Summary
הבדיקה המכנית למניעת קונפליקטים משמשת כקריאה לא רפלקסיבית של רגישות לכאב בעכברים, שבה ניתן להשתמש כדי להבין טוב יותר תגובות רגשיות-מוטיבציוניות במגוון מודלים של כאב עכברים.
Abstract
הכאב מורכב הן מממדים חושיים (nociceptive) והן מממדים רגשיים (לא נעימים). במודלים פרה-קליניים, כאב הוערך באופן מסורתי באמצעות מבחנים רפלקסיביים המאפשרים מסקנות לגבי המרכיב הנוציפטי של הכאב, אך מספקים מידע מועט על המרכיב הרגשי או המוטיבציוני של הכאב. פיתוח מבחנים הלוכדים את מרכיבי הכאב הללו הם אפוא חשובים מבחינה תרגומית. לפיכך, חוקרים צריכים להשתמש במבחנים התנהגותיים לא רפלקסיביים כדי לחקור את תפיסת הכאב ברמה זו. הימנעות מקונפליקט מכני (MCA) היא בדיקת התנהגות לא רפלקסיבית מרצון מבוססת, לחקר תגובות מוטיבציה לגירוי מכני רעיל בפרדיגמה של 3 תאים. שינוי בהעדפת המיקום של העכבר, כאשר הוא מתמודד עם גירויים רעילים מתחרים, משמש כדי להסיק את אי הנעימות הנתפסת של אור בהיר לעומת גירוי מישושי של כפות הרגליים. פרוטוקול זה מתווה גרסה שונה של בדיקת MCA שבה חוקרי כאב יכולים להשתמש כדי להבין תגובות רגשיות-מוטיבציוניות במגוון מודלים של כאב עכברים. אף על פי שלא תוארו כאן באופן ספציפי, נתוני ה-MCA לדוגמה שלנו משתמשים באדג'ובנט התוך-פלנטרי השלם של פרוינד (CFA), בפגיעה עצבית שנחסכה (SNI) ובמודל שבר/יציקה כמודלים של כאב כדי להמחיש את הליך ה-MCA.
Introduction
כאב הוא חוויה מורכבת עם מרכיבים חושיים ורגשיים. הפחתה בסף תפיסת הכאב ורגישות יתר לגירויים תרמיים ו/או מכניים הם מאפיינים מרכזיים של חוויה זו, שמבחני התנהגות כאב מעוררי גירוי יכולים ללכוד (כמו מבחן רגישות החום של Hargreaves ומבחן פון פריי של רגישות מכנית)1,2. למרות שמבחנים כאלה נותנים תוצאות חזקות וניתנות לשחזור, הם מוגבלים על ידי הסתמכותם על נסיגה רפלקסיבית מגירוי מרושע נתפס. זה הטיל ספק בהסתמכות מתמשכת של מחקרי כאב על בדיקות אלה בלבד. לשם כך, חוקרי כאב בוחנים כבר מספר שנים מבחנים התנהגותיים חלופיים/משלימים לשימוש במודלים של כאב מכרסמים במאמץ ללכוד יותר מהמרכיבים הרגשיים ו/או המוטיבציוניים של הכאב. אמצעים לא מעוררים, רצוניים או לא רפלקסיביים אלה (למשל, ריצת גלגלים, פעילות מחילה, העדפת מקום מותנית 3,4,5) מיושמים בניסיון לשפר את יכולת התרגום של מחקר כאב פרה-קליני.
הבדיקה למניעת קונפליקט מכני (MCA) תוארה במקור על ידי Harte et al. בשנת 20166, משמשת בעיקר בחולדות 7,8, ומייצגת שינוי של גישה קודמת - פרדיגמת ההימנעות ממקום בריחה. בגישה זו, גירוי מזיק של הכפה האחורית מבוצע בתא רצוי (כהה) אחרת כדי להניע התנהגות תכליתית של החיה כדי לברוח / למנוע גירוי כזה 9,10. במקום להסתמך על גירוי ידני של הכפה האחורית על ידי משקיף, מבחן ה-MCA מאלץ את העכברים לנהל משא ומתן על גירוי שעלול להיות מזיק כדי להימלט מסביבה מרתיעה ולהגיע לתא החשוך. הקונפליקט/ההימנעות שמעניקים לבדיקה את שמה נובעת משני המניעים המתחרים הללו: לברוח מאזורים מוארים היטב ולהימנע מגירוי מרושע של כפות הרגליים. בדיקת MCA גם חולקת תכונות עם בדיקות העדפת מקום מותנות, שבהן השילוב של שיכוך כאבים עם רמזים סביבתיים מניע שינויים בהתנהגות המשקפים העדפה להקשר משכך הכאבים/מתגמל11.
ביסודו של דבר, כל המבחנים הללו חולקים גישה דומה: שימוש בשינוי בהעדפתו של בעל חיים לסביבה מרתיעה אחת על פני אחרת כאינדיקטור למצב הרגשי/מוטיבציוני שלהם. מבחן MCA הוא פרדיגמה של 3 תאים המורכבת מתא מואר בהיר ואחריו תא אמצעי כהה עם בדיקות גובה מתכווננות ותא שלישי כהה ללא כל גירויים מרתיעים. עכבר לא מרוסן הוא בדרך כלל מוטיבציה לברוח לחדר חשוך, בהתחשב בסלידה המולדת של מכרסמים מאור בהיר12. בדוגמה זו, המוטיבציה הטבעית לברוח מסביבה מוארת בבהירות מתגברת על חוסר ההתאמה להיתקל בגירוי כפות אחוריות (בדיקות הגובה המתכווננות), המתרחש אך ורק בסביבה החשוכה. לעומת זאת, עכבר החווה כאב (עקב דלקת או נוירופתיה, למשל) עשוי לבחור לבלות זמן רב יותר בסביבה המוארת, שכן יש מוטיבציה להימנע מחוויית המישוש הלא נעימה של הגשושיות המכניות בהגדרת רגישות יתר מתמשכת למישוש.
מאמר זה מתאר גרסה שונה של בדיקת MCA. התאמנו את השיטה המקורית (שבוצעה בחולדות6) לשימוש בעכברים. כמו כן, הפחתנו את מספר גבהי הגשושית שנבדקו משישה לשלושה (0, 2 ו-5 מ"מ מעל גובה הרצפה) על מנת לייעל את איסוף הנתונים. גישה זו נבדקה על פני מודלים רבים של כאב, ואומתה באמצעות משככי כאבים ידועים, מה שמצביע על כך שרגישות יתר לכאב ו/או השינויים הרגשיים והמוטיבציוניים הנלווים מניעים שינויים אלה בהתנהגות. גישה זו מהירה יחסית לניצוח וניתנת להתאמה בהשוואה לאמצעים אחרים שאינם רפלקסיביים, שיכולים לקחת ימים רבים של הרגלה ואימון 1,2. בשילוב עם מדדים אחרים של כאב, MCA יכול לייצר תובנות חשובות על ההיבטים הרגשיים והמוטיבציוניים של הכאב.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל הניסויים שכללו שימוש בעכברים והנהלים שבוצעו בהם אושרו על ידי ועדות הטיפול והשימוש בבעלי חיים המוסדיים של מרכז הסרטן MD Anderson ואוניברסיטת סטנפורד, בהתאם קפדנית למדריך של המכונים הלאומיים לבריאות לטיפול ושימוש בחיות מעבדה.
1. בניית MCA
- מבנה תא 1 עם הממדים הבאים: 125 מ"מ x 125 מ"מ x 125 מ"מ (רוחב x עומק x גובה) מתוך אקריליק לבן אטום בעובי 3 מ"מ המשמש לדפנות, לרצפה, לתקרה. השתמשו באקריליק שקוף בעובי 3 מ"מ לקיר הפונה לחזית. הדביקו את כל הצדדים יחד זמן רב מראש באמצעות דבק אקרילי ייעודי.
אזהרה: דבק אקרילי נחשב לחומר מסוכן (דליק, אדים מזיקים, עלולים להזיק אם נבלעים, עלולים לגרות את העור או העיניים). יש להשתמש בדבקים כאלה רק בהתאם להוראות היצרן (כלומר, עם PPE מתאים באזור מאוורר היטב). - חברו את המכסה של תא 1 עם ציר, כך שניתן יהיה להכניס את העכברים בקלות לתוכם ולשלוף אותם מהתא. חברו סרט דיודה פולט אור (LED) הדבקה עצמית למשטח הפנימי של המכסה כדי לספק תאורה של כ-4800 לוקס.
- סגור את תא 1 משאר ה- MCA על ידי החלקת יריעת אקריליק אטומה לתוך ומחוץ למקומה.
- בנה את תא הבדיקה של MCA, תא 2, כתא לא מואר באורך 270 מ"מ המיוצר מאקריל אדום כהה שקוף (בעובי 3 מ"מ) מכל הצדדים, עם מכסה צירי למעלה. הניחו רשת של 13 על 31 של חורים בקוטר 2 מ"מ על רצפת תא 2 שדרכה ניתן לבלוט מערך של בדיקות קהות עם קצוות בקוטר 0.5 מ"מ (למשל, סיכות מפה קהות).
הערה: סיכות קהות עם בלוק נייר זכוכית של 120 חצץ או דומה. נקו אותם במים חמים עם חומר ניקוי לפני שהם מחוטאים בחומר חיטוי ספוריצידלי. - התאימו את גובה הגשושיות על ידי הצבת יריעות אקריליות נוספות מתחת ללוח הבסיס של הגשושית (איור 1). באמצעות גישה זו, להגדיר את המכשיר עם שלוש הגדרות: 0 מ"מ, 2 מ"מ, ו 5 מ"מ גובה בדיקה.
- כחלופה לסיכות מפה קהות או חומרים דומים, השתמש בקבצי המדפסת התלת-ממדית כדי להדפיס את רצפת תא 2 ואת לוחית הבדיקה (ראה קובץ משלים 1: SpikeBed-MCA.stl המתייחס לבדיקות המכניות, וקובץ משלים 2: MCA_baseplate.stl המהווה את רצפת תא 2).
הערה: אם הדפסה תלת-ממדית אינה זמינה, הדביקו סיכות מפה ליריעה אקרילית באמצעות אותו דבק אקרילי המשמש לבניית דפנות המכשיר. - הדפס עם חומר רחיץ וניתן להתאמה ביולוגית, כגון ניילון 12 פלסטיק או דומה (מומלץ).
- מבנה תא 3 עם הממדים הבאים: 125 מ"מ x 125 מ"מ x 125 מ"מ כקופסת אקריליק אדומה כהה שקופה לא מוארת (מכל הצדדים), הממוקמת בקצה הנגדי לחדר 1. מניחים מכסה ציר על החדר, בדומה לתאים 1 ו-2. תא זה משמש כאזור מילוט חשוך מהגשושיות המכניות בתא 2.
2. הרגלה ובדיקה של MCA בעכבר
- כמו בכל הניסויים הכוללים תוצאות התנהגותיות בבעלי חיים, הקפידו על אקראיות וסנוור מתאימים לאורך כל הדרך כדי למזער את ההטיה הפוטנציאלית.
הערה: התוצאות הייצוגיות נוצרו על ידי שימוש בעכברי C57BL/6J זכרים ונקבות בני 8-12 שבועות (מספר הזן של מעבדות ג'קסון 000664). העכברים שוכנו חברתית, עד 5 לכל כלוב, עם גישה למזון ולמים ad libitum ומחזור אור של 07:00 שעות עד 19:00 שעות. MCA התקיים בתקופת האור, בין השעות 09:00 ל-12:00. - יום אחד לפני הבדיקה הבסיסית המתוכננת, התאקלמו בעכברים ליחידת ה-MCA למשך 5 דקות (מינימום) עד 15 דקות (מקסימום) עם בני זוגם בכלוב כדי להקל על החקירה החברתית של המכשיר כולו.
- לאורך כל התהליך, יש לוודא כי נוריות ה-LED בתא 1 כבויות, המחסום בין תאים 1 ו-2 נותר פתוח, והגששים מוגדרים לגובה של אפס (כלומר, לא בולטים דרך רצפת תא 2).
- בצע בדיקה בסיסית של עכברים (אופציונלי) אם המחקר משלב חיות בקרה שליליות (כלומר, ניתוח בושה או בקרות הזרקה לרכב). אם תרצה בכך, השתמש במבחן בסיסי כדי לא לכלול חריגות שלא טופלו שלעולם אינן חוצות לתא 2, אם כי זה לא הוכח כהכרחי. אם נעשה בהם שימוש, דווח על כל הקריטריונים להחרגה ועל מספר העכברים שאינם נכללים.
- לפני תחילת הבדיקה, הגדר מצלמת וידאו המסוגלת להקליט קטעי וידאו של 1080p על חצובה עם מבט הצידה של כל מכשיר ה- MCA. התאם את שדה הראייה כך שה- MCA ימלא את התמונה המוקלטת.
- לאחר תחילת ההקלטה, החזק לוח מחיקה יבש כף יד בשדה הראייה של המצלמה כדי לתייג את תחילת הסרטון עם מידע מזהה על ריצת הניסוי של החיה (למשל, מזהה עכבר, גובה בדיקה, תאריך, נקודת זמן וכו ').
- עבור הריצה הראשונה, הגדר את גובה הגשושית לאפס. העבירו את העכבר לבדיקה מהכלוב הביתי שלו לתא 1 עם דלת המחסום במקומה. הפעל טיימר הנראה בצילומים המוקלטים.
הערה: הטיימר מבטיח שהמרווחים בין החלקים השונים של הבדיקה יהיו עקביים בין הריצות. - לאחר 10 שניות, הפעל את התא 1 נוריות. לאחר שהעכבר נמצא בתא המואר במשך 20 שניות, משכו את המחסום בין התאים 1 ו-2.
- התבונן בבעל החיים במשך 2 דקות. מדוד את העיכובים ו/או זמני השהייה באמצעות שעון עצר בזמן שהבדיקה נמשכת. לחלופין, ניתן לנתח את קטעי הווידאו לאחר השלמת הבדיקה.
הערה: מסיבות של תפוקה והימנעות מחשיפה ממושכת לגירויים מרתיעים, הניתוק נקבע על 2 דקות. - מדוד אחת או יותר מכמה תוצאות שימושיות שזוהו (ראה להלן; איור 1). מומלץ לנתח את כל 5 מדדי התוצאה בעת תחילת הבדיקה, על מנת לוודא אילו היבטים של התנהגות שונים במערך ניסוי נתון.
- אפשרות I: הקלט את ההשהיה לערך הראשון לתא 2. אפשרות II: הקלט את ההשהיה כדי לחצות יותר ממחצית הדרך על פני תא 2. אפשרות ג': רשום את זמן השהייה הכולל בתא 2. אפשרות IV: הקלט את ההשהיה כדי להגיע לתא 3 (בריחה). אפשרות V: בדומה לאפשרות II, רשמו את זמן השהייה הכולל בכל תא תוך 2 דקות והמירו אותם לפרופורציות.
הערה: מכיוון שכל ניסוי הוא ייחודי ועשוי להיות מושפע מגורמים ביולוגיים ומשינויים התנהגותיים הייחודיים למודל המחלה, חוקרים יכולים להתנסות במדדים אלה ואחרים בידיהם.
- אפשרות I: הקלט את ההשהיה לערך הראשון לתא 2. אפשרות II: הקלט את ההשהיה כדי לחצות יותר ממחצית הדרך על פני תא 2. אפשרות ג': רשום את זמן השהייה הכולל בתא 2. אפשרות IV: הקלט את ההשהיה כדי להגיע לתא 3 (בריחה). אפשרות V: בדומה לאפשרות II, רשמו את זמן השהייה הכולל בכל תא תוך 2 דקות והמירו אותם לפרופורציות.
- לאחר השלמת הבדיקה, החזירו את העכבר לכלוב הביתי שלו, נקו את תאי ה-MCA עם 70% אתנול ואפשרו לו להתייבש לחלוטין.
הערה: בדרך כלל ניתן לנקות בולי צואה מהתא בקלות יחסית עם מגבות נייר לפני אתנול / חומר חיטוי. אם יש צורך בניקוי יסודי יותר, ניתן לפרק את התאים 2 ו-3 ולשקוע במי סבון חמים. - לאחר הפעלת כל העכברים בקבוצה כאשר גובה הבדיקה מוגדר לאפס, הכנס יריעה של 3 מ"מ של אקריליק מתחת ללוח הבסיס של הבדיקה המכנית וחזור על שלבים 2.4.2 עד 2.4.7 עם גובה בדיקה של 2 מ"מ.
- לאחר הפעלת כל העכברים עם גובה הבדיקה מוגדר ל -2 מ"מ, הכנס יריעה שנייה של 3 מ"מ של אקריליק מתחת ללוח הבסיס של הבדיקה וחזור על צעדים 2.4.2 עד 2.4.7 עם גובה בדיקה של 5 מ"מ.
הערה: ניתן לבדוק קבוצה של 8 עכברים תוך כ-2 שעות באמצעות גישה זו. השתמש בגדלים של קבוצות קטנות יותר אם נדרש תזמון מדויק יותר לאחר התרופה (למשל, לניסוי קורס בזמן סמים). - בצעו ניקוי סופי עם חומר חיטוי בסוף בדיקת הבדיקה.
- בדיקה חוזרת לאחר גרימת רגישות יתר לכאב ו/או עם טיפול תרופתי.
- השווה את הביצועים של כל עכבר בנקודת ההתחלה לביצועים שלו לאחר ההשריה של הכאב. להעריך את ההשפעה של התערבות פרמקולוגית על ידי השוואת בעלי חיים שטופלו ברכב עם בעלי חיים שטופלו בתרופות באותה נקודת זמן.
- בצע ניתוח סטטיסטי לא פרמטרי (לדוגמה, מבחן Mann Whitney U) אם בעלי חיים מגיעים לניתוק של 2 דקות מבלי לספק את מדד התוצאה הרצוי, וכתוצאה מכך נתונים לא רציפים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
בדיקת MCA שימשה בהצלחה עם מספר מודלים של כאב עכברים שונים מבחינה מכניסטית. איור 2 מציג נתונים שבהם מדד התוצאה של הבחירה היה חציית נקודת האמצע של תא 2 (איור 2A). הנתונים המתקבלים על ידי שימוש בנקודת אמצע הדרך לעומת הבריחה לחדר 3 דומים מאוד, ~ 40 שניות למחצית הדרך לעומת ~ 45 שניות לבריחת תא 3 במודל פגיעה עצבית (SNI) של כאב נוירופתי עם גובה בדיקה 5 מ"מ13.
במודל הכאב הדלקתי המושרה על-ידי CFA, הזרקת כפה אחורית מבוקרת (intraplantar) של מי מלח אינה משנה את חביון הבריחה לעומת קו הבסיס. אותם עכברים שהוזרק להם CFA בכפה אחורית אחת הראו עלייה משמעותית בהשהיית מילוט 4 ימים לאחר ההזרקה, אך רק כאשר גובה הגשושית הועלה ל-5 מ"מ. באופן מכריע, ההשהיה המוגברת הזו כדי לברוח ב-5 מ"מ לא נראתה בעכברים שקיבלו את ה-NSAID carprofen (10 מ"ג/ק"ג, כלומר) 90 דקות לפני תחילת הבדיקה (איור 2B).
מודל הפגיעה העצבית שנחסכה (SNI) של כאב נוירופתי טראומטי, קשור גם הוא לעלייה משמעותית בהשהיה כדי לברוח לעומת קו הבסיס כאשר גובה הבדיקה נקבע על 5 מ"מ. השפעה זו נצפתה בעכברי SNI, אך לא בבקרת ניתוחי הבושה שלהם. ההשהיה המוגברת הזו של הבריחה נמנעה גם על-ידי מתן מערכתי של משכך הכאבים האופיואידי buprenorphine (25 מיקרוגרם/ק"ג, כלומר) 90 דקות לפני הבדיקה (איור 2C). חביון מילוט מוגבר נצפה גם בעכברים שלא עברו סבב בסיסי של בדיקות MCA לפני פגיעה עצבית (איור 2D). במקרה זה, השהיית הבריחה המוגברת בעכברי SNI ב-5 מ"מ נמנעה על ידי גאבאפנטין (30 מ"ג/ק"ג, כלומר) שניתן 90 דקות לפני הבדיקה. באופן קולקטיבי, זה מצביע על כך ש- MCA יכול לזהות שינויים הקשורים לכאב בסלידה מהגירוי ובהימנעות ממנו בשני מודלים נפוצים של כאב דלקתי ונוירופתי.
MCA נבדק עוד יותר במודל השבר/יציקה של תסמונת הכאב האזורית המורכבת של מצב הכאב הכרוני (CRPS) אשר נקבעת על ידי שבר עצם דיסטלי ימין סגור ואחריו 3 שבועות של יציקה14. מודל זה, המבוסס קלינית, מציג דלקת היקפית חריפה בשלב זה, כמו גם פעילות חיסונית ארוכת טווח במערכת העצבים המרכזית עם אלודיניה אחורית מתמשכת. בדומה למודלים של CFA ו-SNI, נצפו חריגות מילוט מוגברות במודל השבר/יציקה (איור 3A). לפני הפציעה, ההשהיה כדי לברוח מתא 1 גדלה באופן יחסי לגובה הגשושית. לאחר הפציעה, ההשהיה של הבריחה נותרה ללא שינוי ברמה של 0 מ"מ, אך עלתה משמעותית בגובה הגשושית של 2 מ"מ ו-5 מ"מ לזכרים ובגובה הגשושית של 5 מ"מ לנקבות בהשוואה לבסיס (איור 3B).
איור 1: סכמות ותמונות של התקן MCA. (A) מדדי תוצאה פוטנציאליים במבחן MCA, (מסומנים על ידי סמלי שעון): השהיה לתא יציאה 1 (I), השהיה כדי לחצות יותר מ-50% מתא 2 (קו מקווקו); II), משך הזמן הכולל שבילה בתא 2 (III), השהיה כדי להגיע לתא הבריחה (IV) או אחוז הזמן המושקע בכל תא (V). בעלי חיים החווים כאב בממוצע מראים ערכים גבוהים יותר עבור I, II ו- IV, וערכים מופחתים עבור III. ערך מופחת עבור III מגדיל בהכרח את שיעור הזמן המושקע בתא 1 ו/או בתא 3, אשר ייתפס על ידי מדד התוצאה V. נוצר עם Biorender.com. (B) תמונות הממחישות את התקן ה-MCA (ואת התאים הממוספרים 1, 2 ו-3) כאשר נוריות ה-LED כבויות (למעלה משמאל), נוריות ה-LED מופעלות (למטה משמאל). (ג) מבט על התאים מלמעלה עם פתיחת הדלתות. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 2: הימנעות מהגברת כאב דלקתי ונוירופתי במבחן MCA. (A) תיאור של מדד התוצאה הספציפי שבו נעשה שימוש כאן: השהיה כדי לחצות את נקודת האמצע של תא 2. (B) הזרקה תוך-פלנטרית של CFA הגדילה באופן משמעותי את ההשהיה לבריחה (ריבועים אדומים) לעומת פקדים מלוחים (עיגולים שחורים) כאשר גובה הגשושית נקבע על 5 מ"מ. קרפרופן תוך-צפקי (10 מ"ג/ק"ג) החליש את העלייה המושרה על-ידי CFA בהשהיית מילוט (משולשים כחולים). הנתונים משורטטים כהשהיית מילוט ממוצעת ± שגיאת תקן של הממוצע (SEM); n = 7 זכרים/קבוצה. (C) ניתוח פגיעה עצבית שנחסכה (SNI) הגדילה באופן משמעותי את חביון הבריחה של תא 1 לעומת בקרות ניתוח בושה (עיגולים שחורים), כאשר גובה הבדיקה נקבע ל-5 מ"מ (ריבועים אדומים). בופרנורפין תוך-צפקי (25 מ"ג/ק"ג) החליש משמעותית את העלייה הזו בהשהיית מילוט (משולשים כחולים). הנתונים מתוארים כהשהיה ממוצעת של בריחה ±-SEM; n = 6-7 זכרים לכל קבוצה. (D) העלייה המושרה על ידי SNI בהשהיית הבריחה התהפכה על ידי שימוש בגאבאפנטין משכך כאבים (משולשים ירוקים). הנתונים מתוארים כהשהיה ממוצעת של בריחה ±-SEM; n = 8 זכרים/קבוצה. ## = p < 0.01, ***/### = p < .001, עבור ההשוואות שצוינו (ANOVA דו-כיווני, Bonferroni post-hoc). נתון זה שונהמ-13. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 3: שבר/יציקה טיביאליים גרמו להימנעות מהתגברות כאב כרונית במבחן MCA. שבר/יציקה הגדילו באופן משמעותי את חביון הבריחה ב-3 שבועות לאחר הפציעה (W3) לעומת קו הבסיס (BL) אצל זכרים בגבהי הגשושית 2 מ"מ ו-5 מ"מ ובנקבות בגובה הגשושית 5 מ"מ (n = 5/sex). נתונים מכל עכבר מתוארים בשחור דהוי (זכרים) או קאיין (נקבות) עם ממוצע המיוצג על ידי קווים כהים. **/*** = p < 0.01/< 0.001 לעומת ערך בסיס תואם גובה מין ובדיקה על ידי ANOVA דו-כיווני, Tukey לאחר הוק. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
קובץ משלים 1: קובץ מדפסת תלת-ממד SpikeBed-MCA. כאשר הוא מודפס בחומר הניתן להתאמה ביולוגית וניתן לכביסה, כגון ניילון 12, SpikeBed-MCA.stl מייצר את הפלטפורמה של בדיקות מישוש הבולטות דרך רצפת תא 2. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
קובץ משלים 2: קובץ מדפסת תלת-ממד MCA_baseplate. כאשר הוא מודפס בחומר תואם ביולוגית וניתן לכביסה, כגון ניילון 12, MCA_baseplate.stl מייצר את רצפת תא 2, שדרכה בולטות הגשושיות המישושיות. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
כמו בכל המבחנים ההתנהגותיים, טיפול נכון, אקראיות ועיוורון לטיפול בבעלי חיים הם חיוניים לאורך כל הדרך. בהתחשב בתשומות הרב-גורמיות להתנהגויות מורכבות ולקבלת החלטות, חובה על בעלי חיים להיות מטופלים, מורגלים ונבדקים באופן עקבי ככל האפשר תוך מזעור המצוקה. יש להקפיד גם לשחזר את תזמון מיקום העכבר בתא 1, הדלקת נורות ה-LED והסרת המחסום, שכן ההבדלים כאן עלולים להשפיע על ההתנהגות הבאה.
יש לציין כי מדדי התוצאה השונים המתוארים באיור 1A קשורים זה בזה. לדוגמה, עכבר הנכנס לחדר 2 חוצה בדרך כלל את נקודת אמצע הדרך של תא 2 ואז כמעט תמיד משלים את הבריחה לחדר 3. משמעות הדבר היא שמדדי התוצאה I, II ו- IV קשורים זה בזה. מדדי התוצאה III ו-V מודדים את זמן השהייה הכולל בתא 2, ואת שיעור זמן השהייה בכל 3 התאים, בהתאמה. לכן, אמצעים אלה קשורים זה לזה באופן הדוק. עם זאת, עכבר יכול תיאורטית לצבור זמן שהייה משמעותי בתא 2 בין אם חציית הדרך או הבריחה לתוך תא 3 הייתה בעלת השהיה נמוכה, השהיה גבוהה או לא התרחשה כלל.
מספר וריאציות או שינויים של שיטה זו דווחו. בנוסף למדדי התוצאה השונים המפורטים כאן (איור 1), חוקרים יכולים לשנות את התקדמות גובה הגשושית במאמץ להדגיש הבדלים ברגישות. מכיוון שלא היו הבדלים מובהקים סטטיסטית עם גובה הגשושית הבינוני 2 מ"מ, ייתכן שיהיה יעיל יותר להריץ עכברים רק ב-0 מ"מ וב-5 מ"מ. לחלופין, גובה גשושית בין 2 ל-5 מ"מ, או ריצות חוזרות בגובה בדיקה של 5 מ"מ עשויים להתחיל לחשוף הבדלים שלא היו ברורים אחרת. בנוסף, הערכה של זמן השהייה בכל תא יכולה לשמש כקריאה של מוטיבציה ופעילות. זה יכול להיות שימושי במקרים שבהם חלק מהעכברים רצים במהירות אל תא 3, אך לאחר מכן חוזרים לתא 1 כדי לחקור עוד יותר. במצבים אלה, ההשהיה לכניסה לחדר 3 בלבד לא תלכוד את העדינות הזו. העלאת זמן הפסקת הבדיקות מעבר למגבלה של 2 דקות שנקבעה כאן עשויה גם היא להתגלות ככדאית עבור חלק מהחוקרים. לבסוף, איננו יכולים לשלול את האפשרות שניסויים חוזרים של אותם בעלי חיים (יותר משלוש הפעמים שתוארו כאן), או ניסויים בתדירות גבוהה יותר (פחות מ-4-7 ימים בין המבחנים) עשויים לגרום להרגלה או להשפעות למידה. מסיבות אלה, מעודדת הכללה של קבוצות ביקורת נאיביות ובלתי מנוהלות בכל נקודת זמן. בסופו של דבר, שינויים בהתנהגות נוטים מאוד להיות ספציפיים למודל הכאב ומצדיקים חקירה נוספת במודלים אלה ואחרים של כאב.
המודלים הגורמים לכאב המשמשים כאן (CFA, SNI, שבר/יציקה) קשורים בדרך כלל לרגישות יתר במבחני התנהגות כאב אחרים, מה שמתאים לעלייה בהשהיית הימנעות/בריחה. ייתכן שגם בדיקת ה-MCA תוכל לזהות אובדן של חדות חושית (באמצעות זמן רב יותר שבילה בתא 2, למשל), אם כי זה לא נבדק רשמית. ל- MCA יש כמה מגבלות המצדיקות התחשבות. סלידה מאור בהיר היא אמצעי מפתח להנעת כניסה לתא 2 ולכן מניע של הסכסוך הבא. כל תכונה פתולוגית הקשורה למודל עכבר מסוים שעשויה לשנות סלידה מאור בהיר (למשל, לקות ראייה) צריכה להישקל בקפידה לפני ביצוע בדיקה זו. גם תרומתה של חרדה להימלטות מההשהיה לא נבדקה באופן שיטתי, אם כי דווח כי מודלים כרוניים של כאב דלקתי ונוירופתי מראים סימנים של התנהגות דמוית חרדה בעכברים בבדיקות אחרות, עדיין יש ויכוח לגבי15,16 אלה. עם זאת, לא ניתן לאשר או לשלול תרומה של חרדה הקשורה לכאב לתוצאות התנהגותיות אלה בשלב זה. מכיוון של-MCA יש תשומות מרובות במדדי התוצאה, זה מגיע עם יותר בלבולים פוטנציאליים שיש לקחת בחשבון.
לסיכום, בדיקת MCA מספקת קריאה לא רפלקסיבית של רגישות לכאב במודלים של עכברים. מדדי התוצאה מושפעים מגורמים שאינם רגישות רפלקסיבית ומספקים מדד מורכב של רגישות לכאב ומצב רגשי/מוטיבציוני. משך הזמן הדרוש להפעלת כל בדיקה, ורמת המיומנות והציוד המיוחד הנדרשים משתווים לטובה עם מדדים אחרים שאינם רפלקסיביים של כאב, כגון ניתוח הליכה או העדפת מקום מותנית 5,13. למרות שהיא עדיין חדשנית במקצת, הגישה אומצה ואומתה באופן עצמאי על ידי צוותים רבים של חוקרים, בעיקר בחולדות. קשירת עצבים סיאטית חלקית הגבירה את חביון היציאה17 ואת הנסיגה התלויה במורפיום בחולדות7. מחקר אחר שפורסם בכתב העת Rats הציע כי ספירת מספר המעברים, תוך שימוש במודלים של פגיעה בחוט השדרה ומודלים של פגיעה כרונית בפגיעה בחוט השדרה בחולדות, עשויה לשמש כמדד תוצאה שימושי8. באופן מכריע, מחקר זה זיהה גם עלייה בהימנעות מבדיקות בבקרות על ניתוחי שומה, מה שמצביע על כך שהכללת קבוצה נאיבית לצד בקרות בושה/רכב היא מוצדקת. יישומים עתידיים של MCA יכולים להתמקד בשונות בין זני עכברים ו/או מודלים של כאב, בהשפעת החרדה על ביצועי הבדיקה ובשילוב של ניתוח תנוחה או קינמטיקה של הליכה כדי להבין טוב יותר את ההבדלים בהסתגלות התנהגותית לגירויים רעילים.
הפער התרגומי בין מחקרי עכברים פרה-קליניים לבין התפתחותם של טיפולים חדשניים ממשיך להוות סיבה לדאגה. מתוך מחשבה על כך, בדיקת MCA משלימה את הכלים הקיימים בחקר הכאב ומסייעת לתת תמונה מלאה יותר של הממדים החושיים והרגשיים הרבים של הכאב.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
למחברים אין ניגודי עניינים רלוונטיים לחשוף.
Acknowledgments
GM נתמכת על ידי מלגת בוגר NDSEG. VLT נתמכת על ידי מענק NIH NIGMS #GM137906 וקרן ריטה אלן. AJS נתמך על ידי מענקי משרד ההגנה W81XWH-20-1-0277, W81XWH-21-1-0197, וקרן ריטה אלן. אנו מודים לד"ר Alexxai Kravitz בבית הספר לרפואה של אוניברסיטת וושינגטון על תכנון והפיכת קבצי המדפסת התלת-ממדית לזמינים באופן חופשי עבור רצפת החדר 2 וצלחת הבדיקה.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 32.8ft 3000K-6000K Tunable White LED Strip Lights, Dimmable Super Bright LED Tape Lights with 600 SMD 2835 LEDs | Lepro | SKU: 410087-DWW-US | For lighting chamber 1. https://www.lepro.com/32ft-dimmable-tunable-white-led-strip-lights.html |
| 3D printed 'spike bed' and 'chamber 2 floor' | Shapeways | N/A | Optional, for mechanical probes as an alternative to blunted map pins. |
| 70% ethanol | Various | N/A | To clean MCA between mice. |
| Acryl-Hinge 2 | TAP Plastics | N/A | for attaching chamber lids to rear walls. https://www.tapplastics.com/product/plastics/handles_hinges_latches/acryl_hinge_2/122 |
| Chemcast Cast Acrylic Sheet, Clear | TAP Plastics | N/A | 3mm thick. For front wall of chamber 1. https://www.tapplastics.com/product/plastics/cut_to_size_plastic/acrylic_sheets_cast_clear/510 |
| Chemcast Cast Transparent Colored Acrylic, Transparent Dark Red - 50% | TAP Plastics | N/A | 3mm thick. 50% light transmission. For walls and lids of chambers 2 and 3. https://www.tapplastics.com/product/plastics/cut_to_size_plastic/acrylic_sheets_transparent_colors/519 |
| Chemcast Translucent & Opaque Colored Cast Acrylic, Sign Opaque White - 0.1% | TAP Plastics | N/A | 3mm thick. For side walls and lid of chamber 1. https://www.tapplastics.com/product/plastics/cut_to_size_plastic/acrylic_sheets_color/341 |
| Disinfectant (e.g. Quatricide) | Pharmacal Research Laboratories, Inc. | 65020F | To disinfect MCA at the end of a testing session. |
| Dry-erase markers and board | Various | N/A | To add experimental info to the beginning of video footage. |
| Map pins | Various | N/A | Optional, for mechanical probes. Use sandpaper to blunt sharp points before use. Can be used in place of 3D-printed parts. |
| Paper towels | Various | N/A | To clean/disinfect MCA. |
| SCIGRIP Weld-On #3 Acrylic Cement | TAP Plastics | N/A | For assembling acrylic sheets into chambers and affixing hinges. https://www.tapplastics.com/product/repair_products/plastic_adhesives/weld_on_3_cement/131 |
| Stopwatch | Various | N/A | To record escape latencies/dwell times in real-time or from recorded video. |
| Timer | Various | N/A | To ensure LED turn-on, barrier removal and test completion are timed consistently. |
| Video camera | Various | HDRCX405 Handycam Camcorder | To record mouse behavior in the MCA device. Can be substituted with any consumer-grade video camera capable of 1080p resolution. |
| Tripod | Famall | N/A | Any tripod that can hold the camera at bench height for recording MCA footage is acceptable. |
References
- Hargreaves, K., Dubner, R., Brown, F., Flores, C., Joris, J. A new and sensitive method for measuring thermal nociception in cutaneous hyperalgesia. Pain. 32 (1), 77-88 (1988).
- Chaplan, S. R., Bach, F. W., Pogrel, J. W., Chung, J. M., Yaksh, T. L. Quantitative assessment of tactile allodynia in the rat paw. Journal of Neuroscience Methods. 53 (1), 55-63 (1994).
- Sheahan, T. D., et al. Inflammation and nerve injury minimally affect mouse voluntary behaviors proposed as indicators of pain. Neurobiology of Pain. 2, 1-12 (2017).
- Wodarski, R., et al. Cross-centre replication of suppressed burrowing behaviour as an ethologically relevant pain outcome measure in the rat: a prospective multicentre study. Pain. 157 (10), 2350-2365 (2016).
- King, T., et al. Unmasking the tonic-aversive state in neuropathic pain. Nature Neuroscience. 12 (11), 1364-1366 (2009).
- Harte, S. E., Meyers, J. B., Donahue, R. R., Taylor, B. K., Morrow, T. J. Mechanical Conflict System: A Novel Operant Method for the Assessment of Nociceptive Behavior. PLoS One. 11 (2), 0150164 (2016).
- Pahng, A. R., Edwards, S. Measuring Pain Avoidance-Like Behavior in Drug-Dependent Rats. Current Protocols in Neuroscience. 85 (1), 53 (2018).
- Odem, M. A., et al. Sham surgeries for central and peripheral neural injuries persistently enhance pain-avoidance behavior as revealed by an operant conflict test. Pain. 160 (11), 2440-2455 (2019).
- LaBuda, C. J., Fuchs, P. N. A behavioral test paradigm to measure the aversive quality of inflammatory and neuropathic pain in rats. Experimental Neurology. 163 (2), 490-494 (2000).
- LaBuda, C. J., Fuchs, P. N. Morphine and gabapentin decrease mechanical hyperalgesia and escape/avoidance behavior in a rat model of neuropathic pain. Neuroscience Letters. 290 (2), 137-140 (2000).
- Vichaya, E. G., et al. Motivational changes that develop in a mouse model of inflammation-induced depression are independent of indoleamine 2,3 dioxygenase. Neuropsychopharmacology. 44 (2), 364-371 (2019).
- Hascoët, M., Bourin, M., Nic Dhonnchadha, B. A. The mouse light-dark paradigm: a review. Progress in Neuropsychopharmacology & Biological Psychiatry. 25 (1), 141-166 (2001).
- Shepherd, A. J., Mohapatra, D. P. Pharmacological validation of voluntary gait and mechanical sensitivity assays associated with inflammatory and neuropathic pain in mice. Neuropharmacology. 130, 18-29 (2018).
- Huck, N. A., et al. Temporal Contribution of Myeloid-Lineage TLR4 to the Transition to Chronic Pain: A Focus on Sex Differences. Journal of Neuroscience. 41 (19), 4349-4365 (2021).
- Pitzer, C., La Porta, C., Treede, R. D., Tappe-Theodor, A. Inflammatory and neuropathic pain conditions do not primarily evoke anxiety-like behaviours in C57BL/6 mice. European Journal of Pain. 23 (2), 285-306 (2019).
- Sieberg, C. B., et al. Neuropathic pain drives anxiety behavior in mice, results consistent with anxiety levels in diabetic neuropathy patients. Pain Reports. 3 (3), 651 (2018).
- Meuwissen, K. P. V., van Beek, M., Joosten, E. A. J. Burst and Tonic Spinal Cord Stimulation in the Mechanical Conflict-Avoidance System: Cognitive-Motivational Aspects. Neuromodulation. 23 (5), 605-612 (2020).
