Summary
O ensaio mecânico de prevenção de conflitos é usado como uma leitura não reflexiva da sensibilidade à dor em camundongos que podem ser usados para entender melhor as respostas afetivas-motivacionais em uma variedade de modelos de dor de rato.
Abstract
A dor compreende tanto as dimensões sensorial (nociceptiva) quanto afetivas (desagradáveis). Em modelos pré-clínicos, a dor tem sido tradicionalmente avaliada por meio de testes reflexivos que permitem inferências em relação ao componente nociceptivo da dor, mas fornecem poucas informações sobre o componente afetivo ou motivacional da dor. Desenvolver testes que capturem esses componentes da dor são, portanto, traduções importantes. Assim, os pesquisadores precisam usar ensaios comportamentais não reflexivos para estudar a percepção da dor nesse nível. A prevenção de conflitos mecânicos (MCA) é um ensaio de comportamento voluntário não reflexivo estabelecido, por estudar respostas motivacionais a um estímulo mecânico nocivo em um paradigma de 3 câmaras. Uma mudança na preferência de localização de um rato, quando confrontada com estímulos nocivos concorrentes, é usada para inferir o descontentamento percebido da luz brilhante versus estimulação tátil das patas. Este protocolo descreve uma versão modificada do ensaio mca que os pesquisadores da dor podem usar para entender respostas afetivas-motivacionais em uma variedade de modelos de dor de rato. Embora não seja especificamente descrito aqui, nossos dados mca exemplo usar o intraplantar complete Freund's adjuvante (CFA), poupado lesão nervosa (SNI) e um modelo de fratura/fundição como modelos de dor para ilustrar o procedimento mca.
Introduction
A dor é uma experiência complexa com componentes sensoriais e afetivos. Uma redução no limiar da percepção da dor e da hipersensibilidade aos estímulos térmicos e/ou mecânicos são características fundamentais dessa experiência, que os testes de comportamento de dor evocados por estímulos podem capturar (como o teste de hargreaves de sensibilidade térmica e o teste von Frey de sensibilidade mecânica)1,2. Embora tais testes dêem resultados robustos e reprodutíveis, eles são limitados por sua dependência da retirada reflexiva de um estímulo nocivo percebido. Isso pôs em causa uma dependência contínua da pesquisa de dor apenas nestes testes. Para isso, os pesquisadores da dor vêm explorando há vários anos testes comportamentais alternativos/complementares para uso em modelos de dor de roedores, em um esforço para capturar mais dos componentes afetivos e/ou motivacionais da dor. Essas medidas não evocadas, voluntárias ou não reflexivas (por exemplo, corrida de rodas, atividade de escavação, preferência de localcondicionada 3,4,5) estão sendo implementadas na tentativa de melhorar a tradução da pesquisa de dor pré-clínica.
O ensaio de prevenção de conflitos mecânicos (MCA) foi originalmente descrito por Harte et al. em2016 6, é usado predominantemente em ratos 7,8, e representa uma modificação de uma abordagem anterior - o paradigma de fuga do local. Nesta abordagem, um estímulo nocivo da pata traseira é realizado em uma câmara de outra forma desejável (escura) para conduzir o comportamento proposital do animal para escapar/evitar tal estimulação 9,10. Em vez de depender de uma estimulação nociva manual da pata traseira por um observador, o ensaio da MCA força os ratos a negociar um estímulo potencialmente nocivo para escapar de um ambiente aversivo e alcançar a câmara escura. O conflito/evasão que dá nome ao ensaio surge dessas duas motivações concorrentes: escapar de áreas iluminadas e evitar estímulos nocivos das patas. O ensaio mca também compartilha características com testes de preferência de local condicionado, onde o emparelhamento do alívio da dor com pistas ambientais impulsiona mudanças de comportamento que refletem uma preferência pelo contexto de alívio/recompensa da dor11.
Fundamentalmente falando, todos esses ensaios compartilham uma abordagem semelhante: usando uma mudança na preferência de um animal por um ambiente aversivo sobre outro como um indicador de seu estado afetivo/motivacional. O ensaio mca é um paradigma de 3 câmaras que consiste em uma câmara iluminada brilhantemente seguido por uma câmara média escura com sondas de altura ajustáveis e uma terceira câmara escura sem qualquer estímulo aversivo. Um rato ileso é tipicamente motivado a escapar para uma câmara escura, dada a aversão inata de roedores à luz brilhante12. Neste exemplo, a motivação natural para escapar de um ambiente iluminado supera a desinclinação ao encontrar estimulação da pata traseira (as sondas de altura ajustáveis), que ocorre exclusivamente no ambiente escurecido. Em contraste, um rato que experimenta dor (devido à inflamação ou neuropatia, por exemplo) pode optar por passar mais tempo no ambiente iluminado, já que há motivação para evitar a desagradável experiência tátil das sondas mecânicas no cenário de hipersensibilidade tátil contínua.
Este artigo descreve uma versão modificada do ensaio mca. Adaptamos o método original (que foi realizado em ratos6) para uso em camundongos. Também reduzimos o número de alturas da sonda testadas de seis para três (0, 2 e 5 mm acima da altura do piso) para agilizar a aquisição de dados. Essa abordagem foi testada em vários modelos de dor e validada com analgésicos conhecidos, indicando que a hipersensibilidade da dor e/ou as alterações afetivas e motivacionais associadas estão conduzindo essas mudanças de comportamento. Essa abordagem é relativamente rápida de conduzir e adaptável quando comparada a outras medidas não reflexivas, que podem levar muitos dias de habituação e treinamento 1,2. Em conjunto com outras medidas de dor, a MCA pode gerar insights valiosos sobre os aspectos afetivos e motivacionais da dor.
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Protocol
Todos os experimentos envolvendo o uso de camundongos e os procedimentos nele realizados foram aprovados pelos Comitês Institucionais de Cuidado e Uso de Animais do MD Anderson Cancer Center e da Universidade de Stanford, em estrita conformidade com o Guia dos Institutos Nacionais de Saúde para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório.
1. Construção mca
- Construa a câmara 1 com as seguintes dimensões: 125 mm x 125 mm x 125 mm (largura x profundidade x altura) a partir de acrílico branco opaco de 3 mm de espessura usado para as paredes laterais, piso, teto. Use um acrílico de 3 mm de espessura para a parede frontal. Cole todos os lados com bastante antecedência usando adesivo acrílico dedicado.
ATENÇÃO: O adesivo acrílico é considerado material perigoso (inflamável, vapor prejudicial, pode ser prejudicial se engolido, pode irritar a pele ou os olhos). Esses adesivos só devem ser utilizados de acordo com as instruções do fabricante (ou seja, com EPI apropriado em uma área bem ventilada). - Conecte a tampa da câmara 1 com uma dobradiça, para que os ratos possam ser facilmente colocados e recuperados da câmara. Conecte fita de diodo emissor de luz autoadesiva (LED) à superfície interna da tampa para fornecer iluminação de ~4800 lux.
- Feche a câmara 1 do resto da MCA deslizando uma folha de acrílico opaca para dentro e fora de posição.
- Construa a câmara de teste MCA, câmara 2, como uma câmara não iluminada de 270 mm de comprimento fabricada a partir de acrílico vermelho escuro translúcido (3 mm de espessura) em todos os lados, com uma tampa articulada em cima. Coloque uma grade de 13 x 31 de furos de 2 mm no chão da câmara 2 através da qual uma matriz de sondas sem cortes com pontas de 0,5 mm de diâmetro (por exemplo, pinos de mapa sem cortes) pode se projetar.
NOTA: Pinos sem corte com um bloco de lixa de 120 grãos ou similares. Limpe-os em água morna com detergente antes de ser desinfetado com desinfetante esporicidal. - Ajuste a altura das sondas colocando folhas de acrílico adicionais abaixo da placa base da sonda (Figura 1). Usando esta abordagem, configure o dispositivo com três configurações: 0 mm, 2 mm e 5 mm de altura da sonda.
- Como alternativa aos pinos de mapa sem cortes ou materiais similares, use os arquivos da impressora 3D para imprimir o piso da câmara 2 e a placa da sonda (ver Arquivo Suplementar 1: SpikeBed-MCA.stl que se refere às sondas mecânicas, e Arquivo Suplementar 2: MCA_baseplate.stl que forma o piso da câmara 2).
NOTA: Se a impressão 3D não estiver disponível, cole os pinos do mapa em uma folha de acrílico usando o mesmo adesivo acrílico usado para construir as paredes do dispositivo. - Imprima com um material lavável e biocompatível, como o plástico nylon 12 ou similar (recomendado).
- Construa a câmara 3 com as seguintes dimensões: 125 mm x 125 mm x 125 mm como uma caixa de acrílico vermelho translúcido não iluminada (em todos os lados), colocada na extremidade oposta à câmara 1. Coloque uma tampa dobradiça na câmara, semelhante às câmaras 1 e 2. Esta câmara serve como uma área de fuga escurecida das sondas mecânicas na câmara 2.
2. Habituação e teste do Mouse MCA
- Como acontece com todos os experimentos envolvendo desfechos comportamentais em animais, observe a randomização adequada e a cegueira para minimizar o viés potencial.
NOTA: Os resultados representativos foram gerados utilizando camundongos C57BL/6J masculino e feminino de 8 a 12 semanas (número de cepas da Jackson Laboratories 000664). Os camundongos foram socialmente alojados, até 5 por gaiola, com acesso a alimentos e água ad libitum e um ciclo de luz das 07:00 h às 19:00 h. O MCA ocorreu no período de luz, entre 09:00 h e 12:00 h. - Um dia antes do teste da linha de base ser agendado, aclimatar ratos à unidade MCA por 5 min (mínimo) a 15 min (máximo) com seus companheiros de gaiola para facilitar a exploração social de todo o dispositivo.
- Durante todo o processo, certifique-se de que os LEDs na câmara 1 sejam desligados, a barreira entre as câmaras 1 e 2 seja deixada aberta, e as sondas sejam definidas a uma altura de zero (ou seja, não se projetando pelo chão da câmara 2).
- Realize um teste de linha de base de camundongos (opcional) se o estudo incorporar animais de controle negativos (ou seja, cirurgia falsa ou controles de injeção de veículo). Se desejar, use um teste de linha de base para excluir quaisquer outliers não feridos que nunca cruzem para a câmara 2, embora isso não tenha se mostrado necessário. Se utilizado, informe todos os critérios de exclusão e o número de camundongos excluídos.
- Antes de começar a testar, configure uma câmera de vídeo capaz de gravar imagens de 1080p em um tripé com uma visão lateral de todo o dispositivo MCA. Ajuste o campo de visão de modo que o MCA preencha a imagem gravada.
- Uma vez que a gravação começa, segure uma placa de apagamento a seco portátil no campo de visão da câmera para rotular o início do vídeo com informações de identificação sobre a execução de testes do animal (por exemplo, ID do mouse, altura da sonda, data, ponto de hora, etc.).
- Para a primeira corrida, ajuste a altura da sonda como zero. Transfira o mouse para ser testado de sua gaiola para a câmara 1 com a porta da barreira no lugar. Inicie um temporizador visível nas imagens gravadas.
NOTA: O temporizador garante que os intervalos entre as diferentes partes do teste sejam consistentes entre as corridas. - Depois dos 10, ligue os LEDs da câmara 1. Depois que o rato estiver na câmara iluminada por 20 s, retire a barreira entre as câmaras 1 e 2.
- Observe o animal por 2 minutos. Meça latências e/ou tempos de moradia com um cronômetro enquanto o teste estiver em andamento. Alternativamente, as imagens de vídeo podem ser analisadas assim que os testes estiverm concluídos.
NOTA: Por razões de rendimento e evitar exposição prolongada a estímulos aversivos, o corte foi fixado em 2 min. - Meça um ou mais dos vários desfechos úteis que foram identificados (veja abaixo; Figura 1). Recomendado para analisar todas as 5 medidas de desfecho ao iniciar os testes, a fim de verificar quais aspectos de comportamento diferem em uma determinada configuração experimental.
- Opção I: Regissu o registro da latência para a primeira entrada na câmara 2. Opção II: Regissu o registro da latência para atravessar mais de metade da câmara 2. Opção III: Regisso tempo total de moradia na câmara 2. Opção IV: Registo da latência para chegar à câmara 3 (fuga). Opção V: Semelhante à opção II, registo o tempo total de moradia em cada câmara dentro de 2 minutos e converta-os em proporções.
NOTA: Como cada experimento é único e pode ser influenciado por fatores biológicos e mudanças comportamentais exclusivas do modelo da doença, os pesquisadores podem experimentar essas e outras medidas em suas próprias mãos.
- Opção I: Regissu o registro da latência para a primeira entrada na câmara 2. Opção II: Regissu o registro da latência para atravessar mais de metade da câmara 2. Opção III: Regisso tempo total de moradia na câmara 2. Opção IV: Registo da latência para chegar à câmara 3 (fuga). Opção V: Semelhante à opção II, registo o tempo total de moradia em cada câmara dentro de 2 minutos e converta-os em proporções.
- Uma vez que o teste esteja completo, devolva o mouse para sua gaiola doméstica, limpe as câmaras mca com 70% de etanol e deixe-o secar completamente.
NOTA: O boli fecal geralmente pode ser limpo da câmara relativamente facilmente com toalhas de papel antes do etanol/desinfetante. Se for necessária uma limpeza mais completa, as câmaras 2 e 3 podem ser desmontadas e imersas em água morna e com sabão. - Depois de executar todos os ratos em uma coorte com a altura da sonda definida a zero, insira uma folha de 3 mm de acrílico sob a placa de base da sonda mecânica e repita as etapas 2.4.2 a 2.4.7 com uma altura de sonda de 2 mm.
- Depois de rodar todos os ratos com a altura da sonda definida para 2 mm, insira uma segunda folha de 3 mm de acrílico sob a placa base da sonda e repita as etapas 2.4.2 a 2.4.7 com uma altura de sonda de 5 mm.
NOTA: Um grupo de 8 camundongos pode ser testado em aproximadamente 2 h usando esta abordagem. Use tamanhos de grupo menores se for necessário um tempo pós-droga mais preciso (por exemplo, para um experimento de curso de tempo de drogas). - Faça uma limpeza final com um desinfetante no final de uma sessão de teste.
- Repita os testes após induzir a hipersensibilidade da dor e/ou com tratamento medicamentoso.
- Compare o desempenho de cada rato na linha de base com seu desempenho após a dor ser induzida. Avaliar o impacto de uma intervenção farmacológica comparando animais tratados com animais tratados com drogas ao mesmo tempo.
- Realize análise estatística não paramétrica (por exemplo, o Teste U Mann Whitney) se os animais atingirem o corte de 2 min sem satisfazer a medida de desfecho desejada, resultando em dados não contínuos.
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Representative Results
O ensaio MCA tem sido usado com sucesso com vários modelos de dor de rato mecanisticamente distintos. A Figura 2 mostra dados onde a medida de escolha foi o cruzamento do ponto médio da câmara 2 (Figura 2A). Os dados obtidos usando o meio-termo versus fuga na câmara 3 são muito semelhantes, ~40 s para a metade versus ~45 s para a fuga da câmara 3 no modelo de lesão nervosa poupada (SNI) de dor neuropática com altura da sonda de 5 mm13.
No modelo de dor inflamatória induzida pelo CFA, a injeção de pata traseira (intraplantar) de soro fisiológico não altera a latência de fuga versus linha de base. Os camundongos que foram injetados com CFA em uma pata traseira mostraram um aumento significativo na latência de fuga 4 dias após a injeção, mas apenas quando a altura da sonda foi elevada para 5 mm. Crucialmente, esse aumento da latência para escapar a 5 mm não foi visto em camundongos que receberam o nsaid carprofen (10 mg/kg, i.p.) 90 min antes do início dos testes (Figura 2B).
O modelo de lesão nervosa poupada (SNI) de dor neuropática traumática, também está associado a um aumento significativo na latência para escapar versus linha de base quando a altura da sonda foi definida para 5 mm. Este efeito foi visto em camundongos SNI, mas não em seus controles de cirurgia falsos. Esse aumento da latência de fuga também foi evitado pela administração sistêmica da buprenorfina analgésico opioide (25 μg/kg, i.p.) 90 min antes dos testes (Figura 2C). O aumento da latência de fuga também foi observado em camundongos que não foram submetidos a uma rodada de base de testes de MCA antes da lesão nervosa (Figura 2D). Neste caso, o aumento da latência de escape em camundongos SNI a 5 mm foi evitado por gabapentina (30 mg/kg, i.p.) administrada 90 min antes dos testes. Coletivamente, isso sugere que a MCA pode detectar alterações relacionadas à dor na aversão ao estímulo e evitar em dois modelos amplamente utilizados de dor inflamatória e neuropática.
A AMC foi ainda testada no modelo de fratura/fundição da síndrome da dor regional complexa (CRPS) da condição crônica de dor, que é estabelecida por uma fratura tíbia distal direita fechada seguida por 3 semanas de fundição14. Este modelo clinicamente informado apresenta inflamação periférica de fase aguda, bem como atividade imunológica de longo prazo no sistema nervoso central com aodídia de escalada traseira persistente. Semelhante aos modelos CFA e SNI, foram observadas latências de escape aumentadas no modelo de fratura/fundição (Figura 3A). Antes da lesão, a latência para escapar da câmara 1 aumentou proporcionalmente à altura da sonda. Após a lesão, a latência de fuga permaneceu inalterada em 0 mm, mas aumentou significativamente na altura da sonda de 2 mm e 5 mm para os machos e a altura da sonda de 5 mm para as fêmeas quando comparada à linha de base (Figura 3B).
Figura 1: Esquema e imagens do dispositivo MCA. (A) Medidas potenciais de desfecho no ensaio MCA, (marcado por ícones do relógio): latência para saída da câmara 1 (I), latência para atravessar mais de 50% da câmara 2 (linha pontilhada; II), o tempo total gasto na câmara 2 (III), latência para chegar à câmara de escape (IV) ou percentual de tempo gasto em cada câmara (V). Animais que experimentam dor em média apresentam valores maiores para I, II e IV, e valores reduzidos para III. Um valor reduzido para III aumenta necessariamente a proporção de tempo gasto na câmara 1 e/ou câmara 3, que seria capturada pela medida de resultado V. Criada com Biorender.com. (B) Imagens que ilustram o dispositivo MCA (e câmaras numeradas 1, 2 e 3) com os LEDs desligados (superior esquerdo), os LEDs ligados (inferior esquerdo). (C) Uma vista das câmaras de cima com as portas abertas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Dor inflamatória e neuropática aumenta evitar no ensaio mca. (A) Representação da medida específica de desfecho utilizada aqui: latência para atravessar a câmara 2 ponto médio. (B) A injeção intraplantar de CFA aumentou significativamente a latência para escapar (quadrados vermelhos) versus controles salinos (círculos pretos) quando a altura da sonda foi definida para 5 mm. O carprofeno intraperitoneal (10 mg/kg) atenuou o aumento induzido pelo CFA na latência de fuga (triângulos azuis). Os dados são plotados como latência média de fuga ± erro padrão da média (SEM); n = 7 machos/grupo. (C) A cirurgia de lesão nervosa poupada (SNI) aumentou significativamente a latência de fuga da câmara 1 versus controles de cirurgia falsa (círculos negros), quando a altura da sonda foi definida para 5 mm (quadrados vermelhos). Buprenorfina intraperitoneal (25 mg/kg) atenuou significativamente esse aumento na latência de fuga (triângulos azuis). Os dados são traçados como latência média de fuga ± SEM; n = 6-7 machos por grupo. (D) O aumento induzido pelo SNI na latência de fuga foi revertido pelo uso da gabapentina analgésica (triângulos verdes). Os dados são traçados como latência média de fuga ± SEM; n = 8 machos/grupo. ## = p < 0,01, ***/### = p < .001, para as comparações indicadas (ANOVA bidirecional, Bonferroni pós-hoc). Este número foi modificado de13. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Fratura tibial/fundição induzida de aumento da dor crônica no ensaio mca. A fratura/fundição aumentou significativamente a latência de fuga em 3 semanas após a lesão (W3) versus linha de base (BL) em machos nas alturas da sonda de 2 mm e 5 mm e em fêmeas na altura da sonda de 5 mm (n = 5/sexo). Os dados de cada rato são retratados em preto desbotado (machos) ou caiena (fêmeas) com média representada por linhas escuras. **/*** = p < 0,01/< 0,001 versus sexo e preço de linha de base compatível com a altura da sonda por ANOVA bidirecional, Tukey pós-hoc. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Arquivo suplementar 1: arquivo de impressora 3D SpikeBed-MCA. Quando impresso em um material adequadamente biocompatível e lavável, como o nylon 12, o SpikeBed-MCA.stl produz a plataforma de sondas táteis que se projetam pelo chão da câmara 2. Clique aqui para baixar este Arquivo.
Arquivo suplementar 2: MCA_baseplate de arquivo de impressora 3D. Quando impresso em um material adequadamente biocompatível e lavável, como o nylon 12, MCA_baseplate.stl produz o piso da câmara 2, através do qual as sondas táteis se projetam. Clique aqui para baixar este Arquivo.
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Discussion
Como em todos os testes comportamentais, o manuseio adequado, a randomização e a cegueira ao tratamento dos animais são essenciais em todos os momentos. Dadas as insumos multifatoriais em comportamentos complexos e tomada de decisões, é imperativo que os animais sejam manuseados, habituados e testados da forma mais consistente possível, minimizando a angústia. Deve-se também ter cuidado para reproduzir o tempo de colocação do mouse na câmara 1, ligar as luzes LED e remover a barreira, uma vez que as diferenças aqui podem influenciar o comportamento subsequente.
Deve-se notar que as diferentes medidas de desfecho retratadas na Figura 1A estão inter-relacionadas. Por exemplo, um rato que entra na câmara 2 geralmente atravessa a metade da câmara 2 e quase sempre completa a fuga para a câmara 3. Isso significa que as medidas de resultado I, II e IV estão inter-relacionadas. As medidas de desfecho III e V medem o tempo total de moradia na câmara 2, e a proporção de tempo de moradia em todas as 3 câmaras, respectivamente. Portanto, essas medidas estão intimamente relacionadas umas com as outras. No entanto, um rato pode teoricamente acumular tempo substancial de moradia na câmara 2 se a travessia do meio ou fuga para a câmara 3 teve baixa latência, alta latência, ou não ocorreu em tudo.
Várias variações ou modificações deste método foram relatadas. Além das diferentes medidas de desfecho listadas aqui (Figura 1), os investigadores poderiam variar a progressão da altura da sonda em um esforço para destacar diferenças de sensibilidade. Como não houve diferenças estatisticamente significativas com a altura intermediária da sonda de 2 mm, pode ser mais eficiente rodar camundongos apenas a 0 mm e 5 mm. Alternativamente, uma altura da sonda entre 2 e 5 mm, ou repetidas corridas a uma altura de sonda de 5 mm pode começar a desmascarar diferenças que não eram aparentes de outra forma. Além disso, a avaliação do tempo de moradia em cada câmara pode ser usada como leitura de motivação e atividade. Isso pode ser útil em casos em que alguns ratos correm rapidamente até a câmara 3, mas depois retornam à câmara 1 para explorar mais. Nessas situações, a latência para entrar na câmara 3 sozinha não capturaria essa sutileza. Elevar o tempo de corte de testes além do limite de 2 minutos aqui também pode ser útil para alguns investigadores. Finalmente, não podemos excluir a possibilidade de que os testes repetidos dos mesmos animais (mais do que as três vezes descritos aqui), ou testes com maior frequência (menos de 4-7 dias entre os testes) possam introduzir efeitos de habitação ou aprendizagem. Por essas razões, incentiva-se a inclusão de grupos de controle ingênuos e não domesticados em todos os momentos. Em última análise, variações de comportamento são altamente propensas a serem específicas do modelo de dor e justificam uma investigação mais aprofundada nestes e em outros modelos de dor.
Os modelos indutores de dor utilizados aqui (CFA, SNI, fratura/fundição) estão tipicamente associados à hipersensibilidade em outros testes de comportamento de dor, o que corresponde a um aumento na latência de evasão/fuga. O ensaio mca também pode ser capaz de detectar uma perda de acuidade sensorial (através do aumento do tempo gasto na câmara 2, por exemplo), embora isso não tenha sido formalmente testado. A MCA tem algumas limitações que justificam a consideração. A aversão à luz brilhante é um meio fundamental de motivar a entrada na câmara 2 e, portanto, um condutor de conflitos subsequentes. Qualquer característica patológica associada a um modelo de mouse específico que possa alterar a aversão à luz brilhante (por exemplo, deficiência visual) deve ser cuidadosamente considerada antes de empregar este teste. A contribuição da ansiedade para escapar da latência também não foi sistematicamente testada, embora modelos crônicos de dor inflamatória e neuropática tenham sido relatados para mostrar sinais de comportamento de ansiedade em camundongos em outros testes, continua a haver um debate sobre esses15,16. Dito isto, uma contribuição de ansiedade relacionada à dor para esses desfechos comportamentais não pode ser confirmada ou descartada neste momento. Uma vez que a MCA tem múltiplas entradas nas medidas de resultado, isso vem com mais potenciais confusões a considerar.
Em resumo, o teste mca fornece uma leitura não reflexiva da sensibilidade à dor em modelos de mouse. As medidas de desfecho são influenciadas por fatores que não sejam a sensibilidade reflexiva e fornecem uma medida composta de sensibilidade à dor e estado afetivo/motivacional. A quantidade de tempo necessária para executar cada teste, e o nível de habilidade e equipamento especializado necessários se comparam favoravelmente com outras medidas não reflexivas de dor, como análise de marcha ou preferência de local condicionado 5,13. Embora ainda um pouco nova, a abordagem tem sido adotada e verificada independentemente por várias equipes de investigadores, predominantemente em ratos. A ligadura parcial do nervo ciático aumentou a latência de saída17 e a abstinência dependente de morfina em ratos7. Outro estudo em ratos propôs que a contagem do número de travessias, utilizando lesão medular e modelos crônicos de lesão de constrição em ratos, pode servir como medida de resultado útil8. Crucialmente, este estudo também identificou um aumento na evasão de sondas em controles de cirurgia falsa, indicando que a inclusão de um grupo ingênuo ao lado de controles falsos/veículos é justificada. As aplicações futuras da MCA poderiam focar na variação entre as cepas do camundongo e/ou modelos de dor, o impacto da ansiedade no desempenho do ensaio e a integração da análise de postura ou cinemática de marcha para entender melhor as diferenças nas adaptações comportamentais a estímulos nocivos.
A lacuna translacional entre estudos pré-clínicos de camundongos e o desenvolvimento de novas terapêuticas continua a apresentar motivo de preocupação. Com isso em mente, o ensaio mca complementa as ferramentas existentes na pesquisa da dor e ajuda a dar uma imagem mais completa das muitas dimensões sensoriais e afetivas da dor.
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Disclosures
Os autores não têm conflitos de interesse relevantes para divulgar.
Acknowledgments
A GM é apoiada por uma Bolsa de Pós-Graduação NDSEG. O VLT é apoiado pela concessão do NIH NIGMS #GM137906 e pela Fundação Rita Allen. A AJS é apoiada pelo Departamento de Defesa concede W81XWH-20-1-0277, W81XWH-21-1-0197 e a Fundação Rita Allen. Somos gratos ao Dr. Alexxai Kravitz da Faculdade de Medicina da Universidade de Washington por projetar e disponibilizar gratuitamente os arquivos de impressora 3D para a placa de piso e sonda da câmara 2.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 32.8ft 3000K-6000K Tunable White LED Strip Lights, Dimmable Super Bright LED Tape Lights with 600 SMD 2835 LEDs | Lepro | SKU: 410087-DWW-US | For lighting chamber 1. https://www.lepro.com/32ft-dimmable-tunable-white-led-strip-lights.html |
| 3D printed 'spike bed' and 'chamber 2 floor' | Shapeways | N/A | Optional, for mechanical probes as an alternative to blunted map pins. |
| 70% ethanol | Various | N/A | To clean MCA between mice. |
| Acryl-Hinge 2 | TAP Plastics | N/A | for attaching chamber lids to rear walls. https://www.tapplastics.com/product/plastics/handles_hinges_latches/acryl_hinge_2/122 |
| Chemcast Cast Acrylic Sheet, Clear | TAP Plastics | N/A | 3mm thick. For front wall of chamber 1. https://www.tapplastics.com/product/plastics/cut_to_size_plastic/acrylic_sheets_cast_clear/510 |
| Chemcast Cast Transparent Colored Acrylic, Transparent Dark Red - 50% | TAP Plastics | N/A | 3mm thick. 50% light transmission. For walls and lids of chambers 2 and 3. https://www.tapplastics.com/product/plastics/cut_to_size_plastic/acrylic_sheets_transparent_colors/519 |
| Chemcast Translucent & Opaque Colored Cast Acrylic, Sign Opaque White - 0.1% | TAP Plastics | N/A | 3mm thick. For side walls and lid of chamber 1. https://www.tapplastics.com/product/plastics/cut_to_size_plastic/acrylic_sheets_color/341 |
| Disinfectant (e.g. Quatricide) | Pharmacal Research Laboratories, Inc. | 65020F | To disinfect MCA at the end of a testing session. |
| Dry-erase markers and board | Various | N/A | To add experimental info to the beginning of video footage. |
| Map pins | Various | N/A | Optional, for mechanical probes. Use sandpaper to blunt sharp points before use. Can be used in place of 3D-printed parts. |
| Paper towels | Various | N/A | To clean/disinfect MCA. |
| SCIGRIP Weld-On #3 Acrylic Cement | TAP Plastics | N/A | For assembling acrylic sheets into chambers and affixing hinges. https://www.tapplastics.com/product/repair_products/plastic_adhesives/weld_on_3_cement/131 |
| Stopwatch | Various | N/A | To record escape latencies/dwell times in real-time or from recorded video. |
| Timer | Various | N/A | To ensure LED turn-on, barrier removal and test completion are timed consistently. |
| Video camera | Various | HDRCX405 Handycam Camcorder | To record mouse behavior in the MCA device. Can be substituted with any consumer-grade video camera capable of 1080p resolution. |
| Tripod | Famall | N/A | Any tripod that can hold the camera at bench height for recording MCA footage is acceptable. |
References
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