Mechanische conflictvermijdingstest om pijngedrag bij muizen te meten

Summary

De mechanische conflictvermijdingstest wordt gebruikt als een niet-reflexieve uitlezing van pijngevoeligheid bij muizen die kan worden gebruikt om affectieve-motiverende reacties in verschillende muispijnmodellen beter te begrijpen.

Abstract

Pijn bestaat uit zowel zintuiglijke (nociceptieve) als affectieve (onaangename) dimensies. In preklinische modellen wordt pijn traditioneel beoordeeld met behulp van reflexieve tests die gevolgtrekkingen mogelijk maken met betrekking tot de nociceptieve component van pijn, maar weinig informatie geven over de affectieve of motiverende component van pijn. Het ontwikkelen van tests die deze componenten van pijn vastleggen, zijn daarom translationeel belangrijk. Daarom moeten onderzoekers niet-reflexieve gedragstests gebruiken om pijnperceptie op dat niveau te bestuderen. Mechanische conflictvermijding (MCA) is een gevestigde vrijwillige niet-reflexieve gedragstest, voor het bestuderen van motiverende reacties op een schadelijke mechanische stimulus in een 3-kamerparadigma. Een verandering in de locatievoorkeur van een muis, wanneer geconfronteerd met concurrerende schadelijke stimuli, wordt gebruikt om de waargenomen onaangenaamheid van fel licht versus tactiele stimulatie van de poten af te leiden. Dit protocol schetst een aangepaste versie van de MCA-test die pijnonderzoekers kunnen gebruiken om affectief-motiverende reacties in verschillende muispijnmodellen te begrijpen. Hoewel hier niet specifiek beschreven, gebruiken onze voorbeeld MCA-gegevens het intraplantaire complete Freund's adjuvans (CFA), gespaard zenuwletsel (SNI) en een fractuur / gietmodel als pijnmodellen om de MCA-procedure te illustreren.

Introduction

Pijn is een complexe ervaring met zintuiglijke en affectieve componenten. Een verlaging van de drempel van pijnperceptie en overgevoeligheid voor thermische en/of mechanische stimuli zijn belangrijke kenmerken van deze ervaring, die stimulus-opgeroepen pijngedragstests kunnen vastleggen (zoals Hargreaves' test van warmtegevoeligheid en de von Frey-test van mechanische gevoeligheid)^1,2. Hoewel dergelijke tests robuuste en reproduceerbare resultaten geven, worden ze beperkt door hun afhankelijkheid van reflexieve terugtrekking uit een waargenomen schadelijke stimulus. Dit heeft een voortdurende afhankelijkheid van pijnonderzoek op deze tests alleen in twijfel getrokken. Daartoe onderzoeken pijnonderzoekers al enkele jaren alternatieve / complementaire gedragstests voor gebruik in knaagdierpijnmodellen in een poging om meer van de affectieve en / of motiverende componenten van pijn vast te leggen. Deze niet-opgeroepen, vrijwillige of niet-reflexieve maatregelen (bijv. wielrennen, graafactiviteit, geconditioneerde plaatsvoorkeur ^3,4,5) worden geïmplementeerd in een poging om de vertaalbaarheid van preklinisch pijnonderzoek te verbeteren.

De mechanische conflictvermijdingstest (MCA) werd oorspronkelijk beschreven door Harte et al. in 2016⁶, wordt voornamelijk gebruikt bij ratten ^7,8 en vertegenwoordigt een wijziging van een eerdere benadering - het plaatsvlucht-vermijdingsparadigma. Bij deze benadering wordt een schadelijke stimulus van de achterpoot uitgevoerd in een anders wenselijke (donkere) kamer om doelgericht gedrag van het dier te stimuleren om aan een dergelijke stimulatie te ontsnappen / vermijden ^9,10. In plaats van te vertrouwen op handmatige schadelijke stimulatie van de achterpoot door een waarnemer, dwingt de MCA-test muizen om te onderhandelen over een potentieel schadelijke stimulus om te ontsnappen aan een aversieve omgeving en de donkere kamer te bereiken. Het conflict /vermijding dat de test zijn naam geeft, komt voort uit deze twee concurrerende motivaties: ontsnap aan fel verlichte gebieden en vermijd schadelijke stimulatie van de poten. De MCA-test deelt ook kenmerken met geconditioneerde plaatsvoorkeurtests, waarbij de combinatie van pijnverlichting met omgevingssignalen veranderingen in gedrag veroorzaakt die een voorkeur weerspiegelen voor de pijnstillende / lonende context¹¹.

Fundamenteel gesproken delen al deze testen een vergelijkbare benadering: het gebruik van een verschuiving in de voorkeur van een dier voor de ene aversieve omgeving boven de andere als een indicator van hun affectieve / motiverende toestand. De MCA-test is een 3-kamerparadigma bestaande uit een helder verlichte kamer gevolgd door een donkere middenkamer met in hoogte verstelbare sondes en een donkere derde kamer zonder aversieve stimuli. Een ongedeerde muis is meestal gemotiveerd om te ontsnappen naar een verduisterde kamer, gezien de aangeboren afkeer van knaagdieren voor fel licht¹². In dit voorbeeld overwint de natuurlijke motivatie om te ontsnappen aan een fel verlichte omgeving de desinclinatie om achterpootstimulatie (de instelbare hoogtesondes) tegen te komen, die uitsluitend in de verduisterde omgeving voorkomt. Daarentegen kan een muis die pijn ervaart (bijvoorbeeld als gevolg van ontsteking of neuropathie) ervoor kiezen om meer tijd door te brengen in de helder verlichte omgeving, omdat er motivatie is om de onaangename tactiele ervaring van de mechanische sondes te vermijden in de setting van voortdurende tactiele overgevoeligheid.

In dit artikel wordt een aangepaste versie van de MCA-test beschreven. We hebben de oorspronkelijke methode (die werd uitgevoerd bij ratten⁶) aangepast voor gebruik bij muizen. We hebben ook het aantal geteste sondehoogtes teruggebracht van zes naar drie (0, 2 en 5 mm boven vloerhoogte) om de gegevensverzameling te stroomlijnen. Deze aanpak is getest in meerdere pijnmodellen en gevalideerd met bekende analgetica, wat aangeeft dat pijnovergevoeligheid en / of de bijbehorende affectieve en motiverende veranderingen deze gedragsveranderingen veroorzaken. Deze aanpak is relatief snel uit te voeren en aanpasbaar in vergelijking met andere niet-reflexieve maatregelen, die vele dagen van gewenning en training kunnen vergen ^1,2. In combinatie met andere pijnmetingen kan MCA waardevolle inzichten genereren in de affectieve en motiverende aspecten van pijn.

Protocol

Alle experimenten met het gebruik van muizen en de daarin gevolgde procedures werden goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committees van MD Anderson Cancer Center en Stanford University, in strikte overeenstemming met de National Institutes of Health's Guide for the Care and Use of Laboratory Animals.

1. MCA-constructie

1. Constructiekamer 1 met de volgende afmetingen: 125 mm x 125 mm x 125 mm (breedte x diepte x hoogte) van ondoorzichtig wit 3 mm dik acryl gebruikt voor de zijwanden, vloer, plafond. Gebruik een helder acrylaat van 3 mm dik voor de voorwand. Lijm alle zijden ruim van tevoren aan elkaar met speciale acryllijm.
   LET OP: Acryllijm wordt beschouwd als gevaarlijk materiaal (ontvlambaar, damp schadelijk, kan schadelijk zijn bij inslikken, kan de huid of ogen irriteren). Dergelijke lijmen mogen alleen worden gebruikt in overeenstemming met de instructies van de fabrikant (d.w.z. met geschikte PBM in een goed geventileerde ruimte).
2. Bevestig het deksel van kamer 1 met een scharnier, zodat muizen gemakkelijk in de kamer kunnen worden geplaatst en uit de kamer kunnen worden gehaald. Bevestig zelfklevende ledtape (light-emitting diode) aan het binnenoppervlak van het deksel voor een verlichting van ~ 4800 lux.
3. Sluit kamer 1 af van de rest van de MCA door een ondoorzichtige acrylplaat in en uit positie te schuiven.
4. Construeer de MCA-testkamer, kamer 2, als een 270 mm lange onverlichte kamer vervaardigd uit doorschijnend donkerrood acryl (3 mm dik) aan alle zijden, met een scharnierend deksel aan de bovenkant. Plaats een raster van 13 x 31 van 2 mm gaten op de vloer van kamer 2 waardoor een reeks stompe sondes met uiteinden met een diameter van 0,5 mm (bijv. stompe kaartpennen) kunnen uitsteken.
   OPMERKING: Stompe pinnen met een schuurpapierblok van 120 korrels of iets dergelijks. Reinig ze in warm water met afwasmiddel voordat ze worden gedesinfecteerd met sporicide desinfectiemiddel.
5. Pas de hoogte van de sondes aan door extra acrylplaten onder de bodemplaat van de sonde te plaatsen (figuur 1). Configureer het apparaat met deze aanpak met drie instellingen: 0 mm, 2 mm en 5 mm sondehoogte.
6. Als alternatief voor afgestompte kaartpennen of soortgelijke materialen, gebruikt u de 3D-printerbestanden om de vloer van kamer 2 en de sondeplaat te printen (zie aanvullend bestand 1: SpikeBed-MCA.stl dat verwijst naar de mechanische sondes, en aanvullend bestand 2: MCA_baseplate.stl dat de vloer van kamer 2 vormt).
   OPMERKING: Als 3D-printen niet beschikbaar is, lijmt u kaartpennen op een acrylplaat met dezelfde acryllijm die is gebruikt om de wanden van het apparaat te construeren.
7. Druk af met een wasbaar en biocompatibel materiaal, zoals nylon 12 plastic of iets dergelijks (aanbevolen).
8. Constructiekamer 3 met de volgende afmetingen: 125 mm x 125 mm x 125 mm als onverlichte doorschijnende donkerrode acrylaatdoos (aan alle zijden), geplaatst aan de andere kant van kamer 1. Plaats een scharnierend deksel op de kamer, vergelijkbaar met kamer 1 en 2. Deze kamer dient als een verduisterd ontsnappingsgebied van de mechanische sondes in kamer 2.

2. McA-gewenning en testen van muizen

1. Zoals bij alle experimenten met gedragsuitkomsten bij dieren, observeer de juiste randomisatie en verblinding overal om mogelijke vertekening te minimaliseren.
   OPMERKING: De representatieve resultaten werden gegenereerd met behulp van 8-12 weken oude mannelijke en vrouwelijke C57BL / 6J-muizen (Jackson Laboratories stamnummer 000664). Muizen werden sociaal gehuisvest, tot 5 per kooi, met toegang tot voedsel en water ad libitum en een lichtcyclus van 07:00 uur tot 19:00 uur. MCA vond plaats in de lichtperiode, tussen 09:00 uur en 12:00 uur.
2. Een dag voordat baseline-testen zijn gepland, acclimatiseren muizen aan de MCA-eenheid gedurende 5 minuten (minimaal) tot 15 minuten (maximaal) met hun kooigenoten om sociale verkenning van het hele apparaat te vergemakkelijken.
3. Zorg er tijdens het hele proces voor dat de LED's in kamer 1 worden uitgeschakeld, de barrière tussen kamer 1 en 2 open wordt gelaten en de sondes op een hoogte van nul worden ingesteld (d.w.z. niet door de vloer van kamer 2 steken).
4. Voer een basislijntest van muizen uit (optioneel) als de studie negatieve controledieren bevat (d.w.z. schijnchirurgie of voertuiginjectiecontroles). Gebruik indien gewenst een basislijntest om eventuele ongedeerde uitschieters uit te sluiten die nooit in kamer 2 terechtkomen, hoewel dit niet noodzakelijk is gebleken. Indien gebruikt, rapporteer alle criteria voor uitsluiting en het aantal uitgesloten muizen.
   1. Voordat u begint met testen, moet u een videocamera instellen waarmee 1080p-beelden kunnen worden opgenomen op een statief met een zijdelingse weergave van het hele MCA-apparaat. Pas het gezichtsveld zodanig aan dat de MCA het opgenomen beeld vult.
   2. Zodra de opname begint, houdt u een handheld droog-wisbord in het gezichtsveld van de camera om het begin van de video te labelen met identificerende informatie over de testrun van het dier (bijv. muis-ID, sondehoogte, datum, tijdstip, enz.).
   3. Stel voor de eerste run de sondehoogte in op nul. Breng de te testen muis over van zijn thuiskooi naar kamer 1 met de barrièredeur op zijn plaats. Start een timer die zichtbaar is in de opgenomen beelden.
      OPMERKING: De timer zorgt ervoor dat de intervallen tussen de verschillende onderdelen van de test consistent zijn tussen de runs.
   4. Schakel na 10 s de kamer 1 LED's in. Nadat de muis 20 s in de verlichte kamer heeft gezeten, trekt u de barrière tussen kamer 1 en 2 terug.
   5. Observeer het dier gedurende 2 minuten. Meet latenties en/of verblijftijden met een stopwatch terwijl de test aan de gang is. Als alternatief kunnen de videobeelden worden geanalyseerd zodra het testen is voltooid.
      OPMERKING: Om redenen van doorvoer en het vermijden van langdurige blootstelling aan aversieve stimuli, werd de cutoff ingesteld op 2 min.
   6. Meet een of meer van de verschillende nuttige uitkomsten die zijn geïdentificeerd (zie hieronder; Figuur 1). Aanbevolen om alle 5 uitkomstmaten te analyseren bij het starten van het testen, om vast te stellen welke aspecten van gedrag verschillen in een bepaalde experimentele opstelling.
      1. Optie I: Registreer de latentie tot de eerste ingang van kamer 2. Optie II: Registreer de latentie tot meer dan halverwege kamer 2. Optie III: Noteer de totale verblijftijd in kamer 2. Optie IV: Registreer de latentie om kamer 3 (escape) te bereiken. Optie V: Net als bij optie II, noteer de totale verblijftijd in elke kamer binnen 2 minuten en converteer ze in verhoudingen.
         OPMERKING: Omdat elk experiment uniek is en kan worden beïnvloed door biologische factoren en gedragsveranderingen die uniek zijn voor het ziektemodel, kunnen onderzoekers experimenteren met deze en andere maatregelen in hun eigen handen.
   7. Zodra het testen is voltooid, brengt u de muis terug naar zijn thuiskooi, reinigt u de MCA-kamers met 70% ethanol en laat u deze volledig drogen.
      OPMERKING: Fecale boli kan meestal relatief eenvoudig uit de kamer worden gereinigd met papieren handdoeken voorafgaand aan ethanol / desinfectiemiddel. Als een grondigere reiniging nodig is, kunnen kamers 2 en 3 worden gedemonteerd en ondergedompeld in warm zeepsop.
   8. Nadat u alle muizen in een cohort hebt uitgevoerd waarbij de sondehoogte op nul is ingesteld, plaatst u een acrylplaat van 3 mm onder de mechanische sondebasisplaat en herhaalt u de stappen 2.4.2 tot 2.4.7 met een sondehoogte van 2 mm.
   9. Nadat u alle muizen met de sondehoogte op 2 mm hebt uitgevoerd, plaatst u een tweede acrylplaat van 3 mm onder de bodemplaat van de sonde en herhaalt u de stappen 2.4.2 tot 2.4.7 met een sondehoogte van 5 mm.
      OPMERKING: Een groep van 8 muizen kan met deze aanpak in ongeveer 2 uur worden getest. Gebruik kleinere groepsgroottes als een nauwkeuriger timing na het geneesmiddel vereist is (bijvoorbeeld voor een experiment met een medicijntijdverloop).
   10. Voer een laatste reiniging uit met een ontsmettingsmiddel aan het einde van een testsessie.
5. Herhaal het testen na het induceren van pijnovergevoeligheid en / of met medicamenteuze behandeling.
6. Vergelijk de prestaties van elke muis bij baseline met hun prestaties nadat de pijn is geïnduceerd. Beoordeel de impact van een farmacologische interventie door met voertuigen behandelde dieren te vergelijken met met geneesmiddelen behandelde dieren op hetzelfde tijdstip.
7. Voer niet-parametrische statistische analyse uit (bijv. de Mann Whitney U-test) als dieren de 2 minuten cutoff bereiken zonder aan de gewenste uitkomstmaat te voldoen, wat resulteert in niet-continue gegevens.

Representative Results

De MCA-test is met succes gebruikt met verschillende mechanistisch verschillende muispijnmodellen. Figuur 2 toont gegevens waarbij de uitkomstmaat van keuze het middelpunt van kamer 2 overschreed (figuur 2A). De gegevens verkregen door het gebruik van het halverwege punt versus ontsnapping in kamer 3 zijn zeer vergelijkbaar, ~ 40 s voor halverwege versus ~ 45 s voor kamer 3 ontsnapping in het gespaarde zenuwletsel (SNI) model van neuropathische pijn met 5 mm sondehoogte¹³.

In het CFA-geïnduceerde inflammatoire pijnmodel verandert de controleachterpoot (intraplantaire) injectie van zoutoplossing de ontsnappingslatentie niet ten opzichte van de uitgangswaarde. De muizen die werden geïnjecteerd met CFA in één achterpoot vertoonden een significante toename van de ontsnappingslatentie 4 dagen na injectie, maar alleen wanneer de sondehoogte werd verhoogd tot 5 mm. Cruciaal is dat deze verhoogde latentie om te ontsnappen bij 5 mm niet werd gezien bij muizen die de NSAID-carprofen (10 mg / kg, i.p.) 90 minuten voor het begin van de test ontvingen (figuur 2B).

Het gespaarde zenuwletsel (SNI) model van traumatische neuropathische pijn, is ook geassocieerd met een significante toename van de latentie om te ontsnappen versus baseline wanneer de sondehoogte werd ingesteld op 5 mm. Dit effect werd gezien bij SNI-muizen, maar niet bij hun schijnchirurgiecontroles. Deze verhoogde ontsnappingslatentie werd ook voorkomen door systemische toediening van het opioïde analgetische buprenorfine (25 μg/kg, i.p.) 90 minuten voorafgaand aan het testen (figuur 2C). Verhoogde ontsnappingslatentie werd ook waargenomen bij muizen die geen baselineronde van MCA-testen ondergingen voorafgaand aan zenuwletsel (figuur 2D). In dit geval werd de verhoogde ontsnappingslatentie bij SNI-muizen bij 5 mm voorkomen door gabapentine (30 mg/kg, i.p.) dat 90 minuten voorafgaand aan de test werd toegediend. Gezamenlijk suggereert dit dat MCA pijngerelateerde veranderingen in stimulusaversie en -vermijding kan detecteren in twee veelgebruikte modellen van inflammatoire en neuropathische pijn.

MCA werd verder getest in het fractuur/gietmodel van het chronische pijnaandoening complex regionaal pijnsyndroom (CRPS), dat wordt vastgesteld door een gesloten rechter distale tibiafractuur gevolgd door 3 weken gieten¹⁴. Dit klinisch geïnformeerde model vertoont acute fase perifere ontsteking, evenals langdurige immuunactiviteit in het centrale zenuwstelsel met aanhoudende hindlimb allodynie. Net als bij de CFA- en SNI-modellen werden verhoogde ontsnappingslatenties waargenomen in het fractuur/gietmodel (figuur 3A). Voorafgaand aan het letsel nam de latentie om uit kamer 1 te ontsnappen evenredig toe met de sondehoogte. Na het letsel bleef de ontsnappingslatentie onveranderd op 0 mm, maar nam aanzienlijk toe bij de sondehoogte van 2 mm en 5 mm voor mannetjes en de sondehoogte van 5 mm voor vrouwtjes in vergelijking met de uitgangswaarde (figuur 3B).

Figuur 1: Schema en afbeeldingen van het MCA-apparaat. (A) Mogelijke uitkomstmaten in de MCA-test (gemarkeerd door wijzerplaatpictogrammen): latentie tot uitgang kamer 1 (I), latentie om meer dan 50% van kamer 2 (stippellijn; II), de totale hoeveelheid tijd doorgebracht in kamer 2 (III), latentie om de ontsnappingskamer te bereiken (IV) of procentuele tijd doorgebracht in elke kamer (V). Dieren die gemiddeld pijn ervaren, vertonen hogere waarden voor I, II en IV en lagere waarden voor III. Een verlaagde waarde voor III verhoogt noodzakelijkerwijs het aandeel van de tijd doorgebracht in kamer 1 en/of kamer 3, dat zou worden vastgelegd door uitkomstmaat V. Gemaakt met Biorender.com. (B) Afbeeldingen van het MCA-apparaat (en kamers genummerd 1, 2 en 3) met de LED's uitgeschakeld (linksboven), de LED's ingeschakeld (linksonder). (C) Een blik op de kamers van bovenaf met de deuren geopend. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2: Inflammatoire en neuropathische pijnvergrotingsvermijding in de MCA-test. (A) Weergave van de specifieke uitkomstmaat die hier wordt gebruikt: latentie om het middelpunt van kamer 2 te passeren. (B) Intraplantaire injectie van CFA verhoogde significant de latentie om te ontsnappen (rode vierkanten) versus zoutcontroles (zwarte cirkels) wanneer de sondehoogte werd ingesteld op 5 mm. Intraperitoneaal carprofen (10 mg/kg) verzwakte de cfa-geïnduceerde toename van de ontsnappingslatentie (blauwe driehoeken). Gegevens worden uitgezet als gemiddelde escape latency ± standaardfout van het gemiddelde (SEM); n = 7 reuen/groep. (C) Gespaarde zenuwletsel (SNI) chirurgie aanzienlijk verhoogde kamer 1 ontsnappingslatentie versus schijnchirurgie controles (zwarte cirkels), wanneer de sondehoogte werd ingesteld op 5 mm (rode vierkanten). Intraperitoneale buprenorfine (25 mg/kg) verzwakte deze toename van de ontsnappingslatentie (blauwe driehoeken) aanzienlijk. Gegevens worden uitgezet als gemiddelde ontsnappingslatentie ± SEM; n = 6-7 mannetjes per groep. (D) SNI-geïnduceerde toename van de ontsnappingslatentie werd omgekeerd door gebruik te maken van het pijnstillende gabapentine (groene driehoeken). Gegevens worden uitgezet als gemiddelde ontsnappingslatentie ± SEM; n = 8 reuen/groep. ## = p < 0,01, ***/### = p < .001, voor de aangegeven vergelijkingen (tweerichtingsverkeer ANOVA, Bonferroni post-hoc). Dit cijfer is gewijzigd van¹³. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3: Tibiale fractuur/casting geïnduceerde chronische pijnvergrotingsvermijding in de MCA-test. Fractuur/gieten verhoogde significant de ontsnappingslatentie 3 weken na het letsel (W3) versus baseline (BL) bij mannen op de sondehoogte van 2 mm en 5 mm en bij vrouwen op de sondehoogte van 5 mm (n = 5/geslacht). Gegevens van elke muis worden weergegeven in vervaagd zwart (mannetjes) of cayennepeper (vrouwtjes) met gemiddelde weergegeven door donkere lijnen. **/*** = p < 0,01/< 0,001 versus geslachts- en sondehoogte-gematchte uitgangswaarde door tweerichtings ANOVA, Tukey post-hoc. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Aanvullend bestand 1: 3D-printerbestand SpikeBed-MCA. Wanneer het wordt afgedrukt in een geschikt biocompatibel en wasbaar materiaal, zoals nylon 12, produceert SpikeBed-MCA.stl het platform van tactiele sondes die door de vloer van kamer 2 steken. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullend bestand 2: 3D-printerbestand MCA_baseplate. Wanneer het wordt afgedrukt in een geschikt biocompatibel en wasbaar materiaal, zoals nylon 12, produceert MCA_baseplate.stl de vloer van kamer 2, waardoor de tactiele sondes uitsteken. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Discussion

Zoals met alle gedragstests, is een goede behandeling, randomisatie en blindering voor de behandeling van dieren overal essentieel. Gezien de multifactoriële input in complex gedrag en besluitvorming, is het noodzakelijk dat dieren zo consistent mogelijk worden behandeld, gewenning en getest, terwijl de nood wordt geminimaliseerd. Er moet ook voor worden gezorgd dat de timing van de muisplaatsing in kamer 1 wordt gereproduceerd, de LED-verlichting wordt ingeschakeld en de barrière wordt verwijderd, omdat verschillen hier het daaropvolgende gedrag kunnen beïnvloeden.

Opgemerkt moet worden dat de verschillende uitkomstmaten in figuur 1A onderling gerelateerd zijn. Een muis die kamer 2 binnengaat, passeert bijvoorbeeld meestal het halverwege punt van kamer 2 en voltooit dan bijna altijd de ontsnapping naar kamer 3. Dit betekent dat uitkomstmaten I, II en IV met elkaar samenhangen. Uitkomstmaten III en V meten respectievelijk de totale verblijftijd in kamer 2 en het aandeel van de verblijftijd in alle 3 de kamers. Daarom hangen deze maatregelen nauw met elkaar samen. Een muis kan echter in theorie een aanzienlijke verblijftijd opbouwen in kamer 2, ongeacht of de halverwege kruising of ontsnapping naar kamer 3 een lage latentie, hoge latentie of helemaal niet heeft plaatsgevonden.

Er zijn verschillende variaties of aanpassingen van deze methode gemeld. Naast de verschillende uitkomstmaten die hier worden vermeld (figuur 1), konden onderzoekers de progressie van de sondehoogte variëren in een poging om verschillen in gevoeligheid te benadrukken. Aangezien er geen statistisch significante verschillen waren met de tussenliggende 2 mm sondehoogte, kan het efficiënter zijn om muizen alleen op 0 mm en 5 mm te laten lopen. Als alternatief kan een sondehoogte tussen 2 en 5 mm of herhaalde runs op een sondehoogte van 5 mm beginnen met het ontmaskeren van verschillen die anders niet duidelijk waren. Bovendien kan de evaluatie van de verblijftijd in elke kamer worden gebruikt als een uitlezing van motivatie en activiteit. Dit kan handig zijn in gevallen waarin sommige muizen snel doorlopen naar kamer 3, maar dan terugkeren naar kamer 1 om verder te verkennen. In deze situaties zou latentie tot het betreden van kamer 3 alleen deze subtiliteit niet vangen. Het verhogen van de testtijd tot boven de hier vastgestelde limiet van 2 minuten kan voor sommige onderzoekers ook de moeite waard zijn. Ten slotte kunnen we niet uitsluiten dat herhaald testen van dezelfde dieren (meer dan de drie keer die hier worden beschreven), of testen met een grotere frequentie (minder dan 4-7 dagen tussen tests) gewennings- of leereffecten kan veroorzaken. Om deze redenen wordt de opname van naïeve, ongemanipuleerde controlegroepen op elk tijdstip aangemoedigd. Uiteindelijk zijn variaties in gedrag hoogstwaarschijnlijk pijnmodelspecifiek en rechtvaardigen ze verder onderzoek in deze en andere pijnmodellen.

De pijn-inducerende modellen die hier worden gebruikt (CFA, SNI, fractuur / casting) worden meestal geassocieerd met overgevoeligheid in andere pijngedragstests, wat overeenkomt met een toename van vermijdings- / ontsnappingslatentie. De MCA-test kan ook een verlies van sensorische scherpte detecteren (bijvoorbeeld door meer tijd doorgebracht in kamer 2), hoewel dit niet formeel is getest. MCA heeft enkele beperkingen die aandacht verdienen. Afkeer van fel licht is een belangrijk middel om de toegang tot kamer 2 te motiveren en daarom een aanjager van latere conflicten. Elk pathologisch kenmerk dat verband houdt met een bepaald muismodel en dat de afkeer van fel licht kan veranderen (bijv. visuele beperking), moet zorgvuldig worden overwogen voordat deze test wordt gebruikt. De bijdrage van angst aan de latentie is ook niet systematisch getest, hoewel chronische inflammatoire en neuropathische pijnmodellen in andere tests tekenen van angstachtig gedrag bij muizen vertonen, blijft er een debat over deze^15,16. Dat gezegd hebbende, kan een bijdrage van pijngerelateerde angst aan deze gedragsuitkomsten op dit moment niet worden bevestigd of uitgesloten. Omdat MCA meerdere ingangen heeft in de uitkomstmaten, komt dit met meer potentiële verstoringen om te overwegen.

Samenvattend biedt de MCA-test een niet-reflexieve uitlezing van pijngevoeligheid in muismodellen. De uitkomstmaten worden beïnvloed door andere factoren dan reflexieve gevoeligheid en bieden een samengestelde maat voor pijngevoeligheid en affectieve / motiverende toestand. De hoeveelheid tijd die nodig is om elke test uit te voeren en het vereiste vaardigheidsniveau en de vereiste gespecialiseerde apparatuur steken gunstig af bij andere niet-reflexieve pijnmetingen, zoals loopanalyse of geconditioneerde plaatsvoorkeur ^5,13. Hoewel nog steeds enigszins nieuw, is de aanpak aangenomen en onafhankelijk geverifieerd door meerdere teams van onderzoekers, voornamelijk bij ratten. Partiële ischiaszenuwligatie verhoogde de exitlatentie¹⁷ en morfine-afhankelijke terugtrekking bij ratten⁷. Een andere studie bij ratten stelde voor dat het tellen van het aantal kruisingen, met behulp van dwarslaesie en chronische vernauwingsletselmodellen bij ratten, kan dienen als een nuttige uitkomstmaat⁸. Cruciaal is dat deze studie ook een toename van het vermijden van sondes in schijnchirurgiecontroles identificeerde, wat aangeeft dat opname van een naïeve groep naast schijn- / voertuigcontroles gerechtvaardigd is. Toekomstige toepassingen van MCA zouden zich kunnen richten op de variatie tussen muizenstammen en / of pijnmodellen, de impact van angst op testprestaties en integratie van houdingsanalyse of loopkinematica om verschillen in gedragsaanpassingen aan schadelijke stimuli beter te begrijpen.

De translationele kloof tussen preklinische muisstudies en de ontwikkeling van nieuwe therapieën blijft een reden tot bezorgdheid. Met dit in gedachten vormt de MCA-test een aanvulling op bestaande hulpmiddelen in pijnonderzoek en helpt het een completer beeld te geven van de vele sensorische en affectieve dimensies van pijn.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
32.8ft 3000K-6000K Tunable White LED Strip Lights, Dimmable Super Bright LED Tape Lights with 600 SMD 2835 LEDs	Lepro	SKU: 410087-DWW-US	For lighting chamber 1. https://www.lepro.com/32ft-dimmable-tunable-white-led-strip-lights.html
3D printed 'spike bed' and 'chamber 2 floor'	Shapeways	N/A	Optional, for mechanical probes as an alternative to blunted map pins.
70% ethanol	Various	N/A	To clean MCA between mice.
Acryl-Hinge 2	TAP Plastics	N/A	for attaching chamber lids to rear walls. https://www.tapplastics.com/product/plastics/handles_hinges_latches/acryl_hinge_2/122
Chemcast Cast Acrylic Sheet, Clear	TAP Plastics	N/A	3mm thick. For front wall of chamber 1. https://www.tapplastics.com/product/plastics/cut_to_size_plastic/acrylic_sheets_cast_clear/510
Chemcast Cast Transparent Colored Acrylic, Transparent Dark Red - 50%	TAP Plastics	N/A	3mm thick. 50% light transmission. For walls and lids of chambers 2 and 3. https://www.tapplastics.com/product/plastics/cut_to_size_plastic/acrylic_sheets_transparent_colors/519
Chemcast Translucent & Opaque Colored Cast Acrylic, Sign Opaque White - 0.1%	TAP Plastics	N/A	3mm thick. For side walls and lid of chamber 1. https://www.tapplastics.com/product/plastics/cut_to_size_plastic/acrylic_sheets_color/341
Disinfectant (e.g. Quatricide)	Pharmacal Research Laboratories, Inc.	65020F	To disinfect MCA at the end of a testing session.
Dry-erase markers and board	Various	N/A	To add experimental info to the beginning of video footage.
Map pins	Various	N/A	Optional, for mechanical probes. Use sandpaper to blunt sharp points before use. Can be used in place of 3D-printed parts.
Paper towels	Various	N/A	To clean/disinfect MCA.
SCIGRIP Weld-On #3 Acrylic Cement	TAP Plastics	N/A	For assembling acrylic sheets into chambers and affixing hinges. https://www.tapplastics.com/product/repair_products/plastic_adhesives/weld_on_3_cement/131
Stopwatch	Various	N/A	To record escape latencies/dwell times in real-time or from recorded video.
Timer	Various	N/A	To ensure LED turn-on, barrier removal and test completion are timed consistently.
Video camera	Various	HDRCX405 Handycam Camcorder	To record mouse behavior in the MCA device. Can be substituted with any consumer-grade video camera capable of 1080p resolution.
Tripod	Famall	N/A	Any tripod that can hold the camera at bench height for recording MCA footage is acceptable.