Summary
Det mekaniske konflikt-undgåelsesassay bruges som en ikke-refleksiv aflæsning af smertefølsomhed hos mus, som kan bruges til bedre at forstå affektive-motiverende reaktioner i en række musesmertemodeller.
Abstract
Smerte består af både sensoriske (nociceptive) og affektive (ubehagelige) dimensioner. I prækliniske modeller er smerte traditionelt blevet vurderet ved hjælp af refleksive tests, der tillader slutninger vedrørende smertens nociceptive komponent, men giver lidt information om den affektive eller motiverende komponent i smerte. Udvikling af tests, der fanger disse komponenter af smerte, er derfor translationelt vigtige. Derfor er forskere nødt til at bruge ikke-refleksive adfærdsmæssige assays til at studere smerteopfattelse på dette niveau. Mekanisk konfliktundgåelse (MCA) er et etableret frivilligt ikke-refleksivt adfærdsassay til at studere motiverende reaktioner på en skadelig mekanisk stimulus i et 3-kammerparadigme. En ændring i en muss placeringspræference, når den står over for konkurrerende skadelige stimuli, bruges til at udlede den opfattede ubehagelighed ved stærkt lys versus taktil stimulering af poterne. Denne protokol skitserer en modificeret version af MCA-analysen, som smerteforskere kan bruge til at forstå affektive-motiverende reaktioner i en række musesmertermodeller. Selvom det ikke er specifikt beskrevet her, bruger vores eksempel MCA-data intraplantar complete Freunds adjuvans (CFA), sparet nerveskade (SNI) og en brud/ støbemodel som smertemodeller til at illustrere MCA-proceduren.
Introduction
Smerte er en kompleks oplevelse med sensoriske og affektive komponenter. En reduktion i tærsklen for smerteopfattelse og overfølsomhed over for termiske og / eller mekaniske stimuli er nøglefunktioner i denne oplevelse, som stimulus-fremkaldte smerteadfærdstest kan fange (som Hargreaves 'test af varmefølsomhed og von Frey-testen af mekanisk følsomhed)1,2. Selvom sådanne tests giver robuste og reproducerbare resultater, er de begrænset af deres afhængighed af refleksiv tilbagetrækning fra en opfattet skadelig stimulus. Dette har sat spørgsmålstegn ved en løbende afhængighed af smerteforskning på disse tests alene. Til det formål har smerteforskere i flere år undersøgt alternative / komplementære adfærdstest til brug i gnaversmertemodeller i et forsøg på at fange flere af de affektive og / eller motiverende komponenter i smerte. Disse ikke-fremkaldte, frivillige eller ikke-refleksive foranstaltninger (f.eks. Hjulløb, graveaktivitet, betinget stedpræference 3,4,5) implementeres i et forsøg på at forbedre oversætteligheden af præklinisk smerteforskning.
Det mekaniske konfliktundgåelsesassay (MCA) blev oprindeligt beskrevet af Harte et al. i 20166, bruges overvejende i rotter 7,8 og repræsenterer en ændring af en tidligere tilgang - stedet flugt-undgåelse paradigme. I denne tilgang udføres en skadelig stimulus af bagpoten i et ellers ønskeligt (mørkt) kammer for at drive dyrets målbevidste adfærd for at undslippe / undgå en sådan stimulering 9,10. I stedet for at stole på manuel skadelig stimulering af bagpoten af en observatør, tvinger MCA-analysen mus til at forhandle en potentielt skadelig stimulus for at undslippe et aversivt miljø og nå det mørke kammer. Konflikten / undgåelsen, der giver analysen sit navn, stammer fra disse to konkurrerende motivationer: undslippe stærkt oplyste områder og undgå skadelig stimulering af poterne. MCA-analysen deler også funktioner med betinget stedpræferencetest, hvor parring af smertelindring med miljømæssige signaler driver ændringer i adfærd, der afspejler en præference for den smertelindrende / givende kontekst11.
Grundlæggende set deler alle disse assays en lignende tilgang: Brug af et skift i et dyrs præference for et aversivt miljø frem for et andet som en indikator for deres affektive / motiverende tilstand. MCA-analysen er et 3-kammerparadigme bestående af et stærkt oplyst kammer efterfulgt af et mørkt mellemkammer med justerbare højdesonder og et mørkt tredje kammer uden aversive stimuli. En uskadt mus er typisk motiveret til at flygte til et mørkt kammer i betragtning af gnaveres medfødte modvilje mod stærkt lys12. I dette eksempel overvinder den naturlige motivation til at undslippe et stærkt oplyst miljø ulyst tilbøjeligheden til at støde på bagpotestimulering (de justerbare højdesonder), som udelukkende forekommer i det mørkede miljø. I modsætning hertil kan en mus, der oplever smerte (f.eks. På grund af betændelse eller neuropati) vælge at tilbringe mere tid i det stærkt oplyste miljø, da der er motivation til at undgå den ubehagelige taktile oplevelse af de mekaniske sonder i indstillingen af løbende taktil overfølsomhed.
I denne artikel beskrives en ændret version af MCA-analysen. Vi har tilpasset den oprindelige metode (som blev udført i rotter6) til brug i mus. Vi har også reduceret antallet af testede sondehøjder fra seks til tre (0, 2 og 5 mm over gulvhøjde) for at strømline dataindsamlingen. Denne tilgang er blevet testet på tværs af flere smertemodeller og valideret med kendte analgetika, hvilket indikerer, at smerteoverfølsomhed og / eller de tilhørende affektive og motiverende ændringer driver disse ændringer i adfærd. Denne tilgang er relativt hurtig at gennemføre og tilpasningsdygtig sammenlignet med andre ikke-refleksive foranstaltninger, som kan tage mange dages tilvænning og træning 1,2. I samspil med andre målinger af smerte kan MCA generere værdifuld indsigt i de affektive og motiverende aspekter af smerte.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle forsøg, der involverede brug af mus og de procedurer, der blev fulgt deri, blev godkendt af Institutional Animal Care and Use Committees of MD Anderson Cancer Center og Stanford University i nøje overensstemmelse med National Institutes of Health's Guide for the Care and Use of Laboratory Animals.
1. MCA-konstruktion
- Byg kammer 1 med følgende dimensioner: 125 mm x 125 mm x 125 mm (bredde x dybde x højde) fra uigennemsigtig hvid 3 mm tyk akryl, der anvendes til sidevægge, gulv, loft. Brug en klar 3 mm tyk akryl til den frontvendte væg. Lim alle sider sammen i god tid ved hjælp af dedikeret akrylklæbemiddel.
FORSIGTIG: Akrylklæbemiddel betragtes som farligt materiale (brandfarligt, dampskadeligt, kan være skadeligt ved indtagelse, kan irritere hud eller øjne). Sådanne klæbemidler bør kun anvendes i overensstemmelse med producentens anvisninger (dvs. med passende PV i et godt ventileret område). - Fastgør låget på kammer 1 med et hængsel, så mus let kan placeres i og hentes fra kammeret. Fastgør selvklæbende lysdiodetape (LED) på lågets indre overflade for at give belysning på ~ 4800 lux.
- Luk kammer 1 fra resten af MCA'en ved at skubbe et uigennemsigtigt akrylark ind og ud af position.
- Byg MCA-testkammeret, kammer 2, som et 270 mm langt uoplyst kammer fremstillet af gennemsigtig mørkerød akryl (3 mm tykt) på alle sider med et hængslet låg på toppen. Placer et 13 x 31 gitter med 2 mm huller på gulvet i kammer 2, hvorigennem en række stumpe sonder med spidser med en diameter på 0,5 mm (f.eks. Afstumpede kortstifter) kan stikke ud.
BEMÆRK: Stumpe stifter med en sandpapirblok på 120 grus eller lignende. Rengør dem i varmt vand med vaskemiddel, inden de desinficeres med sporicide desinfektionsmidler. - Juster sondernes højde ved at placere yderligere akrylplader under sondens byggeplade (figur 1). Brug denne fremgangsmåde til at konfigurere enheden med tre indstillinger: 0 mm, 2 mm og 5 mm sondehøjde.
- Som et alternativ til afstumpede kortstifter eller lignende materialer skal du bruge 3D-printerfilerne til at udskrive gulvet i kammer 2 og sondepladen (se Supplerende fil 1: SpikeBed-MCA.stl, der henviser til de mekaniske sonder, og supplerende fil 2: MCA_baseplate.stl, der danner gulvet i kammer 2).
BEMÆRK: Hvis 3D-udskrivning ikke er tilgængelig, limes kortstifter til et akrylark ved hjælp af det samme akrylklæbemiddel, der bruges til at konstruere enhedens vægge. - Udskriv med et vaskbart og biokompatibelt materiale, f.eks. nylon 12-plast eller lignende (anbefales).
- Konstruer kammer 3 med følgende dimensioner: 125 mm x 125 mm x 125 mm som en uoplyst gennemsigtig mørkerød akrylkasse (på alle sider), placeret i den modsatte ende af kammer 1. Placer et hængslet låg på kammeret, svarende til kammer 1 og 2. Dette kammer fungerer som et mørkt flugtområde fra de mekaniske sonder i kammer 2.
2. Mus MCA tilvænning og test
- Som med alle eksperimenter, der involverer adfærdsmæssige resultater hos dyr, skal du observere passende randomisering og blinding hele vejen igennem for at minimere potentiel bias.
BEMÆRK: De repræsentative resultater blev genereret ved at bruge 8-12 uger gamle mandlige og kvindelige C57BL / 6J mus (Jackson Laboratories stamme nummer 000664). Mus blev socialt anbragt, op til 5 pr. Bur, med adgang til mad og vand ad libitum og en 07:00 h til 19:00 timers lyscyklus. MCA fandt sted i den lyse periode mellem 09:00 og 12:00. - En dag før baseline-test er planlagt, akklimatisere mus til MCA-enheden i 5 minutter (minimum) til 15 minutter (maksimum) med deres burkammerater for at lette social udforskning af hele enheden.
- Under hele processen skal du sikre dig, at lysdioderne i kammer 1 er slukket, barrieren mellem kammer 1 og 2 efterlades åben, og sonderne er indstillet til en højde på nul (dvs. ikke stikker ud gennem gulvet i kammer 2).
- Udfør en baseline-test af mus (valgfrit), hvis undersøgelsen omfatter negative kontroldyr (dvs. sham-kirurgi eller kontrol af køretøjsinjektion). Hvis det ønskes, skal du bruge en baseline-test til at udelukke eventuelle uskadte afvigende værdier, der aldrig krydser ind i kammer 2, selvom dette ikke har vist sig nødvendigt. Hvis det anvendes, skal du indberette alle udelukkelseskriterier og antallet af udelukkede mus.
- Før du begynder at teste, skal du konfigurere et videokamera, der er i stand til at optage 1080p-optagelser på et stativ med en sidevendt visning af hele MCA-enheden. Juster synsfeltet, så MCA'en udfylder det optagede billede.
- Når optagelsen begynder, skal du holde et håndholdt tørsletningskort i kameraets synsfelt for at mærke starten af videoen med identificerende oplysninger om dyrets testkørsel (f.eks. muse-id, sondehøjde, dato, klokkeslæt osv.).
- For det første løb skal du indstille sondehøjden til nul. Overfør musen, der skal testes, fra sit hjemmebur til kammer 1 med barrieredøren på plads. Start en timer, der er synlig i de optagede optagelser.
BEMÆRK: Timeren sikrer, at intervallerne mellem de forskellige dele af testen er konsistente mellem kørslerne. - Efter 10 s skal du tænde for kammer 1-lysdioderne. Når musen har været i det oplyste kammer i 20 s, skal du trække barrieren mellem kamre 1 og 2 tilbage.
- Overhold dyret i 2 min. Mål ventetider og/eller opholdstider med et stopur, mens testen er i gang. Alternativt kan videooptagelserne analyseres, når testen er afsluttet.
BEMÆRK: Af hensyn til gennemstrømning og undgåelse af langvarig eksponering for aversive stimuli blev afskæringen sat til 2 minutter. - Måle et eller flere af de mange nyttige resultater, der er blevet identificeret (se nedenfor; Figur 1). Anbefales at analysere alle 5 resultatmål, når man begynder at teste, for at fastslå, hvilke aspekter af adfærd der adskiller sig i en given eksperimentel opsætning.
- Mulighed I: Registrer ventetiden til den første indgang til kammer 2. Mulighed II: Registrer ventetiden for at krydse mere end halvvejs over kammer 2. Mulighed III: Registrer den samlede opholdstid i kammer 2. Mulighed IV: Registrer latenstiden for at nå kammer 3 (flugt). Mulighed V: I lighed med mulighed II skal du registrere den samlede opholdstid i hvert kammer inden for 2 minutter og konvertere dem til proportioner.
BEMÆRK: Da hvert eksperiment er unikt og kan påvirkes af biologiske faktorer og adfærdsændringer, der er unikke for sygdomsmodellen, kan efterforskere eksperimentere med disse og andre foranstaltninger i egne hænder.
- Mulighed I: Registrer ventetiden til den første indgang til kammer 2. Mulighed II: Registrer ventetiden for at krydse mere end halvvejs over kammer 2. Mulighed III: Registrer den samlede opholdstid i kammer 2. Mulighed IV: Registrer latenstiden for at nå kammer 3 (flugt). Mulighed V: I lighed med mulighed II skal du registrere den samlede opholdstid i hvert kammer inden for 2 minutter og konvertere dem til proportioner.
- Når testen er afsluttet, skal du returnere musen til sit hjemmebur, rengøre MCA-kamrene med 70% ethanol og lade den tørre helt.
BEMÆRK: Fækal boli kan normalt rengøres fra kammeret relativt let med papirhåndklæder før ethanol / desinfektionsmiddel. Hvis mere grundig rengøring bliver nødvendig, kan kammer 2 og 3 adskilles og nedsænkes i varmt sæbevand. - Når du har kørt alle mus i en kohorte med sondehøjden indstillet til nul, skal du indsætte et 3 mm ark akryl under den mekaniske sondebundplade og gentage trin 2.4.2 til 2.4.7 med en sondehøjde på 2 mm.
- Når du har kørt alle mus med sondehøjden indstillet til 2 mm, skal du indsætte et andet 3 mm ark akryl under sondens bundplade og gentage trin 2.4.2 til 2.4.7 med en sondehøjde på 5 mm.
BEMÆRK: En gruppe på 8 mus kan testes på ca. 2 timer ved hjælp af denne fremgangsmåde. Brug mindre gruppestørrelser, hvis der kræves mere præcis timing efter lægemidlet (f.eks. Til et lægemiddeltidskursuseksperiment). - Udfør en slutrengøring med et desinfektionsmiddel i slutningen af en testsession.
- Gentag testen efter at have fremkaldt smerteoverfølsomhed og/eller med lægemiddelbehandling.
- Sammenlign hver muss ydeevne ved baseline med deres ydeevne, efter at smerten er induceret. Vurder virkningen af en farmakologisk intervention ved at sammenligne køretøjsbehandlede dyr med lægemiddelbehandlede dyr på samme tidspunkt.
- Udfør ikke-parametrisk statistisk analyse (f.eks. Mann Whitney U-testen), hvis dyrene når 2 minutters afskæring uden at opfylde det ønskede resultatmål, hvilket resulterer i ikke-kontinuerlige data.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
MCA-assayet er blevet brugt med succes med flere mekanisk forskellige musesmertemodeller. Figur 2 viser data, hvor det valgte resultatmål krydsede midtpunktet i kammer 2 (figur 2A). De data, der opnås ved at bruge halvvejspunktet versus flugt ind i kammer 3, er meget ens, ~ 40 s for halvvejs versus ~ 45 s for kammer 3 flugt i den sparede nerveskade (SNI) model af neuropatisk smerte med 5 mm sondehøjde13.
I CFA-induceret inflammatorisk smertemodel ændrer kontrol bagpote (intraplantar) injektion af saltvand ikke flugt latenstid versus baseline. De mus, der blev injiceret med CFA i den ene bagpote, viste en signifikant stigning i flugtventetid 4 dage efter injektionen, men kun når sondehøjden blev hævet til 5 mm. Det afgørende var, at denne øgede latenstid for at undslippe ved 5 mm ikke blev set hos mus, der modtog NSAID-carprofen (10 mg / kg, i.p.) 90 minutter før testens begyndelse (figur 2B).
Den sparede nerveskade (SNI) model af traumatisk neuropatisk smerte, er også forbundet med en signifikant stigning i latenstiden for at undslippe versus baseline, når sondehøjden blev indstillet til 5 mm. Denne effekt blev set hos SNI-mus, men ikke deres falske kirurgiske kontroller. Denne øgede flugt latenstid blev også forhindret ved systemisk administration af det opioide smertestillende middel buprenorphin (25 μg/kg, i.p.) 90 min før testning (figur 2C). Øget flugt latenstid blev også observeret hos mus, der ikke gennemgik en baseline runde af MCA-test før nerveskade (figur 2D). I dette tilfælde blev den øgede flugt latenstid hos SNI-mus ved 5 mm forhindret af gabapentin (30 mg/kg, i.p.) administreret 90 minutter før testning. Samlet set tyder dette på, at MCA kan detektere smerterelaterede ændringer i stimulusaversion og undgåelse i to almindeligt anvendte modeller af inflammatorisk og neuropatisk smerte.
MCA blev yderligere testet i fraktur/støbemodellen af kronisk smertetilstand kompleks regionalt smertesyndrom (CRPS), som er etableret ved en lukket højre distal tibia fraktur efterfulgt af 3 ugers støbning14. Denne klinisk informerede model udviser akut fase perifer inflammation, såvel som langvarig immunaktivitet i centralnervesystemet med vedvarende bagben allodyni. I lighed med CFA- og SNI-modellerne blev der observeret øgede flugtventencer i brud/støbemodellen (figur 3A). Før skaden steg latenstiden for at undslippe fra kammer 1 proportionalt med sondehøjden. Efter skaden forblev flugtventestiden uændret ved 0 mm, men steg signifikant ved 2 mm og 5 mm sondehøjde for mænd og 5 mm sondehøjde for kvinder sammenlignet med baseline (figur 3B).
Figur 1: Skematisk og billeder af MCA-enheden. (A) Potentielle resultatmål i MCA-analysen (markeret med urskiveikoner): latenstid for at forlade kammer 1 (I), latenstid for at krydse mere end 50% af kammer 2 (prikket linje; II), den samlede tid brugt i kammer 2 (III), latenstid for at nå flugtkammeret (IV) eller procentvis tid brugt i hvert kammer (V). Dyr, der oplever smerte i gennemsnit, viser større værdier for I, II og IV og reducerede værdier for III. En reduceret værdi for III øger nødvendigvis den andel af tiden, der bruges i kammer 1 og/eller kammer 3, som ville blive fanget af resultatmål V. Oprettet med Biorender.com. (B) Billeder, der illustrerer MCA-enheden (og kamre nummereret 1, 2 og 3) med led'erne slukket (øverst til venstre), LED'erne tændt (nederst til venstre). (C) Udsigt over kamrene ovenfra med dørene åbne. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Inflammatorisk og neuropatisk smerteforstærker undgåelse i MCA-analysen. (A) Skildring af det specifikke resultatmål, der anvendes her: latenstid for at krydse kammeret 2 midtpunkt. (B) Intraplantar injektion af CFA øgede signifikant latenstiden for at undslippe (røde firkanter) i forhold til saltvandskontroller (sorte cirkler), når sondehøjden blev indstillet til 5 mm. Intraperitoneal carprofen (10 mg/kg) dæmpede den CFA-inducerede stigning i flugt latenstid (blå trekanter). Data afbildes som gennemsnitlig flugt latenstid ± standardfejl i gennemsnittet (SEM); n = 7 mænd/gruppe. (C) Skånet nerveskade (SNI) kirurgi signifikant øget kammer 1 flugt latenstid versus sham kirurgi kontroller (sorte cirkler), når sondehøjden blev indstillet til 5 mm (røde firkanter). Intraperitoneal buprenorphin (25 mg/kg) dæmpede signifikant denne stigning i flugtventenstid (blå trekanter). Data afbildes som gennemsnitlig flugt latenstid ± SEM; n = 6-7 mænd pr. Gruppe. (D) SNI-induceret stigning i flugt latenstid blev vendt ved brug af det smertestillende gabapentin (grønne trekanter). Data afbildes som gennemsnitlig flugt latenstid ± SEM; n = 8 mænd/gruppe. ## = p < 0,01, ***/### = p < ,001, for de angivne sammenligninger (tovejs ANOVA, Bonferroni post-hoc). Dette tal er ændret fra13. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Tibial fraktur/ støbning induceret kronisk smerte øge undgåelse i MCA-assayet. Fraktur/støbning øgede signifikant flugtventetid 3 uger efter skaden (W3) i forhold til baseline (BL) hos mænd i 2 mm og 5 mm sondehøjder og hos hunner i 5 mm sondehøjde (n = 5 / køn). Data fra hver mus er afbildet i falmet sort (hanner) eller cayenne (hunner) med middelværdi repræsenteret af mørke linjer. **/*** = p < 0,01/< 0,001 versus køns- og sondehøjdematchet baselineværdi med tovejs ANOVA, Tukey post-hoc. Klik her for at se en større version af denne figur.
Supplerende fil 1: 3D-printerfil SpikeBed-MCA. Når SpikeBed-MCA.stl er trykt i et passende biokompatibelt og vaskbart materiale, såsom nylon 12, producerer SpikeBed-MCA.stl platformen af taktile sonder, der stikker ud gennem gulvet i kammer 2. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende fil 2: 3D-printerfil MCA_baseplate. Når det er trykt i et passende biokompatibelt og vaskbart materiale, såsom nylon 12, producerer MCA_baseplate.stl gulvet i kammer 2, hvorigennem de taktile sonder stikker ud. Klik her for at downloade denne fil.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Som med alle adfærdsmæssige tests er korrekt håndtering, randomisering og blinding for behandling af dyr afgørende hele vejen igennem. I betragtning af de multifaktorielle input til kompleks adfærd og beslutningstagning er det bydende nødvendigt, at dyr håndteres, vænnes og testes så konsekvent som muligt, samtidig med at nød minimeres. Der skal også sørges for at gengive tidspunktet for museplacering i kammer 1, tænde LED-lysene og fjerne barrieren, da forskelle her kan påvirke efterfølgende adfærd.
Det skal bemærkes, at de forskellige resultatmål, der er afbildet i figur 1A , er indbyrdes forbundne. For eksempel krydser en mus, der kommer ind i kammer 2, normalt halvvejspunktet i kammer 2 og fuldender derefter næsten altid flugt ind i kammer 3. Det betyder, at resultatmål I, II og IV er indbyrdes forbundne. Resultatmål III og V måler henholdsvis den samlede opholdstid i kammer 2 og andelen af opholdstid i alle 3 kamre. Derfor er disse foranstaltninger tæt forbundet med hinanden. En mus kan dog teoretisk optjene betydelig opholdstid i kammer 2, uanset om halvvejskrydsningen eller flugten ind i kammer 3 havde en lav latenstid, høj latenstid eller slet ikke forekom.
Flere variationer eller modifikationer af denne metode er blevet rapporteret. Ud over de forskellige resultatmål, der er anført her (figur 1), kunne efterforskerne variere progressionen af sondehøjde i et forsøg på at fremhæve forskelle i følsomhed. Da der ikke var statistisk signifikante forskelle med den mellemliggende 2 mm sondehøjde, kan det være mere effektivt kun at køre mus ved 0 mm og 5 mm. Alternativt kan en sondehøjde mellem 2 og 5 mm eller gentagne kørsler i en 5 mm sondehøjde begynde at afsløre forskelle, der ellers ikke var synlige. Derudover kan evaluering af opholdstid i hvert kammer bruges som en aflæsning af motivation og aktivitet. Dette kan være nyttigt i tilfælde, hvor nogle mus løber hurtigt igennem til kammer 3, men derefter vender tilbage til kammer 1 for yderligere at udforske. I disse situationer ville latenstid til indtræden i kammer 3 alene ikke fange denne subtilitet. At hæve testskæringstiden ud over den grænse på 2 minutter, der er fastsat her, kan også vise sig at være umagen værd for nogle efterforskere. Endelig kan vi ikke udelukke muligheden for, at gentagne forsøg med de samme dyr (mere end de tre gange, der er beskrevet her) eller test med større hyppighed (mindre end 4-7 dage mellem testene) kan medføre tilvænnings- eller læringseffekter. Af disse grunde tilskyndes der til at inkludere naive, umanipulerede kontrolgrupper på hvert tidspunkt. I sidste ende er variationer i adfærd meget tilbøjelige til at være smertemodelspecifikke og berettige yderligere undersøgelse i disse og andre smertemodeller.
De smertefremkaldende modeller, der anvendes her (CFA, SNI, brud / støbning), er typisk forbundet med overfølsomhed i andre smerteadfærdstest, hvilket svarer til en stigning i undgåelse / flugt latenstid. MCA-analysen kan også være i stand til at detektere et tab af sensorisk skarphed (via øget tid brugt i kammer 2, for eksempel), selvom dette ikke er blevet formelt testet. MCA har nogle begrænsninger, der berettiger til overvejelse. Modvilje mod stærkt lys er et centralt middel til at motivere til adgang til kammer 2 og derfor en drivkraft for efterfølgende konflikt. Ethvert patologisk træk forbundet med en bestemt musemodel, der kan ændre modviljen mod stærkt lys (f.eks. Synshandicap), bør overvejes nøje, inden denne test anvendes. Angstens bidrag til at undslippe latenstid er heller ikke blevet systematisk testet, selvom kroniske inflammatoriske og neuropatiske smertemodeller er blevet rapporteret at vise tegn på angstlignende adfærd hos mus i andre tests, er der fortsat en debat om dette15,16. Når det er sagt, kan et bidrag af smerterelateret angst til disse adfærdsmæssige resultater ikke bekræftes eller udelukkes på nuværende tidspunkt. Da MCA har flere input til resultatmålingerne, kommer dette med flere potentielle forvirringer at overveje.
Sammenfattende giver MCA-testen en ikke-refleksiv aflæsning af smertefølsomhed i musemodeller. Resultatmålingerne påvirkes af andre faktorer end refleksiv følsomhed og giver et sammensat mål for smertefølsomhed og affektiv /motiverende tilstand. Den tid, der er nødvendig for at køre hver test, og niveauet af færdigheder og specialudstyr, der kræves, sammenlignes positivt med andre ikke-refleksive smertemål, såsom ganganalyse eller konditioneret stedpræference 5,13. Selvom det stadig er noget nyt, er tilgangen blevet vedtaget og uafhængigt verificeret af flere hold af efterforskere, overvejende hos rotter. Delvis iskiasnerveligation øgede udgangs latenstid17 og morfinafhængig tilbagetrækning hos rotter7. En anden undersøgelse af rotter foreslog, at optælling af antallet af krydsninger ved hjælp af rygmarvsskade og kroniske indsnævringsskademodeller hos rotter kan tjene som et nyttigt resultatmål8. Det afgørende er, at denne undersøgelse også identificerede en stigning i sondeundgåelse i falske kirurgiske kontroller, hvilket indikerer, at inkludering af en naiv gruppe sammen med sham / køretøjskontrol er berettiget. Fremtidige anvendelser af MCA kunne fokusere på variationen mellem musestammer og / eller smertemodeller, angstens indvirkning på assayydelsen og integration af kropsholdningsanalyse eller gangkinematik for bedre at forstå forskelle i adfærdsmæssige tilpasninger til skadelige stimuli.
Den translationelle kløft mellem prækliniske musestudier og udviklingen af nye lægemidler giver fortsat anledning til bekymring. Med dette i tankerne supplerer MCA-analysen eksisterende værktøjer inden for smerteforskning og hjælper med at give et mere komplet billede af de mange sensoriske og affektive dimensioner af smerte.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen relevante interessekonflikter at oplyse.
Acknowledgments
GM støttes af et NDSEG Graduate Fellowship. VLT er støttet af NIH NIGMS grant #GM137906 og Rita Allen Foundation. AJS er støttet af Forsvarsministeriets bevillinger W81XWH-20-1-0277, W81XWH-21-1-0197 og Rita Allen Foundation. Vi er taknemmelige for Dr. Alexxai Kravitz ved Washington University School of Medicine for at designe og gøre 3D-printerfilerne til kammeret 2 etage og sondeplade frit tilgængelige.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 32.8ft 3000K-6000K Tunable White LED Strip Lights, Dimmable Super Bright LED Tape Lights with 600 SMD 2835 LEDs | Lepro | SKU: 410087-DWW-US | For lighting chamber 1. https://www.lepro.com/32ft-dimmable-tunable-white-led-strip-lights.html |
| 3D printed 'spike bed' and 'chamber 2 floor' | Shapeways | N/A | Optional, for mechanical probes as an alternative to blunted map pins. |
| 70% ethanol | Various | N/A | To clean MCA between mice. |
| Acryl-Hinge 2 | TAP Plastics | N/A | for attaching chamber lids to rear walls. https://www.tapplastics.com/product/plastics/handles_hinges_latches/acryl_hinge_2/122 |
| Chemcast Cast Acrylic Sheet, Clear | TAP Plastics | N/A | 3mm thick. For front wall of chamber 1. https://www.tapplastics.com/product/plastics/cut_to_size_plastic/acrylic_sheets_cast_clear/510 |
| Chemcast Cast Transparent Colored Acrylic, Transparent Dark Red - 50% | TAP Plastics | N/A | 3mm thick. 50% light transmission. For walls and lids of chambers 2 and 3. https://www.tapplastics.com/product/plastics/cut_to_size_plastic/acrylic_sheets_transparent_colors/519 |
| Chemcast Translucent & Opaque Colored Cast Acrylic, Sign Opaque White - 0.1% | TAP Plastics | N/A | 3mm thick. For side walls and lid of chamber 1. https://www.tapplastics.com/product/plastics/cut_to_size_plastic/acrylic_sheets_color/341 |
| Disinfectant (e.g. Quatricide) | Pharmacal Research Laboratories, Inc. | 65020F | To disinfect MCA at the end of a testing session. |
| Dry-erase markers and board | Various | N/A | To add experimental info to the beginning of video footage. |
| Map pins | Various | N/A | Optional, for mechanical probes. Use sandpaper to blunt sharp points before use. Can be used in place of 3D-printed parts. |
| Paper towels | Various | N/A | To clean/disinfect MCA. |
| SCIGRIP Weld-On #3 Acrylic Cement | TAP Plastics | N/A | For assembling acrylic sheets into chambers and affixing hinges. https://www.tapplastics.com/product/repair_products/plastic_adhesives/weld_on_3_cement/131 |
| Stopwatch | Various | N/A | To record escape latencies/dwell times in real-time or from recorded video. |
| Timer | Various | N/A | To ensure LED turn-on, barrier removal and test completion are timed consistently. |
| Video camera | Various | HDRCX405 Handycam Camcorder | To record mouse behavior in the MCA device. Can be substituted with any consumer-grade video camera capable of 1080p resolution. |
| Tripod | Famall | N/A | Any tripod that can hold the camera at bench height for recording MCA footage is acceptable. |
References
- Hargreaves, K., Dubner, R., Brown, F., Flores, C., Joris, J. A new and sensitive method for measuring thermal nociception in cutaneous hyperalgesia. Pain. 32 (1), 77-88 (1988).
- Chaplan, S. R., Bach, F. W., Pogrel, J. W., Chung, J. M., Yaksh, T. L. Quantitative assessment of tactile allodynia in the rat paw. Journal of Neuroscience Methods. 53 (1), 55-63 (1994).
- Sheahan, T. D., et al. Inflammation and nerve injury minimally affect mouse voluntary behaviors proposed as indicators of pain. Neurobiology of Pain. 2, 1-12 (2017).
- Wodarski, R., et al. Cross-centre replication of suppressed burrowing behaviour as an ethologically relevant pain outcome measure in the rat: a prospective multicentre study. Pain. 157 (10), 2350-2365 (2016).
- King, T., et al. Unmasking the tonic-aversive state in neuropathic pain. Nature Neuroscience. 12 (11), 1364-1366 (2009).
- Harte, S. E., Meyers, J. B., Donahue, R. R., Taylor, B. K., Morrow, T. J. Mechanical Conflict System: A Novel Operant Method for the Assessment of Nociceptive Behavior. PLoS One. 11 (2), 0150164 (2016).
- Pahng, A. R., Edwards, S. Measuring Pain Avoidance-Like Behavior in Drug-Dependent Rats. Current Protocols in Neuroscience. 85 (1), 53 (2018).
- Odem, M. A., et al. Sham surgeries for central and peripheral neural injuries persistently enhance pain-avoidance behavior as revealed by an operant conflict test. Pain. 160 (11), 2440-2455 (2019).
- LaBuda, C. J., Fuchs, P. N. A behavioral test paradigm to measure the aversive quality of inflammatory and neuropathic pain in rats. Experimental Neurology. 163 (2), 490-494 (2000).
- LaBuda, C. J., Fuchs, P. N. Morphine and gabapentin decrease mechanical hyperalgesia and escape/avoidance behavior in a rat model of neuropathic pain. Neuroscience Letters. 290 (2), 137-140 (2000).
- Vichaya, E. G., et al. Motivational changes that develop in a mouse model of inflammation-induced depression are independent of indoleamine 2,3 dioxygenase. Neuropsychopharmacology. 44 (2), 364-371 (2019).
- Hascoët, M., Bourin, M., Nic Dhonnchadha, B. A. The mouse light-dark paradigm: a review. Progress in Neuropsychopharmacology & Biological Psychiatry. 25 (1), 141-166 (2001).
- Shepherd, A. J., Mohapatra, D. P. Pharmacological validation of voluntary gait and mechanical sensitivity assays associated with inflammatory and neuropathic pain in mice. Neuropharmacology. 130, 18-29 (2018).
- Huck, N. A., et al. Temporal Contribution of Myeloid-Lineage TLR4 to the Transition to Chronic Pain: A Focus on Sex Differences. Journal of Neuroscience. 41 (19), 4349-4365 (2021).
- Pitzer, C., La Porta, C., Treede, R. D., Tappe-Theodor, A. Inflammatory and neuropathic pain conditions do not primarily evoke anxiety-like behaviours in C57BL/6 mice. European Journal of Pain. 23 (2), 285-306 (2019).
- Sieberg, C. B., et al. Neuropathic pain drives anxiety behavior in mice, results consistent with anxiety levels in diabetic neuropathy patients. Pain Reports. 3 (3), 651 (2018).
- Meuwissen, K. P. V., van Beek, M., Joosten, E. A. J. Burst and Tonic Spinal Cord Stimulation in the Mechanical Conflict-Avoidance System: Cognitive-Motivational Aspects. Neuromodulation. 23 (5), 605-612 (2020).
