Summary
בלוטת יותרת המוח היא הרגולטור העיקרי של המערכת האנדוקרינית של הגוף. מאמר זה מתאר את ההתפתחות של organoids מן בלוטת יותרת המוח העכבר כמו מודל הפריה חוץ גופית 3D רומן לחקור את אוכלוסיית תאי הגזע של הבלוטה אשר הביולוגיה והתפקוד נשארים מובנים היטב.
Abstract
בלוטת יותרת המוח היא בלוטת האנדוקרינית הראשית ויסות תהליכים פיזיולוגיים מפתח, כולל צמיחת הגוף, חילוף החומרים, התבגרות מינית, רבייה, ותגובת מתח. לפני יותר מעשור, תאי גזע זוהו בבלוטת יותרת המוח. עם זאת, למרות היישום של גישות vivogenic, פנוטיפ שלהם, ביולוגיה, ותפקיד עדיין לא ברור. כדי להתמודד עם תעלומה זו, מודל חדש וחדשני אורגנויד במבחנה מפותחת כדי לפענח עמוק ביולוגיה של תאי גזע בלוטת יותרת המוח. אורגנוידים מייצגים מבני תאים תלת-ממדיים, אשר בתנאי תרבית מוגדרים, מתפתחים באופן עצמי מתאי גזע (אפיתל) של רקמה ומסמנים מחדש סימני היכר מרובים של תאי גזע אלה ורקמתם. זה מוצג כאן כי אורגנוידים שמקורם בבלוטת יותרת המוח מפתחים מתאי הגזע של הבלוטה, בנאמנות recapitulate שלהם in vivo phenotypic ומאפיינים פונקציונליים. בין היתר, הם משחזרים את מצב ההפעלה של תאי הגזע כמו ויוו המתרחשים בתגובה לנזק מקומי שנגרם מהונדסים. האורגנוידים ניתנים להרחבה לטווח ארוך תוך שמירה איתנה על פנוטיפ הגבעול שלהם. מודל המחקר החדש הוא בעל ערך רב כדי לפענח את הפנוטיפ של תאי הגזע והתנהגות במהלך תנאים מרכזיים של שיפוץ בלוטת יותרת המוח, החל התבגרות יילודים כדי דהייה הקשורים להזדקנות, ומ בריא לבלוטות חולים. כאן, פרוטוקול מפורט מוצג כדי להקים אורגנוידים שמקורם בבלוטת יותרת המוח עכבר, אשר מספקים כלי רב עוצמה לצלול לתוך העולם עדיין חידתי של תאי גזע בלוטת יותרת המוח.
Introduction
בלוטת יותרת המוח היא בלוטה אנדוקרינית זעירה הממוקמת בבסיס המוח, שם היא מחוברת להיפותלמוס. הבלוטה משלבת תשומות היקפיות ומרכזיות (היפותלמיות) כדי ליצור שחרור הורמונלי מכוון ומתואם, ובכך מווסתת איברים אנדוקריניים למטרה במורד הזרם (כגון בלוטות יותרת הכליה ובלוטות המין) לייצור הורמונים מתאימים בזמן הנכון. בלוטת יותרת המוח היא הרגולטור העיקרי של המערכת האנדוקרינית ולכן הוא מכונה בצדק בלוטת הורים1.
בלוטת יותרת המוח של העכבר מורכבת משלוש אונות (איור 1), כלומר, האונה הקדמית (AL), האונה האמצעית (IL) והאונה האחורית (PL). AL האנדוקרינית העיקרית מכילה חמישה סוגי תאים הורמונליים, כולל סומטוטרופים המייצרים הורמון גדילה (GH); לקטוטרופים המייצרים פרולקטין (PRL); קורטיקוטרופים המפרישים הורמון adrenocorticotropic (ACTH); תירוטרופים האחראים על ייצור הורמון מגרה בלוטת התריס (TSH); וגונדוטרופים שהופכים הורמון מחלמן (LH) והורמון מגרה זקיק (FSH). PL מורכב תחזיות אקסונליות מן ההיפותלמוס שבו ההורמונים אוקסיטוצין ו vasopressin (הורמון antidiuretic) מאוחסנים. ה- IL ממוקם בין AL ו- PL ובתים מלנוטרופים המייצרים הורמון מגרה מלנוציטים (MSH). בבלוטת יותרת המוח האנושית, IL נסוג במהלך הפיתוח, מלנוטרופים מופצים בתוך AL1. בנוסף לתאים האנדוקריניים, בלוטת יותרת המוח מכיל גם בריכה של תאי גזע, מסומן בעצם על ידי גורם שעתוק SOX2 2,3,4,5,6. תאי SOX2+ אלה ממוקמים באזור השולי (MZ), בטנת האפיתל של השסע (לומן שריד עוברי בין AL ל- IL), או מפוזרים כאשכולות לאורך הפרנצ'ימה של AL, ובכך מציעים שתי נישות תאי גזע בבלוטה (איור 1)2,3,4,5,6.
בהתחשב באופי החיוני של בלוטת יותרת המוח, תקלה של הבלוטה קשורה עם תחלואה חמורה. Hyperpituitarism (מאופיין על ידי הפרשת יתר של הורמון אחד או יותר) ו hypopituitarism (ייצור פגום או חסר של הורמון אחד או יותר) יכול להיגרם על ידי גידולים נוירואנדוקריניים יותרת המוח (PitNETs; למשל, גידולים המייצרים ACTH המובילים למחלת קושינג) או על ידי פגמים גנטיים (למשל, חוסר GH וכתוצאה מכך גמדות)7. בנוסף, ניתוח בלוטת יותרת המוח (למשל, כדי להסיר גידולים), זיהומים (למשל, שחפת ההיפותלמוסית-יותרת המוח, או זיהומים בעקבות דלקת קרום המוח חיידקית או דלקת המוח), תסמונת שיאן (נמק בגלל זרימת דם לא מספקת עקב איבוד דם כבד בלידה- מתן), אפופלקסיה בלוטת יותרת המוח ופגיעה מוחית טראומטית הם גורמים חשובים אחרים של hypofunction בלוטת יותרת המוח8 . הוכח כי בלוטת יותרת המוח העכבר בעל יכולת התחדשות, להיות מסוגל לתקן נזק מקומי הציג על ידי אבלציה מהונדסת של תאים אנדוקריניים 9,10. תאי הגזע SOX2+ מגיבים בחריפות לפציעה שנגרמה מראה פנוטיפ פעיל, מסומן על ידי התפשטות משופרת (וכתוצאה מכך התרחבות תאי גזע) וביטוי מוגבר של גורמים ומסלולים הקשורים לגבעול (למשל, WNT / NOTCH). יתר על כן, תאי הגזע מתחילים לבטא את ההורמון ablated, ולבסוף וכתוצאה מכך שיקום משמעותי של אוכלוסיית התאים המדולדלים במהלך החודשים הבאים (5 עד 6) 9,10. כמו כן, במהלך שלב ההתבגרות היילוד של הבלוטה (3 השבועות הראשונים לאחר הלידה), תאי הגזע של בלוטת יותרת המוח משגשגים במצב פעיל 6,11,12,13, ואילו הזדקנות אורגניזמית קשורה לירידה בתפקוד תאי הגזע במקום, עקב סביבה דלקתית גוברת (מיקרו)בהזדקנות (או 'הדלקה')10,14 . בנוסף, tumorigenesis בבלוטה קשורה גם עם הפעלת תאי גזע 7,15. למרות הפעלת תאי גזע זוהתה במספר מצבים של שיפוץ בלוטת יותרת המוח (נסקר ב 7,16), המנגנונים הבסיסיים עדיין לא ברורים. מאז in vivo גישות (כגון מעקב שושלת בעכברים מהונדסים) לא סיפקו תמונה ברורה או מקיפה של תאי גזע בלוטת יותרת המוח, פיתוח של מודלים במבחנה אמין לחקור ביולוגיה של תאי גזע בלוטת יותרת המוח נורמלית וחולנית היא חיונית. תרבות הפריה חוץ גופית סטנדרטית של תאי גזע בלוטת יותרת המוח העיקריים נשאר לקוי בגלל יכולת צמיחה מוגבלת מאוד ותנאים לא פיזיולוגיים (2D) עם אובדן מהיר של פנוטיפ (לסקירה מפורטת יותר, ראה16). תרביות כדור 3D (pituispheres) הוקמו מתאי גזע בלוטת יותרת המוח כפי שזוהו על ידי אוכלוסייה צדדית ופנוטיפ SOX2 + 2,3,4. הפיתוספירות גדלות באופן קלונלי מתאי הגזע, מבטאות סמני גזע ומראים יכולת בידול לסוגי התאים האנדוקריניים. עם זאת, הם אינם מתרחבים במידה ניכרת תוך הצגת מעבר מוגבלת בלבד (2-3 קטעים)3,4. מבנים דמויי כדור התקבלו גם מקבצי תאי גזע לא מנותקים של יותרת המוח כאשר הם מתורבתים ב-50% מטריגל מדולל במשך שבוע אחד, אך יכולת ההרחבה לא הוצגה17. הגישה pituisphere משמש בעיקר ככלי קריאה עבור מספרי תאי גזע, אבל יישומים נוספים מוגבלים על ידי יכולת הרחבה נחותה16.
כדי לטפל ולהתגבר על חסרונות אלה, מודל 3D חדש הוקם לאחרונה, כלומר, organoids, החל AL האנדוקרינית העיקרית של עכברים המכילים את תאי הגזע MZ ו parenchymal. הוכח כי האורגנוידים אכן נגזרים מתאי הגזע של בלוטת יותרת המוח, בנאמנות recapitulate הפנוטיפ שלהם18. יתר על כן, האורגנוידים ניתנים להרחבה לטווח ארוך, תוך שמירה איתנה על טבע הגבעול שלהם. לכן, הם מספקים שיטה אמינה להרחיב תאי גזע בלוטת יותרת המוח העיקריים לחקר מעמיק. מחקר כזה אינו בר השגה עם מספר מוגבל של תאי גזע שניתן לבודד מ יותרת המוח, אשר גם אינם ניתנים להרחבה בתנאים 2D16. הוכח כי organoids הם כלים יקרי ערך ואמינים לחשוף תכונות תאי גזע בלוטת יותרת המוח חדשים (מתורגם in vivo)14,18. חשוב לציין, מודל organoid משקף בנאמנות את מצב הפעלת תאי הגזע בלוטת יותרת המוח כפי שהתרחשו במהלך נזק לרקמות מקומיות והתבגרות יילודים, מראה יעילות היווצרות משופרת ושכפול מסלולים מולקולריים upregulated 14,18. לפיכך, מודל organoid שמקורו בבלוטת יותרת המוח הוא חדשני ורב עוצמה יותרת המוח ביולוגיה של תאי גזע מודל מחקר, כמו גם כלי קריאת הפעלת תאי גזע.
פרוטוקול זה מתאר בפירוט את הקמתם של אורגנוידים שמקורם בבלוטת יותרת המוח של העכבר. לשם כך, האל על מבודדת ומנותקת לתאים בודדים, המוטמעים במטריצה חוץ-תאית המחקה מטריגל (להלן ECM). הרכבה תא-ECM הוא אז תרבית במדיום מוגדר, בעצם המכיל גורמי גדילה של תאי גזע ורגולטורים עובריים בלוטת יותרת המוח (המכונה עוד יותרת המוח 'מדיום organoid בלוטת יותרת המוח' (PitOM)18; טבלה 1). לאחר האורגנוידים מפותחים במלואם (לאחר 10-14 ימים), ניתן להרחיב אותם עוד יותר מעבר רציף שוקת ונתונים לחקירה נרחבת במורד הזרם (למשל, אימונופלואורסצנטיות, RT-qPCR, ותמלול בתפזורת או חד-תאית; איור 1). בטווח הארוך יותר, צפוי כי organoids תא גזע בלוטת יותרת המוח יסלול את הדרך תיקון רקמות גישות ורפואה רגנרטיבית.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ניסויים בבעלי חיים למחקר זה אושרו על ידי הוועדה האתית של KU Leuven לניסויים בבעלי חיים (P153/2018). כל העכברים שוכנו במתקן החיות של האוניברסיטה בתנאים סטנדרטיים (טמפרטורה קבועה של 23 ± 1.5 מעלות צלזיוס, לחות יחסית 40%-60%, ומחזור יום /לילה של 12 שעות), עם גישה למים ומזון עד ליביטום.
1. עכברים
- השתמש בזני עכבר זמינים מסחרית, כגון עכברי C57BL/6J, בגיל צעיר-מבוגר (בני 8-12 שבועות). באופן כללי, 2-3 עכברים מספקים מספר מספיק של תאי AL לפרוטוקול.
2. בידוד וניתוק של העכבר AL
הערה: בינוני A, B ו- C מוכנים מראש19,20. קומפוזיציות מוצגות בטבלה 2.
- בידוד של עכבר אל על
- הרדים את העכברים על ידי חנק CO2 , ואחריו עריפת ראש (איור 2A). לשטוף ראשי עכברים עם מים deionized כדי להסיר את הדם לרסס אותם עם 70% EtOH כדי ליצור סביבה סטרילית.
- בעזרת כלים כירורגיים סטריליים, הסירו את עור הראש בין האוזניים (איור 2B).
- פתח את הגולגולת והסר את המוח.
- לשבור את 'גשר האף' (כלומר, חלק קדמי של העצם הקדמית; איור 2B) עם מספריים סטריליות.
- פתחו את הגולגולת עוד יותר עם מספריים, החל מגשר האף השבור לכיוון האוזניים, משני הצדדים (איור 2C).
- הסר את הגולגולת ואת המוח עם פינצטה סטרילית, מבלי לגעת בבלוטת יותרת המוח (איור 2D).
- הסר את סלה הסרעפת עם פינצטה קהה, מבלי לפגוע בבלוטת יותרת המוח. השלך את ה- PL ואת ה- IL מה- AL תחת סטריאומיקרוסקופ.
הערה: PL ו- IL מקושרים ולכן מוסרים בו זמנית. חלקים אלה מופיעים כרקמה לבנה, בהשוואה ל-AL בצבע ורוד (איור 2D). - בזהירות לבודד את AL עם פינצטה קהה ולאסוף אותו בקבוק 10 מ"ל Erlenmeyer, מלא 3 מ"ל של בינוני A (ראה טבלה 2). מניחים את הבקבוקון על הקרח עד לעיבוד נוסף.
- ניתוק של עכבר AL
- הסר את המדיום העל-טבעי (SN) A מבקבוק ארלנמייר המכיל את ה- AL המבודד. הוסף 2 מ"ל של תמיסת טריפסין 2.5% טרום המלחמה (37 °C) ודגר ב 37 °C (15 °F) במשך 15 דקות.
- מבלי להסיר את פתרון הטריפסין, הוסיפו 2 מ"ל של פתרון DNase לפני המלחמה (37 °C) (2 מיקרוגרם / מ"ל במדיום A; סינון סטרילי באמצעות רשת של 0.22 מיקרומטר), וסובבו את בקבוק ארלנמייר 10 פעמים. תן את בלוטת יותרת המוח לשקוע לתחתית (~ 1 דקות) ולהסיר את SN.
- יש להוסיף 2 מ"ל של תמיסת מעכב טריפסין (37°C) (0.1 מ"ג/מ"ל במדיום A; מסונן באמצעות רשת של 0.22 מיקרומטר) ולדגור ב-37°C למשך 10 דקות. תן את משקע בלוטת יותרת המוח לתחתית ולהסיר את SN.
- יש להוסיף 2 מ"ל של B בינוני (37°C) לפני המלחמה (ראו טבלה 2) ולדגור ב-37°C למשך 5 דקות. מבלי להסיר את ה-SN, הוסיפו 2 מ"ל של C בינוני (37 מעלות צלזיוס) (ראו טבלה 2) ודגרו ב-37 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות.
- תן את בלוטת יותרת המוח לשקוע לתחתית ולהסיר את SN. לשטוף את בלוטת יותרת המוח שלוש פעמים עם מראש (37 °C )? C בינוני.
- לנתק את בלוטת יותרת המוח לתאים בודדים.
- הוסף 2 מ"ל של prewarmed (37 °C) בינוני C. שאיפה ולגרש את בלוטת יותרת המוח עם סטרילי, מלוטש להבה פסטר פיפטה פיפטה מספר פעמים, עד שברים אינם נראים יותר.
- מעבירים את המתלים לצינור 15 מ"ל עם 4.5 מ"ל של פתרון DNase (37 °C) (2 מיקרוגרם / מ"ל בינוני A; מסונן סטרילי באמצעות רשת של 0.22 מיקרומטר). לשטוף את Erlenmeyer שלוש פעמים עם 2 מ"ל של מראש (37 °C) בינוני C ולהעביר את ההשעיה לצינור 15 מ"ל.
- מערבבים את ההשעיה התא שנאספה ולסנן אותו דרך מסננת תא 40 מיקרומטר לתוך צינור 30 מ"ל. לשטוף את צינור 15 מ"ל ואת מסננת התא שלוש פעמים עם 2 מ"ל של C בינוני ולהעביר את ההשעיה לצינור 30 מ"ל.
- מקם את הקצה של פיפטה פסטר זכוכית, מלא 2 מ"ל של 3% סלמון סרום בקר (BSA) פתרון (בינוני A; סטרילי מסונן דרך רשת 0.22 מיקרומטר), בתחתית הצינור בעדינות פיפטה החוצה כדי ליצור שכבת צפיפות גלויה. צנטריפוגה ב 190 x g במשך 10 דקות ב 4 °C (65 °F).
- הסר את SN על ידי היפוך הצינור בתנועה שוטפת אחת ולהסיר את טיפות SN הנותרות עם קצה P1000. לפנק מחדש את גלולה התא ב 1 מ"ל של קר כקרח מתקדם DMEM / F12 (עו"ד DMEM / F12) ולכמת את התאים עם מונה תא.
3. הקמה ופולחן של אורגנוידים שמקורם באל על
הערה: להפשיר ECM על קרח מראש (2-3 שעות עבור 1 מ"ל) ולשמור אותו על קרח למשך הפרוטוקול.
- זריעת אורגנויד ופולחן
- צנטריפוגה ההשעיה תא AL ב 190 x g במשך 10 דקות ב 4 °C (4 °F) ולהסיר את SN. Resuspend גלולה התא עו"ד DMEM / F12 באמצעות אמצעי האחסון הספציפי מחושב כדי להגיע לצפיפות תאים של 1.1 x 106 תאים / מ"ל.
הערה: לדוגמה, אם ההשעיה התאית מכילה 500,000 תאים / מ"ל, יש לחדש את גלולה התא ב 454.54 μL של Adv DMEM / F12 כדי להגיע לצפיפות הרצויה של 1.1 x 106 תאים / מ"ל. - להוציא את נפח ההשעיה התא הדרוש לציפוי (על פי המספר הרצוי של בארות לזרע להתפתחות organoid) ולהוסיף ECM ביחס 30:70 (30% השעיית תאים (ב עו"ד DMEM / F12 ) ו 70% ECM). מערבבים היטב על ידי צנרת למעלה ולמטה.
הערה: לדוגמה, עבור טיפה אחת של 30 μL (ראה שלב 3.1.3), יש לערבב (בעדינות) 9 μL של השעיית תא (המכיל ~ 10,000 תאים כאשר נלקח מן 1.1 x 1010 6 תאים / השעיה מ"ל) עם 21 μL של ECM. - לבאר, להפקיד טיפה 30 μL של תערובת השעיית התא / ECM (ראה שלב 3.1.2) על צלחת מחוממת מראש (37 °C ) 48-well. להפוך את הצלחת ולתת ECM להתמצק ב 37 °C (50 °F) במשך 20 דקות.
הערה: מחממים מראש את צלחות התרבות לפחות 24 שעות ב-37 מעלות צלזיוס. - החזירו את הצלחת לכיוון הנכון שלה והוסיפו בזהירות 250 μL של PitOM לפני המלחמה (37 °C) (ראה טבלה 1) בתוספת 10 מעכבי סלע מיקרומטר (Y-27632).
- המשיכו לתרבות את האורגנוידים על ידי שינוי המדיום (נטול Y-27632) כל 2-3 ימים עד שהאורגנואידים יגדלו במלואם, וזה לוקח בין 10-14 ימים (איור 3A). לאחר מכן, להעביר את האורגנוידים.
הערה: בעת שאיפת המדיום, הקפד לא לשבש את כיפת ECM. הטה מעט את צלחת התרבות והסר את המדיום מהשוליים התחתונים של הבאר. טרי (לפני המלחמה ב 37 °C (50 °F) בינוני יש להוסיף בעדינות לצד הבאר. אם טיפות ג'ל לבטל לצרף, לאסוף את organoids ו resuspend ולתרבות אותם שוב בטיפת ECM חדשה.
- צנטריפוגה ההשעיה תא AL ב 190 x g במשך 10 דקות ב 4 °C (4 °F) ולהסיר את SN. Resuspend גלולה התא עו"ד DMEM / F12 באמצעות אמצעי האחסון הספציפי מחושב כדי להגיע לצפיפות תאים של 1.1 x 106 תאים / מ"ל.
- מעבר אורגנויד
- לשאוף את המדיום בעדינות ולהוסיף 400 μL של קר כקרח עו"ד DMEM / F12 כדי לפורר את ECM ולאסוף את organoids בצינור microcentrifuge. לשטוף פעם אחת עם 400 μL של קר כקרח Adv DMEM / F12 EM. צנטריפוגה ב 200 x g במשך 5 דקות ב 4 °C (4 °F).
- הסר את SN בזהירות ולהוסיף 400 μL של אנזים טריפל אקספרס (37 °C) טריפל אקספרס (1X). מערבבים על ידי היפוך הצינור מספר פעמים, ודגור ב 37 °C (5 °F) במשך 5 דקות.
- הוסף 400 μL של קר כקרח עו"ד DMEM / F12 וצנטריפוגה ב 200 x g במשך 5 דקות ב 4 °C (4 °F). הסר את ה- SN.
- לפנק מחדש את הכדור עם 100 μL של קר כקרח Adv DMEM / F12 ולאחר מכן לשבור את האורגנוידים על ידי צנרת נמרצת למעלה ולמטה עם קצה P200 צר (כלומר, לדחוף את הקצה הריק נגד החלק התחתון של צינור microcentrifuge, כדי להפחית את קוטר הפתיחה שלה) עד שברי organoid (עם קוטר סביב 50 מיקרומטר) מתקבלים (איור 3B).
הערה: תערובת הדיסוציאציה צריכה להכיל בעיקר שברי אורגנויד ורק כמה תאים בודדים. דיסוציאציה קשה של האורגנוידים לתאים בודדים משפיעה לרעה על הצמיחה מחדש של האורגנוידים. - הוסף 800 μL של עו"ד DMEM / F12 וצנטריפוגה ב 190 x g במשך 10 דקות ב 4 °C (4 °F). הסר את ה- SN.
- מעבר האורגנוידים ביחס של 1:2 ל-1:4. Resuspend את הכדור בנפח נאות של עו"ד DMEM / F12 לפי הצורך לציפוי ולהוסיף ECM ביחס 30:70 (30% השעיית תאים ו 70% ECM). מערבבים היטב על ידי צנרת למעלה ולמטה.
- זרע ותרבות האורגנוידים כמתואר לעיל בשלבים 3.1.3-3.1.5.
הערה: בממוצע, 20 organoids לפתח לבאר מתוך 10,000 תאים שלם AL זרע (0.2%). מעבר זה 0 organoids ניתן לפצל ביחס 1:2, וכתוצאה מכך >50 organoids לפתח לכל באר (קטע 1). לאחר מכן ניתן לפצל אורגנוידים ביחס של 1:2 ל-1:4 במהלך הקטעים הבאים. צמיחה מחדש של organoids מאט לאחר ~ 10 קטעים (המקבילים 3 חודשים של תרבות), concretated בהדרגה פחות ופחות organoids קטן יותר.
4. שימור קריופרציה של אורגנוידים שמקורם באל על והפשרה
- שימור קריופרציה של אורגנוידים
- פעל בהתאם לפרוטוקול המעבר משלב 3.2.1 עד שלב 3.2.5.
- Resuspend גלולה organoid (המכיל שברים ותאים) עם 1 מ"ל של מדיום cryopreservation (טבלה 3). מעבירים את ההשעיה להקפאה ומניחים אותה על קרח.
הערה: אורגנוידים (כלומר, שברים ותאים תוצאתיים) מתוך עד ארבע בארות של צלחת 48-well ניתן לשלב בהקפאה אחת. - מניחים את cryovials במיכל הקפאה ולהעביר אותם למינוס 80 °C (80 °F).
- לאחר 24 שעות, העבירו את הדגימות לתיבת הקפאה ואחסנו אותן בחנקן נוזלי (-196 מעלות צלזיוס) לאחסון לטווח ארוך.
- הפשרת אורגנוידים שמורים של קריופ
- הסר את cryovial ממיכל החנקן הנוזלי ומניחים אותו על קרח. מיד להמשיך עם פרוטוקול ההפשרה.
- להפשיר את הפתרון עם שברי organoid cryopreserved ותאים בודדים ב 37 °C (אמבט מים).
הערה: אל תשמור את הפתרון במשך יותר מ 2 דקות ב 37 °C (50 °F) כדי למנוע רעילות תאים על ידי DMSO. - העבירו את התוכן לצינור 15 מ"ל המכיל 10 מ"ל של עו"ד DMEM/F12 קר כקרח עם 30% סרום בקר עוברי (FBS). יש לשטוף את ההקפאה עם 1 מ"ל של עו"ד DMEM/F12 עם 30% FBS.
- צנטריפוגה ב 190 x g במשך 10 דקות ב 4 °C (65 °F). תוסיפו מחדש את הכדור עם 1 מ"ל של עו"ד DMEM/F12 קר כקרח והעבירו את ההשעיה לצינור מיקרוצנטריפוגה.
- צנטריפוגה ב 190 x g במשך 10 דקות ב 4 °C (65 °F). לנפח מחדש את הכדור בנפח נאות של עו"ד DMEM / F12 לפי הצורך לציפוי ולהוסיף ECM ביחס של 30:70. מערבבים היטב על ידי צנרת למעלה ולמטה.
- זרע ותרבות האורגנוידים כמתואר לעיל בשלבים 3.1.3-3.1.5.
5. אימות אורגנוידים שמקורם באל על
- איסוף וליזה של אורגנוידים לבידוד RNA
- לאסוף ולצנטריפוגה האורגנוידים כמתואר לעיל (שלב 3.2.1).
- הסר את SN ולהוסיף 350 μL של מאגר תמוגה עם 1% 2-mercapto-אתנול. מערבולת עבור 30 s ולאחסן ב -80 °C (80 °F) או להמשיך מיד לבידוד RNA.
זהירות: היזהר כי 2-mercapto-אתנול הוא תרכובת רעילה. כל העבודה חייבת להיעשות בברדס אדים כימי תוך לבישת כפפות ניטריל, מסכת אבק ומשקפי בטיחות. 2-Mercapto-אתנול יכול לגרום נזק בלתי הפיך לעיניים ולעור.
- קיבעון והטבעה של אורגנוידים לכתם אימונו-היסטוכימיה/פלואורסצנטיות
- לאסוף ולצנטריפוגה האורגנוידים כמתואר לעיל (שלב 3.2.1).
- הסר את SN, להוסיף 1 מ"ל של 4% paraformaldehyde (PFA) ודגור במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר (RT) על שייקר מסלולית (100 סל"ד).
אזהרה: PFA הוא מסרטן אנושי ידוע שיכול לגרום נזק בלתי הפיך לקרנית. כל העבודה חייבת להיעשות במכסה מנוע של אדים כימיים. כפפות ניטריל ומשקפי בטיחות חייבים תמיד להיות משוחקים. - צנטריפוגה ב 200 x g במשך 5 דקות ולהסיר את SN. הוסיפו 1 מ"ל של PBS, דגרו 10 דקות ב-RT על שייקר מסלולי (100 סל"ד), וצנטריפוגה ב-90 x גרם למשך 3 דקות ב-4 °C (4 °F). חזור על שלב הכביסה פעמיים. יש לאחסן ב-PBS בטמפרטורה של 4 °C (4 °F).
- לעיבוד רקמות והתייבשות, להסיר את SN ולהוסיף 150 μL של 2% ג'ל agarose (ב PBS) לכדור organoid באמצעות קצה p200 מורחב מראש (עשה על ידי חיתוך חתיכה קטנה של הקצה). מיד לשפוך את כל עוצמת הקול למעלה ולהוציא במכסה של צינור microcentrifuge.
הערה: חשוב לעבוד במהירות, כמו הג'ל המכיל את organoids יתמצק במהירות. - נותנים לג'ל להתמצק בחוזקה במשך 30 דקות ומעבירים את דיסק הג'ל לקלטת היסטולוגיה. יש לטבול ולאחסן ב-50% EtOH, עד להתייבשות במעבד הרקמות.
- להטמעת פרפין, מניחים את דיסק הג'ל (בעזרת מלקחיים) בתבנית הטבעה וממלאים בפרפין חם (60 מעלות צלזיוס). מניחים את התבניות על 4 מעלות צלזיוס עד שהפרפין מוצק (כ-45 דקות). דגימות אלה ניתן לאחסן ב 4 °C (4 °F) או יכול להיות נתון באופן מיידי חתך.
- Microtome בלוקים פרפין המכיל organoids בעובי 5 מיקרומטר ולאסוף את הדגימות על שקופיות זכוכית. הוסף טיפה אחת של מים deionized מתחת לכל קטע כדי לאפשר מתיחה נכונה של הקטע ומניחים את השקופיות על צלחת חימום שטוחה ב 37 °C (50 °F) לילה. יש לאחסן את השקופיות עם מקטעים בטמפרטורה של 4 °C (4 °F) או להמשיך ישירות עם כתמים אימונוהיסטוכימיים או אימונופלואורסצנטיים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
לאחר בידוד וניתוק של AL, התאים הבודדים המתקבלים נזרעים ב- ECM וגדלים בפיתום (איור 1, טבלה 1). איור 3A מציג את תרבית התא ואת הצפיפות בזריעה (יום 0). פסולת קטנה מסוימת עשויה להיות נוכחת (איור 3A, ראשי חץ לבנים), אך תיעלם בעת המעבר. 14 יום לאחר הזריעה, האורגנוידים שמקורם באל-על מפותחים במלואם (איור 3A). האורגנוידים מציגים מורפולוגיה ציסטית, עם שכבת אפיתל המקיפה לומן. בשלב זה, organoids להגיע לקוטר של 500 מיקרומטר ויש לעבור. איור 3B מציג את תרבות האורגנוידים שמקורה באל על לאחר שחלפה בזמן שצוין לאחר זריעה מחדש של שברי האורגנויד המנותקים.
מדי פעם, מבנה צפוף אחד או יותר עשוי להופיע בתרבות האורגנויד (איור 3A, שלילי). כאשר עוברים אורח, אורגנוידים צפופים נוטים להשתלט, ומגיעים לתרבויות עם מבנים צפופים בלבד לאחר כמה קטעים (איור 3B, שלילי). לכן, מומלץ לא להמשיך עם בארות המכילות organoids צפוף (סעיף 0). לחלופין, organoids צפוף ניתן להשליך על ידי משקעים, אשר משאיר את organoids ציסטי להמשיך עם. המקור של organoids צפוף אלה הוא כרגע לא ברור, אבל הם מראים טבע יותרת המוח פחות בולט18. אם organoids לא, או פחות ביעילות לגדל מחדש לאחר עובר, הליכי דיסוציאציה צריך להיות ממוטב. בפרט, יש לשים לב לא להתנתק קשה מדי; יש לפצל את האורגנוידים לרסיסים, לא לתאים בודדים (איור 3B, יום 0, כניסה).
ניתוח כתמי אימונופלואורסצנטיות מאשר את האופי האפיתל של האורגנוידים שמקורם באל, כפי שהם מבטאים את סמני האפיתל E-cadherin (E-Cad) וציטוקרטין 8/18 (CK8/18; איור 3C), אשר, יתר על כן, תוארו כסמני תאי גזע בבלוטת יותרת המוח18. אופי הגזע של האורגנוידים בא לידי ביטוי גם על ידי ביטוי SOX2 ו- TROP2, שניהם זוהו גם כסמני תאי גזע של בלוטת יותרת המוח (איור 3C)14,18. LHX3, גורם שעתוק המתבטא במיוחד בבלוטת יותרת המוח (המתפתחת המוקדמת), מאמת את פנוטיפ יותרת המוח של האורגנוידים (איור 3C). חלק מהתאים המרכיבים אורגנויד נמצאים במצב של התפשטות, המבטאים את סמן ההתפשטות Ki67 (איור 3C).
מחקר נוסף ואימות של פנוטיפ יותרת המוח (גזעיות) של organoids נגזר AL מבוצעת עם PCR כמותי שעתוק הפוך (RT-qPCR). ביטוי גבוה של סמני הגבעול Sox2, Cdh1 (קידוד E-Cad), Krt8, Krt8, Krt18 ו Trop2 נמצא באורגנוידים, בבירור גבוה יותר מאשר באל על העיקרית, המציין כי organoids להעשיר עבור תאי הגזע ובכך לייצג את תא תאי הגזע AL, כפי שתואר בעבר (איור 3D)18. ראוי לציין כי גורמי התמלול ההתפתחותיים פיטקס1 ו-Pitx2 עדיין באים לידי ביטוי לאחר התפתחות במספר סוגי תאים הורמונליים באל על, ומכאן ביטוים הגבוה גם באל על. התרבויות שומרות בחוזקה על פנוטיפ הגבעול שלהן, כפי שמדגים הביטוי המתמשך (הגבוה) של סמנים אלה לאחר קטעים מרובים (איור 3D).
איור 1: סקירה כללית של הממסד, התחזוקה, האפיון ופוטנציאל היישום של אורגנוידים מבלוא יותרת המוח בריאים וחולים. אל על, האונה הקדמית; IL, אונת ביניים; PL, האונה האחורית; MZ, אזור שוליים; PitOM, מדיום אורגנויד בלוטת יותרת המוח (נוצר עם BioRender.com). נישות תאי גזע באל על מסומנות בסגול. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: בידוד בלוטת יותרת המוח מעכבר מורדם בוגר. תמונות מייצגות שצולמו ברציפות בעקבות (A) עריפת ראש, (B) הסרת עור הראש (גשר האף מוקף), (C) פתיחת הגולגולת, ו-(D) הסרת המוח, חשיפת בלוטת יותרת המוח (מוקף). החץ מצביע על PL, אשר נמחק (יחד עם IL המשויך), עוזב את AL לבידוד וניתוק. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: הקמה ואימות של אורגנוידים שמקורם באל על. (א) זריעת תאי AL ופיתוח אורגנויד בפיטום בימים שצוינו (מעבר 0). השורה העליונה מראה צמיחה אורגנויד חיובית, עם רק מבנים ציסטיים המתפתחים. השורה התחתונה מציגה צמיחה שלילית עם מבנה צפוף גדול המופיע (בקופסה). ראשי חץ לבנים מציינים פסולת, ראשי חץ שחורים מציינים תאים בודדים (מוגדלים בכניסה). (B) שברי אורגנויד (מוגדלים בכניסה) שנזרעו במעבר (יום 0) וצמיחה מחדש של אורגנוידים כפי שנצפה 7 ימים לאחר מכן. השורה העליונה מציגה צמיחה מחדש אורגנויד חיובית, עם רק מבנים ציסטיים גדלים. השורה התחתונה מראה צמיחה מחדש שלילית עם אורגנוידים צפופים שמשתלטים על התרבות. (ג) כתמי אימונופלואורסצנטיות של E-Cad, SOX2, TROP2 (כולם אדומים), CK8/18, LHX3 ו- Ki67 (כולם ירוקים) באורגנוידים שמקורם ב- AL. גרעינים מסומנים עם Hoechst33342 (כחול). ראשי חץ מציינים תאי Ki67+ . סרגלי קנה מידה מסומנים. (ד) ניתוח ביטוי גנים של סמני גזע (Sox2, Cdh1, Krt8, Krt18, Trop2), וגורמי שעתוק התפתחותיים (Pitx1, Pitx2) באורגנוידים ראשוניים שמקורם באל על וב- AL (מעבר 0 פירושו 14 ימים לאחר זריעת התאים) שנקבעו על ידי RT-qPCR (ממוצע ± SEM). נקודות נתונים מייצגות שכפולים ביולוגיים. ערכי סף מחזור דלתא (dCT) מוצגים, מחושבים באמצעות הנוסחה: CT (גן מעניין) - CT (גן משק בית Actb). ככל שערך ה- dCT חיובי יותר (המוצג על ציר ה- Y מתחת לציר ה- X האפס), כך רמת הביטוי של גן העניין נמוכה יותר. ככל שערך dCT נמוך יותר (או שלילי יותר), כך רמת הביטוי גבוהה יותר 14,18,21,22. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
| מדיום אורגנויד בלוטת יותרת המוח (PitOM) | |
| רכיב | ריכוז |
| מתקדם DMEM/F12 | |
| Hepes | 1% |
| פניצילין-סטרפטומיצין | 1% |
| גלוטמקס | 1% |
| תוסף B-27 (50X), מינוס ויטמין A | פי 1 |
| L-גלוטמין (200 מ"ר) | 2 מ"מ |
| רקומביננטי אנושי FGF בסיסי / FGF2 / bFGF (157 aa) חלבון | 20 ננוגרם/מ"ל |
| IGF-1 אנושי רקומביננטי | 100 ננוגרם/מ"ל |
| תוספת N-2 (100X) | פי 1 |
| N-אצטיל-ציסטאין | 1.25 מ"ר |
| רקומביננטי אדם / מורין FGF-8b | 200 ננוגרם/מ"ל |
| FGF-10 אנושי רקומביננטי | 100 ננוגרם/מ"ל |
| A83-01 (מעכב קינאז דמוי קולטן אקטיבין 4/5/7) | 0.50 מיקרומטר |
| עכבר רקומביננטי סוניק קיפוד / ששש (C25II) N-טרמינוס | 100 ננוגרם/מ"ל |
| חלבון EGF אנושי רקומביננטי, CF | 50 ננוגרם/מ"ל |
| SB202190 (מעכב קינאז חלבון המופעל על ידי מיטוגן p38) | 10 מיקרומטר |
| נגיף אנושי רקומביננטי | 100 ננוגרם/מ"ל |
| כולרה רעלן מ Vibrio כולרה | 100 ננוגרם/מ"ל |
| רקומביננטי אנושי R-ספונדין-1 | 200 ננוגרם/מ"ל |
| רקומביננטי אנושי IL-6 | 20 ננוגרם/מ"ל |
טבלה 1. הרכב של פיטום. PitOM מסונן באמצעות מסנן רשת של 0.22 מיקרומטר ומאוחסן בטמפרטורה של 4 °C (65 °F) למשך שבועיים לכל היותר.
| בינוני A | |
| רכיב | כמות |
| DMEM, אבקה, גלוקוז גבוה | 13.38 גרם |
| HEPES | 5.96 גרם |
| נתרן-פירובט (C3H3נאו3) | 0.11 גרם |
| פניצילין G מלח נתרן | 35.00 מ"ג |
| סטרפטומיצין מלח גופרתי | 50.00 מ"ג |
| נתרן כלורי (NaCl) | 0.50 גרם |
| נתרן מימן קרבונט (NaHCO3) | 1.00 גרם |
| אלבומין בקר (כיתה תרבית תאים) | 3.00 גרם |
| מים סטריליים | 1.00 ליטר |
| בינוני C | |
| רכיב | כמות |
| נתרן כלורי (NaCl) | 7.50 גר' |
| אשלגן כלורי (KCl) | 0.40 גרם |
| נתרן די-מימן פוספט 1-לחות | 0.14 גרם |
| D-גלוקוז | 1.00 גרם |
| HEPES | 4.76 גרם |
| סטרפטומיצין מלח גופרתי | 50.00 מ"ג |
| פניצילין G מלח נתרן | 35.00 מ"ג |
| פנול אדום | 10.00 מ"ג |
| אלבומין בקר (כיתה תרבית תאים) | 3.00 גרם |
| נתרן מימן קרבונט (NaHCO3) | 1.00 גרם |
| מים סטריליים | 1.00 ליטר |
| בינוני B | |
| רכיב | כמות |
| טיטרפלקס III (אדטט דיסודיום מלח דיהידרט) | 0.74 גר' |
| בינוני C | 100 מ"ל |
טבלה 2. הרכב של A, B ו- C בינוניים. כל המדיה מסוננת באמצעות מסנן רשת שינוי של 0.22 מיקרומטר ומאוחסנת בטמפרטורה של 4 °C (4 °F) לכל היותר למשך 4 חודשים לכל היותר. יש להתאים את ה- pH של A ו- C בינוני ל- 7.3.
| מדיום שימור הקפאה | |
| רכיב | ריכוז |
| מתקדם DMEM/F12 | 60% |
| FBS | 30% |
| DMSO | 10% |
טבלה 3. הרכב של מדיום שימור קריופרציה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
האורגנוידים שמקורם באל, כמתואר כאן, מייצגים מודל מחקר רב עוצמה לחקר תאי גזע בלוטת יותרת המוח במבחנה. נכון לעכשיו, גישה זו organoid הוא הכלי הזמין היחיד כדי אמין וחזק לגדול ולהרחיב תאי גזע בלוטת יותרת המוח העיקרי. מודל אורגנויד בלוטת יותרת המוח נגזר מתאי גזע עובריים (ESC) או תאי גזע פלוריפוטנט המושרה (iPSC) דווח בעבר, אשר מקרוב recapitulatesess יותרת המוח organogenesis עוברי23; עם זאת, למרות מאוד שימושי כדי ללמוד פיתוח בלוטת יותרת המוח או מודל מחלת יותרת המוח 23,24,25, הפרוטוקול שדווח, החל ESC / iPSC, הוא מאוד זמן רב בהשוואה לפרוטוקול המתואר כאן, ואת organoids וכתוצאה מכך הם גם אינם ניתנים להרחבה.
פולחן מוצלח של organoids תאי גזע בלוטת יותרת המוח תלוי בכמה צעדים קריטיים בפרוטוקול. חשוב צלחת מספר מתאים של תאים בזריעת התא הראשונית. מספר גבוה מאוד יוליד תרבויות צפופות, אשר מדרדר את הכדאיות של organoids וחוסם התפשטות organoid מלאה, בעוד מספר נמוך מאוד של תאים יגרום היווצרות organoid מוגבלת. יתר על כן, חשוב לא להפריע לשלמות כיפת ECM פעם אחת בתרבות. הוספה והסרה בינונית צריכה להיעשות בזהירות רבה, מבלי לגעת בטיפת הג'ל. בנוסף, לפני ההתחממות של המדיום התרבותי מפחית את הסיכון לדה-פילמור של הג'ל. לבסוף, העברת האורגנוידים בצורה נכונה (כלומר, ניתוק לרסיסים ולא לתאים בודדים) חיונית להתרחבות יעילה של התרבויות.
אורגנוידים אלה תאי גזע בלוטת יותרת המוח ניתן לרתום כדי לענות על שאלות לגבי פנוטיפ של תאי הגזע, ביולוגיה, ותפקוד. הם כבר הוכחו כבעלי ערך בחשיפת תכונות חדשות של תאי גזע, כמו גם סמנים של הפעלת תאי גזע הקשורים לנזק בבלוטת יותרת המוח וכלי קריאה לפעילות תאי גזע (איור 1)14,18. המאמצים הנוכחיים כוללים את נגזרתם מבלו בבלוטת יותרת המוח, כגון היפופיאטואריזם ופיתות ים (איור 1). בסופו של דבר, organoids יכול להיות מעורב גם לתוך פלטפורמה להקרנת סמים, כפי שהוקם בהצלחה עבור מחלות אחרות26,27. לכן, יהיה צורך בהגדלה נוספת של תרביות האורגנויד כדי להגיע לניתוח תפוקה גבוהה. זה כבר הבחין כי organoids שמקורו AL ניתן לגדל ביעילות בפורמט 96-well, גם וכתוצאה מכך תרבויות הומוגניות יותר.
זה נצפתה כי לאחר ~ 10 קטעים (המקבילים 3 חודשים של תרבות), יעילות הצמיחה organoid ירד בהדרגה עם organoids מחדש במספרים נמוכים יותר וגודל קטן יותר. ירידה זו הצמיחה עשויה להיות טבועה בטבע הפנימי של תאי גזע בלוטת יותרת המוח, אשר ייתכן שלא צריך לחדש את עצמו פעמים רבות בבלוטה ב vivo, אשר רק לאט מתהפך, ובכך הופך מותש לאחר כמה סיבובי חלוקה16,28. למרות ירידה זו הצמיחה בסופו של דבר עשוי להיחשב מגבלה, המודל הוא מאוד שימושי מאז הרחבת organoid במהלך המעברים הקודמים הוא יותר ממספיק עבור ניתוחים נרחבים במורד הזרם.
היבט נוסף שניתן לראות כמגבלה הוא כי organoids תאי גזע בלוטת יותרת המוח אינם מראים יכולת בידול בולטת כלפי סוגי התאים האנדוקריניים של AL, גם לאחר קסנוגרפט תחת כמוסת הכליות של עכברים חיסוניים (אשר הביא מספר מוגבל של תאי GH + ו PRL + כפי שתואר בפירוט בהתייחסות18). או שתנאי הפריה חוץ גופית הנכונים כדי לדחוף את תאי הגזע לבידול עדיין אינם מזוהים, או שהתפקיד העיקרי של תאי הגזע (במיוחד בבלוטה הבוגרת) אינו ממוקם ביצירת תאים אנדוקריניים חדשים (שכן סביר להניח שלא היה צורך בבלוטת העצל אלא רק בתנאים מטרידים או מאותגרים)9,10,14, 18. במקום זאת, הפונקציה העיקרית עשויה להיות ממוקמת בהיבטים ביולוגיים אחרים (למשל, paracrine איתות לאב הקדמה הורמונלית / הקדמה או תאים בוגרים בסיסיים, אבל סביר יותר פעיל (התפתחותי, תיקון, מחלה) תנאים)13,16. ואכן, למרות שתאי גזע בלוטת יותרת המוח הוכחו כבעלי יכולת בידול רב-תכליתית במיוחד בתקופה העוברית והילודים, מתקבל על הדעת שתאי גזע בבלוטה הבוגרת אינם (צריכים) לשמור על יכולת זו, בהתחשב במחזור הנמוך מאוד של בלוטת המבוגרים16,28. ייתכן כי תאי גזע בלוטת יותרת המוח למבוגרים לפעול יותר כמו רכזת איתות paracrine, מעורב מגרה או ויסות האב שמסביב/הקדמה/תאים אנדוקריניים13,16. לפיכך, הבחנה חזקה של אורגנוידים תאי גזע בלוטת יותרת המוח שהגיע לשיאו הפרשת הורמונים עשוי להיות ציפייה שגויה כי לעולם לא יגיע.
יחד, הפרוטוקול המוצג כאן מציע כלי ישים ואמין במהירות כדי להרחיב בחוזקה תאי גזע בלוטת יותרת המוח העיקריים בסביבה 3D במבחנה. הפרוטוקול מעורר אורגנוידים הלוכדים בנאמנות את פנוטיפ תאי הגזע של בלוטת יותרת המוח. המערכת כבר יושמה בהצלחה ללמוד ביולוגיה של תאי גזע בלוטת יותרת המוח והפעלה 14,18, והממצאים ניתנים לתרגום גבוה למצב in vivo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים מצהירים שאין אינטרסים פיננסיים מתחרים.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מקרן המחקר KU Leuven והקרן למחקר מדעי (FWO) - פלנדריה. E.L. (11A3320N), ו- C.N. (1S14218N) נתמכים על ידי מלגת דוקטורט מ- FWO / FWO-SB.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250 | |
| 48-well plates, TC treated, individually wrapped | Costar | 734-1607 | |
| A83-01 | Sigma-Aldrich | SML0788 | |
| Advanced DMEM/F12 | Gibco | 12634010 | |
| Albumin Bovine (cell culture grade) | Serva | 47330 | |
| B-27 Supplement (50X), minus vitamin A | Gibco | 12587010 | |
| Base moulds | VWR | 720-1918 | |
| Buffer RLT | Qiagen | 79216 | |
| Cassettes, Q Path Microtwin | VWR | 720-2191 | |
| Cell strainer, 40 µm mesh, disposable | Falcon | 352340 | |
| Cholera Toxin from Vibrio cholerae | Sigma-Aldrich | C8052 | |
| Deoxyribonuclease I from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | D5025 | |
| D-glucose | Merck | 108342 | |
| Dimethylsulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| DMEM, powder, high glucose | Gibco | 52100039 | |
| Eppendorf Safe-Lock Tubes, 1.5 mL | Eppendorf | 30120086 | |
| Epredia SuperFrost Plus Adhesion slides | Thermo Fisher Scientific | J1800AMNZ | |
| Epredia HistoStar Embedding Workstation, 220 to 240Vac | Thermo Fisher Scientific | 12587976 | |
| Ethanol Absolute 99.8+% | Thermo Fisher Scientific | 10342652 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Sigma-Aldrich | F7524 | |
| GlutaMAX Supplement | Gibco | 35050061 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | |
| HEPES Buffer Solution | Gibco | 15630056 | |
| InSolution Y-27632 | Sigma-Aldrich | 688001 | |
| L-Glutamine (200 mM) | Gibco | 25030081 | |
| Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix, LDEV-Free | Corning | 15505739 | |
| Mr. Frosty Freezing Container | Thermo Fisher Scientific | 5100-0001 | |
| N-2 Supplement (100X) | Thermo Fisher Scientific | 17502048 | |
| N-Acetyl-L-cysteine | Sigma-Aldrich | A7250 | |
| Nunc Biobanking and Cell Culture Cryogenic Tubes | Thermo Fisher Scientific | 375353 | |
| Paraformaldehyde for synthesis (PFA) | Merck | 818715 | |
| PBS, pH 7.4 | Gibco | 10010023 | |
| Penicillin G sodium salt | Sigma-Aldrich | P3032 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140122 | |
| Phenol red | Merck | 107241 | |
| Potassium Chloride (KCl) | Merck | 104936 | |
| Recombinant Human EGF Protein, CF | R&D systems | 236-EG | |
| Recombinant Human FGF basic/FGF2/bFGF (157 aa) Protein | R&D systems | 234-FSE | |
| Recombinant Human FGF-10 | Peprotech | 100-26 | |
| Recombinant Human IGF-1 | Peprotech | 100-11 | |
| Recombinant Human IL-6 | Peprotech | 200-06 | |
| Recombinant Human Noggin | Peprotech | 120-10C | |
| Recombinant Human R-Spondin-1 | Peprotech | 120-38 | |
| Recombinant Human/Murine FGF-8b | Peprotech | 100-25 | |
| Recombinant Mouse Sonic Hedgehog/Shh (C25II) N-Terminus | R&D systems | 464-SH | |
| RNeasy micro kit | Qiagen | 74004 | |
| SB202190 | Sigma-Aldrich | S7067 | |
| SeaKem LE Agarose | Lonza | 50004 | |
| Sodium Chloride (NaCl) | BDH | 102415K | |
| Sodium di-Hydrogen Phosphate 1-hydrate | PanReac-AppliChem | A1047 | |
| Sodium Hydrogen Carbonate (NaHCO3) | Merck | 106329 | |
| Sodium-Pyruvate (C3H3NaO3) | Sigma-Aldrich | P5280 | |
| Stericup-GP, 0.22 µm | Millipore | SCGPU02RE | |
| Steriflip-GP Sterile Centrifuge Tube Top Filter Unit, 0.22 μm | Millipore | SCGP00525 | |
| Sterile water | Fresenius | B230531 | |
| Streptomycin sulfate salt | Sigma-Aldrich | S6501 | |
| Thermo Scientific Excelsior ES Tissue Processor | Thermo Scientific | 12505356 | |
| Titriplex III | Merck | 108418 | |
| TrypL Express Enzyme (1X), phenol red | Thermo Fisher Scientific | 12605028 | |
| Trypsin inhibitor from Glycine max (soybean) | Sigma-Aldrich | T9003 | |
| Trypsin solution 2.5 % | Thermo Fisher Scientific | 15090046 |
References
- Melmed, S. The pituitary. 3rd ed. , Elsevier/Academic Press. Cambridge. 1 (2011).
- Chen, J., et al. The adult pituitary contains a cell population displaying stem/progenitor cell and early-embryonic characteristics. Endocrinology. 146 (9), 3985-3998 (2005).
- Chen, J., et al. Pituitary progenitor cells tracked down by side population dissection. Stem Cells. 27 (5), 1182-1195 (2009).
- Fauquier, T., Rizzoti, K., Dattani, M., Lovell-Badge, R., Robinson, I. C. A. F. SOX2-expressing progenitor cells generate all of the major cell types in the adult mouse pituitary gland. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (8), 2907-2912 (2008).
- Rizzoti, K., Akiyama, H., Lovell-Badge, R. Mobilized adult pituitary stem cells contribute to endocrine regeneration in response to physiological demand. Cell Stem Cell. 13 (4), 419-432 (2013).
- Andoniadou, C. L., et al. Sox2+ stem/progenitor cells in the adult mouse pituitary support organ homeostasis and have tumor-inducing potential. Cell Stem Cell. 13 (4), 433-445 (2013).
- Nys, C., Vankelecom, H. Pituitary disease and recovery: How are stem cells involved. Molecular and Cellular Endocrinology. 525 (4), 111176 (2021).
- Schneider, H. J., Aimaretti, G., Kreitschmann-Andermahr, I., Stalla, G. K., Ghigo, E.
- Fu, Q., et al. The adult pituitary shows stem/progenitor cell activation in response to injury and is capable of regeneration. Endocrinology. 153 (7), 3224-3235 (2012).
- Willems, C., et al. Regeneration in the pituitary after cell-ablation injury: time-related aspects and molecular analysis. Endocrinology. 157 (2), 705-721 (2016).
- Gremeaux, L., Fu, Q., Chen, J., Vankelecom, H. Activated phenotype of the pituitary stem/progenitor cell compartment during the early-postnatal maturation phase of the gland. Stem Cells and Development. 21 (5), 801-813 (2012).
- Zhu, X., Tollkuhn, J., Taylor, H., Rosenfeld, M. G. Notch-dependent pituitary SOX2+ stem cells exhibit a timed functional extinction in regulation of the postnatal gland. Stem Cell Reports. 5 (6), 1196-1209 (2015).
- Russell, J. P., et al. Pituitary stem cells produce paracrine WNT signals to control the expansion of their descendant progenitor cells. eLife. 10 (1), 59142 (2021).
- Vennekens, A., et al. Interleukin-6 is an activator of pituitary stem cells upon local damage, a competence quenched in the aging gland. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (25), 2100052118 (2021).
- Mertens, F., et al. Pituitary tumors contain a side population with tumor stem cell-associated characteristics. Endocrine-Related Cancer. 22 (4), 481-504 (2015).
- Laporte, E., Vennekens, A., Vankelecom, H. Pituitary remodeling throughout life: are resident stem cells involved. Frontiers in Endocrinology. 11 (1), 604519 (2021).
- Yoshida, S., et al. Isolation of adult pituitary stem/progenitor cell clusters located in the parenchyma of the rat anterior lobe. Stem Cell Research. 17 (2), 318-329 (2016).
- Cox, B., et al. Organoids from pituitary as novel research model to study pituitary stem cell biology. Journal of Endocrinology. 240 (2), 287-308 (2019).
- Denef, C., Hautekeete, E., De Wolf, A., Vanderschueren, B. Pituitary basophils from immature male and female rats: distribution of gonadotrophs and thyrotrophs as studied by unit gravity sedimentation. Endocrinology. 130 (3), 724-735 (1978).
- Vander Schueren, B., Denef, C., Cassiman, J. J. Ultrastructural and functional characteristics of rat pituitary cell aggregates. Endocrinology. 110 (2), 513-523 (1982).
- Claes, C., et al. Human stem cell-derived monocytes and microglia-like cells reveal impaired amyloid plaque clearance upon heterozygous or homozygous loss of TREM2. Alzheimer's and Dementia. 15 (3), 453-464 (2019).
- Trompeter, H. -I., et al. MicroRNAs miR-26a, miR-26b, and miR-29b accelerate osteogenic differentiation of unrestricted somatic stem cells from human cord blood. BMC Genomics. 14, 111 (2013).
- Suga, H., et al. Self-formation of functional adenohypophysis in three-dimensional culture. Nature. 480 (7375), 57-62 (2011).
- Matsumoto, R., et al. Congenital pituitary hypoplasia model demonstrates hypothalamic OTX2 regulation of pituitary progenitor cells. Journal of Clinical Investigation. 130 (2), 641-654 (2019).
- Kanie, K., et al. Pathogenesis of anti-PIT-1 antibody syndrome: PIT-1 presentation by HLA class I on anterior pituitary cells. Journal of the Endocrine Society. 3 (11), 1969-1978 (2019).
- Lee, S. H., et al. Tumor evolution and drug response in patient-derived organoid models of bladder cancer. Cell. 173 (2), 515-528 (2018).
- Yan, H. H. N., et al. A comprehensive human gastric cancer organoid biobank captures tumor subtype heterogeneity and enables therapeutic screening. Cell Stem Cell. 23 (6), 882-897 (2018).
- Nolan, L. A., Kavanagh, E., Lightman, S. L., Levy, A. Anterior pituitary cell population control: basal cell turnover and the effects of adrenalectomy and dexamethasone treatment. Journal of Neuroendocrinology. 10 (3), 207-215 (1998).
