Summary
يستخدم الفحص الميكانيكي لتجنب الصراع كقراءة غير انعكاسية لحساسية الألم لدى الفئران والتي يمكن استخدامها لفهم الاستجابات العاطفية التحفيزية بشكل أفضل في مجموعة متنوعة من نماذج آلام الفئران.
Abstract
يتكون الألم من أبعاد حسية (مسببة للألم) وعاطفية (غير سارة). في النماذج قبل السريرية ، تم تقييم الألم تقليديا باستخدام اختبارات انعكاسية تسمح بالاستدلالات المتعلقة بالمكون المسبب للألم ولكنها توفر القليل من المعلومات حول المكون العاطفي أو التحفيزي للألم. وبالتالي فإن تطوير الاختبارات التي تلتقط مكونات الألم هذه مهم من الناحية الترجمية. وبالتالي ، يحتاج الباحثون إلى استخدام الفحوصات السلوكية غير الانعكاسية لدراسة إدراك الألم على هذا المستوى. تجنب الصراع الميكانيكي (MCA) هو اختبار سلوك طوعي غير انعكاسي راسخ ، لدراسة الاستجابات التحفيزية لحافز ميكانيكي ضار في نموذج من 3 غرف. يستخدم التغيير في تفضيل موقع الفأر ، عندما يواجه محفزات ضارة منافسة ، لاستنتاج عدم الرضا المتصور للضوء الساطع مقابل التحفيز اللمسي للمخالب. يحدد هذا البروتوكول نسخة معدلة من فحص MCA الذي يمكن للباحثين استخدامه لفهم الاستجابات العاطفية التحفيزية في مجموعة متنوعة من نماذج آلام الفئران. على الرغم من عدم وصفها على وجه التحديد هنا ، إلا أن بيانات MCA الخاصة بنا تستخدم مساعد فرويند الكامل داخل الأخمص (CFA) ، وإصابة الأعصاب المنقذة (SNI) ، ونموذج الكسر / الصب كنماذج ألم لتوضيح إجراء MCA.
Introduction
الألم هو تجربة معقدة مع المكونات الحسية والعاطفية. يعد انخفاض عتبة إدراك الألم وفرط الحساسية للمحفزات الحرارية و / أو الميكانيكية من السمات الرئيسية لهذه التجربة ، والتي يمكن أن تلتقطها اختبارات سلوك الألم التي يستحدثها التحفيز (مثل اختبار هارجريفز للحساسية الحرارية واختبار فون فراي للحساسية الميكانيكية) 1،2. على الرغم من أن مثل هذه الاختبارات تعطي نتائج قوية وقابلة للتكرار ، إلا أنها محدودة بسبب اعتمادها على الانسحاب الانعكاسي من الحافز الضار المتصور. وقد أثار هذا تساؤلات حول الاعتماد المستمر لأبحاث الألم على هذه الاختبارات وحدها. تحقيقا لهذه الغاية ، كان باحثو الألم لعدة سنوات يستكشفون اختبارات سلوكية بديلة / تكميلية لاستخدامها في نماذج آلام القوارض في محاولة لالتقاط المزيد من المكونات العاطفية و / أو التحفيزية للألم. يتم تنفيذ هذه التدابير غير المستحضرة أو الطوعية أو غير الانعكاسية (على سبيل المثال ، تشغيل العجلات ، ونشاط الحفر ، وتفضيل المكان المشروط3،4،5) في محاولة لتحسين قابلية ترجمة أبحاث الألم قبل السريرية.
تم وصف اختبار تجنب الصراع الميكانيكي (MCA) في الأصل من قبل Harte et al. في عام 20166 ، ويستخدم في الغالب في الفئران 7,8 ، ويمثل تعديلا لنهج سابق - نموذج الهروب وتجنب المكان. في هذا النهج ، يتم إجراء حافز ضار للمخلب الخلفي في غرفة مرغوب فيها (مظلمة) لدفع السلوك الهادف للحيوان للهروب / تجنب مثل هذا التحفيز 9,10. بدلا من الاعتماد على التحفيز اليدوي الضار للمخلب الخلفي من قبل مراقب ، فإن فحص MCA يجبر الفئران على التفاوض على حافز ضار محتمل للهروب من بيئة مترددة والوصول إلى الغرفة المظلمة. ينشأ الصراع / التجنب الذي يعطي الفحص اسمه من هذين الدوافع المتنافسة: الهروب من المناطق المضاءة بشكل ساطع وتجنب التحفيز الضار للمخالب. يشارك فحص MCA أيضا ميزات مع اختبار تفضيل المكان المشروط ، حيث يؤدي اقتران تخفيف الألم بالإشارات البيئية إلى تغييرات في السلوك تعكس تفضيلا للسياق المخفف للألم / المجزي11.
بشكل أساسي ، تشترك جميع هذه الفحوصات في نهج مماثل: استخدام تحول في تفضيل لبيئة مترددة على أخرى كمؤشر على حالته العاطفية / التحفيزية. فحص MCA هو نموذج من 3 غرف يتكون من غرفة مضاءة بشكل ساطع تليها غرفة وسطى مظلمة مع مجسات ارتفاع قابلة للتعديل وغرفة ثالثة مظلمة دون أي محفزات مترددة. عادة ما يكون الدافع وراء الفأر غير المصاب هو الهروب إلى غرفة مظلمة ، نظرا للنفور الفطري للقوارض من الضوء الساطع12. في هذا المثال ، يتغلب الدافع الطبيعي للهروب من بيئة مضاءة بشكل ساطع على عدم الرغبة في مواجهة تحفيز المخلب الخلفي (مجسات الارتفاع القابلة للتعديل) ، والذي يحدث حصريا في البيئة المظلمة. في المقابل ، قد يختار الفأر الذي يعاني من الألم (بسبب الالتهاب أو الاعتلال العصبي ، على سبيل المثال) قضاء المزيد من الوقت في البيئة المضاءة بشكل ساطع ، حيث يوجد دافع لتجنب التجربة اللمسية غير السارة للمجسات الميكانيكية في إعداد فرط الحساسية اللمسية المستمر.
توضح هذه المقالة نسخة معدلة من فحص MCA. لقد قمنا بتكييف الطريقة الأصلية (التي تم إجراؤها في الفئران6) لاستخدامها في الفئران. كما قمنا بتخفيض عدد ارتفاعات المسبار التي تم اختبارها من ستة إلى ثلاثة (0 و 2 و 5 مم فوق ارتفاع الأرض) من أجل تبسيط الحصول على البيانات. تم اختبار هذا النهج عبر نماذج الألم المتعددة ، وتم التحقق من صحته باستخدام المسكنات المعروفة ، مما يشير إلى أن فرط الحساسية للألم و / أو التغيرات العاطفية والتحفيزية المرتبطة به هي التي تقود هذه التغييرات في السلوك. هذا النهج سريع نسبيا في السلوك وقابل للتكيف عند مقارنته بالتدابير غير الانعكاسية الأخرى ، والتي يمكن أن تستغرق عدة أيام من التعود والتدريب 1,2. بالتنسيق مع مقاييس الألم الأخرى ، يمكن أن تولد MCA رؤى قيمة في الجوانب العاطفية والتحفيزية للألم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تمت الموافقة على جميع التجارب التي تنطوي على استخدام الفئران والإجراءات المتبعة فيها من قبل اللجان المؤسسية لرعاية واستخدام الحيوانات في مركز إم دي أندرسون للسرطان وجامعة ستانفورد ، بما يتفق تماما مع دليل المعاهد الوطنية للصحة لرعاية واستخدام المختبر.
1. بناء MCA
- بناء غرفة 1 بالأبعاد التالية: 125 مم × 125 مم × 125 مم (العرض × العمق × الارتفاع) من الأكريليك الأبيض غير الشفاف بسماكة 3 مم المستخدم في الجدران الجانبية والأرضيات والسقف. استخدم أكريليك شفاف بسماكة 3 مم للجدار الأمامي. قم بلصق جميع الجوانب معا في وقت مبكر باستخدام مادة لاصقة مخصصة من الأكريليك.
تنبيه: تعتبر مادة لاصقة الأكريليك مادة خطرة (قابلة للاشتعال ، بخار ضار ، قد تكون ضارة إذا تم ابتلاعها ، قد تهيج الجلد أو العينين). يجب استخدام هذه المواد اللاصقة فقط وفقا لتعليمات الشركة المصنعة (أي مع معدات الوقاية الشخصية المناسبة في منطقة جيدة التهوية). - قم بإرفاق غطاء الغرفة 1 بمفصلة ، بحيث يمكن وضع الفئران بسهولة في الغرفة واستردادها منها. قم بتوصيل شريط الصمام الثنائي الباعث للضوء (LED) ذاتي اللصق بالسطح الداخلي للغطاء لتوفير إضاءة ~ 4800 لوكس.
- أغلق الغرفة 1 عن بقية MCA عن طريق انزلاق ورقة أكريليك غير شفافة داخل وخارج الموضع.
- قم ببناء غرفة اختبار MCA ، الغرفة 2 ، كغرفة غير مضاءة بطول 270 مم مصنوعة من الأكريليك الأحمر الداكن الشفاف (بسمك 3 مم) من جميع الجوانب ، مع غطاء مفصلي في الأعلى. ضع شبكة 13 × 31 من ثقوب 2 مم على أرضية الغرفة 2 يمكن من خلالها أن تبرز مجموعة من المجسات الحادة ذات الأطراف التي يبلغ قطرها 0.5 مم (على سبيل المثال ، دبابيس الخريطة المخففة).
ملاحظة: دبابيس حادة مع كتلة ورق صنفرة 120 حصى أو ما شابه ذلك. قم بتنظيفها في ماء دافئ بالمنظفات قبل تطهيرها بمطهر مبيد للبوغ. - اضبط ارتفاع المجسات عن طريق وضع صفائح أكريليك إضافية أسفل صفيحة المسبار (الشكل 1). باستخدام هذا النهج ، قم بتكوين الجهاز بثلاثة إعدادات: 0 مم و 2 مم و 5 مم ارتفاع المسبار.
- كبديل لدبابيس الخرائط المخففة أو المواد المماثلة، استخدم ملفات الطابعة ثلاثية الأبعاد لطباعة أرضية الغرفة 2 ولوحة المسبار (انظر الملف التكميلي 1: SpikeBed-MCA.stl الذي يشير إلى المجسات الميكانيكية، والملف التكميلي 2: MCA_baseplate.stl الذي يشكل أرضية الغرفة 2).
ملاحظة: في حالة عدم توفر الطباعة ثلاثية الأبعاد، قم بلصق دبابيس الخريطة على ورقة أكريليك باستخدام نفس المادة اللاصقة الأكريليك المستخدمة لبناء جدران الجهاز. - اطبع باستخدام مادة قابلة للغسل ومتوافقة حيويا، مثل بلاستيك النايلون 12 أو ما شابه ذلك (مستحسن).
- قم ببناء الغرفة 3 بالأبعاد التالية: 125 مم × 125 مم × 125 مم كصندوق أكريليك أحمر داكن شفاف غير مضاء (من جميع الجوانب) ، يوضع في الطرف الآخر من الغرفة 1. ضع غطاء مفصليا على الغرفة ، على غرار الغرفتين 1 و 2. تعمل هذه الغرفة كمنطقة هروب مظلمة من المجسات الميكانيكية في الغرفة 2.
2. الماوس MCA التعود والاختبار
- كما هو الحال مع جميع التجارب التي تنطوي على نتائج سلوكية في الحيوانات ، راقب التوزيع العشوائي المناسب والعمى طوال الوقت لتقليل التحيز المحتمل.
ملاحظة: تم إنشاء النتائج التمثيلية باستخدام الفئران C57BL/6J من الذكور والإناث الذين تتراوح أعمارهم بين 8 و 12 أسبوعا (رقم سلالة مختبرات جاكسون 000664). تم إيواء الفئران اجتماعيا ، حتى 5 لكل قفص ، مع إمكانية الوصول إلى الطعام والماء ودورة الضوء من الساعة 07:00 إلى الساعة 19:00 ساعة. أقيم MCA في فترة الضوء ، بين الساعة 09:00 و 12:00 ساعة. - قبل يوم واحد من تحديد موعد الاختبار الأساسي ، تتأقلم الفئران مع وحدة MCA لمدة 5 دقائق (الحد الأدنى) إلى 15 دقيقة (كحد أقصى) مع زملائها في القفص لتسهيل الاستكشاف الاجتماعي للجهاز بأكمله.
- طوال العملية ، تأكد من إيقاف تشغيل مصابيح LED في الغرفة 1 ، وترك الحاجز بين الغرفتين 1 و 2 مفتوحا ، وضبط المجسات على ارتفاع صفر (أي عدم البروز عبر أرضية الغرفة 2).
- قم بإجراء اختبار أساسي للفئران (اختياري) إذا كانت الدراسة تتضمن مراقبة سلبية (أي جراحة صورية أو ضوابط حقن المركبات). إذا رغبت في ذلك ، استخدم اختبار خط الأساس لاستبعاد أي قيم شاذة غير مصابة لا تعبر أبدا إلى الغرفة 2 ، على الرغم من أن هذا لم يثبت ضرورته. إذا تم استخدامها، فقم بالإبلاغ عن جميع معايير الاستبعاد وعدد الفئران المستبعدة.
- قبل البدء في الاختبار ، قم بإعداد كاميرا فيديو قادرة على تسجيل لقطات بدقة 1080 بكسل على حامل ثلاثي القوائم مع عرض جانبي لجهاز MCA بأكمله. اضبط مجال الرؤية بحيث يملأ MCA الصورة المسجلة.
- بمجرد بدء التسجيل ، أمسك بلوحة مسح جاف محمولة باليد في مجال رؤية الكاميرا لتسمية بداية الفيديو بمعلومات تعريف عن تشغيل اختبار الحيوان (على سبيل المثال ، معرف الماوس ، ارتفاع المسبار ، التاريخ ، النقطة الزمنية ، إلخ).
- بالنسبة للتشغيل الأول، اضبط ارتفاع المسبار على الصفر. انقل الماوس ليتم اختباره من قفصه المنزلي إلى الغرفة 1 مع وجود باب الحاجز في مكانه. بدء تشغيل مؤقت مرئي في اللقطات المسجلة.
ملاحظة: يضمن المؤقت أن الفواصل الزمنية بين الأجزاء المختلفة من الاختبار متناسقة بين عمليات التشغيل. - بعد 10 ثوان ، قم بتشغيل الغرفة 1 LEDs. بعد أن يكون الماوس في الغرفة المضاءة لمدة 20 ثانية ، اسحب الحاجز بين الغرفتين 1 و 2.
- مراقبة الحيوان لمدة 2 دقيقة. قم بقياس زمن الوصول و/أو أوقات الإقامة باستخدام ساعة توقيت أثناء استمرار الاختبار. بدلا من ذلك ، يمكن تحليل لقطات الفيديو بمجرد اكتمال الاختبار.
ملاحظة: لأسباب تتعلق بالإنتاجية وتجنب التعرض لفترات طويلة للمحفزات المترددة، تم تعيين الحد الأقصى عند 2 دقيقة. - قياس واحد أو أكثر من النتائج المفيدة العديدة التي تم تحديدها (انظر أدناه؛ الشكل 1). يوصى بتحليل جميع مقاييس النتائج ال 5 عند بدء الاختبار ، من أجل التأكد من جوانب السلوك التي تختلف في إعداد تجريبي معين.
- الخيار الأول: تسجيل زمن الوصول إلى الإدخال الأول إلى الغرفة 2. الخيار الثاني: سجل زمن الوصول إلى عبور أكثر من منتصف الطريق عبر الغرفة 2. الخيار الثالث: سجل إجمالي وقت الإقامة في الغرفة 2. الخيار الرابع: سجل زمن الوصول للوصول إلى الغرفة 3 (الهروب). الخيار الخامس: على غرار الخيار الثاني، سجل إجمالي وقت الإقامة في كل غرفة في غضون 2 دقيقة وقم بتحويلها إلى نسب.
ملاحظة: نظرا لأن كل تجربة فريدة من نوعها وقد تتأثر بالعوامل البيولوجية والتغيرات السلوكية الفريدة لنموذج المرض ، يمكن للباحثين تجربة هذه التدابير وغيرها بأيديهم.
- الخيار الأول: تسجيل زمن الوصول إلى الإدخال الأول إلى الغرفة 2. الخيار الثاني: سجل زمن الوصول إلى عبور أكثر من منتصف الطريق عبر الغرفة 2. الخيار الثالث: سجل إجمالي وقت الإقامة في الغرفة 2. الخيار الرابع: سجل زمن الوصول للوصول إلى الغرفة 3 (الهروب). الخيار الخامس: على غرار الخيار الثاني، سجل إجمالي وقت الإقامة في كل غرفة في غضون 2 دقيقة وقم بتحويلها إلى نسب.
- بمجرد اكتمال الاختبار ، أعد الماوس إلى قفصه المنزلي ، وقم بتنظيف غرف MCA بنسبة 70٪ من الإيثانول ، واتركه يجف تماما.
ملاحظة: يمكن عادة تنظيف البلوري البرازي من الغرفة بسهولة نسبية باستخدام المناشف الورقية قبل الإيثانول / المطهر. إذا أصبح التنظيف الأكثر شمولا ضروريا ، فيمكن تفكيك الغرفتين 2 و 3 وغمرهما في الماء الدافئ والصابون. - بعد تشغيل جميع الفئران في مجموعة مع ضبط ارتفاع المسبار على الصفر ، أدخل ورقة 3 مم من الأكريليك أسفل صفيحة المسبار الميكانيكية وكرر الخطوات من 2.4.2 إلى 2.4.7 مع ارتفاع مسبار يبلغ 2 مم.
- بعد تشغيل جميع الفئران مع ضبط ارتفاع المسبار على 2 مم ، أدخل ورقة ثانية من الأكريليك مقاس 3 مم أسفل لوحة قاعدة المسبار وكرر الخطوات من 2.4.2 إلى 2.4.7 مع ارتفاع مسبار يبلغ 5 مم.
ملاحظة: يمكن اختبار مجموعة من 8 فئران في حوالي 2 ساعة باستخدام هذا النهج. استخدم أحجام مجموعات أصغر إذا كانت هناك حاجة إلى توقيت أكثر دقة بعد الدواء (على سبيل المثال ، لتجربة دورة وقت الدواء). - قم بإجراء تنظيف نهائي باستخدام مطهر في نهاية جلسة الاختبار.
- كرر الاختبار بعد الحث على فرط الحساسية للألم و / أو مع العلاج بالعقاقير.
- قارن أداء كل ماوس عند خط الأساس بأدائه بعد إحداث الألم. تقييم تأثير التدخل الدوائي من خلال مقارنة الحيوانات المعالجة بالمركبات مع الحيوانات المعالجة بالعقاقير في نفس النقطة الزمنية.
- قم بإجراء تحليل إحصائي غير بارامتري (على سبيل المثال ، اختبار مان ويتني يو) إذا وصلت الحيوانات إلى الحد الأقصى لمدة 2 دقيقة دون تلبية مقياس النتيجة المطلوب ، مما يؤدي إلى بيانات غير مستمرة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
تم استخدام فحص MCA بنجاح مع العديد من نماذج آلام الماوس المتميزة ميكانيكيا. ويبين الشكل 2 البيانات التي كان فيها مقياس النتيجة للاختيار يعبر نقطة الوسط في الغرفة 2 (الشكل 2 ألف). البيانات التي تم الحصول عليها باستخدام نقطة منتصف الطريق مقابل الهروب إلى الغرفة 3 متشابهة جدا ، ~ 40 ثانية لمنتصف الطريق مقابل ~ 45 ثانية لهروب الغرفة 3 في نموذج إصابة الأعصاب (SNI) لألم الأعصاب مع ارتفاع مسبار 5 مم13.
في نموذج الألم الالتهابي الناجم عن CFA ، لا يغير التحكم في حقن المخلب الخلفي (داخل الأخمص) من محلول ملحي زمن انتقال الهروب مقابل خط الأساس. أظهرت تلك الفئران التي تم حقنها ب CFA في مخلب خلفي واحد زيادة كبيرة في زمن انتقال الهروب بعد 4 أيام من الحقن ، ولكن فقط عندما تم رفع ارتفاع المسبار إلى 5 مم. والأهم من ذلك، أن هذا الكمون المتزايد للهروب عند 5 مم لم يشاهد في الفئران التي تلقت كاربروفين مضادات الالتهاب غير الستيروئيدية (10 ملغم/كغ، أي أي بي) قبل 90 دقيقة من بدء الاختبار (الشكل 2 ب).
يرتبط نموذج إصابة الأعصاب المنقذة (SNI) لألم الأعصاب الرضحي أيضا بزيادة كبيرة في زمن الوصول للهروب مقابل خط الأساس عندما تم ضبط ارتفاع المسبار على 5 مم. وقد شوهد هذا التأثير في الفئران SNI ، ولكن ليس ضوابط الجراحة الزائفة. كما تم منع هذا الكمون المتزايد للهروب عن طريق الإدارة الجهازية للبوبرينورفين المسكن الأفيوني (25 ميكروغرام / كجم ، أي p) قبل 90 دقيقة من الاختبار (الشكل 2C). كما لوحظت زيادة زمن انتقال الهروب في الفئران التي لم تخضع لجولة أساسية من اختبار MCA قبل إصابة الأعصاب (الشكل 2D). في هذه الحالة ، تم منع زيادة زمن انتقال الهروب في فئران SNI عند 5 مم بواسطة جابابنتين (30 مجم / كجم ، أي p) الذي تم إعطاؤه قبل 90 دقيقة من الاختبار. بشكل جماعي ، يشير هذا إلى أن MCA يمكن أن يكتشف التغيرات المرتبطة بالألم في النفور من التحفيز وتجنبه في نموذجين يستخدمان على نطاق واسع من الألم الالتهابي والاعتلال العصبي.
تم اختبار MCA بشكل أكبر في نموذج الكسر / الصب لمتلازمة الألم الناحي المعقد لحالة الألم المزمن (CRPS) والتي يتم إنشاؤها بواسطة كسر الساق البعيد الأيمن المغلق متبوعا ب 3 أسابيع من صب14. يظهر هذا النموذج المستنير سريريا التهابا محيطيا حادا في المرحلة ، بالإضافة إلى نشاط مناعي طويل الأجل في الجهاز العصبي المركزي مع ألودينيا الأطراف الخلفية المستمرة. وعلى غرار نموذجي CFA وSNI، لوحظت زمن انتقال متزايد للهروب في نموذج الكسر/الصب (الشكل 3A). قبل الإصابة ، زاد زمن الوصول للهروب من الغرفة 1 بشكل متناسب مع ارتفاع المسبار. وبعد الإصابة، ظل زمن انتقال الهروب دون تغيير عند 0 مم ولكنه زاد بشكل كبير عند ارتفاع المسبار 2 مم و 5 مم للذكور وارتفاع المسبار 5 مم للإناث عند مقارنته بخط الأساس (الشكل 3B).
الشكل 1: مخطط وصور جهاز MCA. (أ) مقاييس النتائج المحتملة في فحص MCA ، (المميزة بأيقونات واجهة الساعة): الكمون إلى غرفة الخروج 1 (I) ، الكمون لعبور أكثر من 50٪ من الغرفة 2 (خط منقط) ؛ II) ، إجمالي مقدار الوقت المستغرق في الغرفة 2 (III) ، الكمون للوصول إلى غرفة الهروب (IV) أو النسبة المئوية للوقت المستغرق في كل غرفة (V). تظهر الحيوانات التي تعاني من الألم في المتوسط قيما أكبر ل I و II و IV ، وقيم مخفضة ل III. وتؤدي القيمة المخفضة للغرفة الثالثة بالضرورة إلى زيادة نسبة الوقت المستغرق في الغرفة 1 و/أو الغرفة 3، التي يمكن أن يسجلها مقياس النتائج V Biorender.com. (ب) صور توضح جهاز MCA (والغرف المرقمة 1 و 2 و 3) مع إيقاف تشغيل مصابيح LED (أعلى اليسار) ، وتشغيل مصابيح LED (أسفل اليسار). (ج) منظر للغرف من الأعلى مع فتح الأبواب. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: يزيد الألم الالتهابي والعصبي من التجنب في فحص MCA. (أ) تصوير مقياس النتائج المحدد المستخدم هنا: الكمون لعبور نقطة الوسط في الغرفة 2. (ب) أدى الحقن داخل الأخمص ل CFA إلى زيادة كبيرة في زمن الوصول إلى الهروب (المربعات الحمراء) مقابل عناصر التحكم المالحة (الدوائر السوداء) عندما تم ضبط ارتفاع المسبار على 5 مم. أدى الكاربروفين داخل الصفاق (10 ملغم / كغ) إلى تخفيف الزيادة الناجمة عن CFA في زمن الهروب (المثلثات الزرقاء). يتم رسم البيانات كمتوسط زمن انتقال الهروب ± الخطأ القياسي للمتوسط (SEM) ؛ n = 7 ذكور/مجموعة. (ج) أدت جراحة إصابة الأعصاب المجنبة (SNI) إلى زيادة كبيرة في زمن انتقال هروب الغرفة 1 مقابل ضوابط الجراحة الصورية (الدوائر السوداء) ، عندما تم ضبط ارتفاع المسبار على 5 مم (مربعات حمراء). وقد خفف البوبرينورفين داخل الصفاق (25 مغ/كغ) بشكل كبير من هذه الزيادة في زمن انتقال الهروب (المثلثات الزرقاء). يتم رسم البيانات كمتوسط زمن انتقال الهروب ± SEM ؛ n = 6-7 ذكور لكل مجموعة. (دال) انعكست الزيادة الناجمة عن SNI في زمن الهروب باستخدام جابابنتين المسكن (المثلثات الخضراء). يتم رسم البيانات كمتوسط زمن انتقال الهروب ± SEM ؛ n = 8 ذكور/مجموعة. ## = p < 0.01 ، ***/### = p < .001 ، للمقارنات المشار إليها (ANOVA ثنائي الاتجاه ، Bonferroni post-hoc). وقد عدل هذا الرقم من13. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: كسر الظنبوب / الصب الناجم عن الألم المزمن يزيد من التجنب في فحص MCA. زاد الكسر/الصب بشكل كبير من زمن انتقال الهروب في 3 أسابيع بعد الإصابة (W3) مقابل خط الأساس (BL) لدى الذكور عند ارتفاعي المسبار 2 مم و 5 مم وفي الإناث عند ارتفاع المسبار 5 مم (n = 5/sex). يتم تصوير البيانات من كل ماوس باللون الأسود الباهت (الذكور) أو كايين (الإناث) مع متوسط يمثله خطوط داكنة. **/*** = p < 0.01/< 0.001 مقابل القيمة الأساسية المتطابقة مع ارتفاع الجنس والمسبار بواسطة ANOVA ثنائي الاتجاه ، Tukey post-hoc. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
ملف تكميلي 1: ملف طابعة 3D SpikeBed-MCA. عند طباعتها في مادة متوافقة بيولوجيا وقابلة للغسل بشكل مناسب ، مثل النايلون 12 ، تنتج SpikeBed-MCA.stl منصة من المجسات اللمسية التي تبرز من خلال أرضية الغرفة 2. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الملف.
ملف تكميلي 2: MCA_baseplate ملف طابعة ثلاثية الأبعاد. عند طباعتها في مادة متوافقة بيولوجيا وقابلة للغسل بشكل مناسب ، مثل النايلون 12 ، تنتج MCA_baseplate.stl أرضية الغرفة 2 ، التي تبرز من خلالها المجسات اللمسية. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الملف.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
كما هو الحال مع جميع الاختبارات السلوكية ، فإن التعامل السليم والعشوائية والعمى عن علاج الحيوانات أمر ضروري طوال الوقت. بالنظر إلى المدخلات متعددة العوامل في السلوكيات المعقدة وصنع القرار ، من الضروري التعامل مع الحيوانات وتعويدها واختبارها بأكبر قدر ممكن من الاتساق مع تقليل الضيق. يجب أيضا توخي الحذر لإعادة إنتاج توقيت وضع الماوس في الغرفة 1 ، وتشغيل مصابيح LED ، وإزالة الحاجز ، لأن الاختلافات هنا يمكن أن تؤثر على السلوك اللاحق.
وتجدر الإشارة إلى أن مختلف مقاييس النتائج المبينة في الشكل 1 ألف مترابطة. على سبيل المثال ، عادة ما يعبر الماوس الذي يدخل الغرفة 2 نقطة منتصف الطريق في الغرفة 2 ثم يكمل دائما تقريبا الهروب إلى الغرفة 3. وهذا يعني أن مقاييس النتائج الأولى والثانية والرابعة مترابطة. يقيس قياسا النتائج الثالث والخامس إجمالي وقت الإقامة في الغرفة 2 ، ونسبة وقت الإقامة في جميع الغرف الثلاث ، على التوالي. لذلك ، ترتبط هذه التدابير ارتباطا وثيقا ببعضها البعض. ومع ذلك ، يمكن للفأر نظريا أن يكدس وقتا كبيرا للسكن في الغرفة 2 سواء كان عبور منتصف الطريق أو الهروب إلى الغرفة 3 لديه زمن انتقال منخفض أو زمن انتقال مرتفع أو لم يحدث على الإطلاق.
تم الإبلاغ عن العديد من الاختلافات أو التعديلات في هذه الطريقة. بالإضافة إلى مقاييس النتائج المختلفة المدرجة هنا (الشكل 1) ، يمكن للمحققين تغيير تقدم ارتفاع المسبار في محاولة لتسليط الضوء على الاختلافات في الحساسية. نظرا لعدم وجود فروق ذات دلالة إحصائية مع ارتفاع المسبار المتوسط 2 مم ، فقد يكون من الأكثر كفاءة تشغيل الفئران فقط عند 0 مم و 5 مم. بدلا من ذلك ، قد يبدأ ارتفاع المسبار بين 2 و 5 مم ، أو الجري المتكرر على ارتفاع مسبار 5 مم في كشف الاختلافات التي لم تكن واضحة بخلاف ذلك. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن استخدام تقييم وقت الإقامة في كل غرفة كقراءة للدافع والنشاط. يمكن أن يكون هذا مفيدا في الحالات التي تمر فيها بعض الفئران بسرعة إلى الغرفة 3 ولكن بعد ذلك تعود إلى الغرفة 1 لمزيد من الاستكشاف. وفي هذه الحالات، فإن زمن الوصول إلى الغرفة 3 وحده لن يلتقط هذه الدقة. قد يكون رفع وقت قطع الاختبار إلى ما بعد حد 2 دقيقة المحدد هنا مفيدا أيضا لبعض المحققين. أخيرا ، لا يمكننا استبعاد احتمال أن يؤدي تكرار اختبار نفس الحيوانات (أكثر من المرات الثلاث الموضحة هنا) ، أو الاختبار بتواتر أكبر (أقل من 4-7 أيام بين الاختبارات) إلى إدخال تأثيرات التعود أو التعلم. ولهذه الأسباب، يتم تشجيع إدراج مجموعات تحكم ساذجة وغير متلاعبة في كل نقطة زمنية. في نهاية المطاف ، من المرجح جدا أن تكون الاختلافات في السلوك محددة بنموذج الألم وتستدعي مزيدا من التحقيق في نماذج الألم هذه وغيرها.
عادة ما ترتبط النماذج المسببة للألم المستخدمة هنا (CFA ، SNI ، الكسر / الصب) بفرط الحساسية في اختبارات سلوك الألم الأخرى ، والتي تتوافق مع زيادة في زمن انتقال التجنب / الهروب. قد يكون فحص MCA قادرا أيضا على اكتشاف فقدان الحدة الحسية (عن طريق زيادة الوقت الذي يقضيه في الغرفة 2 ، على سبيل المثال) ، على الرغم من أن هذا لم يتم اختباره رسميا. لدى MCA بعض القيود التي تستحق النظر. النفور من الضوء الساطع هو وسيلة رئيسية لتحفيز الدخول إلى الغرفة 2 وبالتالي محرك للصراع اللاحق. يجب النظر بعناية في أي ميزة مرضية مرتبطة بنموذج ماوس معين قد يغير النفور من الضوء الساطع (على سبيل المثال ، ضعف البصر) قبل استخدام هذا الاختبار. كما لم يتم اختبار مساهمة القلق في الهروب من الكمون بشكل منهجي ، على الرغم من أنه تم الإبلاغ عن نماذج الألم الالتهابي المزمن والأعصاب لإظهار علامات على سلوك يشبه القلق في الفئران في اختبارات أخرى ، لا يزال هناك نقاش بشأن هذا15,16. ومع ذلك ، لا يمكن تأكيد أو استبعاد مساهمة القلق المرتبط بالألم في هذه النتائج السلوكية في هذا الوقت. نظرا لأن MCA لديها مدخلات متعددة في مقاييس النتائج ، فإن هذا يأتي مع المزيد من الارتباك المحتمل الذي يجب مراعاته.
باختصار ، يوفر اختبار MCA قراءة غير انعكاسية لحساسية الألم في نماذج الماوس. تتأثر مقاييس النتائج بعوامل أخرى غير الحساسية الانعكاسية وتوفر مقياسا مركبا لحساسية الألم والحالة العاطفية / التحفيزية. مقدار الوقت اللازم لإجراء كل اختبار ، ومستوى المهارة والمعدات المتخصصة المطلوبة مقارنة إيجابية مع غيرها من التدابير غير الانعكاسية للألم ، مثل تحليل المشي أو تفضيل المكان المشروط 5,13. على الرغم من أنه لا يزال جديدا إلى حد ما ، فقد تم اعتماد هذا النهج والتحقق منه بشكل مستقل من قبل فرق متعددة من المحققين ، معظمهم في الفئران. أدى ربط العصب الوركي الجزئي إلى زيادة زمن انتقال الخروج17 والانسحاب المعتمد على المورفين في الفئران7. اقترحت دراسة أخرى أجريت على الفئران أن حساب عدد المعابر ، باستخدام نماذج إصابة الحبل الشوكي وإصابة الانقباض المزمن في الفئران ، قد يكون بمثابة مقياس نتائج مفيد8. والأهم من ذلك، حددت هذه الدراسة أيضا زيادة في تجنب التحقيق في ضوابط الجراحة الصورية، مما يشير إلى أن إدراج مجموعة ساذجة إلى جانب ضوابط الصورية / السيارة له ما يبرره. يمكن أن تركز التطبيقات المستقبلية ل MCA على التباين بين سلالات الفئران و / أو نماذج الألم ، وتأثير القلق على أداء الفحص ، ودمج تحليل الموقف أو حركية المشي لفهم الاختلافات في التكيف السلوكي مع المحفزات الضارة بشكل أفضل.
لا تزال الفجوة الانتقالية بين دراسات الفئران قبل السريرية وتطوير علاجات جديدة تشكل سببا للقلق. مع وضع ذلك في الاعتبار ، يكمل فحص MCA الأدوات الموجودة في أبحاث الألم ويساعد على إعطاء صورة أكثر اكتمالا للعديد من الأبعاد الحسية والعاطفية للألم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للإفصاح عنه.
Acknowledgments
يتم دعم جنرال موتورز من قبل زمالة الدراسات العليا NDSEG. يتم دعم VLT من قبل #GM137906 منحة NIGMS NIGMS ومؤسسة ريتا ألين. يتم دعم AJS من خلال منح وزارة الدفاع W81XWH-20-1-0277 و W81XWH-21-1-0197 ومؤسسة ريتا ألين. نحن ممتنون للدكتور أليكساي كرافيتز في كلية الطب بجامعة واشنطن لتصميم وإتاحة ملفات الطابعة ثلاثية الأبعاد مجانا لأرضية الغرفة 2 ولوحة التحقيق.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 32.8ft 3000K-6000K Tunable White LED Strip Lights, Dimmable Super Bright LED Tape Lights with 600 SMD 2835 LEDs | Lepro | SKU: 410087-DWW-US | For lighting chamber 1. https://www.lepro.com/32ft-dimmable-tunable-white-led-strip-lights.html |
| 3D printed 'spike bed' and 'chamber 2 floor' | Shapeways | N/A | Optional, for mechanical probes as an alternative to blunted map pins. |
| 70% ethanol | Various | N/A | To clean MCA between mice. |
| Acryl-Hinge 2 | TAP Plastics | N/A | for attaching chamber lids to rear walls. https://www.tapplastics.com/product/plastics/handles_hinges_latches/acryl_hinge_2/122 |
| Chemcast Cast Acrylic Sheet, Clear | TAP Plastics | N/A | 3mm thick. For front wall of chamber 1. https://www.tapplastics.com/product/plastics/cut_to_size_plastic/acrylic_sheets_cast_clear/510 |
| Chemcast Cast Transparent Colored Acrylic, Transparent Dark Red - 50% | TAP Plastics | N/A | 3mm thick. 50% light transmission. For walls and lids of chambers 2 and 3. https://www.tapplastics.com/product/plastics/cut_to_size_plastic/acrylic_sheets_transparent_colors/519 |
| Chemcast Translucent & Opaque Colored Cast Acrylic, Sign Opaque White - 0.1% | TAP Plastics | N/A | 3mm thick. For side walls and lid of chamber 1. https://www.tapplastics.com/product/plastics/cut_to_size_plastic/acrylic_sheets_color/341 |
| Disinfectant (e.g. Quatricide) | Pharmacal Research Laboratories, Inc. | 65020F | To disinfect MCA at the end of a testing session. |
| Dry-erase markers and board | Various | N/A | To add experimental info to the beginning of video footage. |
| Map pins | Various | N/A | Optional, for mechanical probes. Use sandpaper to blunt sharp points before use. Can be used in place of 3D-printed parts. |
| Paper towels | Various | N/A | To clean/disinfect MCA. |
| SCIGRIP Weld-On #3 Acrylic Cement | TAP Plastics | N/A | For assembling acrylic sheets into chambers and affixing hinges. https://www.tapplastics.com/product/repair_products/plastic_adhesives/weld_on_3_cement/131 |
| Stopwatch | Various | N/A | To record escape latencies/dwell times in real-time or from recorded video. |
| Timer | Various | N/A | To ensure LED turn-on, barrier removal and test completion are timed consistently. |
| Video camera | Various | HDRCX405 Handycam Camcorder | To record mouse behavior in the MCA device. Can be substituted with any consumer-grade video camera capable of 1080p resolution. |
| Tripod | Famall | N/A | Any tripod that can hold the camera at bench height for recording MCA footage is acceptable. |
References
- Hargreaves, K., Dubner, R., Brown, F., Flores, C., Joris, J. A new and sensitive method for measuring thermal nociception in cutaneous hyperalgesia. Pain. 32 (1), 77-88 (1988).
- Chaplan, S. R., Bach, F. W., Pogrel, J. W., Chung, J. M., Yaksh, T. L. Quantitative assessment of tactile allodynia in the rat paw. Journal of Neuroscience Methods. 53 (1), 55-63 (1994).
- Sheahan, T. D., et al. Inflammation and nerve injury minimally affect mouse voluntary behaviors proposed as indicators of pain. Neurobiology of Pain. 2, 1-12 (2017).
- Wodarski, R., et al. Cross-centre replication of suppressed burrowing behaviour as an ethologically relevant pain outcome measure in the rat: a prospective multicentre study. Pain. 157 (10), 2350-2365 (2016).
- King, T., et al. Unmasking the tonic-aversive state in neuropathic pain. Nature Neuroscience. 12 (11), 1364-1366 (2009).
- Harte, S. E., Meyers, J. B., Donahue, R. R., Taylor, B. K., Morrow, T. J. Mechanical Conflict System: A Novel Operant Method for the Assessment of Nociceptive Behavior. PLoS One. 11 (2), 0150164 (2016).
- Pahng, A. R., Edwards, S. Measuring Pain Avoidance-Like Behavior in Drug-Dependent Rats. Current Protocols in Neuroscience. 85 (1), 53 (2018).
- Odem, M. A., et al. Sham surgeries for central and peripheral neural injuries persistently enhance pain-avoidance behavior as revealed by an operant conflict test. Pain. 160 (11), 2440-2455 (2019).
- LaBuda, C. J., Fuchs, P. N. A behavioral test paradigm to measure the aversive quality of inflammatory and neuropathic pain in rats. Experimental Neurology. 163 (2), 490-494 (2000).
- LaBuda, C. J., Fuchs, P. N. Morphine and gabapentin decrease mechanical hyperalgesia and escape/avoidance behavior in a rat model of neuropathic pain. Neuroscience Letters. 290 (2), 137-140 (2000).
- Vichaya, E. G., et al. Motivational changes that develop in a mouse model of inflammation-induced depression are independent of indoleamine 2,3 dioxygenase. Neuropsychopharmacology. 44 (2), 364-371 (2019).
- Hascoët, M., Bourin, M., Nic Dhonnchadha, B. A. The mouse light-dark paradigm: a review. Progress in Neuropsychopharmacology & Biological Psychiatry. 25 (1), 141-166 (2001).
- Shepherd, A. J., Mohapatra, D. P. Pharmacological validation of voluntary gait and mechanical sensitivity assays associated with inflammatory and neuropathic pain in mice. Neuropharmacology. 130, 18-29 (2018).
- Huck, N. A., et al. Temporal Contribution of Myeloid-Lineage TLR4 to the Transition to Chronic Pain: A Focus on Sex Differences. Journal of Neuroscience. 41 (19), 4349-4365 (2021).
- Pitzer, C., La Porta, C., Treede, R. D., Tappe-Theodor, A. Inflammatory and neuropathic pain conditions do not primarily evoke anxiety-like behaviours in C57BL/6 mice. European Journal of Pain. 23 (2), 285-306 (2019).
- Sieberg, C. B., et al. Neuropathic pain drives anxiety behavior in mice, results consistent with anxiety levels in diabetic neuropathy patients. Pain Reports. 3 (3), 651 (2018).
- Meuwissen, K. P. V., van Beek, M., Joosten, E. A. J. Burst and Tonic Spinal Cord Stimulation in the Mechanical Conflict-Avoidance System: Cognitive-Motivational Aspects. Neuromodulation. 23 (5), 605-612 (2020).
