Neuroscience

यांत्रिक संघर्ष-परिहार परख चूहों में दर्द व्यवहार को मापने के लिए

Published: February 18, 2022 doi: 10.3791/63454

Caitlyn M. Gaffney¹, Gabriella Muwanga², Huaishuang Shen², Vivianne L. Tawfik², Andrew J. Shepherd²

¹Laboratories of Neuroimmunology, Department of Symptom Research, and the MD Anderson Pain Research Consortium, University of Texas MD Anderson Cancer Center, ²Department of Anesthesiology, Perioperative and Pain Medicine, Stanford University School of Medicine

Summary

यांत्रिक संघर्ष-परिहार परख चूहों में दर्द संवेदनशीलता के एक गैर reflexive readout जो बेहतर माउस दर्द मॉडल की एक किस्म में भावात्मक-प्रेरक प्रतिक्रियाओं को समझने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है के रूप में प्रयोग किया जाता है.

Abstract

दर्द में संवेदी (nociceptive) और भावात्मक (अप्रिय) आयाम दोनों शामिल हैं। प्रीक्लिनिकल मॉडल में, दर्द का मूल्यांकन पारंपरिक रूप से रिफ्लेक्सिव परीक्षणों का उपयोग करके किया गया है जो दर्द के nociceptive घटक के बारे में अनुमान लगाने की अनुमति देता है लेकिन दर्द के भावात्मक या प्रेरक घटक के बारे में बहुत कम जानकारी प्रदान करता है। दर्द के इन घटकों को कैप्चर करने वाले परीक्षणों को विकसित करना इसलिए अनुवादात्मक रूप से महत्वपूर्ण है। इसलिए, शोधकर्ताओं को उस स्तर पर दर्द की धारणा का अध्ययन करने के लिए गैर-रिफ्लेक्सिव व्यवहार assays का उपयोग करने की आवश्यकता है। यांत्रिक संघर्ष-परिहार (एमसीए) एक स्थापित स्वैच्छिक गैर-रिफ्लेक्सिव व्यवहार परख है, जो 3 कक्ष प्रतिमान में एक हानिकारक यांत्रिक उत्तेजना के लिए प्रेरक प्रतिक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए है। एक माउस के स्थान वरीयता में परिवर्तन, जब प्रतिस्पर्धी हानिकारक उत्तेजनाओं का सामना करना पड़ता है, तो इसका उपयोग उज्ज्वल प्रकाश बनाम पंजे की स्पर्श उत्तेजना की कथित अप्रियता का अनुमान लगाने के लिए किया जाता है। यह प्रोटोकॉल एमसीए परख के एक संशोधित संस्करण की रूपरेखा तैयार करता है जो दर्द शोधकर्ताओं को माउस दर्द मॉडल की एक किस्म में भावात्मक-प्रेरक प्रतिक्रियाओं को समझने के लिए उपयोग कर सकते हैं। हालांकि यहां विशेष रूप से वर्णित नहीं है, हमारे उदाहरण एमसीए डेटा एमसीए प्रक्रिया को चित्रित करने के लिए इंट्राप्लांटर पूर्ण फ्रुंड के सहायक (सीएफए), बख्शा तंत्रिका चोट (एसएनआई), और दर्द मॉडल के रूप में फ्रैक्चर / कास्टिंग मॉडल का उपयोग करते हैं।

Introduction

दर्द संवेदी और भावात्मक घटकों के साथ एक जटिल अनुभव है। थर्मल और / या यांत्रिक उत्तेजनाओं के लिए दर्द धारणा और अतिसंवेदनशीलता की दहलीज में कमी इस अनुभव की प्रमुख विशेषताएं हैं, जो उत्तेजना-उत्पन्न दर्द व्यवहार परीक्षण कैप्चर कर सकते हैं (जैसे कि हार्ग्रेव्स के गर्मी संवेदनशीलता के परीक्षण और यांत्रिक संवेदनशीलता के वॉन फ्रे परीक्षण) ^1,2। यद्यपि इस तरह के परीक्षण मजबूत और पुन: प्रस्तुत करने योग्य परिणाम देते हैं, वे एक कथित हानिकारक उत्तेजना से रिफ्लेक्सिव वापसी पर उनकी निर्भरता से सीमित हैं। इसने अकेले इन परीक्षणों पर दर्द अनुसंधान की चल रही निर्भरता पर सवाल उठाया है। उस अंत तक, दर्द शोधकर्ता कई वर्षों से दर्द के भावनात्मक और / या प्रेरक घटकों को अधिक कैप्चर करने के प्रयास में कृंतक दर्द मॉडल में उपयोग के लिए वैकल्पिक / पूरक व्यवहार परीक्षणों की खोज कर रहे हैं। इन un-evoked, स्वैच्छिक, या गैर reflexive उपायों (उदाहरण के लिए, पहिया चल रहा है, burrowing गतिविधि, वातानुकूलित स्थान वरीयता ^3,4,5) preclinical दर्द अनुसंधान की translatability में सुधार करने के प्रयास में लागू किया जा रहा है।

यांत्रिक संघर्ष परिहार (एमसीए) परख मूल रूप से हार्ट एट अल द्वारा वर्णित किया गया था 2016⁶ में, मुख्य रूप से चूहों में उपयोग किया जाता है ^7,8, और पहले के दृष्टिकोण के संशोधन का प्रतिनिधित्व करता है - जगह पलायन-परिहार प्रतिमान। इस दृष्टिकोण में, हिंद पंजे का एक हानिकारक उत्तेजना एक अन्यथा वांछनीय (अंधेरे) कक्ष में किया जाता है ताकि इस तरह की उत्तेजना से बचने / बचने के लिए जानवर के उद्देश्यपूर्ण व्यवहार को चलाया^{जा सके} ^9,10। एक पर्यवेक्षक द्वारा हिंद पंजा के मैनुअल हानिकारक उत्तेजना पर भरोसा करने के बजाय, एमसीए परख चूहों को एक प्रतिकूल वातावरण से बचने और अंधेरे कक्ष तक पहुंचने के लिए संभावित हानिकारक उत्तेजना पर बातचीत करने के लिए मजबूर करता है। संघर्ष / परिहार जो परख को अपना नाम देता है, इन दो प्रतिस्पर्धी प्रेरणाओं से उत्पन्न होता है: उज्ज्वल रूप से रोशनी वाले क्षेत्रों से बचें और पंजे की हानिकारक उत्तेजना से बचें। एमसीए परख भी वातानुकूलित स्थान वरीयता परीक्षण के साथ सुविधाओं को साझा करता है, जहां पर्यावरणीय संकेतों के साथ दर्द से राहत की जोड़ी व्यवहार में परिवर्तन करती है जो दर्द से राहत देने / पुरस्कृत संदर्भ¹¹ के लिए वरीयता को दर्शाती है।

मौलिक रूप से बोलते हुए, ये सभी assays एक समान दृष्टिकोण साझा करते हैं: उनके भावात्मक / प्रेरक राज्य के संकेतक के रूप में दूसरे पर एक प्रतिकूल वातावरण के लिए एक जानवर की वरीयता में बदलाव का उपयोग करना। एमसीए परख एक 3 कक्ष प्रतिमान एक उज्ज्वल रूप से जलाया कक्ष समायोज्य ऊंचाई जांच और किसी भी प्रतिकूल उत्तेजनाओं के बिना एक अंधेरे तीसरे कक्ष के साथ एक अंधेरे मध्य कक्ष के बाद से मिलकर है. एक अनियंत्रित माउस को आमतौर पर एक अंधेरे कक्ष में भागने के लिए प्रेरित किया जाता है, जो उज्ज्वल प्रकाश¹² के लिए कृन्तकों के जन्मजात घृणा को देखते हुए होता है। इस उदाहरण में, एक उज्ज्वल रूप से जलाए गए वातावरण से बचने के लिए प्राकृतिक प्रेरणा हिंद पंजा उत्तेजना (समायोज्य ऊंचाई जांच) का सामना करने के लिए अरुचि को दूर करती है, जो विशेष रूप से अंधेरे वातावरण में होती है। इसके विपरीत, दर्द का अनुभव करने वाला एक माउस (उदाहरण के लिए, सूजन या न्यूरोपैथी के कारण) उज्ज्वल रूप से जलाए गए वातावरण में अधिक समय बिताने का विकल्प चुन सकता है, क्योंकि चल रहे स्पर्श अतिसंवेदनशीलता की स्थापना में यांत्रिक जांच के अप्रिय स्पर्श अनुभव से बचने के लिए प्रेरणा है।

यह आलेख MCA परख के एक संशोधित संस्करण का वर्णन करता है। हमने चूहों में उपयोग के लिए मूल विधि (जो चूहों⁶ में की गई थी) को अनुकूलित किया है। हमने डेटा अधिग्रहण को सुव्यवस्थित करने के लिए छह से तीन (0, 2, और 5 मिमी ऊपर फर्श की ऊंचाई) से परीक्षण की गई जांच ऊंचाइयों की संख्या को भी कम कर दिया है। इस दृष्टिकोण को कई दर्द मॉडलों में परीक्षण किया गया है, और ज्ञात एनाल्जेसिक के साथ मान्य किया गया है, यह दर्शाता है कि दर्द अतिसंवेदनशीलता और / या संबंधित भावात्मक और प्रेरक परिवर्तन व्यवहार में इन परिवर्तनों को चला रहे हैं। यह दृष्टिकोण अन्य गैर-रिफ्लेक्सिव उपायों की तुलना में संचालन और अनुकूलनीय होने के लिए अपेक्षाकृत त्वरित है, जिसमें कई दिनों की आदत और प्रशिक्षण ^1,2 लग सकता ^है। दर्द के अन्य उपायों के साथ कॉन्सर्ट में, एमसीए दर्द के भावात्मक और प्रेरक पहलुओं में मूल्यवान अंतर्दृष्टि उत्पन्न कर सकता है।

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Protocol

चूहों के उपयोग और उनमें अपनाई गई प्रक्रियाओं से जुड़े सभी प्रयोगों को एमडी एंडरसन कैंसर सेंटर और स्टैनफोर्ड विश्वविद्यालय की संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समितियों द्वारा अनुमोदित किया गया था, जो प्रयोगशाला जानवरों की देखभाल और उपयोग के लिए राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान की मार्गदर्शिका के अनुसार सख्ती से था।

1. एमसीए निर्माण

निम्नलिखित आयामों के साथ कक्ष 1 का निर्माण करें: 125 मिमी x 125 मिमी x 125 मिमी (चौड़ाई एक्स गहराई एक्स ऊंचाई) अपारदर्शी सफेद 3 मिमी मोटी ऐक्रेलिक से साइडवॉल, फर्श, छत के लिए उपयोग किया जाता है। सामने की दीवार के लिए एक स्पष्ट 3 मिमी मोटी ऐक्रेलिक का उपयोग करें। समर्पित ऐक्रेलिक चिपकने वाला का उपयोग कर अग्रिम में अच्छी तरह से सभी पक्षों को एक साथ गोंद।
सावधानी: ऐक्रेलिक चिपकने वाला खतरनाक सामग्री माना जाता है (ज्वलनशील, वाष्प हानिकारक, अगर निगल लिया जाता है तो हानिकारक हो सकता है, त्वचा या आंखों को परेशान कर सकता है)। इस तरह के चिपकने वाले का उपयोग केवल निर्माता के निर्देशों के अनुसार किया जाना चाहिए (यानी, एक अच्छी तरह से हवादार क्षेत्र में उपयुक्त पीपीई के साथ)।
एक काज के साथ कक्ष 1 के ढक्कन को संलग्न करें, ताकि चूहों को आसानी से कक्ष में रखा जा सके और कक्ष से पुनर्प्राप्त किया जा सके। ~ 4800 लक्स की रोशनी प्रदान करने के लिए ढक्कन की आंतरिक सतह पर स्व-चिपकने वाला प्रकाश उत्सर्जक डायोड (एलईडी) टेप संलग्न करें।
एक अपारदर्शी ऐक्रेलिक शीट में और स्थिति से बाहर स्लाइडिंग द्वारा एमसीए के बाकी हिस्सों से कक्ष 1 को बंद करें।
एमसीए परीक्षण कक्ष, कक्ष 2 का निर्माण, एक 270 मिमी लंबे अप्रकाशित कक्ष के रूप में सभी पक्षों पर पारभासी गहरे लाल ऐक्रेलिक (3 मिमी मोटी) से निर्मित, शीर्ष पर एक काज ढक्कन के साथ। कक्ष 2 के फर्श पर 2 मिमी छेद का एक 13 x 31 ग्रिड रखें जिसके माध्यम से 0.5 मिमी व्यास युक्तियों (जैसे, कुंद मानचित्र पिन) के साथ कुंद जांच की एक सरणी उभरी हुई हो सकती है।
नोट: एक 120-ग्रिट सैंडपेपर ब्लॉक या इसी तरह के साथ कुंद पिन। स्पोरिसाइडल कीटाणुनाशक के साथ कीटाणुरहित होने से पहले उन्हें डिटर्जेंट के साथ गर्म पानी में साफ करें।
जांच बेसप्लेट (चित्रा 1) के नीचे अतिरिक्त ऐक्रेलिक शीट रखकर जांच की ऊंचाई को समायोजित करें। इस दृष्टिकोण का उपयोग करते हुए, डिवाइस को तीन सेटिंग्स के साथ कॉन्फ़िगर करें: 0 मिमी, 2 मिमी, और 5 मिमी जांच ऊंचाई।
कुंद मानचित्र पिन या इसी तरह की सामग्री के विकल्प के रूप में, कक्ष 2 और जांच प्लेट के फर्श को मुद्रित करने के लिए 3 डी प्रिंटर फ़ाइलों का उपयोग करें (अनुपूरक फ़ाइल 1 देखें: स्पाइकबेड-एमसीए.एसटीएल जो यांत्रिक जांच को संदर्भित करता है, और पूरक फ़ाइल 2: MCA_baseplate.एसटीएल जो कक्ष 2 के फर्श को बनाता है)।
नोट:: यदि 3 डी मुद्रण उपलब्ध नहीं है, तो डिवाइस की दीवारों के निर्माण के लिए उपयोग किए जाने वाले एक ही ऐक्रेलिक चिपकने वाला का उपयोग करके एक ऐक्रेलिक शीट पर गोंद मानचित्र पिन करता है।
एक धोने योग्य और biocompatible सामग्री, जैसे नायलॉन 12 प्लास्टिक या इसी तरह (अनुशंसित) के साथ मुद्रित करें।
निम्नलिखित आयामों के साथ कक्ष 3 का निर्माण करें: 125 मिमी x 125 मिमी x 125 मिमी एक अप्रकाशित पारभासी गहरे लाल ऐक्रेलिक बॉक्स (सभी पक्षों पर) के रूप में, कक्ष 1 के विपरीत छोर पर रखा गया है। कक्ष 1 और 2 के समान, कक्ष पर एक टिका हुआ ढक्कन रखें। यह कक्ष कक्ष 2 में यांत्रिक जांच से एक अंधेरे पलायन क्षेत्र के रूप में कार्य करता है।

2. माउस एमसीए habituation और परीक्षण

जानवरों में व्यवहारिक परिणामों से जुड़े सभी प्रयोगों के साथ, संभावित पूर्वाग्रह को कम करने के लिए उचित यादृच्छिकता और अंधापन का निरीक्षण करें।
नोट: प्रतिनिधि परिणाम 8-12 सप्ताह पुराने पुरुष और महिला C57BL / 6J चूहों (जैक्सन प्रयोगशालाओं तनाव संख्या 000664) का उपयोग करके उत्पन्न किए गए थे। चूहों को सामाजिक रूप से रखा गया था, प्रति पिंजरे 5 तक, भोजन और पानी के विज्ञापन लिबिटम तक पहुंच और 07: 00 घंटे से 19: 00 घंटे तक प्रकाश चक्र। एमसीए प्रकाश अवधि में 09:00 घंटे और 12:00 बजे के बीच हुआ।
बेसलाइन परीक्षण निर्धारित होने से एक दिन पहले, पूरे डिवाइस की सामाजिक खोज की सुविधा के लिए अपने पिंजरे के साथी के साथ 5 मिनट (न्यूनतम) से 15 मिनट (अधिकतम) के लिए एमसीए इकाई में चूहों को acclimate करें।
प्रक्रिया के दौरान, सुनिश्चित करें कि कक्ष 1 में एल ई डी बंद कर दिए गए हैं, कक्ष 1 और 2 के बीच की बाधा को खुला छोड़ दिया गया है, और जांच को शून्य की ऊंचाई पर सेट किया गया है (यानी, कक्ष 2 के फर्श के माध्यम से बाहर नहीं निकलना)।
चूहों का एक बेसलाइन परीक्षण (वैकल्पिक) करें यदि अध्ययन में नकारात्मक नियंत्रण जानवरों (यानी, शाम सर्जरी, या वाहन इंजेक्शन नियंत्रण) शामिल हैं। यदि वांछित हो, तो किसी भी घायल आउटलायर्स को बाहर करने के लिए एक बेसलाइन परीक्षण का उपयोग करें जो कभी भी चैंबर 2 में पार नहीं करते हैं, हालांकि यह आवश्यक साबित नहीं हुआ है। यदि उपयोग किया जाता है, तो बहिष्करण के लिए सभी मानदंडों और बहिष्कृत चूहों की संख्या की रिपोर्ट करें।
1. परीक्षण शुरू करने से पहले, पूरे एमसीए डिवाइस के साइड-फेसिंग दृश्य के साथ एक तिपाई पर 1080p फुटेज रिकॉर्ड करने में सक्षम एक वीडियो कैमरा सेट करें। दृश्य के क्षेत्र को समायोजित करें जैसे कि एमसीए रिकॉर्ड की गई छवि को भरता है।
2. एक बार रिकॉर्डिंग शुरू होने के बाद, जानवर के परीक्षण रन (जैसे, माउस आईडी, जांच ऊंचाई, तारीख, समय बिंदु, आदि) पर जानकारी की पहचान करने के साथ वीडियो की शुरुआत को लेबल करने के लिए कैमरे के दृश्य के क्षेत्र में एक हैंडहेल्ड ड्राई-इरेज़ बोर्ड रखें।
3. पहले रन के लिए, जांच ऊंचाई को शून्य पर सेट करें। माउस को जगह में बाधा दरवाजे के साथ अपने घर के पिंजरे से कक्ष 1 में परीक्षण करने के लिए स्थानांतरित करें। रिकॉर्ड किए गए फुटेज में दिखाई देने वाला टाइमर प्रारंभ करें.
  नोट:: टाइमर सुनिश्चित करता है कि परीक्षण के विभिन्न भागों के बीच अंतराल रन के बीच संगत हैं।
4. 10 सेकंड के बाद, कक्ष 1 एल ई डी पर स्विच करें। माउस 20 s के लिए जलाया कक्ष में किया गया है के बाद, कक्षों 1 और 2 के बीच बाधा वापस ले लो।
5. 2 मिनट के लिए जानवर का निरीक्षण करें। परीक्षण जारी होने के दौरान स्टॉपवॉच के साथ लेटेंसी और / या रहने के समय को मापें। वैकल्पिक रूप से, परीक्षण पूरा होने के बाद वीडियो फुटेज का विश्लेषण किया जा सकता है।
  नोट: थ्रूपुट के कारणों के लिए और प्रतिकूल उत्तेजनाओं के लिए लंबे समय तक जोखिम से बचने के लिए, कटऑफ 2 मिनट पर सेट किया गया था।
6. पहचाने गए कई उपयोगी परिणामों में से एक या अधिक को मापें (नीचे देखें; चित्र1)। परीक्षण शुरू करते समय सभी 5 परिणाम उपायों का विश्लेषण करने की सिफारिश की जाती है, ताकि यह पता लगाया जा सके कि किसी दिए गए प्रयोगात्मक सेटअप में व्यवहार के कौन से पहलू भिन्न होते हैं।
  1. विकल्प I: कक्ष 2 के लिए पहली प्रविष्टि के लिए विलंबता रिकॉर्ड करें। विकल्प II: कक्ष 2 में आधे से अधिक रास्ते को पार करने के लिए विलंबता रिकॉर्ड करें। विकल्प III: कक्ष 2 में कुल निवास समय रिकॉर्ड करें। विकल्प IV: कक्ष 3 (भागने) तक पहुंचने के लिए विलंबता रिकॉर्ड करें। विकल्प V: विकल्प II के समान, प्रत्येक कक्ष में कुल निवास समय को 2 मिनट के भीतर रिकॉर्ड करें और उन्हें अनुपात में परिवर्तित करें।
    नोट: चूंकि प्रत्येक प्रयोग अद्वितीय है और रोग मॉडल के लिए अद्वितीय जैविक कारकों और व्यवहार परिवर्तनों से प्रभावित हो सकता है, इसलिए जांचकर्ता अपने हाथों में इन और अन्य उपायों के साथ प्रयोग कर सकते हैं।
7. एक बार परीक्षण पूरा हो जाने के बाद, माउस को अपने घर के पिंजरे में वापस कर दें, एमसीए कक्षों को 70% इथेनॉल के साथ साफ करें, और इसे पूरी तरह से सूखने की अनुमति दें।
  नोट: फेकल बोली आमतौर पर इथेनॉल / कीटाणुनाशक से पहले कागज तौलिए के साथ अपेक्षाकृत आसानी से कक्ष से साफ किया जा सकता है। यदि अधिक गहन सफाई आवश्यक हो जाती है, तो कक्ष 2 और 3 को अलग किया जा सकता है और गर्म, साबुन के पानी में डुबोया जा सकता है।
8. जांच ऊंचाई शून्य करने के लिए सेट के साथ एक समूह में सभी चूहों को चलाने के बाद, यांत्रिक जांच baseplate के नीचे ऐक्रेलिक की एक 3 मिमी शीट डालें और 2 मिमी की जांच ऊंचाई के साथ 2.4.2 से 2.4.7 चरणों को दोहराएं।
9. 2 मिमी के लिए सेट जांच ऊंचाई के साथ सभी चूहों को चलाने के बाद, जांच बेस प्लेट के नीचे ऐक्रेलिक की दूसरी 3 मिमी शीट डालें और 5 मिमी की जांच ऊंचाई के साथ 2.4.2 से 2.4.7 चरणों को दोहराएं।
  नोट: 8 चूहों के एक समूह को इस दृष्टिकोण का उपयोग करके लगभग 2 घंटे में परीक्षण किया जा सकता है। छोटे समूह के आकार का उपयोग करें यदि अधिक सटीक पोस्ट-ड्रग समय की आवश्यकता होती है (उदाहरण के लिए, दवा समय पाठ्यक्रम प्रयोग के लिए)।
10. एक परीक्षण सत्र के अंत में एक कीटाणुनाशक के साथ एक अंतिम सफाई करें।
दर्द अतिसंवेदनशीलता और / या दवा उपचार के साथ प्रेरित करने के बाद परीक्षण को दोहराएं।
दर्द प्रेरित होने के बाद उनके प्रदर्शन के साथ बेसलाइन पर प्रत्येक माउस के प्रदर्शन की तुलना करें। एक ही समय बिंदु पर दवा-उपचारित जानवरों के साथ वाहन-उपचारित जानवरों की तुलना करके एक औषधीय हस्तक्षेप के प्रभाव का आकलन करें।
गैर-पैरामीट्रिक सांख्यिकीय विश्लेषण (उदाहरण के लिए, मान व्हिटनी यू टेस्ट) करें यदि जानवर वांछित परिणाम उपाय को संतुष्ट किए बिना 2 मिनट की कटऑफ तक पहुंचते हैं, जिसके परिणामस्वरूप गैर-निरंतर डेटा होता है।

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Representative Results

एमसीए परख कई यंत्रवत अलग माउस दर्द मॉडल के साथ सफलतापूर्वक इस्तेमाल किया गया है. चित्रा 2 डेटा दिखाता है जहां पसंद का परिणाम माप कक्ष 2 (चित्रा 2 ए) के मध्य-बिंदु को पार कर रहा था। कक्ष 3 में आधे रास्ते बिंदु बनाम भागने का उपयोग करके प्राप्त डेटा बहुत समान हैं, ~ 40 s के लिए आधे रास्ते बनाम ~ 45 s के लिए कक्ष 3 5 मिमी जांच ऊंचाई¹³ के साथ न्यूरोपैथिक दर्द के बख्शा तंत्रिका चोट (एसएनआई) मॉडल में भागने के लिए।

सीएफए-प्रेरित भड़काऊ दर्द मॉडल में, खारा के हिंद पंजा (इंट्राप्लांटर) इंजेक्शन को नियंत्रित करने से बचने की विलंबता बनाम बेसलाइन नहीं बदलता है। उन चूहों को एक हिंद पंजे में सीएफए के साथ इंजेक्ट किया गया था, उन्होंने इंजेक्शन के बाद 4 दिनों की एस्केप लेटेंसी में महत्वपूर्ण वृद्धि दिखाई, लेकिन केवल जब जांच की ऊंचाई को 5 मिमी तक बढ़ाया गया था। महत्वपूर्ण रूप से, 5 मिमी पर भागने के लिए यह बढ़ी हुई विलंबता चूहों में नहीं देखी गई थी, जिन्हें परीक्षण की शुरुआत से 90 मिनट पहले एनएसएआईडी कार्प्रोफेन (10 मिलीग्राम / किग्रा, आईपी) प्राप्त हुआ था (चित्रा 2 बी)।

दर्दनाक न्यूरोपैथिक दर्द का बचा हुआ तंत्रिका चोट (एसएनआई) मॉडल, बेसलाइन बनाम भागने के लिए विलंबता में एक महत्वपूर्ण वृद्धि के साथ भी जुड़ा हुआ है जब जांच ऊंचाई 5 मिमी पर सेट की गई थी। यह प्रभाव एसएनआई चूहों में देखा गया था, लेकिन उनके नकली सर्जरी नियंत्रण नहीं। इस बढ़ी हुई भागने की विलंबता को ओपिओइड एनाल्जेसिक बुप्रेनोर्फिन (25 μg / kg, i.p.) के प्रणालीगत प्रशासन द्वारा परीक्षण से 90 मिनट पहले भी रोका गया था (चित्रा 2 सी)। बढ़ी हुई भागने की विलंबता चूहों में भी देखी गई थी जो तंत्रिका चोट (चित्रा 2 डी) से पहले एमसीए परीक्षण के बेसलाइन दौर से नहीं गुजरी थी। इस मामले में, 5 मिमी पर एसएनआई चूहों में बढ़ी हुई भागने की विलंबता को गैबापेंटिन (30 मिलीग्राम / किग्रा, आई.पी.) द्वारा परीक्षण से 90 मिनट पहले प्रशासित किया गया था। सामूहिक रूप से, इससे पता चलता है कि एमसीए भड़काऊ और न्यूरोपैथिक दर्द के दो व्यापक रूप से उपयोग किए जाने वाले मॉडलों में उत्तेजना घृणा और परिहार में दर्द से संबंधित परिवर्तनों का पता लगा सकता है।

एमसीए को क्रोनिक दर्द की स्थिति जटिल क्षेत्रीय दर्द सिंड्रोम (सीआरपीएस) के फ्रैक्चर / कास्टिंग मॉडल में आगे परीक्षण किया गया था, जो एक बंद दाएं डिस्टल टिबिया फ्रैक्चर द्वारा स्थापित किया जाता है, जिसके बाद कास्टिंग¹⁴ के 3 सप्ताह होते हैं। यह नैदानिक रूप से सूचित मॉडल तीव्र चरण परिधीय सूजन, साथ ही साथ केंद्रीय तंत्रिका तंत्र में लगातार हिंडलिंब एलोडिनिया के साथ दीर्घकालिक प्रतिरक्षा गतिविधि प्रदर्शित करता है। सीएफए और एसएनआई मॉडल के समान, फ्रैक्चर / कास्टिंग मॉडल (चित्रा 3 ए) में बढ़ी हुई एस्केप लेटेंसी देखी गई थी। चोट से पहले, कक्ष 1 से बचने के लिए विलंबता जांच ऊंचाई तक आनुपातिक रूप से बढ़ गई। चोट के बाद, एस्केप लेटेंसी 0 मिमी पर अपरिवर्तित रही, लेकिन बेसलाइन (चित्रा 3 बी) की तुलना में पुरुषों के लिए 2 मिमी और 5 मिमी जांच ऊंचाई और महिलाओं के लिए 5 मिमी जांच ऊंचाई पर काफी वृद्धि हुई।

चित्रा 1: योजनाबद्ध और एमसीए डिवाइस की छवियां( ए) एमसीए परख में संभावित परिणाम उपाय, (क्लॉकफेस आइकन द्वारा चिह्नित): कक्ष 1 (I) से बाहर निकलने के लिए विलंबता, कक्ष 2 के 50% से अधिक को पार करने के लिए विलंबता (बिंदीदार रेखा; II), कक्ष 2 (III) में बिताए गए समय की कुल राशि, एस्केप चैंबर (IV) तक पहुंचने के लिए विलंबता या प्रत्येक कक्ष (V) में बिताए गए प्रतिशत समय। औसतन दर्द का अनुभव करने वाले जानवर I, II और IV के लिए अधिक मान दिखाते हैं, और III के लिए कम मान दिखाते हैं। III के लिए एक कम मूल्य आवश्यक रूप से कक्ष 1 और / या कक्ष 3 में बिताए गए समय के अनुपात को बढ़ाता है, जिसे परिणाम माप V द्वारा कैप्चर किया जाएगा Biorender.com। (बी) एमसीए डिवाइस (और कक्षों को 1, 2, और 3 नंबर वाले कक्षों) को चित्रित करने वाली छवियां एलईडी बंद (ऊपर बाईं ओर) के साथ, एलईडी चालू (नीचे बाईं ओर)। (c) दरवाजों को खोलने के साथ ऊपर से कक्षों का एक दृश्य। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

चित्रा 2: भड़काऊ और न्यूरोपैथिक दर्द एमसीए परख में परिहार को बढ़ाते हैं। (ए) यहां उपयोग किए जाने वाले विशिष्ट परिणाम उपाय का चित्रण: कक्ष 2 मध्य बिंदु को पार करने के लिए विलंबता। (बी) सीएफए के इंट्राप्लांटर इंजेक्शन ने भागने के लिए विलंबता (लाल वर्ग) बनाम खारा नियंत्रण (काले सर्कल) में काफी वृद्धि की जब जांच ऊंचाई 5 मिमी पर सेट की गई थी। इंट्रापेरिटोनियल कार्प्रोफेन (10 मिलीग्राम / किग्रा) ने एस्केप लेटेंसी (नीले त्रिकोण) में सीएफए-प्रेरित वृद्धि को कम कर दिया। डेटा को माध्य एस्केप लेटेंसी ± माध्य (SEM) की मानक त्रुटि के रूप में प्लॉट किया जाता है; n = 7 पुरुष / समूह। (सी) बख्श्ड तंत्रिका चोट (एसएनआई) सर्जरी ने कक्ष 1 एस्केप लेटेंसी बनाम शाम सर्जरी नियंत्रण (ब्लैक सर्कल) में काफी वृद्धि की, जब जांच की ऊंचाई 5 मिमी (लाल वर्ग) पर सेट की गई थी। इंट्रापेरिटोनियल ब्यूप्रेनोर्फिन (25 मिलीग्राम / किग्रा) ने एस्केप लेटेंसी (नीले त्रिकोण) में इस वृद्धि को काफी कम कर दिया। डेटा को SEM ± माध्य एस्केप लेटेंसी के रूप में प्लॉट किया जाता है; n = 6-7 पुरुष प्रति समूह। (डी) एस्केप लेटेंसी में एसएनआई-प्रेरित वृद्धि को एनाल्जेसिक गैबापेंटिन (हरे त्रिकोण) के उपयोग से उलट दिया गया था। डेटा को SEM ± माध्य एस्केप लेटेंसी के रूप में प्लॉट किया जाता है; n = 8 पुरुष / समूह। ## = पी < 0.01, ***/### = पी < .001, संकेतित तुलना (दो-तरफ़ा एनोवा, बोनफेरोनी पोस्ट-हॉक) के लिए। इस आंकड़े को¹³ से संशोधित किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

चित्रा 3: Tibial फ्रैक्चर / कास्टिंग प्रेरित पुरानी दर्द एमसीए परख में परिहार में वृद्धि. फ्रैक्चर / कास्टिंग ने 3 सप्ताह के बाद चोट (डब्ल्यू 3) बनाम बेसलाइन (बीएल) पर 2 मिमी और 5 मिमी जांच ऊंचाइयों पर पुरुषों में और 5 मिमी जांच ऊंचाई (एन = 5 / सेक्स) पर महिलाओं में भागने की विलंबता में काफी वृद्धि की। प्रत्येक माउस से डेटा को फीका काले (पुरुषों) या केयेन (मादाओं) में चित्रित किया जाता है, जिसका मतलब अंधेरे लाइनों द्वारा दर्शाया जाता है। = पी < 0.01/< 0.001 बनाम सेक्स- और जांच ऊंचाई मिलान बेसलाइन मूल्य दो तरह से एनोवा, Tukey पोस्ट-हॉक द्वारा मिलान. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

अनुपूरक फ़ाइल 1: 3 डी प्रिंटर फ़ाइल SpikeBed-MCA. जब नायलॉन 12 जैसे उपयुक्त जैव-संगत और धोने योग्य सामग्री में मुद्रित किया जाता है, तो स्पाइकबेड-एमसीए.एसटीएल स्पर्श जांच के मंच का उत्पादन करता है जो कक्ष 2 के फर्श के माध्यम से निकलता है। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें।

अनुपूरक फ़ाइल 2: 3 डी प्रिंटर फ़ाइल MCA_baseplate. जब एक उपयुक्त biocompatible और धोने योग्य सामग्री में मुद्रित, जैसे नायलॉन 12, MCA_baseplate.stl कक्ष 2 के फर्श का उत्पादन करता है, जिसके माध्यम से स्पर्श जांच बाहर निकलती है। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें।

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Discussion

सभी व्यवहार परीक्षणों के साथ, उचित हैंडलिंग, यादृच्छिककरण, और जानवरों के उपचार के लिए अंधा करना आवश्यक है। जटिल व्यवहार और निर्णय लेने में मल्टीफैक्टोरियल इनपुट को देखते हुए, यह आवश्यक है कि जानवरों को संभाला जाए, आदत डाली जाए, और संकट को कम करते हुए जितना संभव हो उतना लगातार परीक्षण किया जाए। कक्ष 1 में माउस प्लेसमेंट के समय को पुन: पेश करने, एलईडी रोशनी पर स्विच करने और बाधा को हटाने के लिए भी ध्यान रखा जाना चाहिए, क्योंकि यहां अंतर बाद के व्यवहार को प्रभावित कर सकते हैं।

यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि चित्र 1A में दर्शाए गए विभिन्न परिणाम उपाय परस्पर संबंधित हैं। उदाहरण के लिए, कक्ष 2 में प्रवेश करने वाला माउस आमतौर पर कक्ष 2 के आधे रास्ते को पार करता है और फिर लगभग हमेशा कक्ष 3 में भागने को पूरा करता है। इसका मतलब यह है कि परिणाम उपाय I, II और IV एक दूसरे से संबंधित हैं। परिणाम उपाय III और V क्रमशः कक्ष 2 में कुल निवास समय, और सभी 3 कक्षों में रहने के समय के अनुपात को मापते हैं। इसलिए, ये उपाय एक दूसरे से निकटता से संबंधित हैं। हालांकि, एक माउस सैद्धांतिक रूप से कक्ष 2 में पर्याप्त निवास समय अर्जित कर सकता है चाहे आधे रास्ते को पार करना या कक्ष 3 में भागने में कम विलंबता, उच्च विलंबता थी, या बिल्कुल भी नहीं हुआ था।

इस विधि के कई बदलावों या संशोधनों की सूचना दी गई है। यहां सूचीबद्ध विभिन्न परिणाम उपायों के अलावा (चित्रा 1), जांचकर्ता संवेदनशीलता में अंतर को उजागर करने के प्रयास में जांच ऊंचाई की प्रगति को अलग-अलग कर सकते हैं। चूंकि मध्यवर्ती 2 मिमी जांच ऊंचाई के साथ कोई सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण अंतर नहीं था, इसलिए चूहों को केवल 0 मिमी और 5 मिमी पर चलाने के लिए यह अधिक कुशल हो सकता है। वैकल्पिक रूप से, 2 और 5 मिमी के बीच एक जांच ऊंचाई, या 5 मिमी जांच ऊंचाई पर दोहराए गए रन उन मतभेदों को अनमास्क करना शुरू कर सकते हैं जो अन्यथा स्पष्ट नहीं थे। इसके अलावा, प्रत्येक कक्ष में रहने के समय के मूल्यांकन का उपयोग प्रेरणा और गतिविधि के रीडआउट के रूप में किया जा सकता है। यह उन उदाहरणों में उपयोगी हो सकता है जहां कुछ चूहे कक्ष 3 के माध्यम से जल्दी से चलते हैं, लेकिन फिर आगे का पता लगाने के लिए कक्ष 1 में लौटते हैं। इन स्थितियों में, अकेले कक्ष 3 में प्रवेश करने के लिए विलंबता इस सूक्ष्मता पर कब्जा नहीं करेगी। यहां निर्धारित 2 मिनट की सीमा से परे परीक्षण कटऑफ समय बढ़ाना भी कुछ जांचकर्ताओं के लिए सार्थक साबित हो सकता है। अंत में, हम इस संभावना को बाहर नहीं कर सकते हैं कि एक ही जानवरों के दोहराने वाले परीक्षण (यहां वर्णित तीन बार से अधिक), या अधिक आवृत्ति के साथ परीक्षण (परीक्षणों के बीच 4-7 दिनों से कम) आदत या सीखने के प्रभाव ों को पेश कर सकते हैं। इन कारणों से, हर समय बिंदु पर भोले, अविभाजित नियंत्रण समूहों को शामिल करने को प्रोत्साहित किया जाता है। आखिरकार, व्यवहार में भिन्नताएं दर्द मॉडल विशिष्ट होने की अत्यधिक संभावना है और इन और अन्य दर्द मॉडलों में आगे की जांच की गारंटी देती है।

यहां उपयोग किए जाने वाले दर्द-उत्प्रेरण मॉडल (सीएफए, एसएनआई, फ्रैक्चर / कास्टिंग) आमतौर पर अन्य दर्द व्यवहार परीक्षणों में अतिसंवेदनशीलता से जुड़े होते हैं, जो परिहार / भागने की विलंबता में वृद्धि से मेल खाती है। एमसीए परख भी संवेदी तीक्ष्णता के नुकसान का पता लगाने में सक्षम हो सकता है (उदाहरण के लिए, चैंबर 2 में बिताए गए समय में वृद्धि के माध्यम से), हालांकि यह औपचारिक रूप से परीक्षण नहीं किया गया है। एमसीए की कुछ सीमाएं हैं जो विचार की गारंटी देती हैं। उज्ज्वल प्रकाश के प्रति घृणा कक्ष 2 में प्रवेश को प्रेरित करने का एक महत्वपूर्ण साधन है और इसलिए बाद के संघर्ष का एक चालक है। एक विशेष माउस मॉडल से जुड़ी कोई भी पैथोलॉजिकल विशेषता जो उज्ज्वल प्रकाश (जैसे, दृश्य हानि) के प्रति घृणा को बदल सकती है, इस परीक्षण को नियोजित करने से पहले सावधानीपूर्वक विचार किया जाना चाहिए। विलंबता से बचने के लिए चिंता के योगदान का भी व्यवस्थित रूप से परीक्षण नहीं किया गया है, हालांकि पुरानी भड़काऊ और न्यूरोपैथिक दर्द मॉडल को अन्य परीक्षणों में चूहों में चिंता जैसे व्यवहार के संकेत दिखाने के लिए सूचित किया गया है, इस^15,16 के बारे में बहस जारी है। उस ने कहा, इन व्यवहारिक परिणामों में दर्द से संबंधित चिंता के योगदान की पुष्टि या इनकार नहीं किया जा सकता है। चूंकि एमसीए के पास परिणाम उपायों में कई इनपुट हैं, इसलिए यह विचार करने के लिए अधिक संभावित उलझनों के साथ आता है।

संक्षेप में, एमसीए परीक्षण माउस मॉडल में दर्द संवेदनशीलता का एक गैर-रिफ्लेक्सिव रीडआउट प्रदान करता है। परिणाम उपाय रिफ्लेक्सिव संवेदनशीलता के अलावा अन्य कारकों से प्रभावित होते हैं और दर्द संवेदनशीलता और भावात्मक / प्रेरक स्थिति का एक समग्र उपाय प्रदान करते हैं। प्रत्येक परीक्षण को चलाने के लिए आवश्यक समय की मात्रा, और आवश्यक कौशल और विशेष उपकरणों का स्तर दर्द के अन्य गैर-रिफ्लेक्सिव उपायों के साथ अनुकूल रूप से तुलना करता है, जैसे कि चाल विश्लेषण या वातानुकूलित स्थान वरीयता ^5,13। हालांकि अभी भी कुछ हद तक उपन्यास, दृष्टिकोण को अपनाया गया है और जांचकर्ताओं की कई टीमों द्वारा स्वतंत्र रूप से सत्यापित किया गया है, मुख्य रूप से चूहों में। आंशिक कटिस्नायुशूल तंत्रिका बंधाव ने निकास विलंबता¹⁷ और चूहों में मॉर्फिन-निर्भर वापसी में वृद्धि^की। चूहों में एक अन्य अध्ययन ने प्रस्तावित किया कि चूहों में रीढ़ की हड्डी की चोट और पुरानी कसना चोट मॉडल का उपयोग करके क्रॉसिंग की संख्या की गिनती, एक उपयोगी परिणाम उपाय के रूप में काम कर सकती^है। महत्वपूर्ण रूप से, इस अध्ययन ने शाम सर्जरी नियंत्रण में जांच परिहार में वृद्धि की भी पहचान की, यह दर्शाता है कि शाम / वाहन नियंत्रण के साथ एक भोले समूह को शामिल करना वारंट किया गया है। एमसीए के भविष्य के अनुप्रयोगों माउस उपभेदों और / या दर्द मॉडल के बीच भिन्नता पर ध्यान केंद्रित कर सकते हैं, परख प्रदर्शन पर चिंता का प्रभाव, और मुद्रा विश्लेषण या चाल कीनेमेटिक्स के एकीकरण के लिए बेहतर हानिकारक उत्तेजनाओं के लिए व्यवहार अनुकूलन में अंतर को समझने के लिए।

प्रीक्लिनिकल माउस अध्ययन और उपन्यास चिकित्सीय के विकास के बीच ट्रांसलेशनल अंतर चिंता का कारण पेश करना जारी रखता है। इस बात को ध्यान में रखते हुए, एमसीए परख दर्द अनुसंधान में मौजूदा उपकरणों को पूरक करता है और दर्द के कई संवेदी और भावात्मक आयामों की अधिक पूर्ण तस्वीर देने में मदद करता है।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए हितों का कोई प्रासंगिक संघर्ष नहीं है।

Acknowledgments

जीएम एक एनडीएसईजी स्नातक फैलोशिप द्वारा समर्थित है। वीएलटी एनआईएच एनआईजीएमएस अनुदान #GM137906 और रीता एलन फाउंडेशन द्वारा समर्थित है। एजेएस रक्षा विभाग अनुदान W81XWH-20-1-0277, W81XWH-21-1-0197, और रीटा एलन फाउंडेशन द्वारा समर्थित है। हम डिजाइन और कक्ष 2 मंजिल और जांच प्लेट के लिए स्वतंत्र रूप से 3 डी प्रिंटर फ़ाइलों को उपलब्ध कराने के लिए वाशिंगटन यूनिवर्सिटी स्कूल ऑफ मेडिसिन में डॉ Alexxai Kravitz के लिए आभारी हैं।

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
32.8ft 3000K-6000K Tunable White LED Strip Lights, Dimmable Super Bright LED Tape Lights with 600 SMD 2835 LEDs	Lepro	SKU: 410087-DWW-US	For lighting chamber 1. https://www.lepro.com/32ft-dimmable-tunable-white-led-strip-lights.html
3D printed 'spike bed' and 'chamber 2 floor'	Shapeways	N/A	Optional, for mechanical probes as an alternative to blunted map pins.
70% ethanol	Various	N/A	To clean MCA between mice.
Acryl-Hinge 2	TAP Plastics	N/A	for attaching chamber lids to rear walls. https://www.tapplastics.com/product/plastics/handles_hinges_latches/acryl_hinge_2/122
Chemcast Cast Acrylic Sheet, Clear	TAP Plastics	N/A	3mm thick. For front wall of chamber 1. https://www.tapplastics.com/product/plastics/cut_to_size_plastic/acrylic_sheets_cast_clear/510
Chemcast Cast Transparent Colored Acrylic, Transparent Dark Red - 50%	TAP Plastics	N/A	3mm thick. 50% light transmission. For walls and lids of chambers 2 and 3. https://www.tapplastics.com/product/plastics/cut_to_size_plastic/acrylic_sheets_transparent_colors/519
Chemcast Translucent & Opaque Colored Cast Acrylic, Sign Opaque White - 0.1%	TAP Plastics	N/A	3mm thick. For side walls and lid of chamber 1. https://www.tapplastics.com/product/plastics/cut_to_size_plastic/acrylic_sheets_color/341
Disinfectant (e.g. Quatricide)	Pharmacal Research Laboratories, Inc.	65020F	To disinfect MCA at the end of a testing session.
Dry-erase markers and board	Various	N/A	To add experimental info to the beginning of video footage.
Map pins	Various	N/A	Optional, for mechanical probes. Use sandpaper to blunt sharp points before use. Can be used in place of 3D-printed parts.
Paper towels	Various	N/A	To clean/disinfect MCA.
SCIGRIP Weld-On #3 Acrylic Cement	TAP Plastics	N/A	For assembling acrylic sheets into chambers and affixing hinges. https://www.tapplastics.com/product/repair_products/plastic_adhesives/weld_on_3_cement/131
Stopwatch	Various	N/A	To record escape latencies/dwell times in real-time or from recorded video.
Timer	Various	N/A	To ensure LED turn-on, barrier removal and test completion are timed consistently.
Video camera	Various	HDRCX405 Handycam Camcorder	To record mouse behavior in the MCA device. Can be substituted with any consumer-grade video camera capable of 1080p resolution.
Tripod	Famall	N/A	Any tripod that can hold the camera at bench height for recording MCA footage is acceptable.