Utveckling av organoider från mus hypofysen som in vitro-modell för att utforska hypofysstamcellsbiologi

Vår organoidmodell är mycket värdefull för att utforska hypofysstamcellsbiologi vid såväl homeostatiska som hypofysremodelleringsförhållanden, såsom vid neonatal mognad av körteln, åldringsassocierad funktionell nedgång och tumörtillväxt i körteln. Hittills är vår hypofysorganoidteknik det enda tillgängliga verktyget för att på ett tillförlitligt och robust sätt växa och expandera primära mus hypofysstamceller. Demonstrerar proceduren gör Emma Laporte och Charlotte Nys, doktorander i min forskargrupp.

För att börja, tvätta mushuvudet med avjoniserat vatten för att ta bort blodet. Spraya 70% etanol på huvudet för att generera en steril miljö. Ta sedan bort huden mellan öronen med sterila kirurgiska verktyg.

För att öppna kraniet, bryt näsbryggan med steril sax. Öppna kraniet ytterligare från näsbryggan mot öronen på båda sidor. Ta bort kraniet och hjärnan med steril pincett utan att röra hypofysen.

Ta bort membranet sellae med trubbig pincett. Sedan, under ett stereomikroskop, separera den främre loben från de bakre och mellanliggande loberna. Isolera försiktigt den främre loben med trubbig pincett och samla den i en 10 ml Erlenmeyerkolv innehållande tre milliliter medium A.Tillsätt två milliliter förvärmd 2,5% trypsinlösning.

Inkubera vid 37 grader Celsius i 15 minuter. Tillsätt två milliliter förvärmd DNAse-lösning och virvla Erlenmeyerkolven 10 gånger. Låt hypofysen sjunka till botten och ta bort supernatanten.

Tillsätt två milliliter förvärmd trypsinhämmarlösning och inkubera vid 37 grader Celsius i 10 minuter. Ta bort supernatanten när hypofysen sjunker till botten. Tillsätt två milliliter förvärmt medium B och inkubera i fem minuter.

Tillsätt två milliliter förvärmt medium C till detta och inkubera i 15 minuter. Låt hypofysen sjunka till botten och ta bort supernatanten. Skölj sedan det tre gånger med förvärmt medium C.Tillsätt två milliliter förvärmt medium C.Aspirera och utvisa hypofysen med en steril, flampolerad Pasteurpipett flera gånger tills fragment inte är synliga längre.

Överför suspensionen till ett 15-milliliters rör innehållande 4,5 ml förvärmd DNAse-lösning. Skölj kolven tre gånger med två milliliter förvärmt medium C och överför suspensionen till röret. Blanda den uppsamlade cellsuspensionen och filtrera den genom en 40-mikron cellsil i ett 30-milliliters rör.

Skölj röret och cellsilen tre gånger med två milliliter medium C och överför suspensionen till röret. Fyll en pasteurpipett i glas med två milliliter BSA. Placera pipettens spets längst ner på röret och pipettera försiktigt ut för att bilda ett synligt densitetsskikt.

Centrifug vid 190 gånger G i 10 minuter vid fyra grader Celsius. Ta bort supernatanten och återsuspendera cellpelleten i en milliliter iskall avancerad DMEM/F-12. Kvantifiera sedan cellerna med en cellräknare.

Centrifugera cellsuspensionen vid 190 gånger G i 10 minuter vid fyra grader Celsius och ta bort supernatanten. Resuspend cellpelleten i avancerad DMEM / F-12 för att nå en celldensitet på 1,1 gånger 10 till 6: e cellerna per milliliter. Tillsätt ECM till önskad volym cellsuspension i ett förhållande av 30:70 och blanda väl.

Deponera en 30-mikroliter droppe av denna blandning i varje brunn av en förvärmd 48-brunnsplatta. Vänd plattan upp och ner och låt ECM stelna vid 37 grader Celsius i 20 minuter. Efter inkubationen tillsätt försiktigt 250 mikroliter förvärmt hypofysorganoidmedium kompletterat med 10-mikromolär ROCK-hämmare.

Varannan till var tredje dag, byt medium utan ROCK-hämmare i 10 till 14 dagar tills organoiderna är fullvuxna. För att passera organoiderna, aspirera först mediet försiktigt och tillsätt 400 mikroliter iskall avancerad DMEM / F-12 för att sönderdela ECM. Samla sedan organoiderna i ett mikrocentrifugrör.

Tvätta brunnen med 400 mikroliter iskall avancerad DMEM/F-12. Centrifugera röret vid 200 gånger G i fem minuter vid fyra grader Celsius. Ta bort supernatanten och tillsätt 400 mikroliter förvärmt TrypLE Express-enzym.

Blanda genom att invertera röret flera gånger och inkubera vid 37 grader Celsius i fem minuter. Lägg till 400 mikroliter iskall avancerad DMEM/F-12. Centrifug vid 200 gånger G i fem minuter vid fyra grader Celsius och ta bort supernatanten.

Resuspend pelletsen med 100 mikroliter iskall avancerad DMEM/F-12. Begränsa en P-200-spets och använd spetsen för att dissociera organoiderna genom att kraftigt pipettera tills organoidfragment erhålls. Lägg till 800 mikroliter avancerad DMEM/F-12.

Centrifugera vid 190 gånger G i 10 minuter vid fyra grader Celsius och ta bort supernatanten. För att passera organoiderna, återsuspendera pelletsen i en tillräcklig volym avancerad DMEM / F-12 och tillsätt ECM i ett förhållande av 30:70. Blanda väl.

Fortsätt att frö och odla organoiderna som beskrivs i textmanuskriptet. Dissocierade enstaka celler från den främre loben såddes i ECM och odlades i hypofysorganoidmedium. 14 dagar efter sådd var organoiderna fullt utvecklade och nådde en diameter på upp till 500 mikrometer.

I detta skede uppvisade organoiderna cystisk morfologi med ett epitelskikt som omsluter en lumen. Det rekommenderas inte att använda brunnarna där täta strukturer uppträder efter tillväxt. För passering användes organoidfragment för sådd.

Sju dagar efter passering observerades gynnsam organoid återväxt med cystiska strukturer. Täta organoider bör kasseras, eftersom de ogynnsamma organoiderna kan ta över kulturen. Immunofluorescensfärgningsanalys för epitelmarkörerna E-kadherin och cytokeratiner 8 och 18 bekräftade organoidernas epitelkaraktär.

Uttryck av hypofysstamcellsmarkörer Sox2 och Trop2 visade stamheten, och hypofysspecifik markör LHX3 visade hypofysfenotyp hos organoiderna. Uttrycket av markören Ki67 visade att de organoidbildande cellerna är i ett proliferativt tillstånd. RTQ PCR-analys visade högre uttryck av stamhetsmarkörer i organoiderna än i den främre loben även efter flera passager, vilket validerade anrikningen av stamceller.

Det är viktigt att platta lämpligt antal enskilda celler i ECM-kupolen vid den första sådden, och när man passerar organoiderna måste man komma ihåg att åter fröfragment och inte enskilda celler.