Summary
Il test meccanico di evitamento dei conflitti viene utilizzato come lettura non riflessiva della sensibilità al dolore nei topi che può essere utilizzata per comprendere meglio le risposte affettivo-motivazionali in una varietà di modelli di dolore murino.
Abstract
Il dolore comprende sia le dimensioni sensoriali (nocicettive) che affettive (spiacevoli). Nei modelli preclinici, il dolore è stato tradizionalmente valutato utilizzando test riflessivi che consentono inferenze riguardanti la componente nocicettiva del dolore, ma forniscono poche informazioni sulla componente affettiva o motivazionale del dolore. Lo sviluppo di test che catturino questi componenti del dolore è quindi importante dal punto di vista della traduzione. Quindi, i ricercatori devono utilizzare saggi comportamentali non riflessivi per studiare la percezione del dolore a quel livello. L'evitamento meccanico dei conflitti (MCA) è un test volontario di comportamento non riflessivo stabilito, per studiare le risposte motivazionali a uno stimolo meccanico nocivo in un paradigma a 3 camere. Un cambiamento nella preferenza di posizione di un topo, di fronte a stimoli nocivi concorrenti, viene utilizzato per dedurre la sgradevolezza percepita della luce intensa rispetto alla stimolazione tattile delle zampe. Questo protocollo delinea una versione modificata del test MCA che i ricercatori del dolore possono utilizzare per comprendere le risposte affettivo-motivazionali in una varietà di modelli di dolore murino. Sebbene non siano specificamente descritti qui, i nostri dati MCA di esempio utilizzano l'adiuvante di Freund completo intraplantarare (CFA), la lesione nervosa risparmiata (SNI) e un modello di frattura / fusione come modelli di dolore per illustrare la procedura MCA.
Introduction
Il dolore è un'esperienza complessa con componenti sensoriali e affettive. Una riduzione della soglia di percezione del dolore e l'ipersensibilità agli stimoli termici e/o meccanici sono caratteristiche chiave di questa esperienza, che i test di comportamento del dolore evocati dallo stimolo possono catturare (come il test di sensibilità al calore di Hargreaves e il test di von Frey di sensibilità meccanica)1,2. Sebbene tali test forniscano risultati robusti e riproducibili, sono limitati dalla loro dipendenza dal ritiro riflessivo da uno stimolo nocivo percepito. Ciò ha messo in discussione una continua dipendenza della ricerca sul dolore solo su questi test. A tal fine, i ricercatori del dolore hanno esplorato per diversi anni test comportamentali alternativi / complementari da utilizzare nei modelli di dolore dei roditori nel tentativo di catturare più componenti affettive e / o motivazionali del dolore. Queste misure non evocate, volontarie o non riflessive (ad esempio, corsa delle ruote, attività di scavatura, preferenza del luogo condizionato 3,4,5) vengono implementate nel tentativo di migliorare la traducibilità della ricerca preclinica sul dolore.
Il test di prevenzione meccanica dei conflitti (MCA) è stato originariamente descritto da Harte et al. nel 20166, è usato prevalentemente nei ratti 7,8 e rappresenta una modifica di un approccio precedente - il paradigma di fuga-evitamento del luogo. In questo approccio, uno stimolo nocivo della zampa posteriore viene eseguito in una camera (scura) altrimenti desiderabile per guidare il comportamento intenzionale dell'animale a sfuggire / evitare tale stimolazione 9,10. Invece di fare affidamento sulla stimolazione nociva manuale della zampa posteriore da parte di un osservatore, il test MCA costringe i topi a negoziare uno stimolo potenzialmente nocivo per sfuggire a un ambiente avverso e raggiungere la camera oscura. Il conflitto/evitamento che dà il nome al saggio nasce da queste due motivazioni in competizione: fuggire da zone illuminate ed evitare la stimolazione nociva delle zampe. Il test MCA condivide anche le caratteristiche con il test condizionato delle preferenze di luogo, in cui l'abbinamento di sollievo dal dolore con segnali ambientali guida cambiamenti nel comportamento che riflettono una preferenza per il contesto antidolorifico / gratificante11.
Fondamentalmente parlando, tutti questi saggi condividono un approccio simile: utilizzare uno spostamento nella preferenza di un animale per un ambiente avversivo rispetto a un altro come indicatore del loro stato affettivo / motivazionale. Il test MCA è un paradigma a 3 camere costituito da una camera illuminata seguita da una camera centrale scura con sonde ad altezza regolabili e una terza camera scura senza stimoli avversi. Un topo illeso è tipicamente motivato a fuggire in una camera oscurata, data l'innata avversione dei roditori alla luce intensa12. In questo esempio, la motivazione naturale a fuggire da un ambiente illuminato supera la riluttanza a incontrare la stimolazione della zampa posteriore (le sonde di altezza regolabili), che si verifica esclusivamente nell'ambiente oscurato. Al contrario, un topo che avverte dolore (a causa di infiammazione o neuropatia, ad esempio) può scegliere di trascorrere più tempo nell'ambiente illuminato, poiché vi è la motivazione per evitare la spiacevole esperienza tattile delle sonde meccaniche nell'impostazione di ipersensibilità tattile in corso.
In questo articolo viene descritta una versione modificata del test MCA. Abbiamo adattato il metodo originale (che è stato eseguito nei ratti6) per l'uso nei topi. Abbiamo anche ridotto il numero di altezze della sonda testate da sei a tre (0, 2 e 5 mm sopra l'altezza del pavimento) al fine di semplificare l'acquisizione dei dati. Questo approccio è stato testato su più modelli di dolore e convalidato con analgesici noti, indicando che l'ipersensibilità al dolore e / o i cambiamenti affettivi e motivazionali associati stanno guidando questi cambiamenti nel comportamento. Questo approccio è relativamente veloce da condurre e adattabile rispetto ad altre misure non riflessive, che possono richiedere molti giorni di assuefazione e allenamento 1,2. Di concerto con altre misure del dolore, MCA può generare preziose intuizioni sugli aspetti affettivi e motivazionali del dolore.
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Protocol
Tutti gli esperimenti che coinvolgono l'uso di topi e le procedure ivi seguite sono stati approvati dai comitati istituzionali per la cura e l'uso degli animali del MD Anderson Cancer Center e della Stanford University, in stretta conformità con la Guida del National Institutes of Health per la cura e l'uso degli animali da laboratorio.
1. Costruzione MCA
- Camera di costruzione 1 con le seguenti dimensioni: 125 mm x 125 mm x 125 mm (larghezza x profondità x altezza) da acrilico bianco opaco di 3 mm di spessore utilizzato per le pareti laterali, pavimento, soffitto. Utilizzare un acrilico trasparente di 3 mm di spessore per la parete frontale. Incollare tutti i lati insieme con largo anticipo utilizzando un adesivo acrilico dedicato.
ATTENZIONE: L'adesivo acrilico è considerato materiale pericoloso (infiammabile, dannoso per il vapore, può essere dannoso se ingerito, può irritare la pelle o gli occhi). Tali adesivi devono essere utilizzati solo in conformità con le istruzioni del produttore (vale a dire, con DPI appropriati in un'area ben ventilata). - Attaccare il coperchio della camera 1 con una cerniera, in modo che i topi possano essere facilmente posizionati e recuperati dalla camera. Fissare il nastro autoadesivo a diodi emettitori di luce (LED) sulla superficie interna del coperchio per fornire un'illuminazione di ~ 4800 lux.
- Chiudere la camera 1 dal resto dell'MCA facendo scorrere un foglio acrilico opaco dentro e fuori posizione.
- Costruisci la camera di prova MCA, camera 2, come una camera non illuminata lunga 270 mm fabbricata in acrilico traslucido rosso scuro (spessore 3 mm) su tutti i lati, con un coperchio incernierato sulla parte superiore. Posizionare una griglia 13 x 31 di fori da 2 mm sul pavimento della camera 2 attraverso la quale può sporgere una serie di sonde smussate con punte di diametro 0,5 mm (ad esempio, perni di mappa smussati).
NOTA: perni smussati con un blocco di carta vetrata a 120 grani o simili. Pulirli in acqua tiepida con detergente prima di essere disinfettati con disinfettante sporicida. - Regolare l'altezza delle sonde posizionando fogli acrilici aggiuntivi sotto la piastra di base della sonda (Figura 1). Utilizzando questo approccio, configurare il dispositivo con tre impostazioni: 0 mm, 2 mm e 5 mm di altezza della sonda.
- In alternativa ai perni della mappa smussati o materiali simili, utilizzare i file della stampante 3D per stampare il pavimento della camera 2 e la piastra della sonda (vedere File supplementare 1: SpikeBed-MCA.stl che si riferisce alle sonde meccaniche e File supplementare 2: MCA_baseplate.stl che forma il pavimento della camera 2).
NOTA: se la stampa 3D non è disponibile, incollare i perni della mappa su un foglio acrilico utilizzando lo stesso adesivo acrilico utilizzato per costruire le pareti del dispositivo. - Stampa con un materiale lavabile e biocompatibile, come la plastica nylon 12 o simile (consigliato).
- Costruire la camera 3 con le seguenti dimensioni: 125 mm x 125 mm x 125 mm come una scatola acrilica rosso scuro traslucida non illuminata (su tutti i lati), posta all'estremità opposta alla camera 1. Posizionare un coperchio incernierato sulla camera, simile alle camere 1 e 2. Questa camera funge da area di fuga oscurata dalle sonde meccaniche nella camera 2.
2. Assuefazione e test MCA del mouse
- Come con tutti gli esperimenti che coinvolgono risultati comportamentali negli animali, osservare la randomizzazione appropriata e l'accecamento per ridurre al minimo i potenziali pregiudizi.
NOTA: I risultati rappresentativi sono stati generati utilizzando topi C57BL/6J maschi e femmine di 8-12 settimane (numero di ceppo Jackson Laboratories 000664). I topi erano socialmente alloggiati, fino a 5 per gabbia, con accesso a cibo e acqua ad libitum e un ciclo di luce dalle 07:00 alle 19:00. MCA ha avuto luogo nel periodo di luce, tra le 09:00 h e le 12:00 h. - Un giorno prima che il test di base sia programmato, acclimatare i topi all'unità MCA per 5 minuti (minimo) a 15 minuti (massimo) con i loro compagni di gabbia per facilitare l'esplorazione sociale dell'intero dispositivo.
- Durante tutto il processo, assicurarsi che i LED nella camera 1 siano spenti, che la barriera tra le camere 1 e 2 sia lasciata aperta e che le sonde siano impostate su un'altezza pari a zero (cioè non sporgenti attraverso il pavimento della camera 2).
- Eseguire un test di base sui topi (facoltativo) se lo studio incorpora animali di controllo negativo (ad esempio, chirurgia fittizia o controlli di iniezione del veicolo). Se lo si desidera, utilizzare un test di base per escludere eventuali valori anomali non feriti che non si incrociano mai nella camera 2, anche se ciò non si è rivelato necessario. Se utilizzato, segnalare tutti i criteri di esclusione e il numero di topi esclusi.
- Prima di iniziare il test, configura una videocamera in grado di registrare filmati 1080p su un treppiede con una vista laterale dell'intero dispositivo MCA. Regolate il campo visivo in modo che l'MCA riempia l'immagine registrata.
- Una volta iniziata la registrazione, tenere una scheda portatile di cancellazione a secco nel campo visivo della telecamera per etichettare l'inizio del video con informazioni identificative sull'esecuzione dei test dell'animale (ad esempio, ID del mouse, altezza della sonda, data, punto temporale, ecc.).
- Per la prima esecuzione, impostare l'altezza della sonda su zero. Trasferire il mouse da testare dalla sua gabbia di casa alla camera 1 con la porta a barriera in posizione. Avviate un timer visibile nel metraggio registrato.
NOTA: il timer garantisce che gli intervalli tra le diverse parti del test siano coerenti tra le esecuzioni. - Dopo 10 s, accendere la camera 1 LED. Dopo che il mouse è stato nella camera illuminata per 20 s, ritirare la barriera tra le camere 1 e 2.
- Osservare l'animale per 2 minuti. Misura le latenze e/o i tempi di permanenza con un cronometro mentre il test è in corso. In alternativa, le riprese video possono essere analizzate una volta completato il test.
NOTA: per motivi di produttività ed evitando un'esposizione prolungata a stimoli avversivi, il cutoff è stato fissato a 2 min. - Misurare uno o più dei numerosi risultati utili che sono stati identificati (vedi sotto; Figura 1). Consigliato di analizzare tutte e 5 le misure di esito all'inizio dei test, al fine di accertare quali aspetti del comportamento differiscono in una determinata configurazione sperimentale.
- Opzione I: Registrare la latenza alla prima voce della camera 2. Opzione II: Registrare la latenza per attraversare più di metà della camera 2. Opzione III: Registrare il tempo di permanenza totale nella camera 2. Opzione IV: Registrare la latenza per raggiungere la camera 3 (escape). Opzione V: Simile all'opzione II, registrare il tempo di permanenza totale in ogni camera entro 2 minuti e convertirli in proporzioni.
NOTA: Poiché ogni esperimento è unico e può essere influenzato da fattori biologici e cambiamenti comportamentali unici per il modello di malattia, i ricercatori possono sperimentare queste e altre misure nelle proprie mani.
- Opzione I: Registrare la latenza alla prima voce della camera 2. Opzione II: Registrare la latenza per attraversare più di metà della camera 2. Opzione III: Registrare il tempo di permanenza totale nella camera 2. Opzione IV: Registrare la latenza per raggiungere la camera 3 (escape). Opzione V: Simile all'opzione II, registrare il tempo di permanenza totale in ogni camera entro 2 minuti e convertirli in proporzioni.
- Una volta completato il test, riportare il mouse nella sua gabbia di casa, pulire le camere MCA con etanolo al 70% e lasciarlo asciugare completamente.
NOTA: i boli fecali di solito possono essere puliti dalla camera relativamente facilmente con asciugamani di carta prima dell'etanolo / disinfettante. Se si rende necessaria una pulizia più accurata, le camere 2 e 3 possono essere smontate e immerse in acqua calda e sapone. - Dopo aver eseguito tutti i topi in una coorte con l'altezza della sonda impostata a zero, inserire un foglio di acrilico da 3 mm sotto la piastra di base della sonda meccanica e ripetere i passaggi da 2.4.2 a 2.4.7 con un'altezza della sonda di 2 mm.
- Dopo aver eseguito tutti i mouse con l'altezza della sonda impostata su 2 mm, inserire un secondo foglio di acrilico da 3 mm sotto la piastra di base della sonda e ripetere i passaggi da 2.4.2 a 2.4.7 con un'altezza della sonda di 5 mm.
NOTA: Un gruppo di 8 topi può essere testato in circa 2 ore utilizzando questo approccio. Utilizzare gruppi di dimensioni più piccole se è richiesta una tempistica post-farmaco più precisa (ad esempio, per un esperimento di corso di droga). - Eseguire una pulizia finale con un disinfettante al termine di una sessione di test.
- Ripetere i test dopo aver indotto ipersensibilità al dolore e / o con il trattamento farmacologico.
- Confrontare le prestazioni di ciascun topo al basale con le loro prestazioni dopo che il dolore è stato indotto. Valutare l'impatto di un intervento farmacologico confrontando gli animali trattati con veicoli con animali trattati con farmaci allo stesso tempo.
- Eseguire analisi statistiche non parametriche (ad esempio, il test Mann Whitney U) se gli animali raggiungono il limite di 2 minuti senza soddisfare la misura di risultato desiderata, con conseguente dati non continui.
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Representative Results
Il test MCA è stato utilizzato con successo con diversi modelli di dolore murino meccanicamente distinti. La Figura 2 mostra i dati in cui la misura del risultato scelta stava attraversando il punto medio della camera 2 (Figura 2A). I dati ottenuti utilizzando il punto intermedio rispetto alla fuga nella camera 3 sono molto simili, ~ 40 s per metà strada contro ~ 45 s per la fuga della camera 3 nel modello di danno nervoso risparmiato (SNI) del dolore neuropatico con altezza della sonda di 5 mm13.
Nel modello di dolore infiammatorio indotto da CFA, l'iniezione di soluzione salina nella zampa posteriore di controllo (intraplantar) non modifica la latenza di fuga rispetto al basale. Quei topi che sono stati iniettati con CFA in una zampa posteriore hanno mostrato un aumento significativo della latenza di fuga 4 giorni dopo l'iniezione, ma solo quando l'altezza della sonda è stata aumentata a 5 mm. Fondamentalmente, questo aumento della latenza per sfuggire a 5 mm non è stato osservato nei topi che hanno ricevuto il carprofene FANS (10 mg / kg, cioè) 90 minuti prima dell'inizio del test (Figura 2B).
Il modello di lesione nervosa risparmiata (SNI) del dolore neuropatico traumatico è anche associato a un significativo aumento della latenza per sfuggire rispetto al basale quando l'altezza della sonda è stata impostata su 5 mm. Questo effetto è stato osservato nei topi SNI, ma non nei loro controlli chirurgici fittizi. Questa maggiore latenza di fuga è stata impedita anche dalla somministrazione sistemica dell'analgesico oppioide buprenorfina (25 μg/kg, i.p.) 90 minuti prima del test (Figura 2C). L'aumento della latenza di fuga è stato osservato anche nei topi che non sono stati sottoposti a un ciclo basale di test MCA prima della lesione del nervo (Figura 2D). In questo caso, l'aumento della latenza di fuga nei topi SNI a 5 mm è stato impedito da gabapentin (30 mg/kg, i.p.) somministrato 90 minuti prima del test. Collettivamente, questo suggerisce che MCA può rilevare cambiamenti legati al dolore nell'avversione e nell'evitamento dello stimolo in due modelli ampiamente utilizzati di dolore infiammatorio e neuropatico.
MCA è stato ulteriormente testato nel modello di frattura / fusione della sindrome del dolore regionale complesso del dolore cronico (CRPS) che è stabilito da una frattura della tibia distale destra chiusa seguita da 3 settimane di fusione14. Questo modello clinicamente informato presenta infiammazione periferica in fase acuta, così come attività immunitaria a lungo termine nel sistema nervoso centrale con allodinia posteriore persistente. Analogamente ai modelli CFA e SNI, nel modello di frattura/fusione sono state osservate maggiori latenze di fuga (Figura 3A). Prima della lesione, la latenza per sfuggire alla camera 1 aumentava proporzionalmente all'altezza della sonda. Dopo l'infortunio, la latenza di fuga è rimasta invariata a 0 mm, ma è aumentata significativamente all'altezza della sonda di 2 mm e 5 mm per i maschi e all'altezza della sonda di 5 mm per le femmine rispetto alla linea di base (Figura 3B).
Figura 1: Schema e immagini del dispositivo MCA. (A) Misure di esito potenziale nel test MCA,(contrassegnato da icone clockface): latenza per uscire dalla camera 1 (I), latenza per attraversare più del 50% della camera 2 (linea tratteggiata; II), la quantità totale di tempo trascorso nella camera 2 (III), la latenza per raggiungere la camera di fuga (IV) o la percentuale di tempo trascorso in ciascuna camera (V). Gli animali che soffrono di dolore in media mostrano valori maggiori per I, II e IV e valori ridotti per III. Un valore ridotto per III aumenta necessariamente la percentuale di tempo trascorso nella camera 1 e/o nella camera 3, che verrebbe catturata dalla misura di risultato V. Creata con Biorender.com. (B) Immagini che illustrano il dispositivo MCA (e le camere numerate 1, 2 e 3) con i LED spenti (in alto a sinistra), i LED accesi (in basso a sinistra). (C) Una vista delle camere dall'alto con le porte aperte. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Il dolore infiammatorio e neuropatico aumenta l'evitamento nel test MCA. (A) Rappresentazione della misura di esito specifica utilizzata qui: latenza per attraversare il punto medio della camera 2. (B) L'iniezione intraplantaria di CFA ha aumentato significativamente la latenza di fuga (quadrati rossi) rispetto ai controlli salini (cerchi neri) quando l'altezza della sonda è stata impostata su 5 mm. Il carprofene intraperitoneale (10 mg/kg) ha attenuato l'aumento della latenza di fuga indotto dal CFA (triangoli blu). I dati sono tracciati come latenza di fuga media ± errore standard della media (SEM); n = 7 maschi/gruppo. (C) La chirurgia con lesioni nervose risparmiate (SNI) ha aumentato significativamente la latenza di fuga della camera 1 rispetto ai controlli chirurgici fittizi (cerchi neri), quando l'altezza della sonda è stata impostata su 5 mm (quadrati rossi). La buprenorfina intraperitoneale (25 mg/kg) ha attenuato significativamente questo aumento della latenza di fuga (triangoli blu). I dati vengono tracciati come latenza media di escape ± SEM; n = 6-7 maschi per gruppo. (D) L'aumento della latenza di fuga indotto da SNI è stato invertito dall'uso dell'analgesico gabapentin (triangoli verdi). I dati vengono tracciati come latenza media di escape ± SEM; n = 8 maschi/gruppo. ## = p < 0.01, ***/### = p < .001, per i confronti indicati (ANOVA bidirezionale, Bonferroni post-hoc). Questa cifra è stata modificata da13. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: La frattura tibiale / fusione ha indotto l'evitamento del dolore cronico nel test MCA. La frattura/colata ha aumentato significativamente la latenza di fuga a 3 settimane dopo la lesione (W3) rispetto al basale (BL) nei maschi alle altezze della sonda di 2 mm e 5 mm e nelle femmine all'altezza della sonda di 5 mm (n = 5 / sesso). I dati di ciascun topo sono rappresentati in nero sbiadito (maschi) o cayenna (femmine) con media rappresentata da linee scure. **/*** = p < 0,01/< 0,001 rispetto al valore basale abbinato all'altezza del sesso e della sonda di ANOVA bidirezionale, Tukey post-hoc. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
File supplementare 1: file della stampante 3D SpikeBed-MCA. Se stampato in un materiale opportunamente biocompatibile e lavabile, come il nylon 12, SpikeBed-MCA.stl produce la piattaforma di sonde tattili che sporgono attraverso il pavimento della camera 2. Fare clic qui per scaricare questo file.
File supplementare 2: file della stampante 3D MCA_baseplate. Quando stampato in un materiale opportunamente biocompatibile e lavabile, come il nylon 12, MCA_baseplate.stl produce il pavimento della camera 2, attraverso il quale sporgono le sonde tattili. Fare clic qui per scaricare questo file.
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Discussion
Come per tutti i test comportamentali, la corretta gestione, randomizzazione e accecamento al trattamento degli animali è essenziale in tutto. Dati gli input multifattoriali in comportamenti complessi e processi decisionali, è imperativo che gli animali siano maneggiati, abituati e testati nel modo più coerente possibile, riducendo al minimo l'angoscia. Bisogna anche fare attenzione a riprodurre i tempi di posizionamento del mouse nella camera 1, accendendo le luci a LED e rimuovendo la barriera, poiché le differenze qui potrebbero influenzare il comportamento successivo.
Va notato che le diverse misure di risultato descritte nella Figura 1A sono correlate. Ad esempio, un topo che entra nella camera 2 di solito attraversa il punto a metà della camera 2 e poi quasi sempre completa la fuga nella camera 3. Ciò significa che le misure di risultato I, II e IV sono correlate. Le misure di risultato III e V misurano rispettivamente il tempo di permanenza totale nella camera 2 e la proporzione del tempo di permanenza in tutte e 3 le camere. Pertanto, queste misure sono strettamente correlate l'una all'altra. Tuttavia, un mouse può teoricamente accumulare un tempo di permanenza sostanziale nella camera 2 se l'attraversamento a metà strada o la fuga nella camera 3 hanno avuto una bassa latenza, un'alta latenza o non si sono verificati affatto.
Sono state segnalate diverse varianti o modifiche di questo metodo. Oltre alle diverse misure di esito elencate qui (Figura 1), i ricercatori potrebbero variare la progressione dell'altezza della sonda nel tentativo di evidenziare le differenze di sensibilità. Poiché non c'erano differenze statisticamente significative con l'altezza intermedia della sonda da 2 mm, potrebbe essere più efficiente far funzionare i topi solo a 0 mm e 5 mm. In alternativa, un'altezza della sonda compresa tra 2 e 5 mm o corse ripetute a un'altezza della sonda di 5 mm possono iniziare a smascherare differenze che altrimenti non erano evidenti. Inoltre, la valutazione del tempo di permanenza in ogni camera può essere utilizzata come lettura della motivazione e dell'attività. Questo può essere utile nei casi in cui alcuni topi corrono rapidamente attraverso la camera 3 ma poi tornano alla camera 1 per esplorare ulteriormente. In queste situazioni, la latenza per l'ingresso nella camera 3 da sola non catturerebbe questa sottigliezza. Aumentare il tempo limite del test oltre il limite di 2 minuti impostato qui può anche rivelarsi utile per alcuni investigatori. Infine, non possiamo escludere la possibilità che test ripetuti sugli stessi animali (più delle tre volte qui descritte), o test con maggiore frequenza (meno di 4-7 giorni tra i test) possano introdurre effetti di assuefazione o apprendimento. Per questi motivi, viene incoraggiata l'inclusione di gruppi di controllo ingenui e non manipolati in ogni momento. In definitiva, le variazioni nel comportamento sono altamente probabilmente specifiche del modello del dolore e giustificano ulteriori indagini in questi e altri modelli di dolore.
I modelli che inducono dolore utilizzati qui (CFA, SNI, frattura / fusione) sono tipicamente associati all'ipersensibilità in altri test di comportamento del dolore, che corrisponde ad un aumento della latenza di evitamento / fuga. Il test MCA può anche essere in grado di rilevare una perdita di acuità sensoriale (attraverso l'aumento del tempo trascorso nella camera 2, ad esempio), sebbene questo non sia stato formalmente testato. MCA ha alcune limitazioni che meritano considerazione. L'avversione alla luce intensa è un mezzo chiave per motivare l'ingresso nella camera 2 e quindi un fattore di conflitto successivo. Qualsiasi caratteristica patologica associata a un particolare modello murino che potrebbe alterare l'avversione alla luce intensa (ad esempio, disabilità visiva) deve essere attentamente considerata prima di utilizzare questo test. Anche il contributo dell'ansia alla fuga dalla latenza non è stato sistematicamente testato, sebbene i modelli di dolore infiammatorio e neuropatico cronico siano stati segnalati per mostrare segni di comportamento simile all'ansia nei topi in altri test, continua ad esserci un dibattito su questo15,16. Detto questo, un contributo dell'ansia correlata al dolore a questi esiti comportamentali non può essere confermato o escluso in questo momento. Poiché MCA ha più input nelle misure di risultato, questo comporta più potenziali confusioni da considerare.
In sintesi, il test MCA fornisce una lettura non riflessiva della sensibilità al dolore nei modelli murini. Le misure di esito sono influenzate da fattori diversi dalla sensibilità riflessiva e forniscono una misura composita della sensibilità al dolore e dello stato affettivo / motivazionale. La quantità di tempo necessaria per eseguire ogni test e il livello di abilità e le attrezzature specializzate richieste si confrontano favorevolmente con altre misure non riflessive del dolore, come l'analisi dell'andatura o la preferenza del luogo condizionato 5,13. Sebbene sia ancora in qualche modo nuovo, l'approccio è stato adottato e verificato in modo indipendente da più team di ricercatori, prevalentemente nei ratti. La legatura parziale del nervo sciatico ha aumentato la latenzadi uscita 17 e l'astinenza dipendente dalla morfina nei ratti7. Un altro studio sui ratti ha proposto che il conteggio del numero di incroci, utilizzando modelli di lesioni del midollo spinale e lesioni da costrizione cronica nei ratti, può servire come utile misura di esito8. Fondamentalmente, questo studio ha anche identificato un aumento dell'evitamento della sonda nei controlli chirurgici fittizi, indicando che l'inclusione di un gruppo ingenuo accanto ai controlli fittizi / veicoli è giustificata. Le future applicazioni di MCA potrebbero concentrarsi sulla variazione tra ceppi di topo e / o modelli di dolore, l'impatto dell'ansia sulle prestazioni del test e l'integrazione dell'analisi della postura o della cinematica dell'andatura per comprendere meglio le differenze negli adattamenti comportamentali agli stimoli nocivi.
Il divario traslazionale tra gli studi preclinici sui topi e lo sviluppo di nuove terapie continua a presentare motivo di preoccupazione. Con questo in mente, il test MCA integra gli strumenti esistenti nella ricerca sul dolore e aiuta a fornire un quadro più completo delle molte dimensioni sensoriali e affettive del dolore.
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Disclosures
Gli autori non hanno conflitti di interesse rilevanti da divulgare.
Acknowledgments
GM è supportato da una NDSEG Graduate Fellowship. Il VLT è supportato dal NIH NIGMS grant #GM137906 e dalla Rita Allen Foundation. AJS è supportato dalle sovvenzioni del Dipartimento della Difesa W81XWH-20-1-0277, W81XWH-21-1-0197 e dalla Rita Allen Foundation. Siamo grati al Dr. Alexxai Kravitz della Washington University School of Medicine per aver progettato e reso liberamente disponibili i file della stampante 3D per il pavimento della camera 2 e la piastra della sonda.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 32.8ft 3000K-6000K Tunable White LED Strip Lights, Dimmable Super Bright LED Tape Lights with 600 SMD 2835 LEDs | Lepro | SKU: 410087-DWW-US | For lighting chamber 1. https://www.lepro.com/32ft-dimmable-tunable-white-led-strip-lights.html |
| 3D printed 'spike bed' and 'chamber 2 floor' | Shapeways | N/A | Optional, for mechanical probes as an alternative to blunted map pins. |
| 70% ethanol | Various | N/A | To clean MCA between mice. |
| Acryl-Hinge 2 | TAP Plastics | N/A | for attaching chamber lids to rear walls. https://www.tapplastics.com/product/plastics/handles_hinges_latches/acryl_hinge_2/122 |
| Chemcast Cast Acrylic Sheet, Clear | TAP Plastics | N/A | 3mm thick. For front wall of chamber 1. https://www.tapplastics.com/product/plastics/cut_to_size_plastic/acrylic_sheets_cast_clear/510 |
| Chemcast Cast Transparent Colored Acrylic, Transparent Dark Red - 50% | TAP Plastics | N/A | 3mm thick. 50% light transmission. For walls and lids of chambers 2 and 3. https://www.tapplastics.com/product/plastics/cut_to_size_plastic/acrylic_sheets_transparent_colors/519 |
| Chemcast Translucent & Opaque Colored Cast Acrylic, Sign Opaque White - 0.1% | TAP Plastics | N/A | 3mm thick. For side walls and lid of chamber 1. https://www.tapplastics.com/product/plastics/cut_to_size_plastic/acrylic_sheets_color/341 |
| Disinfectant (e.g. Quatricide) | Pharmacal Research Laboratories, Inc. | 65020F | To disinfect MCA at the end of a testing session. |
| Dry-erase markers and board | Various | N/A | To add experimental info to the beginning of video footage. |
| Map pins | Various | N/A | Optional, for mechanical probes. Use sandpaper to blunt sharp points before use. Can be used in place of 3D-printed parts. |
| Paper towels | Various | N/A | To clean/disinfect MCA. |
| SCIGRIP Weld-On #3 Acrylic Cement | TAP Plastics | N/A | For assembling acrylic sheets into chambers and affixing hinges. https://www.tapplastics.com/product/repair_products/plastic_adhesives/weld_on_3_cement/131 |
| Stopwatch | Various | N/A | To record escape latencies/dwell times in real-time or from recorded video. |
| Timer | Various | N/A | To ensure LED turn-on, barrier removal and test completion are timed consistently. |
| Video camera | Various | HDRCX405 Handycam Camcorder | To record mouse behavior in the MCA device. Can be substituted with any consumer-grade video camera capable of 1080p resolution. |
| Tripod | Famall | N/A | Any tripod that can hold the camera at bench height for recording MCA footage is acceptable. |
References
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