Mechanischer Konfliktvermeidungstest zur Messung des Schmerzverhaltens bei Mäusen

Summary

Der mechanische Konfliktvermeidungsassay wird als nichtreflexives Auslesen der Schmerzempfindlichkeit bei Mäusen verwendet, um affektiv-motivationale Reaktionen in einer Vielzahl von Mausschmerzmodellen besser zu verstehen.

Abstract

Schmerz umfasst sowohl sensorische (nozizeptive) als auch affektive (unangenehme) Dimensionen. In präklinischen Modellen wurde der Schmerz traditionell mit reflexiven Tests bewertet, die Rückschlüsse auf die nozizeptive Komponente des Schmerzes zulassen, aber wenig Informationen über die affektive oder motivationale Komponente des Schmerzes liefern. Die Entwicklung von Tests, die diese Schmerzkomponenten erfassen, ist daher translational wichtig. Daher müssen Forscher nicht-reflexive Verhaltensassays verwenden, um die Schmerzwahrnehmung auf dieser Ebene zu untersuchen. Mechanische Konfliktvermeidung (MCA) ist ein etablierter freiwilliger nicht-reflexiver Verhaltensassay, um motivierende Reaktionen auf einen schädlichen mechanischen Reiz in einem 3-Kammer-Paradigma zu untersuchen. Eine Änderung der Standortpräferenz einer Maus, wenn sie mit konkurrierenden schädlichen Reizen konfrontiert wird, wird verwendet, um auf die wahrgenommene Unannehmlichkeit von hellem Licht gegenüber der taktilen Stimulation der Pfoten zu schließen. Dieses Protokoll skizziert eine modifizierte Version des MCA-Assays, mit der Schmerzforscher affektiv-motivationale Reaktionen in einer Vielzahl von Mausschmerzmodellen verstehen können. Obwohl hier nicht ausdrücklich beschrieben, verwenden unsere Beispiel-MCA-Daten das intraplantare vollständige Freund-Adjuvans (CFA), die verschonte Nervenverletzung (SNI) und ein Fraktur- / Casting-Modell als Schmerzmodelle, um das MCA-Verfahren zu veranschaulichen.

Introduction

Schmerz ist eine komplexe Erfahrung mit sensorischen und affektiven Komponenten. Eine Verringerung der Schmerzwahrnehmungsschwelle und Überempfindlichkeit gegen thermische und/oder mechanische Reize sind Schlüsselmerkmale dieser Erfahrung, die reizbeschworene Schmerzverhaltenstests erfassen können (wie Hargreaves' Test der Hitzeempfindlichkeit und der von Frey-Test der mechanischen Empfindlichkeit^)1,2. Obwohl solche Tests robuste und reproduzierbare Ergebnisse liefern, sind sie durch ihre Abhängigkeit von einem reflexiven Rückzug aus einem wahrgenommenen schädlichen Reiz begrenzt. Dies hat die anhaltende Abhängigkeit der Schmerzforschung allein von diesen Tests in Frage gestellt. Zu diesem Zweck erforschen Schmerzforscher seit mehreren Jahren alternative/komplementäre Verhaltenstests für die Verwendung in Nagetierschmerzmodellen, um mehr von den affektiven und / oder motivierenden Komponenten des Schmerzes zu erfassen. Diese nicht evozierten, freiwilligen oder nicht-reflexiven Maßnahmen (z. B. Radlauf, Grabungsaktivität, konditionierte Platzpräferenz ^3,4,5) werden implementiert, um die Übersetzbarkeit der präklinischen Schmerzforschung zu verbessern.

Der MCA-Assay (Mechanical Conflict Avoidance) wurde ursprünglich von Harte et al. in 2016⁶ beschrieben, wird überwiegend bei Ratten ^7,8 verwendet und stellt eine Modifikation eines früheren Ansatzes dar - des Paradigmas der Ortsfluchtvermeidung. Bei diesem Ansatz wird ein schädlicher Reiz der Hinterpfote in einer ansonsten wünschenswerten (dunklen) Kammer durchgeführt, um ein zielgerichtetes Verhalten des Tieres zu fördern, um einer solchen Stimulation zu entkommen / auszuweichen ^9,10. Anstatt sich auf die manuelle schädliche Stimulation der Hinterpfote durch einen Beobachter zu verlassen, zwingt der MCA-Assay die Mäuse, einen potenziell schädlichen Reiz auszuhandeln, um einer aversiven Umgebung zu entkommen und die dunkle Kammer zu erreichen. Der Konflikt / die Vermeidung, die dem Assay seinen Namen gibt, ergibt sich aus diesen beiden konkurrierenden Motivationen: Flucht aus hell erleuchteten Bereichen und Vermeidung einer schädlichen Stimulation der Pfoten. Der MCA-Assay teilt auch Merkmale mit konditionierten Ortspräferenztests, bei denen die Paarung von Schmerzlinderung mit Umwelthinweisen Verhaltensänderungen hervorruft, die eine Präferenz für den schmerzlindernden / belohnenden Kontext^{widerspiegeln 11}.

Grundsätzlich teilen alle diese Assays einen ähnlichen Ansatz: Die Verwendung einer Verschiebung der Präferenz eines Tieres für eine aversive Umgebung gegenüber einer anderen als Indikator für seinen affektiven / motivationalen Zustand. Der MCA-Assay ist ein 3-Kammer-Paradigma, das aus einer hell erleuchteten Kammer besteht, gefolgt von einer dunklen mittleren Kammer mit höhenverstellbaren Sonden und einer dunklen dritten Kammer ohne aversive Reize. Eine unverletzte Maus ist typischerweise motiviert, in eine dunkle Kammer zu entkommen, angesichts der angeborenen Abneigung von Nagetieren gegen helles Licht¹². In diesem Beispiel überwindet die natürliche Motivation, einer hell erleuchteten Umgebung zu entkommen, die Abneigung, auf Hinterpfotenstimulation (die verstellbaren Höhensonden) zu stoßen, die ausschließlich in der abgedunkelten Umgebung auftritt. Im Gegensatz dazu kann sich eine Maus, die Schmerzen hat (z. B. aufgrund von Entzündungen oder Neuropathie), dafür entscheiden, mehr Zeit in der hell erleuchteten Umgebung zu verbringen, da die Motivation besteht, die unangenehme taktile Erfahrung der mechanischen Sonden bei der Einstellung einer anhaltenden taktilen Überempfindlichkeit zu vermeiden.

Dieser Artikel beschreibt eine modifizierte Version des MCA-Assays. Wir haben die ursprüngliche Methode (die bei Ratten⁶ durchgeführt wurde) für die Anwendung bei Mäusen angepasst. Wir haben auch die Anzahl der getesteten Sondenhöhen von sechs auf drei (0, 2 und 5 mm über der Bodenhöhe) reduziert, um die Datenerfassung zu rationalisieren. Dieser Ansatz wurde in mehreren Schmerzmodellen getestet und mit bekannten Analgetika validiert, was darauf hindeutet, dass Schmerzüberempfindlichkeit und / oder die damit verbundenen affektiven und motivationalen Veränderungen diese Verhaltensänderungen vorantreiben. Dieser Ansatz ist relativ schnell durchzuführen und anpassungsfähig im Vergleich zu anderen nichtreflexiven Maßnahmen, die viele Tage der Gewöhnung und des Trainings erfordern können ^1,2. In Verbindung mit anderen Schmerzmessungen kann MCA wertvolle Einblicke in die affektiven und motivationalen Aspekte von Schmerz generieren.

Protocol

Alle Experimente mit der Verwendung von Mäusen und den darin angewandten Verfahren wurden von den Institutional Animal Care and Use Committees des MD Anderson Cancer Center und der Stanford University in strikter Übereinstimmung mit dem Leitfaden der National Institutes of Health für die Pflege und Verwendung von Labortieren genehmigt.

1. MCA-Konstruktion

1. Baukammer 1 mit folgenden Abmessungen: 125 mm x 125 mm x 125 mm (Breite x Tiefe x Höhe) aus undurchsichtigem weißem 3 mm starkem Acryl, das für die Seitenwände, den Boden und die Decke verwendet wird. Verwenden Sie ein klares 3 mm starkes Acryl für die nach vorne gerichtete Wand. Kleben Sie alle Seiten rechtzeitig im Voraus mit speziellem Acrylkleber zusammen.
   ACHTUNG: Acrylkleber gilt als Gefahrgut (brennbar, dampfschädlich, kann beim Verschlucken schädlich sein, Haut oder Augen reizen). Solche Klebstoffe sollten nur in Übereinstimmung mit den Anweisungen des Herstellers verwendet werden (d. h. mit geeigneter PSA in einem gut belüfteten Bereich).
2. Befestigen Sie den Deckel von Kammer 1 mit einem Scharnier, damit Mäuse leicht in die Kammer gelegt und aus ihr entnommen werden können. Befestigen Sie selbstklebendes Leuchtdiodenband (LED) an der Innenseite des Deckels, um eine Beleuchtung von ~ 4800 Lux zu erzielen.
3. Schließen Sie Kammer 1 vom Rest der MCA ab, indem Sie eine undurchsichtige Acrylplatte in und aus der Position schieben.
4. Konstruieren Sie die MCA-Testkammer, Kammer 2, als eine 270 mm lange, unbeleuchtete Kammer, die auf allen Seiten aus durchscheinendem dunkelrotem Acryl (3 mm dick) gefertigt ist, mit einem aufklappbaren Deckel auf der Oberseite. Platzieren Sie ein 13 x 31 Raster von 2 mm Löchern auf dem Boden von Kammer 2, durch das eine Reihe von stumpfen Sonden mit Spitzen von 0,5 mm Durchmesser (z. B. abgestumpfte Kartenstifte) hervorstehen kann.
   HINWEIS: Blunt-Pins mit einem Schleifpapierblock mit 120 Körnungen oder ähnlichem. Reinigen Sie sie in warmem Wasser mit Reinigungsmittel, bevor sie mit sporizidem Desinfektionsmittel desinfiziert werden.
5. Stellen Sie die Höhe der Sonden ein, indem Sie zusätzliche Acrylplatten unter die Tastgrundplatte legen (Abbildung 1). Konfigurieren Sie das Gerät bei diesem Ansatz mit drei Einstellungen: 0 mm, 2 mm und 5 mm Sondenhöhe.
6. Als Alternative zu abgestumpften Kartenstiften oder ähnlichen Materialien verwenden Sie die 3D-Druckerdateien, um den Boden von Kammer 2 und die Sondenplatte zu drucken (siehe Zusatzdatei 1: SpikeBed-MCA.stl, die sich auf die mechanischen Sonden bezieht, und Zusatzdatei 2: MCA_baseplate.stl, die den Boden von Kammer 2 bildet).
   HINWEIS: Wenn der 3D-Druck nicht verfügbar ist, kleben Sie die Pins mit demselben Acrylkleber auf eine Acrylplatte, der zum Konstruieren der Wände des Geräts verwendet wurde.
7. Drucken Sie mit einem waschbaren und biokompatiblen Material, wie z.B. Nylon 12 Kunststoff oder ähnlich (empfohlen).
8. Konstruieren Sie Kammer 3 mit folgenden Abmessungen: 125 mm x 125 mm x 125 mm als unbeleuchtete durchscheinende dunkelrote Acrylbox (auf allen Seiten), die am gegenüberliegenden Ende von Kammer 1 platziert ist. Legen Sie einen Klappdeckel auf die Kammer, ähnlich wie in den Kammern 1 und 2. Diese Kammer dient als abgedunkelter Fluchtbereich vor den mechanischen Sonden in Kammer 2.

2. MCA-Gewöhnung und Testen der Maus

1. Wie bei allen Experimenten mit Verhaltensergebnissen bei Tieren, sollten Sie eine angemessene Randomisierung und Verblindung beobachten, um mögliche Verzerrungen zu minimieren.
   HINWEIS: Die repräsentativen Ergebnisse wurden unter Verwendung von 8-12 Wochen alten männlichen und weiblichen C57BL/6J-Mäusen (Jackson Laboratories Stammnummer 000664) generiert. Die Mäuse wurden sozial untergebracht, bis zu 5 pro Käfig, mit Zugang zu Nahrung und Wasser ad libitum und einem Lichtzyklus von 07:00 h bis 19:00 h. Die MCA fand in der Lichtperiode zwischen 09:00 Uhr und 12:00 Uhr statt.
2. Einen Tag bevor Baseline-Tests geplant sind, akklimatisieren Sie Mäuse für 5 Minuten (Minimum) bis 15 min (maximal) mit ihren Käfigkameraden an die MCA-Einheit, um die soziale Erkundung des gesamten Geräts zu erleichtern.
3. Stellen Sie während des gesamten Prozesses sicher, dass die LEDs in Kammer 1 ausgeschaltet sind, die Barriere zwischen den Kammern 1 und 2 offen bleibt und die Sonden auf eine Höhe von Null eingestellt sind (d. h. nicht durch den Boden von Kammer 2 ragen).
4. Führen Sie einen Baseline-Test an Mäusen durch (optional), wenn die Studie Tiere mit negativer Kontrolle umfasst (z. B. Scheinoperationen oder Fahrzeuginjektionskontrollen). Verwenden Sie auf Wunsch einen Baseline-Test, um unverletzte Ausreißer auszuschließen, die niemals in Kammer 2 gelangen, obwohl sich dies nicht als notwendig erwiesen hat. Falls verwendet, melden Sie alle Ausschlusskriterien und die Anzahl der ausgeschlossenen Mäuse.
   1. Bevor Sie mit dem Testen beginnen, richten Sie eine Videokamera ein, die 1080p-Aufnahmen auf einem Stativ mit einer seitlichen Ansicht des gesamten MCA-Geräts aufnehmen kann. Passen Sie das Sichtfeld so an, dass der MCA das aufgenommene Bild ausfüllt.
   2. Sobald die Aufnahme beginnt, halten Sie eine Handheld-Trockenlöschtafel in das Sichtfeld der Kamera, um den Beginn des Videos mit identifizierenden Informationen über den Testlauf des Tieres zu kennzeichnen (z. B. Maus-ID, Sondenhöhe, Datum, Uhrzeit usw.).
   3. Legen Sie für den ersten Durchlauf die Sondenhöhe auf Null fest. Bringen Sie die zu testende Maus aus dem Heimkäfig in die Kammer 1 mit der Schrankentür. Starten Sie einen Timer, der im aufgezeichneten Filmmaterial sichtbar ist.
      HINWEIS: Der Timer stellt sicher, dass die Intervalle zwischen den verschiedenen Teilen des Tests zwischen den Läufen konsistent sind.
   4. Nach 10 s schalten Sie die Kammer 1 LEDs ein. Nachdem sich die Maus 20 Sekunden lang in der beleuchteten Kammer befunden hat, ziehen Sie die Barriere zwischen den Kammern 1 und 2 zurück.
   5. Beobachten Sie das Tier für 2 min. Messen Sie Latenzen und/oder Verweilzeiten mit einer Stoppuhr, während der Test läuft. Alternativ kann das Videomaterial analysiert werden, sobald die Tests abgeschlossen sind.
      HINWEIS: Aus Gründen des Durchsatzes und der Vermeidung längerer Exposition gegenüber aversiven Reizen wurde der Cutoff auf 2 min festgelegt.
   6. Messen Sie eines oder mehrere der verschiedenen nützlichen Ergebnisse, die identifiziert wurden (siehe unten; Abbildung 1). Es wird empfohlen, alle 5 Ergebnismaße zu analysieren, wenn mit dem Testen begonnen wird, um festzustellen, welche Aspekte des Verhaltens sich in einem bestimmten Versuchsaufbau unterscheiden.
      1. Option I: Notieren Sie die Latenz bis zum ersten Eingang in Kammer 2. Option II: Notieren Sie die Latenz, um mehr als die Hälfte von Kammer 2 zu überqueren. Option III: Zeichnen Sie die gesamte Verweildauer in Kammer 2 auf. Option IV: Notieren Sie sich die Latenz, um Kammer 3 zu erreichen (Escape). Option V: Ähnlich wie bei Option II wird die Gesamtverweilzeit in jeder Kammer innerhalb von 2 Minuten aufgezeichnet und in Proportionen umgerechnet.
         HINWEIS: Da jedes Experiment einzigartig ist und durch biologische Faktoren und Verhaltensänderungen, die für das Krankheitsmodell einzigartig sind, beeinflusst werden kann, können Forscher mit diesen und anderen Maßnahmen in ihren eigenen Händen experimentieren.
   7. Sobald die Tests abgeschlossen sind, bringen Sie die Maus in ihren Heimkäfig zurück, reinigen Sie die MCA-Kammern mit 70% Ethanol und lassen Sie sie vollständig trocknen.
      HINWEIS: Fäkale Boli können in der Regel relativ einfach mit Papiertüchern vor dem Ethanol / Desinfektionsmittel aus der Kammer gereinigt werden. Wenn eine gründlichere Reinigung erforderlich wird, können die Kammern 2 und 3 demontiert und in warmes Seifenwasser getaucht werden.
   8. Nachdem Sie alle Mäuse in einer Kohorte mit einer auf Null eingestellten Sondenhöhe ausgeführt haben, setzen Sie eine 3-mm-Acrylplatte unter die mechanische Tastgrundplatte ein und wiederholen Sie die Schritte 2.4.2 bis 2.4.7 mit einer Sondenhöhe von 2 mm.
   9. Nachdem alle Mäuse mit einer Sondenhöhe von 2 mm ausgeführt wurden, wird eine zweite 3-mm-Acrylplatte unter die Tastergrundplatte eingeführt und die Schritte 2.4.2 bis 2.4.7 mit einer Sondenhöhe von 5 mm wiederholt.
      HINWEIS: Eine Gruppe von 8 Mäusen kann mit diesem Ansatz in ca. 2 h getestet werden. Verwenden Sie kleinere Gruppengrößen, wenn ein genaueres Post-Drug-Timing erforderlich ist (z. B. für ein Drogenzeitkursexperiment).
   10. Führen Sie am Ende einer Testsitzung eine Endreinigung mit einem Desinfektionsmittel durch.
5. Wiederholen Sie die Tests nach Induktion einer Schmerzüberempfindlichkeit und / oder mit medikamentöser Behandlung.
6. Vergleichen Sie die Leistung jeder Maus zu Studienbeginn mit ihrer Leistung, nachdem der Schmerz ausgelöst wurde. Bewerten Sie die Auswirkungen einer pharmakologischen Intervention, indem Sie fahrzeugbehandelte Tiere zum gleichen Zeitpunkt mit medikamentös behandelten Tieren vergleichen.
7. Führen Sie eine nicht-parametrische statistische Analyse durch (z. B. den Mann Whitney U-Test), wenn die Tiere den 2-minütigen Grenzwert erreichen, ohne das gewünschte Ergebnismaß zu erfüllen, was zu nicht kontinuierlichen Daten führt.

Representative Results

Der MCA-Assay wurde erfolgreich mit mehreren mechanistisch unterschiedlichen Mausschmerzmodellen eingesetzt. Abbildung 2 zeigt Daten, bei denen das Ergebnismaß der Wahl den Mittelpunkt von Kammer 2 kreuzte (Abbildung 2A). Die Daten, die durch die Verwendung des Halbwegs versus Flucht in Kammer 3 erhalten wurden, sind sehr ähnlich, ~ 40 s für die Hälfte des Weges gegenüber ~ 45 s für die Flucht aus Kammer 3 im SNI-Modell (SNI) für neuropathische Schmerzen mit 5 mm Sondenhöhe¹³.

Im CFA-induzierten entzündlichen Schmerzmodell ändert die Kontrolle der Hinterpfote (intraplantare) Injektion von Kochsalzlösung die Fluchtlatenz gegenüber dem Ausgangswert nicht. Jene Mäuse, denen CFA in eine Hinterpfote injiziert wurde, zeigten 4 Tage nach der Injektion einen signifikanten Anstieg der Fluchtlatenz, jedoch nur, wenn die Sondenhöhe auf 5 mm erhöht wurde. Entscheidend ist, dass diese erhöhte Latenz, um bei 5 mm zu entweichen, bei Mäusen, die das NSAID-Carprofen (10 mg/kg, i.p.) 90 Minuten vor Beginn der Tests erhielten, nicht beobachtet wurde (Abbildung 2B).

Das SNI-Modell (SNI) für traumatische neuropathische Schmerzen ist auch mit einer signifikanten Erhöhung der Latenz zur Flucht gegenüber dem Ausgangswert verbunden, wenn die Sondenhöhe auf 5 mm eingestellt wurde. Dieser Effekt wurde bei SNI-Mäusen beobachtet, aber nicht bei ihren Scheinoperationen. Diese erhöhte Fluchtlatenz wurde auch durch die systemische Verabreichung des Opioid-Analgetikums Buprenorphin (25 μg/kg, i.p.) 90 Minuten vor dem Test verhindert (Abbildung 2C). Eine erhöhte Fluchtlatenz wurde auch bei Mäusen beobachtet, die vor einer Nervenverletzung keine Baseline-Runde von MCA-Tests unterzogen wurden (Abbildung 2D). In diesem Fall wurde die erhöhte Fluchtlatenz bei SNI-Mäusen bei 5 mm verhindert, indem Gabapentin (30 mg/kg, i.p.) 90 Minuten vor dem Test verabreicht wurde. Insgesamt deutet dies darauf hin, dass MCA schmerzbedingte Veränderungen der Reizaversion und -vermeidung in zwei weit verbreiteten Modellen entzündlicher und neuropathischer Schmerzen erkennen kann.

MCA wurde weiter im Fraktur-/Casting-Modell des chronischen Schmerzzustandskomplexes regionales Schmerzsyndrom (CRPS) getestet, das durch eine geschlossene rechtsdistale Tibiafraktur gefolgt von 3 Wochen Casting¹⁴ festgestellt wird. Dieses klinisch informierte Modell zeigt eine akute periphere Entzündung in der Phase sowie eine langfristige Immunaktivität im zentralen Nervensystem mit persistierender Allodynie der Hinterbeine Ähnlich wie bei den CFA- und SNI-Modellen wurden im Bruch-/Gießmodell erhöhte Fluchtlatenzen beobachtet (Abbildung 3A). Vor der Verletzung erhöhte sich die Verzögerung, um aus Kammer 1 zu entkommen, proportional zur Sondenhöhe. Nach der Verletzung blieb die Fluchtlatenz unverändert bei 0 mm, stieg aber bei der Sondenhöhe von 2 mm und 5 mm für Männer und der Sondenhöhe von 5 mm für Weibchen im Vergleich zum Ausgangswert signifikant an (Abbildung 3B).

Abbildung 1: Schaltplan und Bilder des MCA-Geräts. (A) Mögliche Ergebnismaße im MCA-Assay (gekennzeichnet durch Clockface-Symbole): Latenz bis zur Austrittskammer 1 (I), Latenz, um mehr als 50% von Kammer 2 zu überqueren (gepunktete Linie; II), die Gesamtzeit, die in Kammer 2 (III) verbracht wird, die Latenzzeit zum Erreichen der Fluchtkammer (IV) oder die prozentuale Zeit, die in jeder Kammer verbracht wird (V). Tiere, die im Durchschnitt Schmerzen haben, zeigen höhere Werte für I, II und IV und reduzierte Werte für III. Ein reduzierter Wert für III erhöht notwendigerweise den Anteil der in Kammer 1 und/oder Kammer 3 verbrachten Zeit, der durch Ergebnismaß V erfasst würde. Erstellt mit Biorender.com. (B) Bilder, die das MCA-Gerät (und die Kammern mit den Nummern 1, 2 und 3) mit ausgeschalteten LEDs (oben links) und eingeschalteten LEDs (unten links) zeigen. (C) Ein Blick auf die Kammern von oben bei geöffneten Türen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 2: Entzündliche und neuropathische Schmerzen verstärken die Vermeidung im MCA-Assay. (A) Darstellung des hier verwendeten spezifischen Ergebnismaßes: Latenz zum Überqueren des Mittenpunkts der Kammer 2. (B) Die intraplantare Injektion von CFA erhöhte signifikant die Latenz zum Entweichen (rote Quadrate) im Vergleich zu salzhaltigen Kontrollen (schwarze Kreise), wenn die Sondenhöhe auf 5 mm eingestellt wurde. Intraperitoneales Carprofen (10 mg/kg) dämpfte den CFA-induzierten Anstieg der Fluchtlatenz (blaue Dreiecke). Die Daten werden als mittlere Fluchtlatenz ± Standardfehler des Mittelwerts (SEM) dargestellt. n = 7 Männer/Gruppe. (C) Die Operation mit verschonten Nervenverletzungen (SNI) erhöhte die Fluchtlatenz in Kammer 1 im Vergleich zu Scheinoperationskontrollen (schwarze Kreise) signifikant, wenn die Sondenhöhe auf 5 mm (rote Quadrate) eingestellt wurde. Intraperitoneales Buprenorphin (25 mg/kg) dämpfte diesen Anstieg der Escape-Latenz signifikant ab (blaue Dreiecke). Daten werden als mittlere Fluchtlatenz ± SEM dargestellt; n = 6-7 Männchen pro Gruppe. (D) Der SNI-induzierte Anstieg der Escape-Latenz wurde durch die Verwendung des Analgetikums Gabapentin (grüne Dreiecke) umgekehrt. Daten werden als mittlere Fluchtlatenz ± SEM dargestellt; n = 8 Männchen/Gruppe. ## = p < 0,01, ***/### = p < 0,001, für die angegebenen Vergleiche (Zwei-Wege-ANOVA, Bonferroni post-hoc). Diese Zahl wurde von¹³ geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 3: Tibialfraktur/Casting induzierte Vermeidung chronischer Schmerzen verstärken die Vermeidung im MCA-Assay. Fraktur/Guss erhöhte signifikant die Fluchtlatenz 3 Wochen nach der Verletzung (W3) im Vergleich zum Ausgangswert (BL) bei Männern in den Sondenhöhen 2 mm und 5 mm und bei Frauen in der Sondenhöhe von 5 mm (n = 5 / Geschlecht). Die Daten jeder Maus werden in verblasstem Schwarz (Männchen) oder Cayenne (Weibchen) dargestellt, wobei der Mittelwert durch dunkle Linien dargestellt wird. **/*** = p < 0,01/< 0,001 versus Sex- und Sondenhöhen-angepasster Baseline-Wert durch Zwei-Wege-ANOVA, Tukey post-hoc. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Zusatzdatei 1: 3D-Druckerdatei SpikeBed-MCA. Wenn SpikeBed-MCA.stl in einem geeigneten biokompatiblen und waschbaren Material wie Nylon 12 gedruckt wird, erzeugt es die Plattform der taktilen Sonden, die durch den Boden von Kammer 2 ragen. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Zusatzdatei 2: 3D-Drucker-Datei MCA_baseplate. Wenn es in einem geeigneten biokompatiblen und waschbaren Material wie Nylon 12 gedruckt wird, erzeugt MCA_baseplate.stl den Boden von Kammer 2, durch den die taktilen Sonden hinausragen. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Discussion

Wie bei allen Verhaltenstests ist die richtige Handhabung, Randomisierung und Verblindung für die Behandlung von Tieren überall unerlässlich. Angesichts der multifaktoriellen Inputs in komplexe Verhaltensweisen und Entscheidungen ist es unerlässlich, dass Tiere so konsequent wie möglich behandelt, gewöhnt und getestet werden, während die Not minimiert wird. Es sollte auch darauf geachtet werden, das Timing der Mausplatzierung in Kammer 1 zu reproduzieren, die LED-Leuchten einzuschalten und die Barriere zu entfernen, da Unterschiede hier das nachfolgende Verhalten beeinflussen könnten.

Es sei darauf hingewiesen, dass die verschiedenen in Abbildung 1A dargestellten Ergebnismaße miteinander verknüpft sind. Zum Beispiel überquert eine Maus, die Kammer 2 betritt, normalerweise die Hälfte von Kammer 2 und schließt dann fast immer die Flucht in Kammer 3 ab. Das bedeutet, dass die Ergebnismaße I, II und IV miteinander verknüpft sind. Die Ergebnismaße III und V messen die Gesamtverweilzeit in Kammer 2 bzw. den Anteil der Verweildauer in allen 3 Kammern. Daher sind diese Maßnahmen eng miteinander verbunden. Eine Maus kann jedoch theoretisch eine beträchtliche Verweilzeit in Kammer 2 ansammeln, unabhängig davon, ob die halbe Überquerung oder Flucht in Kammer 3 eine geringe Latenz, eine hohe Latenz oder gar nicht auftrat.

Mehrere Variationen oder Modifikationen dieser Methode wurden berichtet. Zusätzlich zu den verschiedenen hier aufgeführten Ergebnismaßen (Abbildung 1) konnten die Forscher die Progression der Sondenhöhe variieren, um Unterschiede in der Empfindlichkeit hervorzuheben. Da es keine statistisch signifikanten Unterschiede zur mittleren Sondenhöhe von 2 mm gab, kann es effizienter sein, Mäuse nur mit 0 mm und 5 mm laufen zu lassen. Alternativ kann eine Sondenhöhe zwischen 2 und 5 mm oder wiederholte Läufe in einer Sondenhöhe von 5 mm beginnen, Unterschiede zu entlarven, die sonst nicht offensichtlich waren. Darüber hinaus kann die Bewertung der Verweildauer in jeder Kammer als Auswertung von Motivation und Aktivität verwendet werden. Dies kann in Fällen nützlich sein, in denen einige Mäuse schnell durch Kammer 3 laufen, aber dann zu Kammer 1 zurückkehren, um weitere Erkundungen durchzuführen. In diesen Situationen würde die Latenz bis zum Eintritt in Kammer 3 allein diese Subtilität nicht erfassen. Die Erhöhung der Testcutoff-Zeit über die hier festgelegte Grenze von 2 Minuten hinaus kann sich für einige Forscher ebenfalls als lohnenswert erweisen. Schließlich können wir die Möglichkeit nicht ausschließen, dass wiederholte Tests derselben Tiere (mehr als die hier beschriebenen drei Male) oder Tests mit größerer Häufigkeit (weniger als 4-7 Tage zwischen den Tests) Gewöhnungs- oder Lerneffekte verursachen können. Aus diesen Gründen wird die Einbeziehung naiver, nicht manipulierter Kontrollgruppen zu jedem Zeitpunkt gefördert. Letztendlich sind Variationen im Verhalten höchstwahrscheinlich schmerzmodellspezifisch und rechtfertigen weitere Untersuchungen in diesen und anderen Schmerzmodellen.

Die hier verwendeten schmerzauslösenden Modelle (CFA, SNI, Fraktur/Casting) sind typischerweise mit einer Überempfindlichkeit in anderen Schmerzverhaltenstests assoziiert, was einer Erhöhung der Vermeidungs-/Fluchtlatenz entspricht. Der MCA-Assay kann auch in der Lage sein, einen Verlust der sensorischen Schärfe zu erkennen (z. B. durch erhöhte Zeit, die in Kammer 2 verbracht wird), obwohl dies nicht formell getestet wurde. MCA hat einige Einschränkungen, die eine Berücksichtigung rechtfertigen. Die Abneigung gegen helles Licht ist ein wichtiges Mittel zur Motivation des Eintritts in Kammer 2 und damit ein Treiber für spätere Konflikte. Jedes pathologische Merkmal, das mit einem bestimmten Mausmodell verbunden ist und die Abneigung gegen helles Licht verändern könnte (z. B. Sehbehinderung), sollte vor der Anwendung dieses Tests sorgfältig abgewogen werden. Der Beitrag der Angst zur Flucht vor der Latenz wurde ebenfalls nicht systematisch getestet, obwohl berichtet wurde, dass chronisch entzündliche und neuropathische Schmerzmodelle in anderen Tests Anzeichen von angstähnlichem Verhalten bei Mäusen zeigen, gibt es weiterhin eine Debatte darüber^15,16. Das heißt, ein Beitrag der schmerzbedingten Angst zu diesen Verhaltensergebnissen kann zu diesem Zeitpunkt nicht bestätigt oder ausgeschlossen werden. Da MCA mehrere Inputs in die Ergebnismaße hat, bringt dies mehr potenzielle Verwechslungen mit sich, die berücksichtigt werden müssen.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass der MCA-Test eine nichtreflexive Anzeige der Schmerzempfindlichkeit in Mausmodellen liefert. Die Ergebnismessungen werden von anderen Faktoren als der reflexiven Empfindlichkeit beeinflusst und liefern ein zusammengesetztes Maß für die Schmerzempfindlichkeit und den affektiven/motivationalen Zustand. Die Zeit, die benötigt wird, um jeden Test durchzuführen, und das Niveau der Fähigkeiten und der erforderlichen Spezialausrüstung sind im Vergleich zu anderen nicht-reflexiven Schmerzmaßen wie Ganganalyse oder konditionierter Ortspräferenz^{günstig zu vergleichen 5,13}. Obwohl der Ansatz immer noch etwas neu ist, wurde er von mehreren Forscherteams, hauptsächlich bei Ratten, übernommen und unabhängig verifiziert. Die partielle Ischiasnervligatur erhöhte die Austrittslatenz¹⁷ und den morphiumabhängigen Entzug bei Ratten⁷. Eine andere Studie an Ratten schlug vor, dass die Zählung der Anzahl der Kreuzungen unter Verwendung von Rückenmarksverletzungen und chronischen Verengungsverletzungsmodellen bei Ratten als nützliches Ergebnismaß^{dienen kann 8}. Entscheidend ist, dass diese Studie auch eine Zunahme der Sondenvermeidung bei scheinchirurgischen Kontrollen feststellte, was darauf hindeutet, dass die Einbeziehung einer naiven Gruppe neben Schein- / Fahrzeugkontrollen gerechtfertigt ist. Zukünftige Anwendungen von MCA könnten sich auf die Variation zwischen Mausstämmen und/oder Schmerzmodellen, die Auswirkungen von Angstzuständen auf die Assay-Leistung und die Integration von Haltungsanalysen oder Gangkinematiken konzentrieren, um Unterschiede in Verhaltensanpassungen an schädliche Reize besser zu verstehen.

Die translationale Lücke zwischen präklinischen Mausstudien und der Entwicklung neuartiger Therapeutika gibt weiterhin Anlass zur Sorge. Vor diesem Hintergrund ergänzt der MCA-Assay bestehende Werkzeuge in der Schmerzforschung und hilft, ein vollständigeres Bild der vielen sensorischen und affektiven Dimensionen des Schmerzes zu vermitteln.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
32.8ft 3000K-6000K Tunable White LED Strip Lights, Dimmable Super Bright LED Tape Lights with 600 SMD 2835 LEDs	Lepro	SKU: 410087-DWW-US	For lighting chamber 1. https://www.lepro.com/32ft-dimmable-tunable-white-led-strip-lights.html
3D printed 'spike bed' and 'chamber 2 floor'	Shapeways	N/A	Optional, for mechanical probes as an alternative to blunted map pins.
70% ethanol	Various	N/A	To clean MCA between mice.
Acryl-Hinge 2	TAP Plastics	N/A	for attaching chamber lids to rear walls. https://www.tapplastics.com/product/plastics/handles_hinges_latches/acryl_hinge_2/122
Chemcast Cast Acrylic Sheet, Clear	TAP Plastics	N/A	3mm thick. For front wall of chamber 1. https://www.tapplastics.com/product/plastics/cut_to_size_plastic/acrylic_sheets_cast_clear/510
Chemcast Cast Transparent Colored Acrylic, Transparent Dark Red - 50%	TAP Plastics	N/A	3mm thick. 50% light transmission. For walls and lids of chambers 2 and 3. https://www.tapplastics.com/product/plastics/cut_to_size_plastic/acrylic_sheets_transparent_colors/519
Chemcast Translucent & Opaque Colored Cast Acrylic, Sign Opaque White - 0.1%	TAP Plastics	N/A	3mm thick. For side walls and lid of chamber 1. https://www.tapplastics.com/product/plastics/cut_to_size_plastic/acrylic_sheets_color/341
Disinfectant (e.g. Quatricide)	Pharmacal Research Laboratories, Inc.	65020F	To disinfect MCA at the end of a testing session.
Dry-erase markers and board	Various	N/A	To add experimental info to the beginning of video footage.
Map pins	Various	N/A	Optional, for mechanical probes. Use sandpaper to blunt sharp points before use. Can be used in place of 3D-printed parts.
Paper towels	Various	N/A	To clean/disinfect MCA.
SCIGRIP Weld-On #3 Acrylic Cement	TAP Plastics	N/A	For assembling acrylic sheets into chambers and affixing hinges. https://www.tapplastics.com/product/repair_products/plastic_adhesives/weld_on_3_cement/131
Stopwatch	Various	N/A	To record escape latencies/dwell times in real-time or from recorded video.
Timer	Various	N/A	To ensure LED turn-on, barrier removal and test completion are timed consistently.
Video camera	Various	HDRCX405 Handycam Camcorder	To record mouse behavior in the MCA device. Can be substituted with any consumer-grade video camera capable of 1080p resolution.
Tripod	Famall	N/A	Any tripod that can hold the camera at bench height for recording MCA footage is acceptable.