Summary
Hypofysen är nyckelregulatorn för kroppens endokrina system. Denna artikel beskriver utvecklingen av organoider från musens hypofys som en ny 3D in vitro-modell för att studera körtelns stamcellspopulation av vilken biologin och funktionen förblir dåligt förstådd.
Abstract
Hypofysen är den mästerliga endokrina körteln som reglerar viktiga fysiologiska processer, inklusive kroppstillväxt, ämnesomsättning, sexuell mognad, reproduktion och stressrespons. För mer än ett decennium sedan identifierades stamceller i hypofysen. Trots tillämpningen av transgena in vivo-metoder är deras fenotyp, biologi och roll fortfarande oklara. För att ta itu med denna gåta utvecklas en ny och innovativ organoid in vitro-modell för att djupt riva upp hypofysstamcellsbiologi. Organoider representerar 3D-cellstrukturer som, under definierade odlingsförhållanden, själv utvecklas från en vävnads (epitel) stamceller och rekapitulerar flera kännetecken för dessa stamceller och deras vävnad. Det visas här att mus hypofys-härledda organoider utvecklas från körtelns stamceller och troget rekapitulerar deras in vivo fenotypiska och funktionella egenskaper. Bland annat reproducerar de aktiveringstillståndet hos stamcellerna som in vivo som uppstår som svar på transgeniskt orsakad lokal skada. Organoiderna är långsiktigt expanderbara samtidigt som de robust behåller sin stamfenotyp. Den nya forskningsmodellen är mycket värdefull för att dechiffrera stamcellernas fenotyp och beteende under viktiga förhållanden för hypofysombyggnad, allt från neonatal mognad till åldringsassocierad blekning och från friska till sjuka körtlar. Här presenteras ett detaljerat protokoll för att etablera mus hypofys-härledda organoider, som ger ett kraftfullt verktyg för att dyka in i den ännu gåtfulla världen av hypofysstamceller.
Introduction
Hypofysen är en liten endokrin körtel som ligger vid hjärnans botten, där den är kopplad till hypotalamus. Körteln integrerar perifera och centrala (hypotalamiska) ingångar för att generera en avstämd och samordnad hormonfrisättning och därigenom reglera nedströms mål endokrina organ (såsom binjurar och gonader) för att producera lämpliga hormoner vid rätt tidpunkt. Hypofysen är nyckelregulatorn för det endokrina systemet och kallas därför med rätta masterkörteln1.
Musens hypofys består av tre lober (figur 1), dvs den främre loben (AL), mellanloben (IL) och den bakre loben (PL). Den stora endokrina AL innehåller fem hormonella celltyper, inklusive somatotroper som producerar tillväxthormon (GH); laktotroper som genererar prolaktin (PRL); kortikotroper som utsöndrar adrenokortikotropt hormon (ACTH); tyrotroper som är ansvariga för sköldkörtelstimulerande hormon (TSH) produktion; och gonadotroper som gör luteiniserande hormon (LH) och follikelstimulerande hormon (FSH). PL består av axonala projektioner från hypotalamus där hormonerna oxytocin och vasopressin (antidiuretiskt hormon) lagras. IL ligger mellan AL och PL och rymmer melanotroper som producerar melanocytstimulerande hormon (MSH). I den mänskliga hypofysen regresserar IL under utvecklingen, och melanotroper sprids inom AL1. Förutom de endokrina cellerna innehåller hypofysen också en pool av stamceller, väsentligen markerade med transkriptionsfaktorn SOX2 2,3,4,5,6. Dessa SOX2+ -celler är belägna i marginalzonen (MZ), epitelfodret i klyftan (en embryonal restlumen mellan AL och IL), eller sprids som kluster genom AL: s parenkym och föreslår därmed två stamcellsnischer i körteln (Figur 1) 2,3,4,5,6.
Med tanke på hypofysens oumbärliga natur är funktionsfel i körteln förknippad med allvarlig sjuklighet. Hyperpituitarism (kännetecknad av översekretion av ett eller flera hormoner) och hypopituitarism (defekt eller saknad produktion av ett eller flera hormoner) kan orsakas av hypofysneuroendokrina tumörer (PitNETs; t.ex. ACTH-producerande tumörer som leder till Cushings sjukdom) eller av genetiska defekter (t.ex. GH-brist som resulterar i dvärgväxt)7. Dessutom är hypofyskirurgi (t.ex. för att avlägsna tumörer), infektioner (t.ex. hypotalamus-hypofys tuberkulos eller infektioner efter bakteriell meningit eller encefalit), Sheehans syndrom (nekros på grund av otillräckligt blodflöde på grund av kraftig blodförlust vid födseln), hypofysapoplexi och traumatisk hjärnskada andra viktiga orsaker till hypofyshypofunktion8 . Det har visat sig att mushypofysen har den regenerativa kapaciteten och kan reparera lokala skador som införs genom transgen ablation av endokrina celler 9,10. SOX2+-stamcellerna reagerar akut på den orsakade skadan som visar en aktiverad fenotyp, markerad av ökad proliferation (vilket resulterar i stamcellsexpansion) och ökat uttryck av stamhetsrelaterade faktorer och vägar (t.ex. WNT / NOTCH). Dessutom börjar stamcellerna uttrycka det ablaterade hormonet, vilket slutligen resulterar i en väsentlig återställning av den utarmade cellpopulationen under följande (5 till 6) månader 9,10. Under körtelns neonatala mognadsfas (de första 3 veckorna efter födseln) trivs hypofysstamcellerna i ett aktiverat tillstånd 6,11,12,13, medan organismens åldrande är förknippat med minskad in situ-stamcellsfunktionalitet på grund av en ökande inflammatorisk (mikro-) miljö vid åldrande (eller "inflammatorisk")10,14 . Dessutom är tumorigenes i körteln också associerad med stamcellsaktivering 7,15. Även om stamcellsaktivering har upptäckts i flera situationer med hypofysombyggnad (granskad i 7,16), är underliggande mekanismer fortfarande oklara. Eftersom in vivo-metoder (såsom härstamningsspårning hos transgena möss) inte har gett en tydlig eller heltäckande bild av hypofysstamceller, är utvecklingen av tillförlitliga in vitro-modeller för att utforska stamcellsbiologi i normal och sjuk hypofys avgörande. Standard in vitro-odling av primära hypofysstamceller är fortfarande otillräcklig på grund av mycket begränsad tillväxtkapacitet och icke-fysiologiska (2D) tillstånd med snabb förlust av fenotyp (för en mer detaljerad översikt, se16). 3D-sfärkulturer (hypofyssfärer) har etablerats från hypofysstamceller som identifierats av sidopopulationen och SOX2+ fenotyp 2,3,4. Hypouisfärerna växer klonalt från stamcellerna, uttrycker stamhetsmarkörer och visar differentieringskapacitet i de endokrina celltyperna. De expanderar dock inte nämn nämnbart samtidigt som de endast visar begränsad passage (2-3 passager)3,4. Sfärliknande strukturer erhölls också från icke-dissocierade hypofysstamcellskluster när de odlades i 50% utspädd Matrigel i 1 vecka, men expanderbarhet visades inte17. Pituisphere-metoden används mest som ett avläsningsverktyg för stamcellsnummer, men ytterligare tillämpningar begränsas av sämre expansionskapacitet16.
För att ta itu med och övervinna dessa brister har en ny 3D-modell nyligen etablerats, dvs organoider, med utgångspunkt från den stora endokrina AL hos möss som innehåller MZ och parenkymala stamceller. Det har visat sig att organoiderna verkligen härrör från hypofysens stamceller och troget rekapitulerar deras fenotyp18. Dessutom är organoiderna långsiktigt expanderbara, samtidigt som de robust bibehåller sin stamhetsnatur. Därför ger de en tillförlitlig metod för att expandera primära hypofysstamceller för djupgående utforskning. En sådan utforskning kan inte uppnås med det begränsade antalet stamceller som kan isoleras från en hypofys, som inte heller kan expanderas under 2D-förhållanden16. Det har visat sig att organoiderna är värdefulla och tillförlitliga verktyg för att avslöja nya hypofysstamcellsegenskaper (översättbara till in vivo)14,18. Viktigt är att organoidmodellen troget speglar hypofysstamcellsaktiveringsstatusen som inträffar under lokal vävnadsskada och neonatal mognad, vilket visar förbättrad bildningseffektivitet och replikerar uppreglerade molekylära vägar14,18. Därför är den hypofys-härledda organoidmodellen en innovativ och kraftfull forskningsmodell för hypofysstamcellsbiologi samt ett stamcellsaktiveringsavläsningsverktyg.
Detta protokoll beskriver i detalj upprättandet av mus hypofys-härledda organoider. För detta syfte isoleras AL och dissocieras i enskilda celler, vilka är inbäddade i extracellulär matris-efterliknande Matrigel (nedan kallad ECM). Cell-ECM-sammansättningen odlas sedan i ett definierat medium, som i huvudsak innehåller stamcellstillväxtfaktorer och hypofysembryonala regulatorer (vidare kallat hypofysorganoidmedium (PitOM)18; Tabell 1). När organoiderna är fullt utvecklade (efter 10-14 dagar) kan de expanderas ytterligare genom sekventiell genomströmspassage och utsättas för omfattande nedströms prospektering (t.ex. immunofluorescens, RT-qPCR och bulk- eller encellstranskriptomik; Figur 1). På längre sikt förväntas hypofysstamcellsorganoiderna bana väg för vävnadsreparationsmetoder och regenerativ medicin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Djurförsök för denna studie godkändes av KU Leuvens etiska kommitté för djurförsök (P153/2018). Alla möss var inrymda på universitetets djuranläggning under standardiserade förhållanden (konstant temperatur på 23 ± 1,5 ° C, relativ luftfuktighet 40% -60% och en dag / nattcykel på 12 timmar), med tillgång till vatten och mat ad libitum.
1. Möss
- Använd kommersiellt tillgängliga musstammar, såsom C57BL / 6J-möss, i ung vuxen ålder (8-12 veckor gammal). I allmänhet ger 2-3 möss ett tillräckligt antal AL-celler för protokollet.
2. Isolering och dissociation av mus AL
OBS: Medium A, B och C förbereds i förväg19,20. Kompositioner visas i tabell 2.
- Isolering av mus AL
- Avliva mössen genomCO2-kvävning , följt av halshuggning (figur 2A). Tvätta mösshuvuden med avjoniserat vatten för att ta bort blodet och spraya dem med 70% EtOH för att generera en steril miljö.
- Använd sterila kirurgiska verktyg, ta bort huvudets hud mellan öronen (Figur 2B).
- Öppna kraniet och ta bort hjärnan.
- Bryt "näsbryggan" (dvs. främre delen av frontbenet; Figur 2B) med steril sax.
- Öppna kraniet ytterligare med en sax, från den trasiga näsbryggan mot öronen, på båda sidor (figur 2C).
- Ta bort kraniet och hjärnan med steril pincett utan att röra hypofysen (Figur 2D).
- Ta bort membranet sellae med trubbig pincett utan att skada hypofysen. Kassera PL och IL från AL under ett stereomikroskop.
OBS: PL och IL är länkade och därmed borttagna samtidigt. Dessa delar visas som vit vävnad, jämfört med den rosa färgade AL (Figur 2D). - Isolera försiktigt AL med en trubbig pincett och samla den i en 10 ml Erlenmeyerkolv, fylld med 3 ml medium A (se tabell 2). Placera kolven på is tills vidare bearbetning.
- Dissociation av mus AL
- Ta bort supernatantmediet (SN) A från Erlenmeyerkolven som innehåller den isolerade AL. Tillsätt 2 ml förvärmd (37 °C) 2,5 % trypsinlösning och inkubera vid 37 °C i 15 minuter.
- Utan att ta bort trypsinlösningen, tillsätt 2 ml förvärmd (37 ° C) DNase-lösning (2 μg / ml i medium A; sterilfiltrerad genom ett 0,22 μm nät) och virvla Erlenmeyerkolven 10 gånger. Låt hypofysen sjunka till botten (~ 1 min) och ta bort SN.
- Tillsätt 2 ml förvärmd (37 °C) trypsinhämmarlösning (0,1 mg/ml i medium A; sterilfiltrerad genom ett nät på 0,22 μm) och inkubera vid 37 °C i 10 min. Låt hypofysen sedimentera till botten och ta bort SN.
- Tillsätt 2 ml förvärmt (37 °C) medium B (se tabell 2) och inkubera vid 37 °C i 5 minuter. Utan att ta bort SN, tillsätt 2 ml förvärmt (37 °C) medium C (se tabell 2) och inkubera vid 37 °C i 15 minuter.
- Låt hypofysen sjunka till botten och ta bort SN. Skölj hypofysen tre gånger med förvärmt (37 °C) medium C.
- Dissociera hypofysen i enskilda celler.
- Tillsätt 2 ml förvärmt (37 ° C) medium C. Aspirera och utvisa hypofysen med en steril, flampolerad Pasteur-pipett flera gånger tills fragment inte är synliga längre.
- Överför suspensionen till ett 15 ml rör med 4,5 ml förvärmd (37 °C) DNaslösning (2 μg/ml i medium A; sterilfiltrerad genom ett nät på 0,22 μm). Skölj Erlenmeyer tre gånger med 2 ml förvärmt (37 °C) medium C och överför suspensionen till 15 ml-röret.
- Blanda den uppsamlade cellsuspensionen och filtrera den genom en 40 μm cellsil i ett 30 ml rör. Skölj 15 ml-röret och cellsilen tre gånger med 2 ml medium C och överför suspensionen till 30 ml-röret.
- Placera spetsen på en Pasteurpipett i glas, fylld med 2 ml 3% bovint serumalbuminlösning (BSA) (i medium A; sterilfiltrerad genom ett 0,22 μm nät), längst ner på röret och pipettera försiktigt ut för att bilda ett synligt densitetsskikt. Centrifug vid 190 x g i 10 min vid 4 °C.
- Ta bort SN genom att invertera röret i en flytande rörelse och ta bort de återstående SN-dropparna med en P1000-spets. Återsuspendera cellpelleten i 1 ml iskall Advanced DMEM/F12 (Adv DMEM/F12) och kvantifiera cellerna med en cellräknare.
3. Etablering och odling av AL-härledda organoider
OBS: Tina ECM på is i förväg (2-3 h för 1 ml) och håll den på is under protokollets varaktighet.
- Organoid sådd och odling
- Centrifugera AL-cellsuspensionen vid 190 x g i 10 min vid 4 °C och ta bort SN. Återutnytt cellpelleten i Adv DMEM/F12 med hjälp av den specifika volym som beräknats för att nå en celldensitet på 1,1 x 106 celler/ml.
OBS: Till exempel, om cellsuspensionen innehåller 500 000 celler / ml, måste man återanvända cellpelleten i 454,54 μL Adv DMEM / F12 för att nå den önskade densiteten på 1,1 x 106 celler / ml. - Ta ut volymen av cellsuspension som behövs för plätering (enligt önskat antal brunnar till frö för organoidutveckling) och tillsätt ECM i ett förhållande på 30:70 (30% cellsuspension (i Adv DMEM / F12 ) och 70% ECM). Blanda väl genom att pipettera upp och ner.
OBS: Till exempel, för en droppe på 30 μL (se steg 3.1.3), bör man (försiktigt) blanda 9 μL cellsuspension (innehållande ~ 10 000 celler när de tas från 1,1 x 106 celler / ml suspension) med 21 μL ECM. - Deponera en droppe på 30 μL av cellsuspensionen/ECM-blandningen (se steg 3.1.2) på en förvärmd (37 °C) 48-brunnsplatta. Vänd plattan upp och ner och låt ECM stelna vid 37 °C i 20 min.
OBS: Förvärm odlingsplattorna i minst 24 timmar vid 37 °C. - Sätt tillbaka plattan till rätt riktning och tillsätt försiktigt 250 μL förvärmd (37 °C) PitOM (se tabell 1) kompletterad med 10 μM berghämmare (Y-27632).
- Fortsätt att odla organoiderna genom att byta medium (utan Y-27632) var 2-3: e dag tills organoiderna är fullvuxna, vilket tar mellan 10-14 dagar (Figur 3A). Passera sedan organoiderna.
OBS: När du aspirerar mediet, se till att inte störa ECM-kupolen. Luta odlingsplattan något och ta bort mediet från brunnens bottenkant. Färskt (förvärmt vid 37 °C) medium ska tillsättas försiktigt till sidan av brunnen. Om geldroppar avtas, samla organoiderna och återsuspendera och odla dem igen i en ny ECM-droppe.
- Centrifugera AL-cellsuspensionen vid 190 x g i 10 min vid 4 °C och ta bort SN. Återutnytt cellpelleten i Adv DMEM/F12 med hjälp av den specifika volym som beräknats för att nå en celldensitet på 1,1 x 106 celler/ml.
- Organoid passaging
- Aspirera mediet försiktigt och tillsätt 400 μL iskall Adv DMEM / F12 för att sönderdela ECM och samla organoiderna i ett mikrocentrifugrör. Tvätta en gång med 400 μL iskall Adv DMEM/F12 EM. Centrifug vid 200 x g i 5 min vid 4 °C.
- Ta försiktigt bort SN och tillsätt 400 μL förvärmd (37 °C) TrypLE Express Enzyme (1X). Blanda genom att invertera röret flera gånger och inkubera vid 37 °C i 5 min.
- Tillsätt 400 μL iskall Adv DMEM/F12 och centrifug vid 200 x g i 5 min vid 4 °C. Ta bort SN.
- Resuspendera pelletsen med 100 μL iskall Adv DMEM/F12 och bryt därefter upp organoiderna genom att kraftigt pipettera upp och ner med en smalare P200-spets (dvs. trycka ner den tomma spetsen mot botten av mikrocentrifugröret, för att minska dess öppningsdiameter) tills organoidfragment (med en diameter runt 50 μm) erhålls (figur 3B).
OBS: Dissociationsblandningen bör innehålla övervägande organoidfragment och endast ett fåtal enskilda celler. Hård dissociation av organoiderna i enskilda celler påverkar organoidernas återväxt negativt. - Tillsätt 800 μL Adv DMEM/F12 och centrifug vid 190 x g i 10 min vid 4 °C. Ta bort SN.
- Passera organoiderna i ett förhållande 1: 2 till 1: 4. Resuspendera pelletsen i en tillräcklig volym Adv DMEM /F12 efter behov för plätering och tillsätt ECM i ett förhållande på 30:70 (30% cellsuspension och 70% ECM). Blanda väl genom att pipettera upp och ner.
- Frö och odling av organoiderna enligt beskrivningen ovan i steg 3.1.3-3.1.5.
OBS: I genomsnitt utvecklas 20 organoider per brunn från de 10 000 hel-AL-celler som såddes (0,2%). Dessa passage 0 organoider kan delas i ett förhållande 1: 2, vilket resulterar i att >50 organoider utvecklas per brunn (passage 1). Organoider kan sedan delas i ett förhållande 1: 2 till 1: 4 under efterföljande passager. Återväxten av organoiderna saktar ner efter ~ 10 passager (motsvarande 3 månaders odling), konkretiserad i gradvis färre och mindre organoider.
4. Kryokonservering av AL-härledda organoider och upptining
- Kryokonservering av organoider
- Följ passeringsprotokollet från steg 3.2.1 till steg 3.2.5.
- Återsuspendera organoidpelleten (innehållande fragment och celler) med 1 ml kryokonserveringsmedium (tabell 3). Överför suspensionen till en kryovial och lägg den på is.
OBS: Organoider (dvs. resulterande fragment och celler) från upp till fyra brunnar på 48-brunnsplattan kan kombineras i en kryovial. - Placera kryovialerna i en frysbehållare och överför dem till -80 °C.
- Efter 24 timmar ska proverna överföras till en kryobox och förvara dem i flytande kväve (-196 °C) för långvarig lagring.
- Upptining av kryokopererade organoider
- Ta bort kryovialen från tanken med flytande kväve och lägg den på is. Fortsätt omedelbart med upptiningsprotokollet.
- Tina lösningen med kryokopererade organoidfragment och enstaka celler vid 37 °C (vattenbad).
OBS: Förvara inte lösningen i mer än 2 minuter vid 37 °C för att undvika celltoxicitet med DMSO. - Överför innehållet till ett 15 ml rör innehållande 10 ml iskall Adv DMEM/F12 med 30 % serum från fostrets nötkreatur (FBS). Skölj kryovialen med 1 ml Adv DMEM/F12 med 30 % FBS.
- Centrifug vid 190 x g i 10 min vid 4 °C. Återsuspendera pelletsen med 1 ml iskall Adv DMEM/F12 och överför suspensionen till ett mikrocentrifugrör.
- Centrifug vid 190 x g i 10 min vid 4 °C. Resuspendera pelletsen i en tillräcklig volym Adv DMEM / F12 efter behov för plätering och tillsätt ECM i ett förhållande 30:70. Blanda väl genom att pipettera upp och ner.
- Frö och odling av organoiderna enligt beskrivningen ovan i steg 3.1.3-3.1.5.
5. Validering av AL-härledda organoider
- Samling och lys av organoider för RNA-isolering
- Samla in och centrifugera organoiderna enligt beskrivningen ovan (steg 3.2.1).
- Ta bort SN och tillsätt 350 μL lysbuffert med 1% 2-merkaptoetanol. Vortex i 30 s och förvara vid -80 ° C eller fortsätt omedelbart till RNA-isolering.
VARNING: Akta dig för att 2-merkaptoetanol är en giftig förening. Allt arbete måste utföras i en kemisk rökhuva medan du bär nitrilhandskar, en dammmask och skyddsglasögon. 2-Mercapto-etanol kan orsaka irreversibel skada på ögon och hud.
- Fixering och inbäddning av organoider för immun-histokemi / fluorescensfärgning
- Samla in och centrifugera organoiderna enligt beskrivningen ovan (steg 3.2.1).
- Ta bort SN, tillsätt 1 ml 4% paraformaldehyd (PFA) och inkubera i 30 min vid rumstemperatur (RT) på en orbital shaker (100 rpm).
VARNING: PFA är ett känt cancerframkallande ämne för människor som kan orsaka irreversibel skada på hornhinnan. Allt arbete måste göras i en kemisk rökhuva. Nitrilhandskar och skyddsglasögon måste alltid bäras. - Centrifug vid 200 x g i 5 min och ta bort SN. Tillsätt 1 ml PBS, inkubera 10 min vid RT på en orbital shaker (100 rpm) och centrifug vid 90 x g i 3 min vid 4 °C. Upprepa tvättsteget två gånger. Förvara i PBS vid 4 °C.
- För vävnadsbearbetning och uttorkning, ta bort SN och tillsätt 150 μL 2% agarosgel (i PBS) till organoidpelleten med en förvärmd breddad p200-spets (gjord genom att skära en liten bit av spetsen). Rör omedelbart upp hela volymen och mata ut i locket på mikrocentrifugröret.
OBS: Det är viktigt att arbeta snabbt, eftersom gelén som innehåller organoiderna snabbt stelnar. - Låt gelén stelna ordentligt i 30 minuter och flytta gelskivan till en histologikassett. Sänk ner och förvara i 50% EtOH tills uttorkning i vävnadsprocessorn.
- För paraffininbäddning, placera gelskivan (med tång) i en inbäddningsform och fyll med varmt paraffin (60 ° C). Placera formarna vid 4 °C tills paraffinet är fast (cirka 45 min). Dessa prover kan antingen lagras vid 4 °C eller omedelbart utsättas för sektionering.
- Mikrotome paraffinblocken som innehåller organoider vid 5 μm tjocklek och samlar proverna på glasrutschbanor. Tillsätt en droppe avjoniserat vatten under varje sektion för att möjliggöra korrekt sträckning av sektionen och placera rutschkanorna på en plan värmeplatta vid 37 ° C över natten. Förvara diabilderna med sektioner vid 4 °C eller fortsätt direkt med immunohistokemisk eller immunofluorescensfärgning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Efter isolering och dissociation av AL frös de erhållna enskilda cellerna i ECM och odlas i PitOM (figur 1, tabell 1). Figur 3A visar cellkulturen och densiteten vid sådd (dag 0). Vissa små skräp kan vara närvarande (figur 3A, vita pilspetsar), men kommer att försvinna vid passering. Fjorton dagar efter sådd är de AL-härledda organoiderna fullt utvecklade (figur 3A). Organoiderna uppvisar en cystisk morfologi, med ett epitelskikt som omsluter en lumen. I detta skede når organoiderna en diameter av 500 μm och måste passeras. Figur 3B visar den AL-härledda organoidkulturen efter genomgång vid den angivna tiden efter återsådd av de dissocierade organoidfragmenten.
Ibland kan en eller flera täta strukturer förekomma i organoidkulturen (Figur 3A, Ogynnsam). Vid passage tenderar täta organoider att ta över och hamnar i kulturer med endast täta strukturer efter ett par passager (Figur 3B, Ogynnsam). Därför rekommenderas att man inte fortsätter med brunnar som innehåller täta organoider (passage 0). Alternativt kan täta organoider kasseras genom sedimentering, vilket lämnar de cystiska organoiderna att fortsätta med. Ursprunget till dessa täta organoider är för närvarande oklart, men de visar en mindre uttalad hypofys natur18. Om organoider inte, eller mindre effektivt växer igen efter att ha passerat, måste dissociationsprocedurer optimeras. I synnerhet måste man vara uppmärksam på att inte dissociera för hårt; organoiderna måste delas upp till fragment, inte till enskilda celler (figur 3B, dag 0, infälld).
Immunofluorescensfärgningsanalys bekräftar epitelkaraktären hos de AL-härledda organoiderna, eftersom de uttrycker epitelmarkörerna E-kadherin (E-Cad) och cytokeratin 8/18 (CK8/18; Figur 3C), som dessutom har beskrivits som stamcellsmarkörer i hypofysen18. Organoidernas stamhetskaraktär demonstreras dessutom av SOX2- och TROP2-uttryck, som båda också identifierades som hypofysstamcellsmarkörer (figur 3C)14,18. LHX3, en transkriptionsfaktor som specifikt uttrycks i (tidigt utvecklande) hypofysen, validerar organoidernas hypofysfenotyp (figur 3C). Några av de organoidbildande cellerna är i ett proliferativt tillstånd, vilket uttrycker proliferationsmarkören Ki67 (figur 3C).
Ytterligare utforskning och validering av hypofysfenotypen (stemness) hos de AL-härledda organoiderna utförs med omvänd transkription-kvantitativ PCR (RT-qPCR). Högt uttryck av stamhetsmarkörerna Sox2, Cdh1 (kodning E-Cad), Krt8, Krt18 och Trop2 finns i organoiderna, klart högre än i primär AL, vilket indikerar att organoiderna berikar för stamcellerna och därmed representerar AL-stamcellsfacket, som tidigare beskrivits (figur 3D)18. I synnerhet förblir de utvecklingstranskriptionsfaktorerna Pitx1 och Pitx2 uttryckta efter utveckling i flera hormonella celltyper i AL, och därmed deras höga uttryck i AL också. Kulturerna behåller robust sin stamfenotyp, vilket framgår av det ihållande (höga) uttrycket av dessa markörer efter flera passager (figur 3D).
Figur 1: Översikt över etablering, underhåll, karakterisering och applikationspotential för organoider från friska och sjuka hypofysen. AL, främre lob; IL, mellanliggande lob; PL, bakre lob; MZ, marginalzon; PitOM, hypofysorganoidmedium (skapat med BioRender.com). Stamcellsnischer i AL anges i lila. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Isolering av hypofysen från vuxen avlivad mus. Representativa bilder i följd tagna efter (A) halshuggning, (B) avlägsnande av huvudhud (näsbryggan är omringad), (C) öppning av kraniet och (D) avlägsnande av hjärnan, exponering av hypofysen (omringad). Pil pekar på PL, som kasseras (tillsammans med tillhörande IL), vilket lämnar AL för isolering och dissociation. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Etablering och validering av AL-härledda organoider. (A) AL-cellssådd och organoidutveckling i PitOM vid angivna dagar (passage 0). Den övre raden visar gynnsam organoidtillväxt, med endast cystiska strukturer som utvecklas. Den nedre raden visar ogynnsam tillväxt med en stor tät struktur som uppträder (boxad). Vita pilspetsar indikerar skräp, svarta pilspetsar indikerar enskilda celler (förstorade i infälld). (B) Organoidfragment (förstorade i infälld) sådda vid passering (dag 0) och återväxt av organoider som observerats 7 dagar senare. Den övre raden visar gynnsam organoid återväxt, med endast cystiska strukturer som växer. Den nedre raden visar ogynnsam återväxt med täta organoider som tar över kulturen. (C) Immunofluorescensfärgning av E-Cad, SOX2, TROP2 (alla röda), CK8/18, LHX3 och Ki67 (alla gröna) i AL-härledda organoider. Kärnor är märkta med Hoechst33342 (blå). Pilspetsar indikerar Ki67+ celler. Skalstänger anges. (D) Genuttrycksanalys av stamhetsmarkörer (Sox2, Cdh1, Krt8, Krt18, Trop2) och utvecklingstranskriptionsfaktorer (Pitx1, Pitx2) i primära AL- och AL-härledda organoider (Passage 0 betyder 14 dagar efter cellsäd) bestämd av RT-qPCR (medelvärde ± SEM). Datapunkter representerar biologiska replikat. Deltacykeltröskelvärden (dCT) visas, beräknade med formeln: CT (gen av intresse) - CT (hushållsgen Actb). Ju mer positivt dCT-värdet (som presenteras på Y-axeln under noll X-axeln), desto lägre är uttrycksnivån för genen av intresse. Ju lägre (eller mer negativt) dCT-värdet är, desto högre uttrycksnivå 14,18,21,22. Klicka här för att se en större version av denna figur.
| Hypofysorganoidmedium (PitOM) | |
| Komponent | Koncentration |
| Avancerad DMEM/F12 | |
| Hepes | 1% |
| Penicillin-streptomycin | 1% |
| Glutamax | 1% |
| B-27 Tillägg (50X), minus vitamin A | 1X |
| L-glutamin (200 mM) | 2 mM |
| Rekombinant humant FGF-basiskt/FGF2/bFGF(157 aa) protein | 20 ng/ml |
| Rekombinant mänsklig IGF-1 | 100 ng/ml |
| N-2 tillägg (100X) | 1X |
| N-acetylcystein | 1,25 mM |
| Rekombinant människa/murin FGF-8b | 200 ng/ml |
| Rekombinant mänsklig FGF-10 | 100 ng/ml |
| A83-01 (aktivinreceptorliknande kinas 4/5/7-hämmare) | 0,50 μM |
| Rekombinant mus Sonic Hedgehog / Shh (C25II) N-Terminus | 100 ng/ml |
| Rekombinant humant EGF-protein, CF | 50 ng/ml |
| SB202190 (p38 mitogenaktiverad proteinkinashämmare) | 10 μM |
| Rekombinant mänsklig Noggin | 100 ng/ml |
| Koleratoxin från Vibrio cholerae | 100 ng/ml |
| Rekombinant human R-Spondin-1 | 200 ng/ml |
| Rekombinant human IL-6 | 20 ng/ml |
Tabell 1. Sammansättning av PitOM. PitOM filtreras genom ett nätfilter på 0,22 μm och förvaras vid 4 °C i högst 2 veckor.
| Medium A | |
| Komponent | Kvantitet |
| DMEM, pulver, hög glukos | 13,38 g |
| HEPES | 5,96 g |
| Natriumpyruvat (C3H3NaO3) | 0,11 g |
| Penicillin G natriumsalt | 35.00 mg |
| Streptomycinsulfatsalt | 50.00 mg |
| Natriumklorid (NaCl) | 0,50 g |
| Natriumvätekarbonat (NaHCO3) | 1,00 g |
| Albumin nötkreatur (cellodlingskvalitet) | 3,00 g |
| Sterilt vatten | 1,00 L |
| Medel C | |
| Komponent | Kvantitet |
| Natriumklorid (NaCl) | 7,50 g |
| Kaliumklorid (KCl) | 0,40 g |
| Natriumdivätefosfat 1-hydrat | 0,14 g |
| D-glukos | 1,00 g |
| HEPES | 4,76 g |
| Streptomycinsulfatsalt | 50.00 mg |
| Penicillin G natriumsalt | 35.00 mg |
| Fenol röd | 10.00 mg |
| Albumin nötkreatur (cellodlingskvalitet) | 3,00 g |
| Natriumvätekarbonat (NaHCO3) | 1,00 g |
| Sterilt vatten | 1,00 L |
| Medel B | |
| Komponent | Kvantitet |
| Titriplex III (Edetate dinatriumsaltdihydrat) | 0,74 g |
| Medel C | 100 ml |
Tabell 2. Sammansättning av medium A, B och C. Alla medier filtreras genom ett nätfilter på 0,22 μm och lagras vid 4 °C i högst 4 månader. PH-värdet för medium A och C måste justeras till 7,3.
| Kryokonserveringsmedium | |
| Komponent | Koncentration |
| Avancerad DMEM/F12 | 60% |
| FBS | 30% |
| DMSO | 10% |
Tabell 3. Sammansättning av kryokonserveringsmedium.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De AL-härledda organoiderna, som beskrivs här, representerar en kraftfull forskningsmodell för att studera hypofysstamceller in vitro. För närvarande är detta organoida tillvägagångssätt det enda tillgängliga verktyget för att på ett tillförlitligt och robust sätt odla och expandera primära hypofysstamceller. En hypofysorganoidmodell som härrör från embryonala stamceller (ESC) eller inducerade pluripotenta stamceller (iPSC) har rapporterats tidigare, som nära rekapitulerar hypofysembryonal organogenes23; Även om det är mycket användbart för att studera hypofysutveckling eller modellera hypofyssjukdom 23,24,25, är det rapporterade protokollet, med början från ESC / iPSC, mycket tidskrävande jämfört med protokollet som beskrivs här, och de resulterande organoiderna är inte heller expanderbara.
Framgångsrik odling av hypofysstamcellsorganoider beror på några kritiska steg i protokollet. Det är viktigt att platta ett lämpligt antal celler vid initial cellsädning. Ett mycket stort antal kommer att ge upphov till överfulla kulturer, vilket försämrar organoidernas livskraft och hindrar full organoidexpansion, medan ett mycket lågt antal celler kommer att resultera i begränsad organoidbildning. Dessutom är det viktigt att inte störa ECM-kupolens integritet en gång i kulturen. Tillsats och borttagning av medium bör göras mycket noggrant, utan att röra geldroppen. Dessutom minskar förvärmningen av odlingsmediet risken för depolymerisation av gelén. Slutligen är det avgörande att passera organoiderna korrekt (dvs dissociera till fragment och inte till enskilda celler) för effektiv expansion av kulturerna.
Dessa hypofysstamcellsorganoider kan utnyttjas för att svara på frågor om stamcellernas fenotyp, biologi och funktion. De har redan visat sig vara värdefulla för att avslöja nya stamcellsfunktioner samt markörer för hypofysskador-associerad stamcellsaktivering och som ett avläsningsverktyg för stamcellsaktivitet (figur 1)14,18. Nuvarande ansträngningar inkluderar deras härledning från sjuk hypofys, såsom hypopituitarism och PitNETs (Figur 1). Så småningom kan organoider också engageras i en plattform för läkemedelsscreening, som framgångsrikt etablerats för andra sjukdomar26,27. Därför kommer ytterligare uppskalning av organoidkulturerna för att nå analys med hög genomströmning att vara nödvändig. Det har redan noterats att AL-härledda organoider effektivt kan odlas i ett 96-brunnsformat, vilket också resulterar i mer homogena kulturer.
Det har observerats att efter ~ 10 passager (motsvarande 3 månaders odling) minskade organoidtillväxteffektiviteten gradvis med organoider som återväxte vid lägre antal och mindre storlek. Denna tillväxtnedgång kan vara inneboende i hypofysstamcellernas inneboende natur, som kanske inte behöver självförnyas många gånger i körteln in vivo, som bara långsamt vänder sig om och därmed blir utmattad efter ett par delningsrundor16,28. Även om denna eventuella tillväxtnedgång kan betraktas som en begränsning, är modellen mycket användbar eftersom organoidexpansion under de föregående passagerna är mer än tillräcklig för omfattande nedströmsanalyser.
En annan aspekt som kan betraktas som en begränsning är att hypofysstamcellsorganoiderna inte visar framträdande differentieringskapacitet mot de endokrina celltyperna i AL, även efter xenotransplantation under njurkapseln hos immunbristfälliga möss (vilket resulterade i ett begränsat antal GH + och PRL + -celler som beskrivs i detalj i referens18). Antingen har de rätta in vitro-förutsättningarna för att driva stamcellerna till differentiering ännu inte identifierats, eller så är stamcellernas huvudsakliga roll (särskilt i den vuxna körteln) inte lokaliserad för att generera nya endokrina celler (eftersom det sannolikt inte behövs i den lata körteln utan endast under störda eller utmanade förhållanden)9,10,14, 18. Istället kan huvudfunktionen vara belägen i andra biologiska aspekter (t.ex. parakrin signalering till hormonell stamfader/prekursor eller mogna celler i grundläggande, men sannolikt mer i aktiva (utvecklings-, reparations-, sjukdoms)13,16. Även om hypofysstamceller har visat sig ha multipotent differentieringskapacitet, särskilt under embryonal och neonatal period, är det tänkbart att stamceller i den vuxna körteln inte (behöver) upprätthålla denna kapacitet, med tanke på den mycket låga omsättningen av den vuxna körteln16,28. Det är möjligt att de vuxna hypofysstamcellerna fungerar mer som ett parakrint signalnav, involverat i att stimulera eller reglera den omgivande stamfadern / prekursorn / endokrina celler13,16. Därför kan robust differentiering av hypofysstamcellsorganoiderna som kulminerar i hormonsekretion vara en felaktig förväntan som aldrig kommer att nås.
Sammantaget erbjuder protokollet som presenteras här ett snabbt tillämpligt och pålitligt verktyg för att robust expandera primära hypofysstamceller i en 3D-inställning in vitro. Protokollet ger upphov till organoider som troget fångar hypofysstamcellsfenotypen. Systemet har redan framgångsrikt tillämpats för att studera hypofysstamcellsbiologi och aktivering 14,18, och resultaten är mycket översättbara till in vivo-situationen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar inga konkurrerande ekonomiska intressen.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av bidrag från KU Leuven Research Fund och Fund for Scientific Research (FWO) - Flandern. E.L. (11A3320N) och C.N. (1S14218N) stöds av ett Ph.D. Fellowship från FWO / FWO-SB.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250 | |
| 48-well plates, TC treated, individually wrapped | Costar | 734-1607 | |
| A83-01 | Sigma-Aldrich | SML0788 | |
| Advanced DMEM/F12 | Gibco | 12634010 | |
| Albumin Bovine (cell culture grade) | Serva | 47330 | |
| B-27 Supplement (50X), minus vitamin A | Gibco | 12587010 | |
| Base moulds | VWR | 720-1918 | |
| Buffer RLT | Qiagen | 79216 | |
| Cassettes, Q Path Microtwin | VWR | 720-2191 | |
| Cell strainer, 40 µm mesh, disposable | Falcon | 352340 | |
| Cholera Toxin from Vibrio cholerae | Sigma-Aldrich | C8052 | |
| Deoxyribonuclease I from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | D5025 | |
| D-glucose | Merck | 108342 | |
| Dimethylsulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| DMEM, powder, high glucose | Gibco | 52100039 | |
| Eppendorf Safe-Lock Tubes, 1.5 mL | Eppendorf | 30120086 | |
| Epredia SuperFrost Plus Adhesion slides | Thermo Fisher Scientific | J1800AMNZ | |
| Epredia HistoStar Embedding Workstation, 220 to 240Vac | Thermo Fisher Scientific | 12587976 | |
| Ethanol Absolute 99.8+% | Thermo Fisher Scientific | 10342652 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Sigma-Aldrich | F7524 | |
| GlutaMAX Supplement | Gibco | 35050061 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | |
| HEPES Buffer Solution | Gibco | 15630056 | |
| InSolution Y-27632 | Sigma-Aldrich | 688001 | |
| L-Glutamine (200 mM) | Gibco | 25030081 | |
| Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix, LDEV-Free | Corning | 15505739 | |
| Mr. Frosty Freezing Container | Thermo Fisher Scientific | 5100-0001 | |
| N-2 Supplement (100X) | Thermo Fisher Scientific | 17502048 | |
| N-Acetyl-L-cysteine | Sigma-Aldrich | A7250 | |
| Nunc Biobanking and Cell Culture Cryogenic Tubes | Thermo Fisher Scientific | 375353 | |
| Paraformaldehyde for synthesis (PFA) | Merck | 818715 | |
| PBS, pH 7.4 | Gibco | 10010023 | |
| Penicillin G sodium salt | Sigma-Aldrich | P3032 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140122 | |
| Phenol red | Merck | 107241 | |
| Potassium Chloride (KCl) | Merck | 104936 | |
| Recombinant Human EGF Protein, CF | R&D systems | 236-EG | |
| Recombinant Human FGF basic/FGF2/bFGF (157 aa) Protein | R&D systems | 234-FSE | |
| Recombinant Human FGF-10 | Peprotech | 100-26 | |
| Recombinant Human IGF-1 | Peprotech | 100-11 | |
| Recombinant Human IL-6 | Peprotech | 200-06 | |
| Recombinant Human Noggin | Peprotech | 120-10C | |
| Recombinant Human R-Spondin-1 | Peprotech | 120-38 | |
| Recombinant Human/Murine FGF-8b | Peprotech | 100-25 | |
| Recombinant Mouse Sonic Hedgehog/Shh (C25II) N-Terminus | R&D systems | 464-SH | |
| RNeasy micro kit | Qiagen | 74004 | |
| SB202190 | Sigma-Aldrich | S7067 | |
| SeaKem LE Agarose | Lonza | 50004 | |
| Sodium Chloride (NaCl) | BDH | 102415K | |
| Sodium di-Hydrogen Phosphate 1-hydrate | PanReac-AppliChem | A1047 | |
| Sodium Hydrogen Carbonate (NaHCO3) | Merck | 106329 | |
| Sodium-Pyruvate (C3H3NaO3) | Sigma-Aldrich | P5280 | |
| Stericup-GP, 0.22 µm | Millipore | SCGPU02RE | |
| Steriflip-GP Sterile Centrifuge Tube Top Filter Unit, 0.22 μm | Millipore | SCGP00525 | |
| Sterile water | Fresenius | B230531 | |
| Streptomycin sulfate salt | Sigma-Aldrich | S6501 | |
| Thermo Scientific Excelsior ES Tissue Processor | Thermo Scientific | 12505356 | |
| Titriplex III | Merck | 108418 | |
| TrypL Express Enzyme (1X), phenol red | Thermo Fisher Scientific | 12605028 | |
| Trypsin inhibitor from Glycine max (soybean) | Sigma-Aldrich | T9003 | |
| Trypsin solution 2.5 % | Thermo Fisher Scientific | 15090046 |
References
- Melmed, S. The pituitary. 3rd ed. , Elsevier/Academic Press. Cambridge. 1 (2011).
- Chen, J., et al. The adult pituitary contains a cell population displaying stem/progenitor cell and early-embryonic characteristics. Endocrinology. 146 (9), 3985-3998 (2005).
- Chen, J., et al. Pituitary progenitor cells tracked down by side population dissection. Stem Cells. 27 (5), 1182-1195 (2009).
- Fauquier, T., Rizzoti, K., Dattani, M., Lovell-Badge, R., Robinson, I. C. A. F. SOX2-expressing progenitor cells generate all of the major cell types in the adult mouse pituitary gland. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (8), 2907-2912 (2008).
- Rizzoti, K., Akiyama, H., Lovell-Badge, R. Mobilized adult pituitary stem cells contribute to endocrine regeneration in response to physiological demand. Cell Stem Cell. 13 (4), 419-432 (2013).
- Andoniadou, C. L., et al. Sox2+ stem/progenitor cells in the adult mouse pituitary support organ homeostasis and have tumor-inducing potential. Cell Stem Cell. 13 (4), 433-445 (2013).
- Nys, C., Vankelecom, H. Pituitary disease and recovery: How are stem cells involved. Molecular and Cellular Endocrinology. 525 (4), 111176 (2021).
- Schneider, H. J., Aimaretti, G., Kreitschmann-Andermahr, I., Stalla, G. K., Ghigo, E.
- Fu, Q., et al. The adult pituitary shows stem/progenitor cell activation in response to injury and is capable of regeneration. Endocrinology. 153 (7), 3224-3235 (2012).
- Willems, C., et al. Regeneration in the pituitary after cell-ablation injury: time-related aspects and molecular analysis. Endocrinology. 157 (2), 705-721 (2016).
- Gremeaux, L., Fu, Q., Chen, J., Vankelecom, H. Activated phenotype of the pituitary stem/progenitor cell compartment during the early-postnatal maturation phase of the gland. Stem Cells and Development. 21 (5), 801-813 (2012).
- Zhu, X., Tollkuhn, J., Taylor, H., Rosenfeld, M. G. Notch-dependent pituitary SOX2+ stem cells exhibit a timed functional extinction in regulation of the postnatal gland. Stem Cell Reports. 5 (6), 1196-1209 (2015).
- Russell, J. P., et al. Pituitary stem cells produce paracrine WNT signals to control the expansion of their descendant progenitor cells. eLife. 10 (1), 59142 (2021).
- Vennekens, A., et al. Interleukin-6 is an activator of pituitary stem cells upon local damage, a competence quenched in the aging gland. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (25), 2100052118 (2021).
- Mertens, F., et al. Pituitary tumors contain a side population with tumor stem cell-associated characteristics. Endocrine-Related Cancer. 22 (4), 481-504 (2015).
- Laporte, E., Vennekens, A., Vankelecom, H. Pituitary remodeling throughout life: are resident stem cells involved. Frontiers in Endocrinology. 11 (1), 604519 (2021).
- Yoshida, S., et al. Isolation of adult pituitary stem/progenitor cell clusters located in the parenchyma of the rat anterior lobe. Stem Cell Research. 17 (2), 318-329 (2016).
- Cox, B., et al. Organoids from pituitary as novel research model to study pituitary stem cell biology. Journal of Endocrinology. 240 (2), 287-308 (2019).
- Denef, C., Hautekeete, E., De Wolf, A., Vanderschueren, B. Pituitary basophils from immature male and female rats: distribution of gonadotrophs and thyrotrophs as studied by unit gravity sedimentation. Endocrinology. 130 (3), 724-735 (1978).
- Vander Schueren, B., Denef, C., Cassiman, J. J. Ultrastructural and functional characteristics of rat pituitary cell aggregates. Endocrinology. 110 (2), 513-523 (1982).
- Claes, C., et al. Human stem cell-derived monocytes and microglia-like cells reveal impaired amyloid plaque clearance upon heterozygous or homozygous loss of TREM2. Alzheimer's and Dementia. 15 (3), 453-464 (2019).
- Trompeter, H. -I., et al. MicroRNAs miR-26a, miR-26b, and miR-29b accelerate osteogenic differentiation of unrestricted somatic stem cells from human cord blood. BMC Genomics. 14, 111 (2013).
- Suga, H., et al. Self-formation of functional adenohypophysis in three-dimensional culture. Nature. 480 (7375), 57-62 (2011).
- Matsumoto, R., et al. Congenital pituitary hypoplasia model demonstrates hypothalamic OTX2 regulation of pituitary progenitor cells. Journal of Clinical Investigation. 130 (2), 641-654 (2019).
- Kanie, K., et al. Pathogenesis of anti-PIT-1 antibody syndrome: PIT-1 presentation by HLA class I on anterior pituitary cells. Journal of the Endocrine Society. 3 (11), 1969-1978 (2019).
- Lee, S. H., et al. Tumor evolution and drug response in patient-derived organoid models of bladder cancer. Cell. 173 (2), 515-528 (2018).
- Yan, H. H. N., et al. A comprehensive human gastric cancer organoid biobank captures tumor subtype heterogeneity and enables therapeutic screening. Cell Stem Cell. 23 (6), 882-897 (2018).
- Nolan, L. A., Kavanagh, E., Lightman, S. L., Levy, A. Anterior pituitary cell population control: basal cell turnover and the effects of adrenalectomy and dexamethasone treatment. Journal of Neuroendocrinology. 10 (3), 207-215 (1998).
