi-onde.
- Combinez les deux faisceaux laser avec un séparateur de faisceau polarisant (PBS).
- Ajoutez une paire de miroirs galvanométriques XY-scan de 3 mm derrière le PBS pour le balayage du faisceau.
- Utilisez une lentille de balayage télécentrique (L5) et une lentille à tube à correction de l’infini (L6) pour conjuguer le miroir de balayage et la pupille arrière de l’objectif 25x. Élargissez le faisceau laser par la lentille de balayage et la lentille tubulaire pour remplir l’ouverture arrière de l’objectif.
- Placez un PBS ou un miroir dichroïque (D2) entre la lentille à tube et la lentille de l’objectif pour la collecte du signal SRS ou de fluorescence. Utilisez un flipper motorisé pour basculer entre PBS et D2.
REMARQUE: Une partie du signal SRS rétrodiffusé est perdue lors du passage dans le PBS en raison de sa polarisation décalée de manière aléatoire. - Utilisez une paire d’objectifs (L7 et L9) pour réduire le faisceau de détection et conjuguer la pupille arrière de l’objectif 25x avec un capteur de photodiode.
- Utilisez une paire de lentilles (L8 et L10) pour réduire le faisceau de détection et conjuguer la pupille arrière de l’objectif 25x avec la surface de détection du photomultiplicateur (PMT).
- Utilisez un miroir dichroïque (D3) pour séparer le chemin de détection des signaux de fluorescence et SRS.
- Placez un ensemble de filtres (Fs1) devant le détecteur de photodiode pour bloquer le laser Stokes et passez uniquement le faisceau de la pompe.
- Placez un ensemble de filtres (Fs2) devant le détecteur PMT pour passer uniquement le signal de fluorescence cible.
- Connectez le PMT à un amplificateur de courant pour l’amplification du signal.
- Connectez la photodiode à un amplificateur verrouillable.
- Connectez le signal de synchronisation de la sortie EOM intégrée à l’entrée de référence de l’amplificateur de verrouillage pour la démodulation du signal SRS.
- Connectez l’amplificateur PMT et les sorties de l’amplificateur de verrouillage au module d’acquisition de données.
2. Calibrage du système de microscope TPEF-SRS
- Démarrage des lasers
- Basculez l’interrupteur à clé de la position Veille à la position Allumée pour allumer le laser Ti: saphir et attendez 30 minutes que le laser se réchauffe.
- Allumez l’OPO en cliquant sur le bouton Démarrer du panneau de commande OPO et attendez 20 minutes que le laser se réchauffe.
- Une fois le laser ps réchauffé, utilisez un photodétecteur à grande vitesse pour vérifier la profondeur de modulation du faisceau de Stokes. Ouvrez l’obturateur laser du faisceau Stokes. Cliquez sur la case Set OPO Power et entrez 20. Placez le photodétecteur haute vitesse à la sortie OPO pour détecter le faisceau. Connectez le port de sortie du photodétecteur au port d’entrée d’un oscilloscope à l’aide d’un câble coaxial avec connecteur BNC (Bayonet Neill-Concelman) pour surveiller l’impulsion laser.
- Ouvrez la fenêtre Contrôle EOM dans le logiciel de contrôle OPO. Ajustez la puissance et la phase de la MOE en fonction du diagramme d’intensité d’impulsion indiqué sur l’oscilloscope pour obtenir une profondeur de modulation maximale à 20 MHz.
REMARQUE: Les performances de la MOE sont généralement stables et ne doivent être vérifiées que lorsque le signal SRS est trouvé significativement diminué.
- Alignement optique du microscope combiné TPEF-SRS
- Effectuer l’alignement optique pour la colocalisation des faisceaux ps et fs comme décrit aux étapes 2.2.2 à 2.2.13.
- Ouvrez l’obturateur laser de la pompe tout en arrêtant la sortie Stokes dans le logiciel de contrôle OPO. Utilisez le logiciel de contrôle OPO pour régler la longueur d’onde du faisceau de la pompe sur 796 nm en cliquant sur la case Définir le signal et en entrant la valeur de longueur d’onde 796. Cliquez sur la case Set OPO Power et entrez 20 pour régler sa puissance au minimum (~ 20 mW) pour l’alignement optique.
- Allumez l’ordinateur du microscope et tous les composants électroniques associés, y compris les scanners, les actionneurs d’objectif, les photodiodes, les PMT, les amplificateurs de courant, les amplificateurs de verrouillage et les palmes motorisées. Démarrez le logiciel de contrôle du microscope.
REMARQUE: Le logiciel de contrôle de microscope est une interface maison. - Placez deux plaques d’alignement (P1 et P2 dans la figure 1) sur le chemin optique. Placez P1 derrière PBS à une distance d’environ 10 cm et placez P2 derrière P1 à une distance d’environ 30 cm.
REMARQUE : Les faisceaux ps et fs sont combinés à l’aide d’un PBS (Figure 1). Les deux plaques d’alignement sont utilisées pour vérifier l’alignement ainsi que la colocalisation des deux faisceaux laser. - Ouvrez l’obturateur du microscope pour le faisceau laser ps.
- Ajustez le miroir M1 pour localiser le centre du faisceau laser ps au trou traversant de P1. Utilisez une lunette infrarouge (IR) pour observer la position du point de faisceau à P1 lors du réglage du miroir M1.
- Ajustez le miroir M2 pour localiser le centre du faisceau laser ps au trou traversant de P2. Utilisez la lunette IR pour observer la position du point de faisceau à P2 lors du réglage du miroir M2.
- Répétez les étapes 2.2.6 et 2.2.7 jusqu’à ce que le centre du faisceau ps se trouve au trou traversant des deux plaques d’alignement. Fermez l’obturateur du faisceau ps dans le logiciel de contrôle du microscope.
- Réglez la longueur d’onde du laser saphir fs Ti: à 740 nm et ouvrez l’obturateur laser. Réglez la puissance du laser sur 5 mW (mesurée au port d’entrée du système de microscope) pour l’alignement optique.
- Ouvrez l’obturateur du microscope pour le faisceau laser fs.
- Ajustez le miroir M3 pour localiser le centre du faisceau laser fs au trou traversant de P1.
- Ajustez le miroir M4 pour localiser le centre du faisceau laser au trou traversant de P2.
- Répétez les étapes 2.2.11 et 2.2.12 jusqu’à ce que le centre du faisceau laser fs se trouve au niveau des trous traversants de deux plaques d’alignement. Fermez l’obturateur du microscope pour le faisceau fs.
- Effectuer le chevauchement spatial de la pompe et des faisceaux de Stokes comme décrit aux étapes 2.2.15 à 2.2.18.
REMARQUE: Bien que la pompe et les faisceaux de Stokes se chevauchent à peu près à l’intérieur du laser ps, un réglage fin des positions des deux faisceaux laser est nécessaire pour obtenir des performances SRS optimales. Étant donné que le faisceau de la pompe est d’abord aligné comme décrit précédemment, ensuite le faisceau de Stokes est ajusté pour colocaliser avec le faisceau de la pompe. - Placez une caméra à la position de l’objectif pour visualiser l’emplacement de deux points de faisceau. Marquez la position du faisceau de la pompe sur l’écran de la caméra comme référence.
- Placez une plaque d’alignement P0 avant L3 (Figure 1). Utilisez une touche hexagonale pour régler le miroir optique 1 (OM1) afin que le centre du faisceau stokes passe le trou traversant de la plaque d’alignement et se colocalise avec le faisceau de la pompe au port de sortie laser. Utilisez la lunette IR pour confirmer la position du point de faisceau à P0 pendant le réglage.
REMARQUE: OM1 et OM2 sont deux miroirs dans la tête OPO pour ajuster la position du faisceau Stokes 1031 nm. - Retirez la plaque d’alignement P0 et utilisez la touche hexadécimale pour régler l’OM2 afin que le centre du faisceau Stokes se colocalise avec la marque de référence du faisceau de pompe sur la caméra.
- Répétez les étapes 2.2.16 et 2.2.17 jusqu’à ce que le faisceau de Stokes chevauche strictement le faisceau de la pompe à la fois sur les plans P0 et caméra.
REMARQUE: Lors de la visualisation des points de faisceau sur la caméra, toutes les plaques d’alignement doivent être retirées du chemin optique.
- Optimiser les conditions d’imagerie
- Effectuez le réglage de phase de l’amplificateur de verrouillage comme décrit aux étapes 2.3.2. au 2.3.7.
REMARQUE: La détection SRS est basée sur un schéma sensible à la phase à haute fréquence. Pour la détection SRL, l’intensité du faisceau stokes est modulée à 20 MHz et un amplificateur de verrouillage est utilisé pour démoduler le signal. La phase et le décalage de l’amplificateur de verrouillage doivent être ajustés pour obtenir le contraste d’image optimal. - Ouvrez le logiciel de contrôle de l’amplificateur de verrouillage.
- Réglez la longueur d’onde du laser de la pompe à 796 nm et la puissance de la pompe et du faisceau de Stokes à 15 mW et 25 mW sur l’échantillon, respectivement.
REMARQUE: Ici, utilisez de l’huile d’olive pour l’optimisation et l’étalonnage de l’imagerie SRS. Le pic Raman de l’huile d’olive dans la région carbone-hydrogène est à 2863,5 cm-1, correspondant à la longueur d’onde du faisceau de la pompe à 796 nm. - Scellez l’huile d’olive dans une diapositive et fixez un papier de soie plié au bas de la diapositive pour améliorer la rétrodiffusion du signal pour la détection de l’épi-SRS. Placez l’échantillon d’huile d’olive sur la scène et ajustez la mise au point de l’objectif 25x sur l’échantillon.
- Utilisez le logiciel de contrôle du microscope pour définir les paramètres d’imagerie comme suit : 512 x 512 pixels pour un champ de vision (FOV) de 500 μm x 500 μm, temps de séjour en pixels de 6,4 μs. Utilisez le logiciel de contrôle de l’amplificateur de verrouillage pour régler la valeur de la constante de temps à 10 μs, ce qui est proche du temps de séjour du pixel.
- Scannez le faisceau laser sur l’échantillon. Utilisez le logiciel de contrôle de l’amplificateur de verrouillage pour régler la phase (0-180 °) avec une taille de pas de 22,5 ° jusqu’à ce que l’intensité du signal SRS atteigne le maximum.
REMARQUE: Dans cet amplificateur de verrouillage entièrement analogique, la sortie du signal est le composant en phase, qui dépend de la phase du signal de référence. La phase peut être ajustée par le logiciel de contrôle de l’amplificateur de verrouillage avec une résolution de 11 °, ce qui permet de maximiser le signal détecté à ~2%12. L’amplificateur de verrouillage se déphase une fois que le signal de synchronisation est perturbé. La phase doit être réajustée chaque fois que le signal de synchronisation est rétabli. - Scannez l’échantillon avec l’obturateur laser fermé. Utilisez le logiciel de contrôle de l’amplificateur de verrouillage pour régler la valeur de décalage avec une taille de pas de 1 mV jusqu’à ce que le signal SRS moyen soit proche de zéro.
REMARQUE: Le signal SRS moyen est estimé comme l’intensité moyenne de tous les pixels de l’image SRS, qui est calculée automatiquement par le logiciel de contrôle du microscope. Les décalages sont utiles pour annuler les signaux de cohérence de phase indésirables. - Effectuez l’optimisation de la synchronisation temporelle comme décrit aux étapes 2.3.9 à 2.3.14.
- Ouvrez la boîte de dialogue Gestionnaire de retard (Figure 2) dans le logiciel de contrôle OPO.
- Scannez l’huile d’olive et réglez l’étape de retard jusqu’à ce que le signal SRS de l’huile d’olive atteigne son maximum.
REMARQUE: Pour la première fois de l’imagerie SRS, lorsque la phase de l’amplificateur de verrouillage n’a pas été optimisée, la synchronisation temporelle est d’abord grossièrement ajustée pour visualiser le signal SRS de l’échantillon avant d’optimiser la phase de l’amplificateur de verrouillage. - Arrêtez l’analyse et cliquez sur le bouton Ajouter des données dans la boîte de dialogue du gestionnaire de retard pour enregistrer les données de retard actuelles.
- Répétez les étapes 2.3. 10 et 2.3.11 pour différents échantillons chimiques à différentes longueurs d’onde.
REMARQUE: Les billes de polystyrène, l’eau lourde, la 5-éthynyl-2′-désoxyuridine, le glycérol sont utilisés pour mesurer les données de retard à différentes bandes vibratoires. - Sélectionnez l’ajustement des données et l’ordre 5 dans la boîte de dialogue du gestionnaire de retard pour adapter les points de données actuels à la fonction polynomique du cinquième ordre. Appliquez les données ajustées en cliquant sur le bouton Utiliser comme personnalisé et en cochant la case. L’étage de retard sera ajusté automatiquement à différentes longueurs d’onde en fonction de la courbe de retard ajustée.
- Enregistrez toutes les données de retard dans un fichier texte, qui peut être chargé pour une utilisation ultérieure.
- Effectuez le réglage de phase de l’amplificateur de verrouillage comme décrit aux étapes 2.3.2. au 2.3.7.
3. Préparation chirurgicale de la souris pour la fluorescence in vivo et l’imagerie SRS
- Stérilisez tous les outils nécessaires, y compris les scalpels, les ciseaux à ressort, les pinces, les couvercles et les tampons de gaze.
- Désinfectez toutes les surfaces qui seraient touchées pendant la chirurgie avec 70% d’éthanol. Couvrez la zone de travail de la paillasse avec des rideaux stériles. Placez un coussin chauffant sous le rideau.
- Utilisez Thy1-YFP-H (Tg(Thy1-YFP)HJrs/J)37 souris transgéniques qui expriment la protéine de fluorescence jaune améliorée (EYFP) dans les neurones afférents du ganglion de la racine dorsale pour l’imagerie in vivo de la moelle épinière. Peser la souris et induire l’anesthésie par injection intrapéritonéale (i.p.) du mélange kétamine-xylazine (87,5 mg kg-1 et 12,5 mg kg-1).
- Pincez l’orteil de la souris pour assurer une anesthésie profonde. Complétez avec la moitié de la dose originale des anesthésiques si nécessaire. Appliquez une pommade sur les yeux de souris pour prévenir la sécheresse de la cornée.
- Rasez les poils sur le dos au-dessus de la colonne thoracique, puis retirez complètement les poils à l’aide d’une crème dépilante. Désinfectez la zone rasée avec une solution d’iode.
- Faites une petite incision médiane (~1,5 cm) de la peau sur la vertèbre T11-T13 avec un scalpel.
- Inciser les muscles et les tendons sur le dessus et sur les côtés de la vertèbre T11-T13 avec des ciseaux à ressort et une pince. Exposez les trois vertèbres adjacentes. Utilisez des tampons de gaze stériles et une solution saline stérile pour contrôler les saignements et nettoyer le site chirurgical.
- Stabilisez la colonne vertébrale à l’aide des deux barres latérales en acier inoxydable sur un étage de stabilisation conçu sur mesure (Figure 2B).
- Utilisez une pince #2 pour effectuer une laminectomie à T12. Utilisez soigneusement la pince pour casser la lame pièce par pièce jusqu’à ce que toute la lame de la vertèbre T12 soit enlevée.
- Lavez le sang qui recouvre la moelle épinière avec une solution saline stérile et utilisez le tampon de gaze pour absorber l’excès de liquide. Appliquez une pression sur le site de saignement avec un morceau de tampon de gaze pour contrôler le saignement.
- Placez un couvercle (22 x 22 mm) sur la barre de serrage et remplissez l’espace entre le couvercle et la moelle épinière avec une solution saline.
4. Imagerie in vivo TPEF-SRS de la moelle épinière de souris
- Montez l’étage de stabilisation sur un étage à cinq axes sous le microscope TPEF-SRS.
REMARQUE: L’étage à cinq axes permet une translation à trois axes et un mouvement de flexion de ±5 ° pas et de roulis. - Fixez la tête de la souris avec deux barres de tête et abaissez la plaque de maintien pour offrir suffisamment d’espace pour le mouvement de la poitrine pendant la respiration, ce qui atténue les artefacts de mouvement.
- Insérez un coussin chauffant sous la souris pour garder la souris au chaud pendant l’imagerie.
- Ajustez l’étape de translation z pour régler la mise au point jusqu’à ce que l’image en champ lumineux de la vascularisation de la moelle épinière puisse être observée sous un objectif 10x.
- Localisez la veine dorsale de la moelle épinière au centre du champ de vision en réglant l’étape translationnelle à deux axes de l’étape à cinq axes.
- Réglez les angles de roulis et de tangage de l’étage à cinq axes pour ajuster la surface dorsale de la moelle épinière perpendiculairement à l’axe de l’objectif en fonction de l’image en champ lumineux.
- Remplacez le 10x par un objectif d’immersion dans l’eau 25x pour l’imagerie TPEF-SRS.
- Réglez la longueur d’onde du faisceau fs sur 920 nm. Réglez la puissance du faisceau fs pour qu’elle soit de 10 mW sur l’échantillon.
- Réglez la longueur d’onde du faisceau de la pompe sur 796 nm. Réglez la puissance de la pompe et du faisceau de Stokes à 60 mW et 75 mW sur l’échantillon, respectivement.
REMARQUE: L’imagerie SRS de la moelle épinière est réalisée au nombre d’onde de 2863,5 cm-1, ce qui correspond au pic Raman des gaines de myéline dans la région carbone-hydrogène sur la base des spectres SRS mesurés7,9. La puissance du laser est déterminée pour assurer l’imagerie TPEF-SRS haute résolution de la moelle épinière. Les lésions tissulaires ne sont pas observées dans les conditions d’imagerie actuelles. - Pour l’imagerie SRS, sélectionnez PBS au-dessus de l’objectif à l’aide d’une nageoire motorisée en appuyant sur le bouton Switch connecté à la nageoire motorisée.
- Définissez les paramètres d’imagerie comme suit : 512 x 512 pixels pour un champ de vision de 150 μm x 150 μm, temps de séjour en pixels de 3,2 μs, constante de temps de 2 μs.
- Commencez à scanner l’échantillon et mettez l’accent sur la surface dorsale de la moelle épinière.
- Réglez finement l’étage de retard par le logiciel de contrôle OPO jusqu’à ce que le signal SRS maximal de la moelle épinière soit atteint.
REMARQUE: Les échantillons biologiques peuvent induire une dispersion chromatique supplémentaire, l’étape de retard peut nécessiter d’être ajustée pour optimiser la synchronisation temporelle. Cependant, lorsque l’imagerie SRS est effectuée près de la surface supérieure du tissu, la différence temporelle des deux impulsions laser introduites par le tissu biologique et la fenêtre d’imagerie est généralement faible (moins de plusieurs centaines de fs). - Pour l’imagerie TPEF, sélectionnez le miroir dichroïque D2 au-dessus de l’objectif à l’aide d’un flipper motorisé en appuyant sur le bouton Switch connecté au flipper motorisé.
- Définissez les paramètres d’imagerie et commencez à analyser l’échantillon. Pour capturer la pile d’images TPEF-SRS, acquérez les images TPEF et SRS séquentiellement avec un intervalle de 1 s à la même profondeur avant de passer à la profondeur suivante. Les paramètres d’imagerie pour l’imagerie TPEF sont de 512 x 512 pixels, 150 μm x 150 μm FOV, 3,2 μs pixel temps de séjour.
- Retirez l’animal de l’étape de stabilisation une fois que toutes les images ont été collectées.
- Nettoyez les tissus exposés en rinçant la solution saline et absorbez l’excès de liquide à l’aide d’un tampon de gaze. Appliquez du gel de silicone sur la moelle épinière exposée et attendez environ 5 minutes jusqu’à ce qu’elle soit guérie.
- Suturez la peau avec une suture chirurgicale #6-0 pour fermer la plaie. Appliquer une crème contre les brûlures sur la peau du site chirurgical pour prévenir l’infection. Administrer un traitement analgésique par voie sous-cutanée (0,1 mg/kg de buprénorphine).
- Placez l’animal dans une cage propre et placez la cage sur un coussin chauffant jusqu’à ce que la souris se rétablisse complètement de l’anesthésie.
- Répétez l’administration d’analgésiques toutes les 12 heures pendant 3 jours après la chirurgie.
- Fermez l’obturateur du laser OPO et fs. Réglez la puissance de la pompe et du faisceau de Stokes au maximum.
REMARQUE: Régler la puissance maximale avant d’éteindre le laser est bénéfique pour la maintenance du laser. - Réglez la longueur d’onde du faisceau de la pompe et du laser fs sur 800 nm.
- Mettez les deux lasers en veille, fermez tous les logiciels de contrôle électronique et éteignez tous les équipements associés.
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Representative Results
L’imagerie bimodale in vivo des axones de la colonne vertébrale ainsi que des gaines de myéline est réalisée à l’aide de souris transgéniques Thy1-YFPH, qui expriment l’EYFP dans les neurones afférents des ganglions de la racine dorsale (Figure 3). Ces neurones afférents marqués relaient l’information sensorielle du nerf périphérique à la moelle épinière, la branche centrale étant située dans la colonne dorsale de la moelle épinière. Avec le microscope TPEF-SRS, la gaine de myéline densément distribuée peut être clairement visualisée à l’aide de l’imagerie SRS sans étiquette, et les axones YFP peu marqués peuvent être observés à l’aide de l’imagerie TPEF. Il est révélé par l’imagerie à double modèle que les axones sont étroitement enveloppés par une épaisse couche de gaines de myéline (Figure 3C). Les nœuds de Ranvier (NR), où l’axolemme est dénudé de la gaine de myéline, jouent un rôle essentiel dans la propagation salanière rapide des potentiels d’action. Comme on peut le voir sur l’image de la moelle épinière TPEF-SRS (Figure 3C), les NR montrent une diminution du diamètre axonal et de l’axolemme directement exposé à la matrice extracellulaire. Il est essentiel d’imager les axones avec les gaines de myéline environnantes pour confirmer l’existence et l’emplacement de NR. Par conséquent, la microscopie TPEF-SRS nous permet d’observer les changements dynamiques des axones et des gaines de myéline dans le développement des troubles de la moelle épinière, ce qui est important pour comprendre les mécanismes de la dynamique cellulaire.
Figure 1 : Schéma du système de microscope TPEF-SRS. La pompe et les faisceaux de Stokes sont combinés avec un miroir dichroïque (D1) dans le laser picoseconde (ps). Le faisceau ps et le faisceau femtoseconde (fs) sont collimés et dilatés/rétrécis par une paire de lentilles (L3, L4 et L1, L2, respectivement) pour correspondre aux miroirs galvanométriques XY-scan de 3 mm. Le faisceau fs est tourné de la polarisation horizontale à la polarisation verticale par une plaque demi-onde (HWP), puis combiné avec le faisceau ps par un séparateur de faisceau polarisant (PBS). Les rétroviseurs de balayage et la pupille arrière de l’objectif sont conjugués par une lentille de balayage télécentrique L5 et une lentille tubulaire corrigée à l’infini L6. Le faisceau laser est élargi par la lentille de balayage et de tube pour remplir l’ouverture arrière de l’objectif 25x. Pour l’imagerie par diffusion Raman stimulée (SRS), le faisceau de pompe rétrodiffusé collecté par l’objectif est réfléchi par un PBS et dirigé vers une photodiode au silicium (PD) de grande surface (10 mm x 10 mm). Pour l’imagerie à deux photons, le signal de fluorescence excitée à deux photons (TPEF) est réfléchi par un séparateur de faisceau dichroïque D2 vers l’unité de photodétection. Un module photomultiplicateur de courant (PMT) est utilisé pour détecter le signal TPEF. Abréviations-L1-L10: lentilles; OL: lentille d’objectif; D1-D3: miroirs dichroïques; Fs1, Fs2: jeux de filtres; M: miroirs; OM1, OM2: miroirs optiques; P0-P2 : plaques d’alignement. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Interface du gestionnaire de retard sur le logiciel de contrôle OPO. La flèche rouge indique la case à cocher pour l’application des données de retard calibrées. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Imagerie IN VIVO TPEF-SRS de la moelle épinière de la souris. (A) Schéma de la préparation chirurgicale de la moelle épinière de la souris et de l’image en champ lumineux de la moelle épinière. (B) Schéma de montage de la souris pour l’imagerie in vivo de la moelle épinière. (C) Images de projection z maximale des gaines d’axones et de myéline dans la moelle épinière de la souris. Les pointes de flèches blanches indiquent l’emplacement d’un nœud de Ranvier. Les images SRS de la myéline sont prises au décalage Raman de 2863,5 cm-1. La figure A a été créée à l’aide de BioRender (https://biorender.com/). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
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Discussion
Dans ce protocole, la configuration de base du microscope TPEF-SRS est décrite en détail. Pour l’imagerie SRS, la pompe et les faisceaux stokes se chevauchent temporellement et spatialement à l’intérieur de l’OPO. Cependant, ce chevauchement peut être perturbé après le passage dans le système de microscope. Par conséquent, l’optimisation spatiale et temporelle de la colocalisation de la pompe et des faisceaux de Stokes est nécessaire et essentielle pour obtenir une imagerie SRS optimale. Le délai temporel entre la pompe et le faisceau de Stokes est lié à la différence de chemin optique des deux faisceaux, qui est déterminée par la dispersion des éléments optiques dans le système de microscope38. Lorsque la longueur d’onde du faisceau de la pompe est réglée pour l’imagerie SRS à différents décalages Raman, la longueur du chemin optique du faisceau de la pompe change en conséquence car l’indice de réfraction des lentilles optiques dépend de la longueur d’onde38. Par conséquent, le délai temporel entre la pompe et l’impulsion laser Stokes change avec la longueur d’onde du faisceau de la pompe et doit donc être étalonné. L’OPO est équipé d’une ligne de retard contrôlée par logiciel pour la synchronisation temporelle de la pompe et du faisceau de Stokes. Pour une même configuration optique, les données de retard restent stables et ne doivent être étalonnées qu’une seule fois. En conséquence, les données de retard à différentes longueurs d’onde du faisceau de la pompe peuvent être enregistrées lors de la première mesure pour une utilisation future. Les données de retard calibrées peuvent être appliquées automatiquement par le logiciel de contrôle OPO lorsque la longueur d’onde du faisceau de la pompe est modifiée, ce qui est pratique pour l’imagerie SRS à différents décalages Raman ou l’imagerie SRS hyperspectrale. Pour l’imagerie TPEF-SRS, le chevauchement spatial strict des faisceaux ps et fs après la combinaison est une étape critique pour éviter tout décalage FOV entre les deux modèles d’imagerie. Tout d’abord, le faisceau de la pompe ps et le faisceau fs sont alignés pour s’assurer qu’ils sont tous deux sur l’axe optique du système de microscope, ce qui est essentiel pour éviter tout décalage FOV lors de la commutation des deux modèles d’imagerie. Ensuite, en utilisant le faisceau de la pompe comme référence, la position du faisceau de Stokes est ajustée en conséquence pour obtenir une colocalisation spatiale stricte. Chaque procédure d’alignement nécessite plusieurs essais pour atteindre l’optimum.
Si le signal SRS diminue de manière significative, la valeur de phase de l’amplificateur de verrouillage et les données de délai doivent d’abord être vérifiées. Étant donné que l’amplificateur de verrouillage se déphase une fois que le signal de synchronisation est perturbé, la valeur de phase doit être réajustée à chaque fois que son alimentation ou son signal de synchronisation EOM est interrompu. La synchronisation temporelle de la pompe et du faisceau stokes peut être rapidement vérifiée en ajustant légèrement la ligne de retard à l’intérieur de l’OPO. Si les données de délai calibrées sont éloignées de la valeur optimale, une analyse zéro doit être effectuée pour recalibrer le décalage de délai en cliquant sur le bouton Zéro analyse dans la boîte de dialogue du gestionnaire de retard. L’ensemble de la procédure d’analyse zéro prend environ 10 minutes. Si le signal SRS ne parvient pas à se rétablir après optimisation de la valeur de phase et de retard, la modulation EOM du faisceau stokes doit être vérifiée comme décrit aux étapes 2.1.3-2.1.4. Si le rapport d’extinction est bien inférieur à 10 dB avec l’observation de petits pics d’impulsion à la position d’arrêt du train d’impulsions de Stokes, la MOE doit être redémarrée et la puissance et la phase de modulation doivent être réajustées pour atteindre une profondeur de modulation maximale. Habituellement, le problème de modulation peut être résolu en réinitialisant la MOE. Si ce n’est pas le cas, une assistance technique du fabricant devrait être requise.
Pour l’imagerie tissulaire épaisse in vivo , le mode de détection epi-SRS doit être utilisé. Dans ce protocole, un PBS est utilisé pour passer le laser d’excitation et réfléchir le signal SRS rétrodiffusé au détecteur. Le signal SRL détecté dépend de la rétrodiffusion du faisceau de pompe vers l’avant par les tissus. Les lasers d’excitation ont une polarisation linéaire et peuvent traverser complètement le PBS, tandis que le faisceau rétrodiffusé a changé de polarisation et ne peut donc être que partiellement réfléchi par le PBS. Par conséquent, le schéma actuel de collecte des signaux montre une efficacité inférieure à celle de la stratégie qui place directement un photodétecteur annulaire devant l’objectif12. Néanmoins, en raison de la forte diffusion des tissus riches en lipides39, des images SRS à rapport signal/bruit élevé (512 x 512 pixels) de la moelle épinière peuvent être acquises avec un temps d’intégration de 1 à 2 s, ce qui fait de ce schéma de collecte basé sur PBS une approche appropriée pour l’imagerie de la moelle épinière. D’autre part, cependant, la forte diffusion des tissus limite la profondeur de pénétration de la lumière. Pour l’imagerie SRS et TPEF, la profondeur d’imagerie de la moelle épinière est limitée à environ 50 μm.
La procédure d’imagerie séquentielle pour l’imagerie SRS et TPEF est la principale limite de la méthode d’imagerie bimodale actuelle. Dans le protocole, l’imagerie TPEF et SRS est effectuée au même endroit séquentiellement avec un intervalle de 1 s en commutant automatiquement la nageoire motorisée. Les artefacts de mouvement peuvent provoquer une fusion imparfaite des images TPEF et SRS, ce qui limite la capacité de cette méthode à imager des processus hautement dynamiques ou des tissus largement affectés par la respiration et le rythme cardiaque des animaux. Une solution possible consiste à collecter simultanément la fluorescence à deux photons excitée par laser ps pendant l’imagerie SRS9. Cependant, cette méthode n’est applicable qu’aux structures biologiques avec de forts signaux de fluorescence, car l’impulsion ps a une efficacité d’excitation de fluorescence beaucoup plus faible que l’impulsion fs14. Alternativement, le problème peut être résolu en utilisant un système fs-SRS22,40, où la source laser fs permet une excitation simultanée des signaux SRS et TPEF efficacement, au détriment de la faible résolution spectrale de l’imagerie SRS. Une autre solution consiste à utiliser la fluorescence excitée par laser ps obtenue lors de l’imagerie SRS comme référence pour enregistrer les images de fluorescence fs. Comme le montre la figure 3, cette stratégie d’enregistrement fonctionne bien si aucun mouvement significatif ne se produit pendant l’imagerie SRS et fluorescence.
SRS présente des avantages uniques en imagerie biologique puisqu’il fournit des informations chimiques sur les biomolécules sur la base de son mécanisme de contraste spécifique sans étiquette41. Comparé à CARS qui a également été combiné avec TPEF pour l’imagerie NLO multimodale, SRS a montré une meilleure capacité d’interprétation spectrale et d’image11. Par conséquent, il a été largement appliqué pour l’imagerie des lipides9,11, des protéines42,43, de l’ADN44 et des composants bio-orthogonaux contenant des liaisons alcyne (C ≡ C)13,45, carbone-deutérium (C−D)9,46 et oxygène-deutérium (O-D)47,48 dans les tissus biologiques. Dans ce protocole, nous avons utilisé une source laser ps pour l’imagerie SRS et une source laser fs pour l’imagerie TPEF, qui combine les avantages d’une excitation de fluorescence efficace et d’une résolution spectrale Raman élevée, permettant une différenciation efficace de diverses biomolécules42,44. Dans la moelle épinière, les interactions complexes cellule-microenvironnement impliquant des cellules gliales, des neurones et des cellules immunitaires recrutées contribuent à la progression des blessures49 et des maladies50. Combinée à diverses sondes d’imagerie de fluorescence et de SRS, la microscopie TPEF-SRS peut réaliser une imagerie simultanée de diverses structures cellulaires ainsi que de leurs composants biomolécules distincts, ce qui peut faciliter considérablement notre compréhension de l’apparition et du développement des troubles de la moelle épinière.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer et n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par le Hong Kong Research Grants Council par le biais de subventions 16103215, 16148816, 16102518, 16102920, T13-607/12R, T13-706/11-1, T13-605/18W, C6002-17GF, C6001-19E, N_HKUST603/19, la Commission de l’innovation et de la technologie (ITCPD/17-9), le programme de domaine d’excellence du Comité des subventions universitaires (AoE/M-604/16, AOE/M-09/12) et l’Université des sciences et technologies de Hong Kong (HKUST) par le biais de la subvention RPC10EG33.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| #2 Forceps | Dumont | 11223-20 | For laminectomy |
| 10X objective | Nikon | CFI Plan Apo Lambda 10X | |
| 25X objective | Olympus | XLPLN25XSVMP2 | |
| Burn cream | Betadine | ||
| Camera | Sony | α6300 | |
| Current amplifier | Stanford research | SR570 | |
| Current photomultiplier modules | Hamamatsu | H11461-01 | |
| D2 665 nm long-pass dichroic mirror | Semrock | FF665-Di02-25x36 | For directing epi-fluorescence signal to the detection module |
| D3 700 nm short-pass dichroic mirror | Edmund | 69-206 | For separating SRS from TPEF detection path |
| Depilating cream | Veet | ||
| FS1 975 nm short-pass filter | Edmund | 86-108 | For blocking stokes beam |
| FS1 Bandpass filter | Semrock | FF01-850/310 | For blocking stokes beam |
| Fs2 Bandpass filter | Semrock | FF01-525/50 | For selecting YFP signal |
| Fs2 Shortpass filter | Semrock | FF01-715/SP-25 | For blocking fs excitation laser beam |
| Half-wave plate | Thorlabs | SAHWP05M-1700 | |
| High-speed photodetector | MenloSystems | FPD 310-F | For checking Stokes beam modulation |
| Iodine | Betadine | ||
| IR Scope | FJW | FIND-R-SCOPE Infrared Viewer 2X Kit Model 84499C2X | |
| Iris | Thorlabs | CPA1 | |
| L1 | Thorlabs | AC254-060-B-ML | |
| L10 | Thorlabs | LA4052-A | |
| L2 | Thorlabs | LA1422-B | |
| L3 | Thorlabs | AC254-050-B | |
| L4 | Thorlabs | AC254-060-B-ML | |
| L7 | f=100 mm, AB coating | ||
| L8 | Thorlabs | LA4874-A | |
| L9 | Thorlabs | AC254-035-B-ML | |
| Lock-in amplifier | APE | ||
| Mirror | Thorlabs | PF10-03-P01 | |
| Motorized flipper | Thorlabs | MFF101/M | |
| multifunctional acquisition card | National Instrument | PCIe-6363 | |
| Oscilloscope | Tektronix | TDS2012C | |
| Photodiode | APE | For detecting SRS signal | |
| Picosecond laser source | APE | picoEmerald | |
| Polarizing beam splitter | Thorlabs | CCM1-PBS252/M | |
| Power meter | Newport | 843-R | |
| Saline | Braun | ||
| Scan lens L5 | Thorlabs | SL50-CLS2 | |
| Scanning mirror | Cambridge Technology | 6215H | |
| Silicone gel | World Precision Inc. | KWIK-SIL | |
| Ti:sapphire fs laser | Coherent | Chameleon Ultra II | |
| Tube lens L6 | Thorlabs | TTL200-S8 |
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