Summary
Le test mécanique d’évitement des conflits est utilisé comme une lecture non réflexive de la sensibilité à la douleur chez la souris qui peut être utilisée pour mieux comprendre les réponses affectives-motivationnelles dans une variété de modèles de douleur murine.
Abstract
La douleur comprend à la fois des dimensions sensorielles (nociceptives) et affectives (désagréables). Dans les modèles précliniques, la douleur a traditionnellement été évaluée à l’aide de tests réflexifs qui permettent des inférences concernant la composante nociceptive de la douleur, mais fournissent peu d’informations sur la composante affective ou motivationnelle de la douleur. Le développement de tests qui capturent ces composants de la douleur est donc important sur le plan translationnel. Par conséquent, les chercheurs doivent utiliser des tests comportementaux non réflexifs pour étudier la perception de la douleur à ce niveau. L’évitement mécanique des conflits (MCA) est un test de comportement non réflexif volontaire établi, pour étudier les réponses motivationnelles à un stimulus mécanique nocif dans un paradigme à 3 chambres. Un changement dans la préférence de localisation d’une souris, lorsqu’elle est confrontée à des stimuli nocifs concurrents, est utilisé pour déduire le désagrément perçu de la lumière vive par rapport à la stimulation tactile des pattes. Ce protocole décrit une version modifiée du test MCA que les chercheurs sur la douleur peuvent utiliser pour comprendre les réponses affectives et motivationnelles dans une variété de modèles de douleur chez la souris. Bien qu’elles ne soient pas spécifiquement décrites ici, nos exemples de données MCA utilisent l’adjuvant de Freund complet intraplantaire (CFA), les lésions nerveuses épargnées (SNI) et un modèle de fracture / coulée comme modèles de douleur pour illustrer la procédure MCA.
Introduction
La douleur est une expérience complexe avec des composantes sensorielles et affectives. Une réduction du seuil de perception de la douleur et une hypersensibilité aux stimuli thermiques et/ou mécaniques sont des caractéristiques clés de cette expérience, que les tests de comportement de la douleur évoqués par stimulus peuvent capturer (comme le test de sensibilité à la chaleur de Hargreaves et le test de von Frey de sensibilité mécanique)1,2. Bien que ces tests donnent des résultats robustes et reproductibles, ils sont limités par leur dépendance à l’égard du retrait réflexif d’un stimulus nocif perçu. Cela a remis en question le recours continu de la recherche sur la douleur à ces seuls tests. À cette fin, les chercheurs sur la douleur explorent depuis plusieurs années des tests comportementaux alternatifs / complémentaires à utiliser dans les modèles de douleur chez les rongeurs dans le but de capturer davantage de composants affectifs et / ou motivationnels de la douleur. Ces mesures non évoquées, volontaires ou non réflexives (p. ex., course sur roues, activité de creusement, préférence de lieu conditionné 3,4,5) sont mises en œuvre dans le but d’améliorer la translatabilité de la recherche préclinique sur la douleur.
Le test d’évitement mécanique des conflits (MCA) a été décrit à l’origine par Harte et al. en 20166, est utilisé principalement chez les rats 7,8 et représente une modification d’une approche antérieure - le paradigme d’évitement de l’évasion du lieu. Dans cette approche, un stimulus nocif de la patte postérieure est effectué dans une chambre autrement souhaitable (sombre) pour conduire un comportement délibéré de l’animal à s’échapper / éviter une telle stimulation 9,10. Au lieu de s’appuyer sur une stimulation nocive manuelle de la patte postérieure par un observateur, le test MCA force les souris à négocier un stimulus potentiellement nocif pour échapper à un environnement aversif et atteindre la chambre sombre. Le conflit/évitement qui donne son nom au test découle de ces deux motivations concurrentes : s’échapper des zones très éclairées et éviter la stimulation nocive des pattes. Le test MCA partage également des caractéristiques avec les tests de préférence de lieu conditionnés, où l’association du soulagement de la douleur avec des indices environnementaux entraîne des changements de comportement qui reflètent une préférence pour le contexte analgésique / gratifiant11.
Fondamentalement, tous ces tests partagent une approche similaire: utiliser un changement dans la préférence d’un animal pour un environnement aversif par rapport à un autre comme indicateur de son état affectif / motivationnel. Le test MCA est un paradigme à 3 chambres composé d’une chambre très éclairée suivie d’une chambre moyenne sombre avec des sondes de hauteur réglables et d’une troisième chambre sombre sans aucun stimulus aversif. Une souris non blessée est généralement motivée à s’échapper dans une chambre sombre, étant donné l’aversion innée des rongeurs pour la lumière vive12. Dans cet exemple, la motivation naturelle à s’échapper d’un environnement très éclairé surmonte la réticence à rencontrer la stimulation de la patte postérieure (les sondes de hauteur réglables), qui se produit exclusivement dans l’environnement sombre. En revanche, une souris souffrant de douleur (due à une inflammation ou à une neuropathie, par exemple) peut choisir de passer plus de temps dans un environnement très éclairé, car il existe une motivation pour éviter l’expérience tactile désagréable des sondes mécaniques dans le cadre d’une hypersensibilité tactile continue.
Cet article décrit une version modifiée du test MCA. Nous avons adapté la méthode originale (qui a été réalisée chez le rat6) pour l’utiliser chez la souris. Nous avons également réduit le nombre de hauteurs de sonde testées de six à trois (0, 2 et 5 mm au-dessus de la hauteur du sol) afin de rationaliser l’acquisition de données. Cette approche a été testée sur plusieurs modèles de douleur et validée avec des analgésiques connus, indiquant que l’hypersensibilité à la douleur et / ou les changements affectifs et motivationnels associés sont à l’origine de ces changements de comportement. Cette approche est relativement rapide à mener et adaptable par rapport à d’autres mesures non réflexives, qui peuvent prendre plusieurs jours d’accoutumance et de formation 1,2. De concert avec d’autres mesures de la douleur, le MCA peut générer des informations précieuses sur les aspects affectifs et motivationnels de la douleur.
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Protocol
Toutes les expériences impliquant l’utilisation de souris et les procédures qui y sont suivies ont été approuvées par les comités institutionnels de soins et d’utilisation des animaux du MD Anderson Cancer Center et de l’Université de Stanford, en stricte conformité avec le Guide pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire des National Institutes of Health.
1. Construction de MCA
- Construire la chambre 1 avec les dimensions suivantes: 125 mm x 125 mm x 125 mm (largeur x profondeur x hauteur) en acrylique blanc opaque de 3 mm d’épaisseur utilisé pour les parois latérales, le sol, le plafond. Utilisez un acrylique transparent de 3 mm d’épaisseur pour le mur orienté vers l’avant. Collez tous les côtés ensemble bien à l’avance à l’aide d’un adhésif acrylique dédié.
ATTENTION: L’adhésif acrylique est considéré comme une matière dangereuse (inflammable, nocif à la vapeur, peut être nocif en cas d’ingestion, peut irriter la peau ou les yeux). Ces adhésifs ne doivent être utilisés que conformément aux instructions du fabricant (c.-à-d. avec un EPI approprié dans un endroit bien ventilé). - Fixez le couvercle de la chambre 1 avec une charnière, de sorte que les souris puissent être facilement placées et récupérées dans la chambre. Fixez du ruban adhésif à diode électroluminescente (LED) autocollant sur la surface interne du couvercle pour fournir un éclairage d’environ 4800 lux.
- Fermez la chambre 1 du reste du MCA en faisant glisser une feuille d’acrylique opaque dans et hors de sa position.
- Construisez la chambre d’essai MCA, chambre 2, comme une chambre non éclairée de 270 mm de long fabriquée en acrylique rouge foncé translucide (3 mm d’épaisseur) sur tous les côtés, avec un couvercle articulé sur le dessus. Placez une grille de 13 x 31 trous de 2 mm sur le sol de la chambre 2 à travers laquelle un réseau de sondes contondantes avec des pointes de 0,5 mm de diamètre (par exemple, des broches de carte émoussées) peut dépasser.
REMARQUE: Broches émoussées avec un bloc de papier de verre de 120 grains ou similaire. Nettoyez-les à l’eau tiède avec du détergent avant d’être désinfectés avec un désinfectant sporicide. - Ajustez la hauteur des sondes en plaçant des feuilles d’acrylique supplémentaires sous la plaque de base de la sonde (Figure 1). En utilisant cette approche, configurez l’appareil avec trois paramètres : 0 mm, 2 mm et 5 mm de hauteur de sonde.
- Comme alternative aux broches de carte émoussées ou à des matériaux similaires, utilisez les fichiers de l’imprimante 3D pour imprimer le sol de la chambre 2 et la plaque de sonde (voir le fichier supplémentaire 1: SpikeBed-MCA.stl qui fait référence aux sondes mécaniques, et le fichier supplémentaire 2: MCA_baseplate.stl qui forme le plancher de la chambre 2).
REMARQUE: Si l’impression 3D n’est pas disponible, collez des broches de carte sur une feuille acrylique en utilisant le même adhésif acrylique utilisé pour construire les parois de l’appareil. - Imprimez avec un matériau lavable et biocompatible, tel que le plastique nylon 12 ou similaire (recommandé).
- Construire la chambre 3 avec les dimensions suivantes: 125 mm x 125 mm x 125 mm comme une boîte acrylique rouge foncé translucide non éclairée (de tous les côtés), placée à l’extrémité opposée de la chambre 1. Placez un couvercle articulé sur la chambre, semblable aux chambres 1 et 2. Cette chambre sert de zone d’évacuation obscurcie des sondes mécaniques de la chambre 2.
2. Accoutumance et test mcA de souris
- Comme pour toutes les expériences impliquant des résultats comportementaux chez les animaux, observez la randomisation et la mise en aveugle appropriées tout au long pour minimiser les biais potentiels.
REMARQUE: Les résultats représentatifs ont été générés en utilisant des souris C57BL / 6J mâles et femelles âgées de 8 à 12 semaines (numéro de souche 000664 jackson laboratories). Les souris étaient logées socialement, jusqu’à 5 par cage, avec un accès à la nourriture et à l’eau ad libitum et un cycle de lumière de 07h00 à 19h00. MCA a eu lieu dans la période de lumière, entre 09:00 h et 12:00 h. - Un jour avant la date prévue des tests de base, acclimatez les souris à l’unité MCA pendant 5 min (minimum) à 15 min (maximum) avec leurs compagnons de cage pour faciliter l’exploration sociale de l’ensemble de l’appareil.
- Tout au long du processus, assurez-vous que les LED de la chambre 1 sont éteintes, que la barrière entre les chambres 1 et 2 est laissée ouverte et que les sondes sont réglées à une hauteur de zéro (c.-à-d. qu’elles ne dépassent pas du plancher de la chambre 2).
- Effectuer un test de base sur des souris (facultatif) si l’étude incorpore des animaux témoins négatifs (c.-à-d. une chirurgie simulée ou des contrôles d’injection de véhicule). Si vous le souhaitez, utilisez un test de base pour exclure toute valeur aberrante non blessée qui ne traverse jamais la chambre 2, bien que cela ne se soit pas avéré nécessaire. S’il est utilisé, indiquez tous les critères d’exclusion et le nombre de souris exclues.
- Avant de commencer les tests, installez une caméra vidéo capable d’enregistrer des séquences 1080p sur un trépied avec une vue latérale de l’ensemble de l’appareil MCA. Ajustez le champ de vision de manière à ce que le MCA remplisse l’image enregistrée.
- Une fois l’enregistrement commencé, tenez une carte d’effacement à sec portative dans le champ de vision de la caméra pour étiqueter le début de la vidéo avec des informations d’identification sur les tests de l’animal (par exemple, l’ID de la souris, la hauteur de la sonde, la date, le point d’heure, etc.).
- Pour la première exécution, réglez la hauteur de la sonde sur zéro. Transférez la souris à tester de sa cage d’origine dans la chambre 1 avec la porte barrière en place. Démarrez une minuterie visible dans le métrage enregistré.
REMARQUE : La minuterie garantit que les intervalles entre les différentes parties du test sont cohérents entre les exécutions. - Après 10 s, allumez les LED de la chambre 1. Une fois que la souris a été dans la chambre allumée pendant 20 s, retirez la barrière entre les chambres 1 et 2.
- Observez l’animal pendant 2 min. Mesurez les latences et/ou les temps d’arrêt avec un chronomètre pendant que le test est en cours. Alternativement, les séquences vidéo peuvent être analysées une fois le test terminé.
REMARQUE: Pour des raisons de débit et pour éviter une exposition prolongée à des stimuli aversifs, le seuil a été fixé à 2 min. - Mesurer un ou plusieurs des nombreux résultats utiles qui ont été identifiés (voir ci-dessous; Figure 1). Recommandé d’analyser les 5 mesures de résultats au début des tests, afin de déterminer quels aspects du comportement diffèrent dans une configuration expérimentale donnée.
- Option I : Enregistrez la latence à la première entrée de la chambre 2. Option II : Enregistrez la latence pour traverser plus de la moitié de la chambre 2. Option III : Enregistrer le temps de séjour total dans la chambre 2. Option IV : Enregistrer la latence pour atteindre la chambre 3 (échappement). Option V: Semblable à l’option II, enregistrez le temps de séjour total dans chaque chambre dans les 2 minutes et convertissez-les en proportions.
REMARQUE: Étant donné que chaque expérience est unique et peut être influencée par des facteurs biologiques et des changements de comportement uniques au modèle de la maladie, les chercheurs peuvent expérimenter ces mesures et d’autres entre leurs propres mains.
- Option I : Enregistrez la latence à la première entrée de la chambre 2. Option II : Enregistrez la latence pour traverser plus de la moitié de la chambre 2. Option III : Enregistrer le temps de séjour total dans la chambre 2. Option IV : Enregistrer la latence pour atteindre la chambre 3 (échappement). Option V: Semblable à l’option II, enregistrez le temps de séjour total dans chaque chambre dans les 2 minutes et convertissez-les en proportions.
- Une fois le test terminé, retournez la souris dans sa cage d’origine, nettoyez les chambres MCA avec 70% d’éthanol et laissez-la sécher complètement.
REMARQUE: Les boli fécaux peuvent généralement être nettoyés de la chambre relativement facilement avec des serviettes en papier avant l’éthanol / désinfectant. Si un nettoyage plus approfondi devient nécessaire, les chambres 2 et 3 peuvent être démontées et immergées dans de l’eau chaude savonneuse. - Après avoir exécuté toutes les souris d’une cohorte dont la hauteur de la sonde est réglée sur zéro, insérez une feuille d’acrylique de 3 mm sous la plaque de base de la sonde mécanique et répétez les étapes 2.4.2 à 2.4.7 avec une hauteur de sonde de 2 mm.
- Après avoir exécuté toutes les souris dont la hauteur de la sonde est réglée sur 2 mm, insérez une deuxième feuille d’acrylique de 3 mm sous la plaque de base de la sonde et répétez les étapes 2.4.2 à 2.4.7 avec une hauteur de sonde de 5 mm.
REMARQUE: Un groupe de 8 souris peut être testé en environ 2 heures en utilisant cette approche. Utilisez des groupes de plus petite taille si un calendrier post-médicament plus précis est nécessaire (p. ex., pour une expérience de cours de traitement de la drogue). - Effectuez un nettoyage final avec un désinfectant à la fin d’une séance de test.
- Répétez les tests après avoir induit une hypersensibilité à la douleur et / ou avec un traitement médicamenteux.
- Comparez les performances de chaque souris au départ avec leurs performances après l’induction de la douleur. Évaluer l’impact d’une intervention pharmacologique en comparant les animaux traités par véhicule avec les animaux traités par des médicaments au même moment.
- Effectuer une analyse statistique non paramétrique (p. ex., le test U de Mann Whitney) si les animaux atteignent le seuil de 2 minutes sans satisfaire à la mesure de résultat souhaitée, ce qui donne des données non continues.
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Representative Results
Le test MCA a été utilisé avec succès avec plusieurs modèles de douleur de souris mécaniquement distincts. La figure 2 montre les données où la mesure de résultat choisie franchissait le point médian de la chambre 2 (figure 2A). Les données obtenues en utilisant le point à mi-chemin par rapport à l’échappement dans la chambre 3 sont très similaires, ~40 s pour la moitié contre ~45 s pour l’échappement de la chambre 3 dans le modèle de lésion nerveuse épargnée (SNI) de la douleur neuropathique avec une hauteur de sonde de 5 mm13.
Dans le modèle de douleur inflammatoire induite par la CFA, l’injection de solution saline sur la patte postérieure (intraplantaire) ne modifie pas la latence d’échappement par rapport à la ligne de base. Les souris auxquelles on a injecté du CFA dans une patte postérieure ont montré une augmentation significative de la latence d’échappement 4 jours après l’injection, mais seulement lorsque la hauteur de la sonde a été portée à 5 mm. De manière cruciale, cette latence accrue pour s’échapper à 5 mm n’a pas été observée chez les souris ayant reçu le carprofène AINS (10 mg / kg, i.p.) 90 minutes avant le début des tests (Figure 2B).
Le modèle de lésion nerveuse épargnée (SNI) de la douleur neuropathique traumatique est également associé à une augmentation significative de la latence pour s’échapper par rapport à la ligne de base lorsque la hauteur de la sonde a été fixée à 5 mm. Cet effet a été observé chez les souris SNI, mais pas chez leurs témoins chirurgicaux simulés. Cette latence d’échappement accrue a également été évitée par l’administration systémique de buprénorphine analgésique opioïde (25 μg/kg, i.p.) 90 min avant le test (Figure 2C). Une latence d’échappement accrue a également été observée chez les souris qui n’ont pas subi une série initiale de tests MCA avant une lésion nerveuse (figure 2D). Dans ce cas, l’augmentation de la latence d’échappement chez les souris SNI à 5 mm a été évitée par la gabapentine (30 mg / kg, i.p.) administrée 90 minutes avant le test. Collectivement, cela suggère que le MCA peut détecter des changements liés à la douleur dans l’aversion et l’évitement des stimuli dans deux modèles largement utilisés de douleur inflammatoire et neuropathique.
Le MCA a ensuite été testé dans le modèle de fracture / coulée du syndrome douloureux régional complexe de la douleur chronique (SDRC) qui est établi par une fracture du tibia distal droit fermé suivie de 3 semaines de coulée14. Ce modèle cliniquement informé présente une inflammation périphérique aiguë en phase, ainsi qu’une activité immunitaire à long terme dans le système nerveux central avec une allodynie persistante des membres postérieurs. À l’instar des modèles CFA et SNI, des latences d’échappement accrues ont été observées dans le modèle de fracture/coulée (figure 3A). Avant la blessure, la latence pour s’échapper de la chambre 1 augmentait proportionnellement à la hauteur de la sonde. Après la blessure, la latence d’échappement est demeurée inchangée à 0 mm, mais a considérablement augmenté à la hauteur de la sonde de 2 mm et de 5 mm pour les mâles et à la hauteur de la sonde de 5 mm pour les femelles par rapport à la ligne de base (figure 3B).
Figure 1 : Schéma et images du dispositif MCA. (A) Mesures des résultats potentiels dans le test MCA , (marquées par des icônes de cadran d’horloge) : latence jusqu’à la sortie de la chambre 1 (I), latence pour traverser plus de 50 % de la chambre 2 (ligne pointillée ; II), le temps total passé dans la chambre 2 (III), la latence pour atteindre la chambre d’évacuation (IV) ou le pourcentage de temps passé dans chaque chambre (V). Les animaux souffrant de douleur présentent en moyenne des valeurs plus élevées pour I, II et IV, et des valeurs réduites pour III. Une valeur réduite pour III augmente nécessairement la proportion de temps passé dans la chambre 1 et/ou la chambre 3, qui serait saisie par la mesure de résultat V. Créée avec Biorender.com. (B) Images illustrant le dispositif MCA (et les chambres numérotées 1, 2 et 3) avec les LED éteintes (en haut à gauche), les LED allumées (en bas à gauche). (C) Une vue des chambres d’en haut avec les portes ouvertes. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Évitement de l’augmentation de la douleur inflammatoire et neuropathique dans le test MCA. (A) Description de la mesure de résultat spécifique utilisée ici : latence pour traverser le point médian de la chambre 2. (B) L’injection intraplantaire de CFA a considérablement augmenté la latence d’échappement (carrés rouges) par rapport aux contrôles salins (cercles noirs) lorsque la hauteur de la sonde a été réglée à 5 mm. Le carprofène intrapéritonéal (10 mg/kg) a atténué l’augmentation induite par la CFA de la latence d’échappement (triangles bleus). Les données sont tracées en tant que latence d’échappement moyenne ± erreur type de la moyenne (SEM); n = 7 hommes/groupe. (C) La chirurgie des lésions nerveuses épargnées (SNI) a considérablement augmenté la latence d’échappement de la chambre 1 par rapport aux contrôles de chirurgie simulée (cercles noirs), lorsque la hauteur de la sonde a été réglée à 5 mm (carrés rouges). La buprénorphine intrapéritonéale (25 mg/kg) a significativement atténué cette augmentation de la latence d’échappement (triangles bleus). Les données sont tracées en tant que latence d’échappement moyenne ± SEM; n = 6-7 mâles par groupe. (D) L’augmentation de la latence d’échappement induite par le SNI a été inversée par l’utilisation de la gabapentine analgésique (triangles verts). Les données sont tracées en tant que latence d’échappement moyenne ± SEM; n = 8 hommes/groupe. ## = p < 0,01, ***/### = p < 0,001, pour les comparaisons indiquées (ANOVA bidirectionnelle, Bonferroni post-hoc). Ce chiffre a été modifié par rapport à13. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : La fracture tibiale/la coulée induite par la douleur chronique augmente l’évitement dans le test MCA. La fracture/coulée a significativement augmenté la latence d’échappement 3 semaines après la blessure (W3) par rapport à la ligne de base (BL) chez les mâles aux hauteurs de sonde de 2 mm et 5 mm et chez les femelles à la hauteur de sonde de 5 mm (n = 5/sexe). Les données de chaque souris sont représentées en noir délavé (mâles) ou en cayenne (femelles) avec une moyenne représentée par des lignes sombres. **/*** = p < 0,01/< 0,001 par rapport à la valeur de base appariée selon le sexe et la taille de la sonde par ANOVA bidirectionnelle, Tukey post-hoc. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Fichier supplémentaire 1: Fichier d’imprimante 3D SpikeBed-MCA. Lorsqu’il est imprimé dans un matériau biocompatible et lavable approprié, tel que le nylon 12, SpikeBed-MCA.stl produit la plate-forme de sondes tactiles qui dépassent à travers le sol de la chambre 2. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
Fichier supplémentaire 2: Fichier d’imprimante 3D MCA_baseplate. Lorsqu’il est imprimé dans un matériau biocompatible et lavable approprié, tel que le nylon 12, MCA_baseplate.stl produit le plancher de la chambre 2, à travers lequel les sondes tactiles dépassent. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
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Discussion
Comme pour tous les tests comportementaux, une manipulation appropriée, la randomisation et l’aveuglement au traitement des animaux sont essentiels tout au long du processus. Compte tenu des apports multifactoriels dans les comportements complexes et la prise de décision, il est impératif que les animaux soient manipulés, habitués et testés de la manière la plus cohérente possible tout en minimisant la détresse. Il faut également veiller à reproduire le moment du placement de la souris dans la chambre 1, à allumer les lumières LED et à supprimer la barrière, car les différences ici pourraient influencer le comportement ultérieur.
Il convient de noter que les différentes mesures des résultats illustrées à la figure 1A sont interdépendantes. Par exemple, une souris entrant dans la chambre 2 traverse généralement le point médian de la chambre 2, puis complète presque toujours l’échappement dans la chambre 3. Cela signifie que les mesures de résultats I, II et IV sont interdépendantes. Les mesures de résultats III et V mesurent le temps de séjour total dans la chambre 2 et la proportion de temps de séjour dans les 3 chambres, respectivement. Par conséquent, ces mesures sont étroitement liées les unes aux autres. Cependant, une souris peut théoriquement accumuler un temps de séjour important dans la chambre 2, que la traversée à mi-chemin ou l’échappement dans la chambre 3 ait eu une faible latence, une latence élevée ou ne se soit pas produite du tout.
Plusieurs variations ou modifications de cette méthode ont été rapportées. En plus des différentes mesures des résultats énumérées ici (figure 1), les chercheurs pourraient faire varier la progression de la hauteur de la sonde dans le but de mettre en évidence les différences de sensibilité. Comme il n’y avait pas de différences statistiquement significatives avec la hauteur intermédiaire de la sonde de 2 mm, il peut être plus efficace de faire fonctionner des souris uniquement à 0 mm et 5 mm. Alternativement, une hauteur de sonde comprise entre 2 et 5 mm, ou des courses répétées à une hauteur de sonde de 5 mm peuvent commencer à démasquer des différences qui n’étaient pas apparentes autrement. En outre, l’évaluation du temps de séjour dans chaque chambre peut être utilisée comme une lecture de la motivation et de l’activité. Cela peut être utile dans les cas où certaines souris passent rapidement à la chambre 3, puis retournent ensuite à la chambre 1 pour explorer davantage. Dans ces situations, la latence à l’entrée dans la chambre 3 seule ne capturerait pas cette subtilité. Augmenter le temps limite de test au-delà de la limite de 2 minutes fixée ici peut également s’avérer utile pour certains enquêteurs. Enfin, nous ne pouvons pas exclure la possibilité que des tests répétés sur les mêmes animaux (plus de trois fois décrits ici), ou des tests plus fréquents (moins de 4-7 jours entre les tests) puissent introduire des effets d’accoutumance ou d’apprentissage. Pour ces raisons, l’inclusion de groupes témoins naïfs et non manipulés à chaque point temporel est encouragée. En fin de compte, les variations de comportement sont très susceptibles d’être spécifiques au modèle de douleur et justifient une enquête plus approfondie dans ces modèles et d’autres modèles de douleur.
Les modèles induisant la douleur utilisés ici (CFA, SNI, fracture/coulée) sont généralement associés à une hypersensibilité dans d’autres tests de comportement de la douleur, ce qui correspond à une augmentation de la latence d’évitement / évasion. Le test MCA peut également être en mesure de détecter une perte d’acuité sensorielle (via une augmentation du temps passé dans la chambre 2, par exemple), bien que cela n’ait pas été formellement testé. MCA a certaines limitations qui méritent d’être prises en considération. L’aversion pour la lumière vive est un moyen clé de motiver l’entrée dans la chambre 2 et donc un moteur de conflit ultérieur. Toute caractéristique pathologique associée à un modèle murin particulier qui pourrait altérer l’aversion à la lumière vive (par exemple, une déficience visuelle) doit être soigneusement examinée avant d’utiliser ce test. La contribution de l’anxiété pour échapper à la latence n’a pas non plus été systématiquement testée, bien que des modèles de douleur inflammatoire et neuropathique chronique aient été rapportés pour montrer des signes de comportement anxieux chez la souris dans d’autres tests, il continue d’y avoir un débat concernant ce15,16. Cela dit, une contribution de l’anxiété liée à la douleur à ces résultats comportementaux ne peut pas être confirmée ou exclue pour le moment. Étant donné que MCA a de multiples intrants dans les mesures de résultats, cela s’accompagne de plus de confusions potentielles à considérer.
En résumé, le test MCA fournit une lecture non réflexive de la sensibilité à la douleur dans les modèles murins. Les mesures des résultats sont influencées par des facteurs autres que la sensibilité réflexive et fournissent une mesure composite de la sensibilité à la douleur et de l’état affectif/motivationnel. Le temps nécessaire pour exécuter chaque test, le niveau de compétence et d’équipement spécialisé requis se comparent favorablement à d’autres mesures non réflexives de la douleur, telles que l’analyse de la marche ou la préférence de lieu conditionné 5,13. Bien qu’encore quelque peu nouvelle, l’approche a été adoptée et vérifiée de manière indépendante par plusieurs équipes d’enquêteurs, principalement chez le rat. La ligature partielle du nerf sciatique a augmenté la latence de sortie17 et le sevrage dépendant de la morphine chez les rats7. Une autre étude chez le rat a proposé que le comptage du nombre de croisements, en utilisant des modèles de lésions de la moelle épinière et de lésions de constriction chronique chez le rat, puisse servir de mesure de résultat utile8. De manière cruciale, cette étude a également identifié une augmentation de l’évitement des sondes dans les contrôles de chirurgie simulée, indiquant que l’inclusion d’un groupe naïf aux côtés des contrôles simulés / véhicules est justifiée. Les applications futures du MCA pourraient se concentrer sur la variation entre les souches de souris et / ou les modèles de douleur, l’impact de l’anxiété sur les performances du test et l’intégration de l’analyse de la posture ou de la cinématique de la marche pour mieux comprendre les différences dans les adaptations comportementales aux stimuli nocifs.
L’écart translationnel entre les études précliniques sur la souris et le développement de nouveaux traitements continue de présenter une source de préoccupation. Dans cet esprit, le test MCA complète les outils existants dans la recherche sur la douleur et aide à donner une image plus complète des nombreuses dimensions sensorielles et affectives de la douleur.
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Disclosures
Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts pertinent à divulguer.
Acknowledgments
GM est soutenu par une bourse d’études supérieures NDSEG. Le VLT est soutenu par la #GM137906 de subvention NIGMS des NIH et la Fondation Rita Allen. AJS est soutenu par les subventions du ministère de la Défense W81XWH-20-1-0277, W81XWH-21-1-0197 et la Fondation Rita Allen. Nous sommes reconnaissants au Dr Alexxai Kravitz de la faculté de médecine de l’Université de Washington d’avoir conçu et mis à disposition gratuitement les fichiers d’imprimante 3D pour la chambre 2 étage et la plaque de sonde.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 32.8ft 3000K-6000K Tunable White LED Strip Lights, Dimmable Super Bright LED Tape Lights with 600 SMD 2835 LEDs | Lepro | SKU: 410087-DWW-US | For lighting chamber 1. https://www.lepro.com/32ft-dimmable-tunable-white-led-strip-lights.html |
| 3D printed 'spike bed' and 'chamber 2 floor' | Shapeways | N/A | Optional, for mechanical probes as an alternative to blunted map pins. |
| 70% ethanol | Various | N/A | To clean MCA between mice. |
| Acryl-Hinge 2 | TAP Plastics | N/A | for attaching chamber lids to rear walls. https://www.tapplastics.com/product/plastics/handles_hinges_latches/acryl_hinge_2/122 |
| Chemcast Cast Acrylic Sheet, Clear | TAP Plastics | N/A | 3mm thick. For front wall of chamber 1. https://www.tapplastics.com/product/plastics/cut_to_size_plastic/acrylic_sheets_cast_clear/510 |
| Chemcast Cast Transparent Colored Acrylic, Transparent Dark Red - 50% | TAP Plastics | N/A | 3mm thick. 50% light transmission. For walls and lids of chambers 2 and 3. https://www.tapplastics.com/product/plastics/cut_to_size_plastic/acrylic_sheets_transparent_colors/519 |
| Chemcast Translucent & Opaque Colored Cast Acrylic, Sign Opaque White - 0.1% | TAP Plastics | N/A | 3mm thick. For side walls and lid of chamber 1. https://www.tapplastics.com/product/plastics/cut_to_size_plastic/acrylic_sheets_color/341 |
| Disinfectant (e.g. Quatricide) | Pharmacal Research Laboratories, Inc. | 65020F | To disinfect MCA at the end of a testing session. |
| Dry-erase markers and board | Various | N/A | To add experimental info to the beginning of video footage. |
| Map pins | Various | N/A | Optional, for mechanical probes. Use sandpaper to blunt sharp points before use. Can be used in place of 3D-printed parts. |
| Paper towels | Various | N/A | To clean/disinfect MCA. |
| SCIGRIP Weld-On #3 Acrylic Cement | TAP Plastics | N/A | For assembling acrylic sheets into chambers and affixing hinges. https://www.tapplastics.com/product/repair_products/plastic_adhesives/weld_on_3_cement/131 |
| Stopwatch | Various | N/A | To record escape latencies/dwell times in real-time or from recorded video. |
| Timer | Various | N/A | To ensure LED turn-on, barrier removal and test completion are timed consistently. |
| Video camera | Various | HDRCX405 Handycam Camcorder | To record mouse behavior in the MCA device. Can be substituted with any consumer-grade video camera capable of 1080p resolution. |
| Tripod | Famall | N/A | Any tripod that can hold the camera at bench height for recording MCA footage is acceptable. |
References
- Hargreaves, K., Dubner, R., Brown, F., Flores, C., Joris, J. A new and sensitive method for measuring thermal nociception in cutaneous hyperalgesia. Pain. 32 (1), 77-88 (1988).
- Chaplan, S. R., Bach, F. W., Pogrel, J. W., Chung, J. M., Yaksh, T. L. Quantitative assessment of tactile allodynia in the rat paw. Journal of Neuroscience Methods. 53 (1), 55-63 (1994).
- Sheahan, T. D., et al. Inflammation and nerve injury minimally affect mouse voluntary behaviors proposed as indicators of pain. Neurobiology of Pain. 2, 1-12 (2017).
- Wodarski, R., et al. Cross-centre replication of suppressed burrowing behaviour as an ethologically relevant pain outcome measure in the rat: a prospective multicentre study. Pain. 157 (10), 2350-2365 (2016).
- King, T., et al. Unmasking the tonic-aversive state in neuropathic pain. Nature Neuroscience. 12 (11), 1364-1366 (2009).
- Harte, S. E., Meyers, J. B., Donahue, R. R., Taylor, B. K., Morrow, T. J. Mechanical Conflict System: A Novel Operant Method for the Assessment of Nociceptive Behavior. PLoS One. 11 (2), 0150164 (2016).
- Pahng, A. R., Edwards, S. Measuring Pain Avoidance-Like Behavior in Drug-Dependent Rats. Current Protocols in Neuroscience. 85 (1), 53 (2018).
- Odem, M. A., et al. Sham surgeries for central and peripheral neural injuries persistently enhance pain-avoidance behavior as revealed by an operant conflict test. Pain. 160 (11), 2440-2455 (2019).
- LaBuda, C. J., Fuchs, P. N. A behavioral test paradigm to measure the aversive quality of inflammatory and neuropathic pain in rats. Experimental Neurology. 163 (2), 490-494 (2000).
- LaBuda, C. J., Fuchs, P. N. Morphine and gabapentin decrease mechanical hyperalgesia and escape/avoidance behavior in a rat model of neuropathic pain. Neuroscience Letters. 290 (2), 137-140 (2000).
- Vichaya, E. G., et al. Motivational changes that develop in a mouse model of inflammation-induced depression are independent of indoleamine 2,3 dioxygenase. Neuropsychopharmacology. 44 (2), 364-371 (2019).
- Hascoët, M., Bourin, M., Nic Dhonnchadha, B. A. The mouse light-dark paradigm: a review. Progress in Neuropsychopharmacology & Biological Psychiatry. 25 (1), 141-166 (2001).
- Shepherd, A. J., Mohapatra, D. P. Pharmacological validation of voluntary gait and mechanical sensitivity assays associated with inflammatory and neuropathic pain in mice. Neuropharmacology. 130, 18-29 (2018).
- Huck, N. A., et al. Temporal Contribution of Myeloid-Lineage TLR4 to the Transition to Chronic Pain: A Focus on Sex Differences. Journal of Neuroscience. 41 (19), 4349-4365 (2021).
- Pitzer, C., La Porta, C., Treede, R. D., Tappe-Theodor, A. Inflammatory and neuropathic pain conditions do not primarily evoke anxiety-like behaviours in C57BL/6 mice. European Journal of Pain. 23 (2), 285-306 (2019).
- Sieberg, C. B., et al. Neuropathic pain drives anxiety behavior in mice, results consistent with anxiety levels in diabetic neuropathy patients. Pain Reports. 3 (3), 651 (2018).
- Meuwissen, K. P. V., van Beek, M., Joosten, E. A. J. Burst and Tonic Spinal Cord Stimulation in the Mechanical Conflict-Avoidance System: Cognitive-Motivational Aspects. Neuromodulation. 23 (5), 605-612 (2020).
