Summary
Hypofysen er nøkkelregulatoren til kroppens endokrine system. Denne artikkelen beskriver utviklingen av organoider fra musen hypofysen som en ny 3D in vitro modell for å studere kjertelens stamcellepopulasjon som biologien og funksjonen forblir dårlig forstått.
Abstract
Hypofysen er den viktigste endokrine kjertelen som regulerer viktige fysiologiske prosesser, inkludert kroppsvekst, metabolisme, kjønnsmodning, reproduksjon og stressrespons. For mer enn et tiår siden ble stamceller identifisert i hypofysen. Til tross for anvendelsen av transgene in vivo-tilnærminger , forblir deres fenotype, biologi og rolle uklar. For å takle denne gåten utvikles en ny og innovativ organoid in vitro-modell for å dypt avdekke hypofyse stamcellebiologi. Organoider representerer 3D-cellestrukturer som under definerte kulturforhold utvikler seg selv fra vevets (epiteliale) stamceller og rekapitulerer flere kjennetegn på disse stamcellene og deres vev. Det er vist her at mus hypofyse-avledede organoider utvikler seg fra kjertelens stamceller og trofast rekapitulere sine in vivo fenotypiske og funksjonelle egenskaper. Blant annet reproduserer de stamcellens aktiveringstilstand som in vivo som oppstår som svar på transgenisk påført lokal skade. Organoidene er langsiktige utvidbare, samtidig som de beholder sin stemness fenotype på en robust måte. Den nye forskningsmodellen er svært verdifull for å dechiffrere stamcellenes fenotype og oppførsel under viktige forhold for hypofyseoppussing, alt fra neonatal modning til aldringsrelatert falming, og fra sunne til syke kjertler. Her presenteres en detaljert protokoll for å etablere mus hypofyse-avledede organoider, som gir et kraftig verktøy for å dykke inn i den ennå gåtefulle verden av hypofyse stamceller.
Introduction
Hypofysen er en liten endokrine kjertel som ligger ved foten av hjernen, hvor den er koblet til hypothalamus. Kjertelen integrerer perifere og sentrale (hypothalamus) innganger for å generere en innstilt og koordinert hormonfrigjøring, og regulerer dermed nedstrøms mål endokrine organer (som binyrene og gonadene) for å produsere passende hormoner til rett tid. Hypofysen er nøkkelregulatoren til det endokrine systemet og kalles derfor med rette masterkjertelen1.
Mus hypofysen består av tre lober (figur 1), det vil si fremre lobe (AL), mellomloben (IL) og bakre lobe (PL). Den store endokrine AL inneholder fem hormonelle celletyper, inkludert somatotroper som produserer veksthormon (GH); laktotroper som genererer prolaktin (PRL); kortikotroper som skiller ut adrenocorticotropisk hormon (ACTH); thyrotropes ansvarlig for skjoldbruskstimulerende hormon (TSH) produksjon; og gonadotroper som gjør luteiniserende hormon (LH) og follikkelstimulerende hormon (FSH). PL består av axonale projeksjoner fra hypothalamus der hormonene oksytocin og vasopressin (antidiuretisk hormon) lagres. IL ligger mellom AL og PL og huser melanotroper som produserer melanocyttstimulerende hormon (MSH). I den menneskelige hypofysen går IL tilbake under utvikling, og melanotroper spres innenfor AL1. I tillegg til de endokrine cellene inneholder hypofysen også et basseng med stamceller, i hovedsak preget av transkripsjonsfaktoren SOX2 2,3,4,5,6. Disse SOX2+ cellene ligger i marginalsonen (MZ), epitelforingen av kløften (en embryonal rest lumen mellom AL og IL), eller spres som klynger gjennom parenchyma av AL, og foreslår dermed to stamcellenisjer i kjertelen (figur 1)2,3,4,5,6.
Gitt hypofysens uunnværlige natur, er funksjonsfeil i kjertelen forbundet med alvorlig sykelighet. Hyperpituitarisme (preget av over-sekresjon av ett eller flere hormoner) og hypopituitarisme (defekt eller manglende produksjon av ett eller flere hormoner) kan være forårsaket av hypofysen nevroendokrine svulster (PitNETs; f.eks. ACTH-produserende svulster som fører til Cushings sykdom) eller ved genetiske defekter (f.eks. GH-mangel som resulterer i dvergisme)7. I tillegg hypofysekirurgi (f.eks. for å fjerne svulster), infeksjoner (f.eks. hypothalamus-hypofyse tuberkulose, eller infeksjoner etter bakteriell meningitt eller encefalitt), Sheehans syndrom (nekrose på grunn av utilstrekkelig blodstrøm på grunn av kraftig blodtap ved fødsel), hypofyse apoplexy og traumatisk hjerneskade er andre viktige årsaker til hypofyse hypofuktighet8 . Det har vist seg at musen hypofysen har regenerativ kapasitet, å kunne reparere lokal skade introdusert ved transgen ablasjon av endokrine celler 9,10. SOX2+-stamcellene reagerer akutt på den påførte skaden som viser en aktivert fenotype, preget av forbedret spredning (som resulterer i stamcelleutvidelse) og økt uttrykk for stamcellerelaterte faktorer og veier (f.eks. Videre begynner stamcellene å uttrykke det ablerte hormonet, noe som til slutt resulterer i betydelig restaurering av den utarmede cellepopulasjonen i løpet av følgende (5 til 6) måneder 9,10. Også under neonatal modningsfasen av kjertelen (de første 3 ukene etter fødselen) blomstrer hypofysen stamceller i en aktivert tilstand 6,11,12,13, mens organismal aldring er forbundet med redusert in situ stamcellefunksjonalitet, på grunn av et økende inflammatorisk (mikro-) miljø ved aldring (eller 'inflammaging')10,14 . I tillegg er tumorigenesis i kjertelen også forbundet med stamcelleaktivering 7,15. Selv om stamcelleaktivering har blitt påvist i flere situasjoner med hypofyseoppussing (gjennomgått i 7,16), er underliggende mekanismer fortsatt uklare. Siden in vivo-tilnærminger (for eksempel avstamningssporing hos transgene mus) ikke har gitt et klart eller omfattende bilde av hypofyse stamceller, er utviklingen av pålitelige in vitro-modeller for å utforske stamcellebiologi i normal og syk hypofyse viktig. Standard in vitrokultur av primære hypofyse stamceller forblir utilstrekkelig på grunn av svært begrenset vekstkapasitet og ikke-fysiologiske (2D) forhold med raskt tap av fenotype (for en mer detaljert oversikt, se16). 3D-sfærekulturer (pituispheres) er etablert fra hypofyse stamceller som identifisert av sidepopulasjon og SOX2 + fenotype 2,3,4. Pituisfærene vokser clonally fra stamcellene, uttrykker stemnessmarkører og viser differensieringskapasitet i de endokrine celletypene. Imidlertid utvides de ikke betydelig mens de bare viser begrenset passasje (2-3 passasjer)3,4. Sfærelignende strukturer ble også hentet fra ikke-dissosierte hypofyse stamcelleklynger når de ble dyrket i 50% fortynnet Matrigel i 1 uke, men utvidelsesmuligheter ble ikke vist17. Pituisphere-tilnærmingen brukes for det meste som et avlesningsverktøy for stamcellenumre, men ytterligere applikasjoner er begrenset av dårligere utvidelseskapasitet16.
For å adressere og overvinne disse manglene har en ny 3D-modell nylig blitt etablert, det vil si organoider, fra den store endokrine AL av mus som inneholder MZ og parenchymale stamceller. Det har vist seg at organoidene faktisk er avledet fra hypofysens stamceller og trofast rekapitulerer deres fenotype18. Videre er organoidene langsiktige utvidbare, samtidig som de opprettholder sin stemness natur på en robust måte. Derfor gir de en pålitelig metode for å utvide primære hypofyse stamceller for dyp utforskning. Slik utforskning kan ikke oppnås med det begrensede antallet stamceller som kan isoleres fra en hypofyse, som heller ikke kan utvides under 2D-forhold16. Det har vist seg at organoidene er verdifulle og pålitelige verktøy for å avdekke nye hypofyse stamcellefunksjoner (oversettbar til in vivo)14,18. Viktigst, den organoide modellen speiler trofast hypofysen stamcelleaktiveringsstatus som oppstår under lokal vevsskade og neonatal modning, som viser forbedret formasjonseffektivitet og replikerer oppregulerte molekylære veier14,18. Derfor er den hypofyse-avledede organoidmodellen en innovativ og kraftig forskningsmodell for hypofyse stamcellebiologi samt et stamcelleaktiveringsavlesningsverktøy.
Denne protokollen beskriver i detalj etableringen av mus hypofyse-avledede organoider. Til dette målet er AL isolert og dissosiert i enkeltceller, som er innebygd i ekstracellulær matrise-etterligning Matrigel (heretter referert til som ECM). Celle-ECM-samlingen dyrkes deretter i et definert medium, som i hovedsak inneholder stamcellevekstfaktorer og hypofysære embryonale regulatorer (videre referert til som 'hypofysen organoid medium' (PitOM)18; Tabell 1). Når organoidene er fullt utviklet (etter 10-14 dager), kan de utvides ytterligere gjennom sekvensiell passivisering og utsettes for omfattende nedstrømsutforskning (f.eks. immunfluorescens, RT-qPCR og bulk- eller encellet transkripsjonsomikk; Figur 1). På lengre sikt forventes det at hypofysens stamcelleorganoider vil bane vei for vevsreparasjonsmetoder og regenerativ medisin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Dyreforsøk for denne studien ble godkjent av KU Leuven Etisk komité for dyreforsøk (P153/2018). Alle musene ble plassert på universitetets dyreanlegg under standardiserte forhold (konstant temperatur på 23 ± 1,5 °C, relativ luftfuktighet 40%-60%, og en dag / natt syklus på 12 timer), med tilgang til vann og mat ad libitum.
1. Mus
- Bruk kommersielt tilgjengelige musestammer, for eksempel C57BL/6J-mus, av ung voksen alder (8-12 uker gammel). Generelt gir 2-3 mus et tilstrekkelig antall AL-celler for protokollen.
2. Isolasjon og dissosiasjon av mus AL
MERK: Middels A, B og C forberedes på forhånd19,20. Komposisjoner er vist i tabell 2.
- Isolering av mus AL
- Avlive musene ved CO 2-kvelning, etterfulgt av halshugging (figur 2A). Vask musenes hoder med deionisert vann for å fjerne blodet og spray dem med 70% EtOH for å generere et sterilt miljø.
- Bruk sterile kirurgiske verktøy til å fjerne huden på hodet mellom ørene (figur 2B).
- Åpne kraniet og fjern hjernen.
- Bryt nesebroen (dvs. fremre del av frontbenet; Figur 2B) steril saks.
- Åpne kraniet ytterligere med saks, fra den ødelagte nesebroen mot ørene, på begge sider (figur 2C).
- Fjern kraniet og hjernen med sterile pinsett, uten å berøre hypofysen (figur 2D).
- Fjern diafragma sellae med stump pinsett , uten å skade hypofysen. Kast PL og IL fra AL under et stereomikroskop.
MERK: PL og IL er koblet sammen og fjernes dermed samtidig. Disse delene vises som hvitt vev, sammenlignet med den rosafargede AL (figur 2D). - Isoler AL forsiktig med stumpe pinsett og samle den i en 10 ml Erlenmeyer-kolbe, fylt med 3 ml middels A (se tabell 2). Plasser kolben på is inntil videre bearbeiding.
- Dissosiasjon av mus AL
- Fjern supernatanten (SN) medium A fra Erlenmeyer-kolben som inneholder den isolerte AL. Tilsett 2 ml forvarsel (37 °C) 2,5 % trypsinoppløsning og inkuber ved 37 °C i 15 minutter.
- Uten å fjerne trypsinoppløsningen, tilsett 2 ml forvarsel (37 °C) DNase-oppløsning (2 μg/ml i middels A; sterilfiltrert gjennom et 0,22 μm nett), og virvle Erlenmeyer-kolben 10 ganger. La hypofysen synke til bunnen (~1 min) og fjern SN.
- Tilsett 2 ml forvarsel (37 °C) trypsinhemmeroppløsning (0,1 mg/ml i middels A; sterilfiltrert gjennom et 0,22 μm nett) og inkuber ved 37 °C i 10 minutter. La hypofysen sedimentet til bunnen og fjern SN.
- Tilsett 2 ml forvarsel (37 °C) medium B (se tabell 2) og inkuber ved 37 °C i 5 minutter. Uten å fjerne SN, tilsett 2 ml forvarsel (37 °C) middels C (se tabell 2) og inkuber ved 37 °C i 15 minutter.
- La hypofysen synke til bunnen og fjern SN. Skyll hypofysen tre ganger med forvarsel (37 °C) middels C.
- Fjern hypofysen i enkeltceller.
- Tilsett 2 ml forhåndsvarslet (37 °C) medium C. Aspirer og utvis hypofysen med en steril, flammepolert Pasteur pipette flere ganger, til fragmenter ikke er synlige lenger.
- Overfør suspensjonen til et 15 ml rør med 4,5 ml forvarsel (37 °C) DNase-oppløsning (2 μg/ml i middels A; sterilfiltrert gjennom et 0,22 μm nett). Skyll Erlenmeyer tre ganger med 2 ml forvarsel (37 °C) middels C og overfør suspensjonen til 15 ml-røret.
- Bland den oppsamlede cellefjæringen og filtrer den gjennom en 40 μm cellesil i et 30 ml rør. Skyll 15 ml-røret og cellesilen tre ganger med 2 ml middels C og overfør suspensjonen til 30 ml-røret.
- Plasser spissen av en pasteurpipette i glass, fylt med 2 ml 3 % bovint serumalbumin (BSA)-løsning (i medium A, sterilfiltrert gjennom et 0,22 μm nett), nederst på røret og forsiktig pipette ut for å danne et synlig tetthetslag. Sentrifuge ved 190 x g i 10 min ved 4 °C.
- Fjern SN ved å invertere røret i en flytende bevegelse og fjern de resterende SN-dråpene med en P1000-spiss. Resuspend cellepellet i 1 ml iskald Avansert DMEM/F12 (Adv DMEM/F12) og kvantifisere cellene med en celleteller.
3. Etablering og dyrking av AL-avledede organoider
MERK: Tine ECM på is på forhånd (2-3 t i 1 ml) og hold den på is så lenge protokollen varer.
- Organoid såing og culturing
- Sentrifuger AL-cellefjæringen ved 190 x g i 10 min ved 4 °C og fjern SN. Resuspend cellepellet i Adv DMEM/ F12 ved hjelp av det spesifikke volumet beregnet for å nå en celletetthet på 1,1 x 106 celler / ml.
MERK: Hvis cellesuspensjonen for eksempel inneholder 500 000 celler/ml, må man bruke cellepelleten på nytt i 454,54 μL Adv DMEM/F12 for å oppnå ønsket tetthet på 1,1 x 106 celler/ml. - Ta ut volumet av cellefjæring som trengs for plating (i henhold til ønsket antall brønner til frø for organoid utvikling) og legg til ECM i et 30: 70-forhold (30% celle suspensjon (i Adv DMEM / F12 ) og 70% ECM). Bland godt ved å pipettere opp og ned.
MERK: For eksempel, for en dråpe på 30 μL (se trinn 3.1.3), bør man (forsiktig) blande 9 μL celle suspensjon (inneholder ~ 10,000 celler når tatt fra 1.1 x 106 celler / ml suspensjon) med 21 μL ECM. - Per brønn, deponer en 30 μL dråpe av cellefjæringen / ECM-blandingen (se trinn 3.1.2) på en forvarmet (37 °C) 48-brønnsplate. Snu platen opp ned og la ECM størkne ved 37 °C i 20 minutter.
MERK: Forvarm kulturplatene i minst 24 timer ved 37 °C. - Returner platen til riktig retning og tilsett forsiktig 250 μL forvarsel (37 °C) PitOM (se tabell 1) supplert med 10 μM rockhemmer (Y-27632).
- Fortsett å dyrke organoidene ved å endre mediet (blottet for Y-27632) hver 2-3 dager til organoidene er fullvoksne, noe som tar mellom 10-14 dager (figur 3A). Deretter passerer du organoidene.
MERK: Når du aspirerer mediet, må du passe på at du ikke forstyrrer ECM-kuppelen. Vipp kulturplaten litt og fjern mediet fra den nederste kanten av brønnen. Friskt (forvarsel ved 37 °C) medium skal tilsettes forsiktig på siden av brønnen. Hvis geldråper løsner, samle organoidene og resuspend og kultur dem igjen i en ny ECM dråpe.
- Sentrifuger AL-cellefjæringen ved 190 x g i 10 min ved 4 °C og fjern SN. Resuspend cellepellet i Adv DMEM/ F12 ved hjelp av det spesifikke volumet beregnet for å nå en celletetthet på 1,1 x 106 celler / ml.
- Organoid passaging
- Aspirer mediet forsiktig og tilsett 400 μL iskald Adv DMEM/F12 for å oppløse ECM og samle organoidene i et mikrosenterrør. Vask én gang med 400 μL iskald Adv DMEM/F12 EM. Sentrifuge ved 200 x g i 5 min ved 4 °C.
- Fjern SN forsiktig og tilsett 400 μL for forhåndsvarslet (37 °C) TrypLE Express-enzymet (1X). Bland ved å invertere røret flere ganger, og inkuber ved 37 °C i 5 minutter.
- Tilsett 400 μL iskald Adv DMEM/F12 og sentrifuge ved 200 x g i 5 min ved 4 °C. Fjern s.nr.
- Resuspend pellet med 100 μL iskald Adv DMEM/F12 og deretter bryte opp organoidene ved kraftig pipettering opp og ned med en innsnevret P200-spiss (dvs. trykk den tomme spissen ned mot bunnen av mikrosenterrøret for å redusere åpningsdiameteren) til organoidfragmenter (med en diameter på rundt 50 μm) oppnås (figur 3B).
MERK: Dissosiasjonsblandingen skal inneholde overveiende organoide fragmenter og bare noen få enkeltceller. Hard dissosiasjon av organoidene i enkeltceller påvirker organoidenes re-vekst negativt. - Tilsett 800 μL Adv DMEM/F12 og sentrifuger ved 190 x g i 10 min ved 4 °C. Fjern s.nr.
- Passasje organoidene i forholdet 1:2 til 1:4. Resuspend pellet i et tilstrekkelig volum av Adv DMEM / F12 etter behov for plating og legge til ECM i et 30: 70 forhold (30% celle suspensjon og 70% ECM). Bland godt ved å pipettere opp og ned.
- Frø og kultur organoidene som beskrevet ovenfor i trinn 3.1.3-3.1.5.
MERK: I gjennomsnitt utvikler 20 organoider per brønn fra de 10.000 hel-AL-cellene frøet (0,2%). Disse passasjen 0 organoider kan deles i et 1:2-forhold, noe som resulterer i at >50 organoider utvikler seg per brønn (passasje 1). Organoider kan deretter deles i forholdet 1:2 til 1:4 under etterfølgende passasjer. Re-vekst av organoidene bremser etter ~ 10 passasjer (tilsvarende 3 måneders kultur), concretized i gradvis færre og mindre organoider.
4. Kryopreservering av AL-avledede organoider og tining
- Kryopreservering av organoider
- Følg passivingsprotokollen fra trinn 3.2.1 til trinn 3.2.5.
- Resuspend den organoide pelletsen (som inneholder fragmenter og celler) med 1 ml kryopreserveringsmedium (tabell 3). Overfør suspensjonen til en kryovial og legg den på is.
MERK: Organoider (dvs. resulterende fragmenter og celler) fra opptil fire brønner av 48-brønnsplaten kan kombineres i ett kryolegemet. - Plasser kryovialene i en frysebeholder og overfør dem til -80 °C.
- Etter 24 timer, overfør prøvene til en kryoboks og lagre dem i flytende nitrogen (-196 °C) for langvarig lagring.
- Tining av kryopreserverte organoider
- Fjern kryonalen fra den flytende nitrogentanken og legg den på is. Fortsett umiddelbart med opptiningsprotokollen.
- Tine oppløsningen med kryopreserverte organoidfragmenter og enkeltceller ved 37 °C (vannbad).
MERK: Ikke oppbevar oppløsningen i mer enn 2 minutter ved 37 °C for å unngå celletoksisitet ved DMSO. - Overfør innholdet til et 15 ml rør som inneholder 10 ml iskald Adv DMEM/F12 med 30 % fosterbovint serum (FBS). Skyll kryonalen med 1 ml Adv DMEM/F12 med 30 % FBS.
- Sentrifuge ved 190 x g i 10 min ved 4 °C. Resuspend pellet med 1 ml iskald Adv DMEM / F12 og overfør suspensjonen til et mikrocentrifugerør.
- Sentrifuge ved 190 x g i 10 min ved 4 °C. Resuspend pellet i et tilstrekkelig volum av Adv DMEM / F12 etter behov for plating og legge til ECM i et 30: 70 forhold. Bland godt ved å pipettere opp og ned.
- Frø og kultur organoidene som beskrevet ovenfor i trinn 3.1.3-3.1.5.
5. Validering av AL-avledede organoider
- Innsamling og lysis av organoider for RNA-isolasjon
- Samle og sentrifuger organoidene som beskrevet ovenfor (trinn 3.2.1).
- Fjern SN og tilsett 350 μL lysisbuffer med 1% 2-mercapto-etanol. Virvel i 30 s og oppbevar ved -80 °C eller fortsett umiddelbart til RNA-isolasjon.
FORSIKTIG: Pass på at 2-mercapto-etanol er en giftig forbindelse. Alt arbeid må gjøres i en kjemisk avtrekkshette mens du bruker nitrilhansker, støvmaske og vernebriller. 2-Mercapto-etanol kan forårsake irreversibel skade på øyne og hud.
- Fiksering og innebygging av organoider for immuno-histokjemi/-fluorescensfarging
- Samle og sentrifuger organoidene som beskrevet ovenfor (trinn 3.2.1).
- Fjern SN, tilsett 1 ml 4% paraformaldehyd (PFA) og inkuber i 30 minutter ved romtemperatur (RT) på en orbital shaker (100 rpm).
FORSIKTIG: PFA er et kjent humant kreftfremkallende middel som kan forårsake irreversibel skade på hornhinnen. Alt arbeid må gjøres i en kjemisk avtrekkshette. Nitrilhansker og vernebriller må alltid brukes. - Sentrifuge ved 200 x g i 5 min og fjern SN. Tilsett 1 ml PBS, inkuber 10 min ved RT på en orbital shaker (100 rpm), og sentrifuger ved 90 x g i 3 minutter ved 4 °C. Gjenta vasketrinnet to ganger. Oppbevars i PBS ved 4 °C.
- For vevsbehandling og dehydrering, fjern SN og tilsett 150 μL 2% agarose gel (i PBS) til den organoide pellet ved hjelp av en forhåndsvarslet utvidet p200-spiss (laget ved å kutte et lite stykke av spissen). Rør straks hele volumet opp og trekk ut i lokket på mikrocentrifugerøret.
MERK: Det er viktig å jobbe raskt, da gelen som inneholder organoidene raskt vil størkne. - La gelen størkne godt i 30 min og flytt gelskiven til en histologikassett. Senk og oppbevar i 50% EtOH, til dehydrering i vevsprosessoren.
- For parafininnbygging plasserer du gelskiven (ved hjelp av tang) i en innbyggingsform og fyller med varm parafin (60 °C). Plasser formene ved 4 °C til parafinen er fast (ca. 45 min). Disse prøvene kan enten oppbevares ved 4 °C eller umiddelbart bli utsatt for seksjonering.
- Mikrotom parafinblokkene som inneholder organoider med 5 μm tykkelse og samle prøvene på glasssklier. Tilsett en dråpe deionisert vann under hver seksjon for å tillate riktig strekking av delen og plasser lysbildene på en flat varmeplate ved 37 °C over natten. Oppbevar lysbildene med seksjoner ved 4 °C eller fortsett direkte med immunhiistokjemisk eller immunfluorescensfarging.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Etter isolasjon og dissosiasjon av AL blir de oppnådde enkeltcellene sådd i ECM og dyrket i PitOM (figur 1, tabell 1). Figur 3A viser cellekulturen og tettheten ved såing (dag 0). Noen små rusk kan være til stede (figur 3A, hvite pilspisser), men vil forsvinne ved passivring. Fjorten dager etter sådd er de AL-avledede organoidene fullt utviklet (figur 3A). Organoidene viser en cystisk morfologi, med et epitellag som omslutter en lumen. På dette stadiet når organoidene en diameter på 500 μm og må passeres. Figur 3B viser den AL-avledede organoidkulturen etter passivitet på det angitte tidspunktet etter re-seeding av de dissosierte organoidfragmentene.
Noen ganger kan en eller flere tette strukturer vises i organoidkulturen (figur 3A, ugunstig). Ved passaging har tette organoider en tendens til å ta over, og ender opp i kulturer med bare tette strukturer etter et par passasjer (figur 3B, ugunstig). Derfor anbefales det ikke å fortsette med brønner som inneholder tette organoider (passasje 0). Alternativt kan tette organoider kastes ved sedimentering, noe som gjør at cystiske organoider fortsetter med. Opprinnelsen til disse tette organoidene er for tiden uklar, men de viser en mindre uttalt hypofyse natur18. Hvis organoider ikke, eller mindre effektivt regrow etter passivitet, må dissosiasjonsprosedyrer optimaliseres. Spesielt må man være oppmerksom på ikke å dissosiere for hardt; organoidene må deles opp i fragmenter, ikke til enkeltceller (figur 3B, dag 0, innsett).
Immunfluorescensfargingsanalyse bekrefter epitelkarakteren til de AL-avledede organoidene, da de uttrykker epitelmarkørene E-kadherin (E-Cad) og cytokeratin 8/18 (CK8/18; Figur 3C), som dessuten er beskrevet som stamcellemarkører i hypofysen18. Organoidenes stilkhet er i tillegg demonstrert av SOX2- og TROP2-uttrykk, som begge også ble identifisert som hypofyse stamcellemarkører (figur 3C)14,18. LHX3, en transkripsjonsfaktor spesielt uttrykt i den (tidlig utviklende) hypofysen, validerer organoidenes hypofysefenotype (figur 3C). Noen av de organoidkonstituerende cellene er i proliferativ tilstand, og uttrykker spredningsmarkøren Ki67 (figur 3C).
Videre utforskning og validering av hypofysen (stemness) fenotypen til de AL-avledede organoidene utføres med omvendt transkripsjon-kvantitativ PCR (RT-qPCR). Høyt uttrykk for stemnessmarkørene Sox2, Cdh1 (koding av E-Cad), Krt8, Krt18 og Trop2 er til stede i organoidene, klart høyere enn i primær AL, noe som indikerer at organoidene beriker stamcellene og dermed representerer AL stamcellerommet, som tidligere beskrevet (figur 3D)18. Spesielt forblir de utviklingsmessige transkripsjonsfaktorene Pitx1 og Pitx2 uttrykt etter utvikling i flere hormonelle celletyper i AL, og dermed deres høye uttrykk i AL også. Kulturene beholder sin stemness fenotype robust, som demonstrert av det vedvarende (høye) uttrykket til disse markørene etter flere passasjer (figur 3D).
Figur 1: Oversikt over etablering, vedlikehold, karakterisering og anvendelsespotensial for organoider fra sunn og syk hypofyse. AL, fremre lobe; IL, mellomliggende lobe; PL, bakre lobe; MZ, marginal sone; Hypoom, hypofysen organoid medium (opprettet med BioRender.com). Stamcellenisjer i AL er indikert i lilla. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Isolering av hypofysen fra voksen euthanized mus. Representative bilder fortløpende tatt etter (A) halshugging, (B) fjerning av hodehud (nesebro er omkranset), (C) åpning av kraniet, og (D) fjerning av hjernen, utsette hypofysen (omkranset). Pilen peker på PL, som kastes (sammen med tilhørende IL), og etterlater AL for isolasjon og dissosiasjon. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Etablering og validering av AL-avledede organoider. (A) AL cellesåing og organoidutvikling i PitOM på angitte dager (passering 0). Den øverste raden viser gunstig organoid vekst, med bare cystiske strukturer som utvikler seg. Den nederste raden viser ugunstig vekst med en stor tett struktur som vises (bokset). Hvite pilspisser indikerer rusk, svarte pilspisser indikerer enkeltceller (forstørret i innsett). (B) Organoidfragmenter (forstørret i innsett) frø ved passivitet (dag 0) og gjenvekst av organoider som observert 7 dager senere. Den øverste raden viser gunstig organoid gjenvekst, med bare cystiske strukturer som vokser. Den nederste raden viser ugunstig gjenvekst med tette organoider som tar over kulturen. (C) Immunfluorescensfarging av E-Cad, SOX2, TROP2 (alle røde), CK8/18, LHX3 og Ki67 (alle grønne) i AL-avledede organoider. Nuclei er merket med Hoechst33342 (blå). Pilspisser angir Ki67+-celler. Skalastenger er indikert. (D) Genuttrykksanalyse av stemnessmarkører (Sox2, Cdh1, Krt8, Krt18, Trop2) og utviklingstranskripsjonsfaktorer (Pitx1, Pitx2) i primære AL- og AL-avledede organoider (Passasje 0 betyr 14 dager etter cellesåing) bestemt av RT-qPCR (gjennomsnittlig ± SEM). Datapunkter representerer biologiske replikeringer. Delta syklus terskel (dCT) verdier vises, beregnet ved hjelp av formelen: CT (gen av interesse) - CT (rengjøring gen Actb). Jo mer positiv dCT-verdien (som presenteres på Y-aksen under null X-aksen), jo lavere er uttrykksnivået for genet av interesse. Jo lavere (eller mer negativ) dCT-verdien er, jo høyere er uttrykksnivået 14,18,21,22. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| Hypofysen organoid medium (PitOM) | |
| Komponent | Konsentrasjon |
| Avansert DMEM/F12 | |
| Hepes | 1% |
| Penicillin-Streptomycin | 1% |
| Glutamax | 1% |
| B-27 Supplement (50X), minus vitamin A | 1X |
| L-Glutamin (200 mM) | 2 mM |
| Rekombinant Human FGF grunnleggende/FGF2/bFGF (157 aa) Protein | 20 ng/ml |
| Rekombinant menneskelig IGF-1 | 100 ng/ml |
| N-2 Supplement (100X) | 1X |
| N-acetyl-cystein | 1,25 mM |
| Rekombinant menneske/murine FGF-8b | 200 ng/ml |
| Rekombinant human FGF-10 | 100 ng/ml |
| A83-01 (aktivinreseptorlignende kinase 4/5/7 hemmer) | 0,50 μM |
| Rekombinant mus sonisk pinnsvin /hysj (C25II) N-Terminus | 100 ng/ml |
| Rekombinant humant EGF-protein, CF | 50 ng/ml |
| SB202190 (p38 mitogenaktivert proteinkinasehemmer) | 10 μM |
| Rekombinant human noggin | 100 ng/ml |
| Koleratoksin fra Vibrio kolerae | 100 ng/ml |
| Rekombinant human R-Spondin-1 | 200 ng/ml |
| Rekombinant human IL-6 | 20 ng/ml |
Tabell 1. Sammensetning av PitOM. PitOM filtreres gjennom et 0,22 μm nettingfilter og lagres ved 4 °C i maksimalt 2 uker.
| Middels A | |
| Komponent | Kvantitet |
| DMEM, pulver, høy glukose | 13,38 g |
| HEPES | 5,96 g |
| Natrium-Pyruvat (C3H3NaO3) | 0,11 g |
| Penicillin G natriumsalt | 35,00 mg |
| Streptomycinsulfat salt | 50,00 mg |
| Natriumklorid (NaCl) | 0,50 g |
| Natrium hydrogen karbonat (NaHCO3) | 1,00 g |
| Albumin Bovine (cellekultur klasse) | 3,00 g |
| Sterilt vann | 1,00 L |
| Middels C | |
| Komponent | Kvantitet |
| Natriumklorid (NaCl) | 7,50 g |
| Kaliumklorid (KCl) | 0,40 g |
| Natriumdi-hydrogenfosfat 1-hydrat | 0,14 g |
| D-glukose | 1,00 g |
| HEPES | 4,76 g |
| Streptomycinsulfat salt | 50,00 mg |
| Penicillin G natriumsalt | 35,00 mg |
| Fenol rød | 10,00 mg |
| Albumin Bovine (cellekultur klasse) | 3,00 g |
| Natrium hydrogen karbonat (NaHCO3) | 1,00 g |
| Sterilt vann | 1,00 L |
| Middels B | |
| Komponent | Kvantitet |
| Titriplex III (Edetat disodium saltdihydrat) | 0,74 g |
| Middels C | 100 ml |
Tabell 2. Sammensetning av middels A, B og C. Alle medier filtreres gjennom et 0,22 μm nettingfilter og lagres ved 4 °C i maksimalt 4 måneder. pH for middels A og C må justeres til 7,3.
| Kryopreserveringsmedium | |
| Komponent | Konsentrasjon |
| Avansert DMEM/F12 | 60% |
| FBS | 30% |
| DMSO | 10% |
Tabell 3. Sammensetning av kryopreserveringsmedium.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De AL-avledede organoidene, som beskrevet her, representerer en kraftig forskningsmodell for å studere hypofyse stamceller in vitro. For tiden er denne organoid tilnærmingen det eneste tilgjengelige verktøyet for pålitelig og robust å vokse og utvide primære hypofyse stamceller. En hypofyse organoid modell avledet fra embryonale stamceller (ESC) eller induserte pluripotente stamceller (iPSC) har blitt rapportert tidligere, som nøye recapitulates hypofyse embryonal organogenese23; Men selv om det er svært nyttig å studere hypofyseutvikling eller modell hypofysesykdom 23,24,25, er den rapporterte protokollen, fra ESC / iPSC, svært tidkrevende sammenlignet med protokollen som er beskrevet her, og de resulterende organoidene er heller ikke utvidbare.
Vellykket dyrking av hypofyse stamcelleorganoider avhenger av noen kritiske trinn i protokollen. Det er viktig å skrive inn et passende antall celler ved første cellesåing. Et svært høyt antall vil gi opphav til overbefolkede kulturer, noe som forverrer organoidenes levedyktighet og hindrer full organoid ekspansjon, mens et svært lavt antall celler vil resultere i begrenset organoiddannelse. Videre er det viktig å ikke forstyrre integriteten til ECM-kuppelen en gang i kulturen. Tilsetning og fjerning av medium bør gjøres veldig nøye, uten å berøre geldråpen. I tillegg reduserer forvarsel av kulturmediet risikoen for depolymerisering av gelen. Til slutt er det avgjørende for effektiv utvidelse av kulturene å passere organoidene riktig (dvs. dissosiere til fragmenter og ikke til enkeltceller).
Disse hypofyse stamcelleorganoidene kan utnyttes til å svare på spørsmål om stamcellens fenotype, biologi og funksjon. De har allerede vist seg verdifulle for å avdekke nye stamcellefunksjoner samt markører for hypofyseskaderelatert stamcelleaktivering og som et avlesningsverktøy for stamcelleaktivitet (figur 1)14,18. Dagens innsats inkluderer deres avledning fra syke hypofyse, som hypopituitarisme og pitNETs (figur 1). Etter hvert kan organoider også engasjeres i en plattform for legemiddelscreening, som vellykket etablert for andre sykdommer26,27. Derfor vil ytterligere oppskalering av organoidkulturene for å nå høy gjennomstrømningsanalyse være nødvendig. Det har allerede blitt lagt merke til at AL-avledede organoider effektivt kan dyrkes i et 96-brønns format, noe som også resulterer i mer homogene kulturer.
Det har blitt observert at etter ~ 10 passasjer (tilsvarende 3 måneders kultur), ble organoid veksteffektivitet gradvis redusert med organoider som regrowing ved lavere tall og mindre størrelse. Denne vekstnedgangen kan være iboende i hypofysens natur, som kanskje ikke trenger å fornye seg selv mange ganger i kjertelen in vivo, som bare sakte snur, og dermed blir utmattet etter et par divisjonsrunder16,28. Selv om denne eventuelle vekstnedgangen kan betraktes som en begrensning, er modellen svært nyttig siden organoid ekspansjon i de foregående passasjene er mer enn tilstrekkelig for omfattende nedstrømsanalyser.
Et annet aspekt som kan betraktes som en begrensning er at hypofysen stamcelle organoider ikke viser fremtredende differensieringskapasitet mot endokrine celletyper av AL, selv etter xenografting under nyrekapselen av immunodeficient mus (som resulterte i et begrenset antall GH + og PRL + celler som beskrevet i detalj i referanse18). Enten er de riktige in vitro-forholdene for å drive stamcellene inn i differensiering ikke identifisert ennå, eller stamcellenes hovedrolle (spesielt i voksenkjertelen) ligger ikke i å generere nye endokrine celler (siden det sannsynligvis ikke er nødvendig i latkjertelen, men bare i perturbed eller utfordrede forhold)9,10,14, 18. I stedet kan hovedfunksjonen være plassert i andre biologiske aspekter (f.eks. parakrinesignalering til hormonelle forfedre/forløper eller modne celler i grunnleggende, men sannsynligvis mer i aktive (utviklingsmessige, reparasjonsmessige, sykdomsmessige) forhold)13,16. Faktisk, selv om hypofyse stamceller har vist seg å ha multipotent differensieringskapasitet spesielt i embryonal og neonatal periode, er det tenkelig at stamceller i voksenkjertelen ikke (trenger å) opprettholde denne kapasiteten, gitt den svært lave omsetningen av voksenkjertelen16,28. Det er mulig at de voksne hypofyse stamcellene fungerer mer som et parakrinesignalerende knutepunkt, involvert i å stimulere eller regulere den omkringliggende forfederen / forløperen / endokrine celler 13,16. Derfor kan robust differensiering av hypofyse stamcelleorganoider som kulminerer i hormonsekresjon være en feilaktig forventning som aldri vil bli nådd.
Samlet sett tilbyr protokollen som presenteres her et raskt anvendelig og pålitelig verktøy for robust å utvide primære hypofyse stamceller i en 3D-innstilling in vitro. Protokollen gir opphav til organoider som trofast fanger hypofysen stamcelle fenotype. Systemet har allerede blitt brukt til å studere hypofyse stamcellebiologi og aktivering 14,18, og funnene er svært oversettbare til in vivo-situasjonen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen konkurrerende økonomiske interesser.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av tilskudd fra KU Leuven Research Fund og Fund for Scientific Research (FWO) - Flandern. E.L. (11A3320N) og C.N. (1S14218N) støttes av et ph.d.-stipend fra FWO/FWO-SB.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250 | |
| 48-well plates, TC treated, individually wrapped | Costar | 734-1607 | |
| A83-01 | Sigma-Aldrich | SML0788 | |
| Advanced DMEM/F12 | Gibco | 12634010 | |
| Albumin Bovine (cell culture grade) | Serva | 47330 | |
| B-27 Supplement (50X), minus vitamin A | Gibco | 12587010 | |
| Base moulds | VWR | 720-1918 | |
| Buffer RLT | Qiagen | 79216 | |
| Cassettes, Q Path Microtwin | VWR | 720-2191 | |
| Cell strainer, 40 µm mesh, disposable | Falcon | 352340 | |
| Cholera Toxin from Vibrio cholerae | Sigma-Aldrich | C8052 | |
| Deoxyribonuclease I from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | D5025 | |
| D-glucose | Merck | 108342 | |
| Dimethylsulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| DMEM, powder, high glucose | Gibco | 52100039 | |
| Eppendorf Safe-Lock Tubes, 1.5 mL | Eppendorf | 30120086 | |
| Epredia SuperFrost Plus Adhesion slides | Thermo Fisher Scientific | J1800AMNZ | |
| Epredia HistoStar Embedding Workstation, 220 to 240Vac | Thermo Fisher Scientific | 12587976 | |
| Ethanol Absolute 99.8+% | Thermo Fisher Scientific | 10342652 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Sigma-Aldrich | F7524 | |
| GlutaMAX Supplement | Gibco | 35050061 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | |
| HEPES Buffer Solution | Gibco | 15630056 | |
| InSolution Y-27632 | Sigma-Aldrich | 688001 | |
| L-Glutamine (200 mM) | Gibco | 25030081 | |
| Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix, LDEV-Free | Corning | 15505739 | |
| Mr. Frosty Freezing Container | Thermo Fisher Scientific | 5100-0001 | |
| N-2 Supplement (100X) | Thermo Fisher Scientific | 17502048 | |
| N-Acetyl-L-cysteine | Sigma-Aldrich | A7250 | |
| Nunc Biobanking and Cell Culture Cryogenic Tubes | Thermo Fisher Scientific | 375353 | |
| Paraformaldehyde for synthesis (PFA) | Merck | 818715 | |
| PBS, pH 7.4 | Gibco | 10010023 | |
| Penicillin G sodium salt | Sigma-Aldrich | P3032 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140122 | |
| Phenol red | Merck | 107241 | |
| Potassium Chloride (KCl) | Merck | 104936 | |
| Recombinant Human EGF Protein, CF | R&D systems | 236-EG | |
| Recombinant Human FGF basic/FGF2/bFGF (157 aa) Protein | R&D systems | 234-FSE | |
| Recombinant Human FGF-10 | Peprotech | 100-26 | |
| Recombinant Human IGF-1 | Peprotech | 100-11 | |
| Recombinant Human IL-6 | Peprotech | 200-06 | |
| Recombinant Human Noggin | Peprotech | 120-10C | |
| Recombinant Human R-Spondin-1 | Peprotech | 120-38 | |
| Recombinant Human/Murine FGF-8b | Peprotech | 100-25 | |
| Recombinant Mouse Sonic Hedgehog/Shh (C25II) N-Terminus | R&D systems | 464-SH | |
| RNeasy micro kit | Qiagen | 74004 | |
| SB202190 | Sigma-Aldrich | S7067 | |
| SeaKem LE Agarose | Lonza | 50004 | |
| Sodium Chloride (NaCl) | BDH | 102415K | |
| Sodium di-Hydrogen Phosphate 1-hydrate | PanReac-AppliChem | A1047 | |
| Sodium Hydrogen Carbonate (NaHCO3) | Merck | 106329 | |
| Sodium-Pyruvate (C3H3NaO3) | Sigma-Aldrich | P5280 | |
| Stericup-GP, 0.22 µm | Millipore | SCGPU02RE | |
| Steriflip-GP Sterile Centrifuge Tube Top Filter Unit, 0.22 μm | Millipore | SCGP00525 | |
| Sterile water | Fresenius | B230531 | |
| Streptomycin sulfate salt | Sigma-Aldrich | S6501 | |
| Thermo Scientific Excelsior ES Tissue Processor | Thermo Scientific | 12505356 | |
| Titriplex III | Merck | 108418 | |
| TrypL Express Enzyme (1X), phenol red | Thermo Fisher Scientific | 12605028 | |
| Trypsin inhibitor from Glycine max (soybean) | Sigma-Aldrich | T9003 | |
| Trypsin solution 2.5 % | Thermo Fisher Scientific | 15090046 |
References
- Melmed, S. The pituitary. 3rd ed. , Elsevier/Academic Press. Cambridge. 1 (2011).
- Chen, J., et al. The adult pituitary contains a cell population displaying stem/progenitor cell and early-embryonic characteristics. Endocrinology. 146 (9), 3985-3998 (2005).
- Chen, J., et al. Pituitary progenitor cells tracked down by side population dissection. Stem Cells. 27 (5), 1182-1195 (2009).
- Fauquier, T., Rizzoti, K., Dattani, M., Lovell-Badge, R., Robinson, I. C. A. F. SOX2-expressing progenitor cells generate all of the major cell types in the adult mouse pituitary gland. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (8), 2907-2912 (2008).
- Rizzoti, K., Akiyama, H., Lovell-Badge, R. Mobilized adult pituitary stem cells contribute to endocrine regeneration in response to physiological demand. Cell Stem Cell. 13 (4), 419-432 (2013).
- Andoniadou, C. L., et al. Sox2+ stem/progenitor cells in the adult mouse pituitary support organ homeostasis and have tumor-inducing potential. Cell Stem Cell. 13 (4), 433-445 (2013).
- Nys, C., Vankelecom, H. Pituitary disease and recovery: How are stem cells involved. Molecular and Cellular Endocrinology. 525 (4), 111176 (2021).
- Schneider, H. J., Aimaretti, G., Kreitschmann-Andermahr, I., Stalla, G. K., Ghigo, E.
- Fu, Q., et al. The adult pituitary shows stem/progenitor cell activation in response to injury and is capable of regeneration. Endocrinology. 153 (7), 3224-3235 (2012).
- Willems, C., et al. Regeneration in the pituitary after cell-ablation injury: time-related aspects and molecular analysis. Endocrinology. 157 (2), 705-721 (2016).
- Gremeaux, L., Fu, Q., Chen, J., Vankelecom, H. Activated phenotype of the pituitary stem/progenitor cell compartment during the early-postnatal maturation phase of the gland. Stem Cells and Development. 21 (5), 801-813 (2012).
- Zhu, X., Tollkuhn, J., Taylor, H., Rosenfeld, M. G. Notch-dependent pituitary SOX2+ stem cells exhibit a timed functional extinction in regulation of the postnatal gland. Stem Cell Reports. 5 (6), 1196-1209 (2015).
- Russell, J. P., et al. Pituitary stem cells produce paracrine WNT signals to control the expansion of their descendant progenitor cells. eLife. 10 (1), 59142 (2021).
- Vennekens, A., et al. Interleukin-6 is an activator of pituitary stem cells upon local damage, a competence quenched in the aging gland. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (25), 2100052118 (2021).
- Mertens, F., et al. Pituitary tumors contain a side population with tumor stem cell-associated characteristics. Endocrine-Related Cancer. 22 (4), 481-504 (2015).
- Laporte, E., Vennekens, A., Vankelecom, H. Pituitary remodeling throughout life: are resident stem cells involved. Frontiers in Endocrinology. 11 (1), 604519 (2021).
- Yoshida, S., et al. Isolation of adult pituitary stem/progenitor cell clusters located in the parenchyma of the rat anterior lobe. Stem Cell Research. 17 (2), 318-329 (2016).
- Cox, B., et al. Organoids from pituitary as novel research model to study pituitary stem cell biology. Journal of Endocrinology. 240 (2), 287-308 (2019).
- Denef, C., Hautekeete, E., De Wolf, A., Vanderschueren, B. Pituitary basophils from immature male and female rats: distribution of gonadotrophs and thyrotrophs as studied by unit gravity sedimentation. Endocrinology. 130 (3), 724-735 (1978).
- Vander Schueren, B., Denef, C., Cassiman, J. J. Ultrastructural and functional characteristics of rat pituitary cell aggregates. Endocrinology. 110 (2), 513-523 (1982).
- Claes, C., et al. Human stem cell-derived monocytes and microglia-like cells reveal impaired amyloid plaque clearance upon heterozygous or homozygous loss of TREM2. Alzheimer's and Dementia. 15 (3), 453-464 (2019).
- Trompeter, H. -I., et al. MicroRNAs miR-26a, miR-26b, and miR-29b accelerate osteogenic differentiation of unrestricted somatic stem cells from human cord blood. BMC Genomics. 14, 111 (2013).
- Suga, H., et al. Self-formation of functional adenohypophysis in three-dimensional culture. Nature. 480 (7375), 57-62 (2011).
- Matsumoto, R., et al. Congenital pituitary hypoplasia model demonstrates hypothalamic OTX2 regulation of pituitary progenitor cells. Journal of Clinical Investigation. 130 (2), 641-654 (2019).
- Kanie, K., et al. Pathogenesis of anti-PIT-1 antibody syndrome: PIT-1 presentation by HLA class I on anterior pituitary cells. Journal of the Endocrine Society. 3 (11), 1969-1978 (2019).
- Lee, S. H., et al. Tumor evolution and drug response in patient-derived organoid models of bladder cancer. Cell. 173 (2), 515-528 (2018).
- Yan, H. H. N., et al. A comprehensive human gastric cancer organoid biobank captures tumor subtype heterogeneity and enables therapeutic screening. Cell Stem Cell. 23 (6), 882-897 (2018).
- Nolan, L. A., Kavanagh, E., Lightman, S. L., Levy, A. Anterior pituitary cell population control: basal cell turnover and the effects of adrenalectomy and dexamethasone treatment. Journal of Neuroendocrinology. 10 (3), 207-215 (1998).
