Summary
机械避免冲突测定用作小鼠疼痛敏感性的非反射性读数，可用于更好地理解各种小鼠疼痛模型中的情感动机反应。
Abstract
疼痛包括感觉（伤害感受）和情感（不愉快）两个方面。在临床前模型中，传统上使用反射测试来评估疼痛，这些测试可以推断疼痛的伤害感受成分，但很少提供有关疼痛的情感或动机成分的信息。因此，开发捕获这些疼痛成分的测试在翻译上很重要。因此，研究人员需要使用非反射性行为测定来研究该水平的疼痛感知。机械冲突避免（MCA）是一种已建立的自愿非自反行为测定，用于在3室范式中研究对有害机械刺激的动机反应。当面对相互竞争的有害刺激时，小鼠位置偏好的变化被用来推断强光与爪子的触觉刺激的感知不愉快。该协议概述了MCA测定的修改版本，疼痛研究人员可以使用该版本来了解各种小鼠疼痛模型中的情感动机反应。虽然这里没有具体描述，但我们的示例MCA数据使用体内完全弗氏佐剂（CFA），幸免于神经损伤（SNI）和骨折/铸造模型作为疼痛模型来说明MCA程序。
Introduction
疼痛是一种具有感觉和情感成分的复杂体验。疼痛知觉阈值的降低和对热和/或机械刺激的超敏反应是这种体验的关键特征，刺激诱发的疼痛行为测试可以捕获（如Hargreaves的热敏感性测试和von Frey的机械敏感性测试）1，2。虽然这些测试给出了稳健且可重复的结果，但它们受到依赖从感知的有害刺激中反射性戒断的限制。这使人们质疑疼痛研究仅依靠这些测试的持续依赖。为此，疼痛研究人员多年来一直在探索用于啮齿动物疼痛模型的替代/补充行为测试，以捕获疼痛的更多情感和/或动机成分。这些非诱发性、自愿性或非反射性措施（例如，车轮运行、挖洞活动、条件位置偏好3，4，5）正在实施，以提高临床前疼痛研究的可转化性。
机械冲突避免（MCA）测定最初由Harte等人在20166中描述，主要用于大鼠7，8，并代表了早期方法的修改 - 逃逸 - 避免范式。在这种方法中，后爪的有害刺激在其他理想的（黑暗）室中进行，以驱动动物的有目的行为以逃避/避免这种刺激9，10。MCA测定不是依靠观察者对后爪的手动有害刺激，而是迫使小鼠通过潜在的有害刺激来逃避令人厌恶的环境并到达暗室。使该测定法得名的冲突/回避源于这两种相互竞争的动机：逃离明亮的区域并避免对爪子的有害刺激。MCA测定还与条件性的地方偏好测试共享特征，其中疼痛缓解与环境线索的配对推动了行为的变化，反映了对缓解疼痛/奖励环境的偏好11。
从根本上说，所有这些测定都有一个相似的方法：使用动物对一种厌恶环境的偏好相对于另一种环境的偏好的转变，作为其情感/动机状态的指标。MCA测定是一种3室范式，由一个明亮的腔室组成，然后是一个带有可调节高度探针的黑暗中间室和一个没有任何厌恶刺激的黑暗第三室。一只未受伤的老鼠通常有动机逃到一个黑暗的房间，因为啮齿动物天生厌恶明亮的光12。在这个例子中，逃离明亮环境的自然动机克服了遇到后爪刺激（可调节高度探头）的倾向，后者只发生在黑暗的环境中。相反，经历疼痛（例如，由于炎症或神经病变）的小鼠可能会选择在明亮的环境中花费更多时间，因为在持续的触觉超敏反应的情况下，有动机避免机械探针的不愉快的触觉体验。
本文介绍了MCA测定的修改版本。我们已经将原始方法（在大鼠6中进行）用于小鼠。我们还将测试的探头高度从 6 个减少到 3 个（高于地板高度 0、2 和 5 mm），以简化数据采集。这种方法已经在多个疼痛模型中进行了测试，并用已知的镇痛药进行了验证，表明疼痛超敏反应和/或相关的情感和动机变化正在推动这些行为变化。与其他非反射性措施相比，这种方法的进行速度相对较快且适应性强，后者可能需要许多天的习惯化和训练1，2。与其他疼痛测量方法一起，MCA可以对疼痛的情感和动机方面产生有价值的见解。
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Protocol
所有涉及使用小鼠的实验以及其中遵循的程序均由MD安德森癌症中心和斯坦福大学的机构动物护理和使用委员会批准，严格按照美国国立卫生研究院的实验动物护理和使用指南。
1. 马华大厦
- 构建具有以下尺寸的1室1：125 mm x 125 mm x 125 mm（宽x深x高度），从不透明的白色3mm厚的丙烯酸树脂中用于侧壁，地板，天花板。使用3毫米厚的透明丙烯酸树脂作为前置墙。使用专用的丙烯酸粘合剂提前将所有侧面粘合在一起。
注意：丙烯酸粘合剂被认为是有害物质（易燃，蒸汽有害，吞咽可能有害，可能会刺激皮肤或眼睛）。此类粘合剂只能按照制造商的说明使用（即，在通风良好的区域使用适当的PPE）。 - 用铰链连接腔室1的盖子，以便可以很容易地将小鼠放入腔室并从中取出。将自粘发光二极管 （LED） 胶带贴在盖子的内表面上，以提供 ~4800 lux 的照明。
- 通过将不透明的丙烯酸板滑入和滑出位置，将室1与MCA的其余部分关闭。
- 将MCA测试室2室构建为270毫米长的无光室，由四面半透明的深红色丙烯酸（3毫米厚）制成，顶部有铰链盖。在腔室2的地板上放置一个13 x 31的2 mm孔网格，通过该网格，可以突出一系列直径为0.5 mm的钝探头（例如，钝的地图针）。
注：带有120粒度砂纸块或类似物的钝销。用洗涤剂用温水清洁，然后用杀菌消毒剂消毒。 - 通过在探头底板下方放置额外的丙烯酸板来调整探头的高度（图1）。使用此方法，使用三种设置配置设备：0 mm、2 mm 和 5 mm 探头高度。
- 作为钝化地图引脚或类似材料的替代方案，使用3D打印机文件打印腔室2的地板和探针板（参见 补充文件1：SpikeBed-MCA.stl，它指的是机械探头，以及 补充文件2：MCA_baseplate.stl，它形成了2室的地板）。
注意：如果 3D 打印不可用，请使用与构建设备壁相同的丙烯酸粘合剂将地图引脚粘合到丙烯酸板上。 - 使用可水洗和生物相容性材料打印，例如尼龙 12 塑料或类似材料（推荐）。
- 构建具有以下尺寸的 3 号腔室：125 mm x 125 mm x 125 mm 作为未点亮的半透明深红色丙烯酸盒（四面），放置在腔室 1 的另一端。在腔室上放置铰链盖，类似于腔室1和2。该室用作2室中机械探头的黑暗逃生区域。
2. 小鼠MCA习惯化和测试
- 与所有涉及动物行为结果的实验一样，在整个过程中观察适当的随机化和盲法，以尽量减少潜在的偏见。
注意：代表性结果通过使用8-12周龄的雄性和雌性C57BL / 6J小鼠（杰克逊实验室菌株编号000664）产生。将小鼠社会饲养，每个笼子最多5只， 随意 获得食物和水，07：00小时至19：00小时的光周期。MCA发生在光照期间，在09：00 h和12：00 h之间。 - 在安排基线测试的前一天，将小鼠与笼中伴侣一起适应MCA单元5分钟（最小）至15分钟（最大值），以促进整个设备的社会探索。
- 在整个过程中，确保室1中的LED关闭，腔室1和2之间的屏障保持打开状态，并将探头的高度设置为零（即，不突出腔室2的地板）。
- 如果研究包含阴性对照动物（即假手术或载体注射对照），则对小鼠进行基线测试（可选）。如果需要，请使用基线测试来排除任何从未进入2室的未受伤异常值，尽管这已被证明不是必需的。如果使用，报告所有排除标准和排除的小鼠数量。
- 在开始测试之前，请设置一个能够在三脚架上录制1080p素材的摄像机，并具有整个MCA设备的侧面视图。调整视野，使 MCA 填充录制的图像。
- 录制开始后，将手持式干擦板放在摄像机的视野中，在视频的开头标注动物测试运行的识别信息（例如，鼠标ID、探头高度、日期、时间点等）。
- 对于首次运行，将探头高度设置为零。将要测试的小鼠从其家庭笼子转移到室1，并放置屏障门。启动在录制的素材中可见的计时器。
注意：计时器可确保测试不同部分之间的间隔在运行之间保持一致。 - 10 秒后，打开腔室 1 个 LED。在鼠标在点亮的腔室中放置20秒后，取出腔室1和2之间的屏障。
- 观察动物2分钟。在测试过程中使用秒表测量延迟和/或停留时间。或者，可以在测试完成后分析视频片段。
注意：出于通量和避免长时间暴露于厌恶刺激的原因，截止时间设置为2分钟。 - 衡量已确定的几个有用结果中的一个或多个（见下文;图 1）。建议在开始测试时分析所有5个结果指标，以确定在给定的实验设置中行为的哪些方面不同。
- 选项 I：记录第一个进入腔室 2 的延迟。选项 II：记录跨过 2 号腔室一半以上的延迟。选项三：记录2号室中的总停留时间。选项 IV：记录到达 3 号舱室（逃生）的延迟。选项五：与选项二类似，记录2分钟内每个腔室的总停留时间，并将其转换为比例。
注意：由于每个实验都是独一无二的，并且可能受到疾病模型特有的生物因素和行为变化的影响，因此研究人员可以在自己手中尝试这些和其他措施。
- 选项 I：记录第一个进入腔室 2 的延迟。选项 II：记录跨过 2 号腔室一半以上的延迟。选项三：记录2号室中的总停留时间。选项 IV：记录到达 3 号舱室（逃生）的延迟。选项五：与选项二类似，记录2分钟内每个腔室的总停留时间，并将其转换为比例。
- 测试完成后，将小鼠放回其家笼，用70%乙醇清洁MCA室，并使其完全干燥。
注意：在乙醇/消毒剂之前，通常可以用纸巾相对容易地从腔室中清洁粪便boli。如果需要更彻底的清洁，可以拆卸腔室2和室3并将其浸入温肥皂水中。 - 在将探针高度设置为零的队列中运行所有小鼠后，在机械探针底板下方插入一片3mm丙烯酸片，并以2mm的探针高度重复步骤2.4.2至2.4.7。
- 在将探针高度设置为2 mm的所有小鼠运行后，在探针底板下方插入第二片3 mm丙烯酸片，并以5 mm的探针高度重复步骤2.4.2至2.4.7。
注意：使用这种方法可以在大约2小时内测试一组8只小鼠。如果需要更精确的用药后时间（例如，对于药物时间过程实验），请使用较小的组大小。 - 在测试会话结束时使用消毒剂进行最终清洁。
- 诱导疼痛超敏反应和/或药物治疗后重复检测。
- 将每只小鼠在基线时的表现与诱导疼痛后的表现进行比较。通过在同一时间点比较载体治疗动物和药物治疗动物来评估药物干预的影响。
- 如果动物在没有满足所需结果测量值的情况下达到2分钟的截止时间，则执行非参数统计分析（例如，曼·惠特尼U检验），从而导致非连续数据。
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Representative Results
MCA测定已成功用于几种机制不同的小鼠疼痛模型。 图2 显示了所选结果测量值穿过腔室2中点的数据（图2A）。使用中途点与逃逸到3室获得的数据非常相似，在5 mm探针高度为13的神经性疼痛的幸免于神经损伤（SNI）模型中，中途逃逸为〜40 s，而腔室3逃逸为〜45 s。
在CFA诱导的炎症性疼痛模型中，对照后爪（跖内）注射盐水不会改变逃逸潜伏期与基线相比。那些在一只后爪中注射CFA的小鼠在注射后4天显示出逃逸潜伏期的显着增加，但只有当探针高度提高到5毫米时。至关重要的是，在测试开始前90分钟接受NSAID卡洛芬（10mg / kg，ip）的小鼠中，看不到这种增加的延迟以5mm逸出（图2B）。
创伤性神经性疼痛的幸免于神经损伤 （SNI） 模型也与探针高度设置为 5 mm 时逃逸潜伏期与基线相比显著增加有关。这种效应在SNI小鼠中可见，但不是他们的假手术对照。通过在测试前90分钟全身施用阿片类镇痛药丁丙诺啡（25μg/ kg，ip）来防止这种增加的逃逸潜伏期（图2C）。在神经损伤前未进行基线一轮MCA测试的小鼠中也观察到逃逸潜伏期增加（图2D）。在这种情况下，在测试前90分钟施用加巴喷丁（30mg / kg，ip）可以防止5mm处SNI小鼠中增加的逃逸潜伏期。总的来说，这表明MCA可以在两种广泛使用的炎症和神经性疼痛模型中检测刺激厌恶和回避的疼痛相关变化。
在慢性疼痛病症复杂区域疼痛综合征（CRPS）的骨折/铸造模型中进一步测试MCA，该模型由闭合性右胫骨远端骨折后3周铸造14建立。该临床依据模型表现为急性期外周炎症，以及伴有持续性后肢异常的中枢神经系统的长期免疫活动。与CFA和SNI模型类似，在断裂/铸造模型中观察到逃逸延迟增加（图3A）。在损伤之前，从腔室1逸出的潜伏期与探针高度成比例地增加。受伤后，逃逸潜伏期在0 mm时保持不变，但与基线相比，雄性在2 mm和5 mm探针高度以及雌性5 mm探针高度处显着增加（图3B）。
（A）MCA测定中的潜在结局测量（用表盘图标标记）：退出腔室1（I）的延迟，穿过腔室2的50%以上的延迟（虚线;II），在2室中花费的总时间（III），到达逃生室的延迟（IV）或在每个腔室中花费的时间百分比（V）。平均经历疼痛的动物对I，II和IV的值更大，III的值降低。III值的降低必然会增加在1室和/或室3中花费的时间比例，这将由结果措施 Biorender.com V捕获。（B） 显示 MCA 设备（以及编号为 1、2 和 3 的腔室）在 LED 熄灭的情况下（左上角）、LED 打开（左下角）的图像。（C） 从上方打开门后看到的房间。请点击此处查看此图的大图。
图 2：炎症和神经性疼痛在 MCA 测定中增加了避免性。 （A） 此处使用的具体结果度量的描述：穿过腔室 2 中点的潜伏期。（B）当探针高度设置为5 mm时，与盐水对照（黑眼圈）相比，植物内注射CFA显着增加了逃逸潜伏期（红色方块）。腹腔内卡洛芬（10mg / kg）减弱CFA诱导的逃逸潜伏期增加（蓝色三角形）。数据被绘制为平均转义延迟±平均值的标准误差（SEM）;n = 7个男性/组。（C）当探头高度设置为5 mm（红色方块）时，与假手术对照组（黑圈）相比，幸免于神经损伤（SNI）手术显着增加了1室逃逸潜伏期。腹腔内丁丙诺啡（25 mg / kg）显着减弱了这种逃逸潜伏期的增加（蓝色三角形）。数据被绘制为SEM±的平均逃逸延迟;n = 每组6-7名男性。（D）SNI诱导的逃逸潜伏期增加通过使用镇痛药加巴喷丁（绿色三角形）逆转。数据被绘制为SEM±的平均逃逸延迟;n = 8 个男性/组。## = p < 0.01， ***/### = p < .001，用于指示的比较（双向方差分析，Bonferroni 事后）。此数字已从13 修改。 请点击此处查看此图的大图。
图 3：胫骨骨折/石膏诱导的慢性疼痛增强了 MCA 测定中的避免。 与基线 （BL） 相比，在 2 mm 和 5 mm 探针高度的男性以及 5 mm 探针高度（n = 5/性别）的雌性中，骨折/铸造显著增加了损伤后 3 周 （W3） 的逃逸潜伏期。来自每只小鼠的数据以褪色的黑色（雄性）或卡宴（雌性）表示，平均值由黑线表示。**/*** = p < 0.01/< 0.001 与双向方差分析的性别和探针高度匹配基线值（Tukey post-hoc） 请点击此处查看此图的大图。
补充文件1：3D打印机文件SpikeBed-MCA。 当印刷在适当的生物相容性和可洗涤的材料（如尼龙12）中时，SpikeBed-MCA.stl产生触觉探针的平台，该探针通过2室的地板突出。 请点击此处下载此文件。
补充文件2：3D打印机文件MCA_baseplate。 当印刷在适当的生物相容性和可洗涤的材料（如尼龙12）中时，MCA_baseplate.stl产生腔室2的地板，触觉探头通过该地板突出。 请点击此处下载此文件。
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Discussion
与所有行为测试一样，正确处理，随机化和对动物治疗的盲法至关重要。鉴于复杂行为和决策的多因素输入，必须尽可能一致地处理，习惯和测试动物，同时最大限度地减少痛苦。还应注意重现鼠标放置在腔室1中，打开LED灯并消除障碍物的时间，因为此处的差异可能会影响后续行为。
应该注意的是， 图1A 中描述的不同结局指标是相互关联的。例如，进入腔室2的小鼠通常穿过腔室2的中点，然后几乎总是完成逃逸进入室3。这意味着结果指标I、II和IV是相互关联的。结局指标III和V分别测量2室的总停留时间，以及所有3个腔室中停留时间的比例。因此，这些措施彼此密切相关。然而，从理论上讲，小鼠可以在2室中累积大量的停留时间，无论中途交叉或逃逸到室3是否具有低延迟，高延迟，或者根本没有发生。
已经报道了这种方法的几种变体或修改。除了此处列出的不同结局指标（图1）外，研究人员还可以改变探针高度的进展，以突出敏感性的差异。由于与中间2mm探针高度没有统计学上的显着差异，因此仅在0 mm和5 mm处运行小鼠可能更有效。或者，探头高度在2至5 mm之间，或在5 mm探头高度下重复运行，可能会开始掩盖在其他方面并不明显的差异。此外，对每个腔室中停留时间的评估可以用作动机和活动的读数。这在一些小鼠快速通过腔室3但随后返回室1以进一步探索的情况下非常有用。在这些情况下，仅进入第3室的延迟不会捕捉到这种微妙之处。对于一些研究人员来说，将测试截止时间提高到此处设置的2分钟限制之外也可能是值得的。最后，我们不能排除对相同动物的重复测试（超过此处描述的三次）或更频繁的测试（测试之间少于4-7天）可能会引入习惯性或学习效果的可能性。出于这些原因，鼓励在每个时间点纳入幼稚、未经操纵的对照组。最终，行为变化很可能是特定于疼痛模型的，并且需要在这些和其他疼痛模型中进一步研究。
这里使用的疼痛诱导模型（CFA，SNI，骨折/石膏固定）通常与其他疼痛行为测试中的超敏反应相关，这与回避/逃逸潜伏期的增加相对应。MCA测定也可能能够检测感觉敏锐度的丧失（例如，通过在 2室中花费的时间增加），尽管这尚未经过正式测试。MCA有一些值得考虑的限制。厌恶强光是促使进入2号会议厅的关键手段，因此也是随后冲突的驱动因素。在采用该测试之前，应仔细考虑与特定小鼠模型相关的任何可能改变对强光的厌恶（例如，视力障碍）的病理特征。焦虑对逃避潜伏期的贡献也尚未经过系统测试，尽管据报道慢性炎症和神经性疼痛模型在其他测试中显示出小鼠焦虑样行为的迹象，但关于这一点仍然存在争议15，16。也就是说，目前无法确认或排除疼痛相关焦虑对这些行为结果的贡献。由于MCA对结果指标有多种投入，因此需要考虑更多潜在的混淆。
总之，MCA测试提供了小鼠模型中疼痛敏感性的非反射读数。结局指标受反射敏感性以外的因素影响，并提供疼痛敏感性和情感/动机状态的综合衡量标准。运行每个测试所需的时间，以及所需的技能水平和专业设备与其他非反射性疼痛措施（例如步态分析或条件位置偏好）相比是有利的5，13。虽然仍然有些新颖，但这种方法已被多个研究小组采用并独立验证，主要是在大鼠中。部分坐骨神经结扎增加了大鼠17 的退出潜伏期和吗啡依赖性戒断7。另一项针对大鼠的研究提出，使用大鼠的脊髓损伤和慢性收缩损伤模型来计算交叉的次数，可以作为有用的结果测量8。至关重要的是，这项研究还确定了假手术对照中探针回避的增加，表明在假/车辆对照组旁边包括一个幼稚的群体是必要的。MCA的未来应用可以集中在小鼠菌株和/或疼痛模型之间的差异，焦虑对测定性能的影响，以及姿势分析或步态运动学的整合，以更好地了解对有害刺激的行为适应差异。
临床前小鼠研究与新型疗法开发之间的转化差距继续引起关注。考虑到这一点，MCA测定补充了疼痛研究的现有工具，并有助于更全面地了解疼痛的许多感官和情感维度。
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Disclosures
作者没有相关的利益冲突需要披露。
Acknowledgments
GM由NDSEG研究生奖学金提供支持。VLT由NIH NIGMS赠款#GM137906和Rita Allen基金会提供支持。AJS 由国防部拨款 W81XWH-20-1-0277、W81XWH-21-1-0197 和 Rita Allen 基金会提供支持。我们感谢华盛顿大学医学院的Alexxai Kravitz博士为2室地板和探针板设计和免费提供3D打印机文件。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 32.8ft 3000K-6000K Tunable White LED Strip Lights, Dimmable Super Bright LED Tape Lights with 600 SMD 2835 LEDs | Lepro | SKU: 410087-DWW-US | For lighting chamber 1. https://www.lepro.com/32ft-dimmable-tunable-white-led-strip-lights.html |
| 3D printed 'spike bed' and 'chamber 2 floor' | Shapeways | N/A | Optional, for mechanical probes as an alternative to blunted map pins. |
| 70% ethanol | Various | N/A | To clean MCA between mice. |
| Acryl-Hinge 2 | TAP Plastics | N/A | for attaching chamber lids to rear walls. https://www.tapplastics.com/product/plastics/handles_hinges_latches/acryl_hinge_2/122 |
| Chemcast Cast Acrylic Sheet, Clear | TAP Plastics | N/A | 3mm thick. For front wall of chamber 1. https://www.tapplastics.com/product/plastics/cut_to_size_plastic/acrylic_sheets_cast_clear/510 |
| Chemcast Cast Transparent Colored Acrylic, Transparent Dark Red - 50% | TAP Plastics | N/A | 3mm thick. 50% light transmission. For walls and lids of chambers 2 and 3. https://www.tapplastics.com/product/plastics/cut_to_size_plastic/acrylic_sheets_transparent_colors/519 |
| Chemcast Translucent & Opaque Colored Cast Acrylic, Sign Opaque White - 0.1% | TAP Plastics | N/A | 3mm thick. For side walls and lid of chamber 1. https://www.tapplastics.com/product/plastics/cut_to_size_plastic/acrylic_sheets_color/341 |
| Disinfectant (e.g. Quatricide) | Pharmacal Research Laboratories, Inc. | 65020F | To disinfect MCA at the end of a testing session. |
| Dry-erase markers and board | Various | N/A | To add experimental info to the beginning of video footage. |
| Map pins | Various | N/A | Optional, for mechanical probes. Use sandpaper to blunt sharp points before use. Can be used in place of 3D-printed parts. |
| Paper towels | Various | N/A | To clean/disinfect MCA. |
| SCIGRIP Weld-On #3 Acrylic Cement | TAP Plastics | N/A | For assembling acrylic sheets into chambers and affixing hinges. https://www.tapplastics.com/product/repair_products/plastic_adhesives/weld_on_3_cement/131 |
| Stopwatch | Various | N/A | To record escape latencies/dwell times in real-time or from recorded video. |
| Timer | Various | N/A | To ensure LED turn-on, barrier removal and test completion are timed consistently. |
| Video camera | Various | HDRCX405 Handycam Camcorder | To record mouse behavior in the MCA device. Can be substituted with any consumer-grade video camera capable of 1080p resolution. |
| Tripod | Famall | N/A | Any tripod that can hold the camera at bench height for recording MCA footage is acceptable. |
References
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