Summary
Den mekaniske konfliktunngåelsesanalysen brukes som en ikke-refleksiv avlesning av smertefølsomhet hos mus som kan brukes til å bedre forstå affektive motivasjonsresponser i en rekke musesmerter.
Abstract
Smerte består av både sensoriske (nociceptive) og affektive (ubehagelige) dimensjoner. I prekliniske modeller har smerte tradisjonelt blitt vurdert ved hjelp av refleksive tester som tillater slutninger angående smertes nociceptive komponent, men gir lite informasjon om den affektive eller motiverende komponenten av smerte. Det er derfor viktig å utvikle tester som fanger opp disse smertekomponentene. Derfor må forskere bruke ikke-refleksive atferdsanalyser for å studere smerteoppfatning på det nivået. Mekanisk konfliktunngåelse (MCA) er en etablert frivillig ikke-refleksiv atferdsanalyse, for å studere motiverende responser på en skadelig mekanisk stimulans i et 3-kammerparadigme. En endring i musens stedspreferanse, når den står overfor konkurrerende skadelige stimuli, brukes til å utlede den oppfattede ubehageligheten av sterkt lys kontra taktil stimulering av potene. Denne protokollen skisserer en modifisert versjon av MCA-analysen som smerteforskere kan bruke til å forstå affektive motivasjonsresponser i en rekke musesmerter. Selv om det ikke er spesifikt beskrevet her, bruker vårt eksempel MCA-data intraplantar complete Freunds adjuvans (CFA), spart nerveskade (SNI) og en brudd/ støpemodell som smertemodeller for å illustrere MCA-prosedyren.
Introduction
Smerte er en kompleks opplevelse med sensoriske og affektive komponenter. En reduksjon i terskelen for smerteoppfattelse og overfølsomhet overfor termiske og/ eller mekaniske stimuli er viktige trekk ved denne opplevelsen, som stimulus-fremkalte smerteadferdstester kan fange (som Hargreaves' test av varmefølsomhet og von Frey-testen av mekanisk følsomhet)1,2. Selv om slike tester gir robuste og reproduserbare resultater, er de begrenset av deres avhengighet av refleksiv tilbaketrekking fra en oppfattet skadelig stimulans. Dette har stilt spørsmål ved en pågående avhengighet av smerteforskning på disse testene alene. I den forbindelse har smerteforskere i flere år utforsket alternative / komplementære atferdstester for bruk i gnagersmerter modeller i et forsøk på å fange mer av de affektive og / eller motiverende komponentene av smerte. Disse ikke-fremkalte, frivillige eller ikke-refleksive tiltakene (f.eks. hjulkjøring, graveaktivitet, betinget stedspreferanse 3,4,5) implementeres i et forsøk på å forbedre overførbarheten av preklinisk smerteforskning.
Den mekaniske konfliktunngåelse (MCA) analysen ble opprinnelig beskrevet av Harte et al. i 20166, brukes hovedsakelig hos rotter 7,8, og representerer en modifikasjon av en tidligere tilnærming - stedet escape-avoidance paradigm. I denne tilnærmingen utføres en skadelig stimulans av bakpoten i et ellers ønskelig (mørkt) kammer for å drive målrettet oppførsel av dyret for å unnslippe / unngå slik stimulering 9,10. I stedet for å stole på manuell skadelig stimulering av bakpoten av en observatør, tvinger MCA-analysen mus til å forhandle om en potensielt skadelig stimulans for å unnslippe et aversivt miljø og nå det mørke kammeret. Konflikten/unngåelse som gir analysen navnet sitt oppstår fra disse to konkurrerende motivasjonene: unnslippe sterkt opplyste områder og unngå skadelig stimulering av potene. MCA-analysen deler også funksjoner med betinget stedspreferansetesting, der sammenkobling av smertelindring med miljøsignaler driver endringer i atferd som gjenspeiler en preferanse for den smertelindrende / givende konteksten11.
I utgangspunktet deler alle disse analysene en lignende tilnærming: ved å bruke et skifte i et dyrs preferanse for ett aversivt miljø over et annet som en indikator på deres affektive / motiverende tilstand. MCA-analysen er et 3-kammerparadigme som består av et sterkt opplyst kammer etterfulgt av et mørkt midtkammer med justerbare høydesonder og et mørkt tredjekammer uten aversive stimuli. En uskadet mus er vanligvis motivert til å unnslippe til et mørkt kammer, gitt medfødt aversjon av gnagere til sterkt lys12. I dette eksemplet overvinner den naturlige motivasjonen for å unnslippe et sterkt opplyst miljø disinclination for å møte bakpotestimulering (de justerbare høydesondene), som utelukkende forekommer i det mørke miljøet. I motsetning kan en mus som opplever smerte (for eksempel på grunn av betennelse eller nevropati) velge å tilbringe mer tid i det sterkt opplyste miljøet, siden det er motivasjon for å unngå den ubehagelige taktile opplevelsen av de mekaniske sondene i innstillingen av pågående taktil overfølsomhet.
Denne artikkelen beskriver en modifisert versjon av MCA-analysen. Vi har tilpasset den opprinnelige metoden (som ble utført hos rotter6) for bruk hos mus. Vi har også redusert antall sondehøyder testet fra seks til tre (0, 2 og 5 mm over gulvhøyde) for å effektivisere datainnsamlingen. Denne tilnærmingen har blitt testet på tvers av flere smertemodeller, og validert med kjente smertestillende midler, noe som indikerer at smerteoverfølsomhet og / eller de tilhørende affektive og motiverende endringene driver disse endringene i atferd. Denne tilnærmingen er relativt rask å gjennomføre og tilpasningsdyktig sammenlignet med andre ikke-refleksive tiltak, noe som kan ta mange dager med habituation og trening 1,2. I samråd med andre smertemål kan MCA generere verdifull innsikt i de affektive og motiverende aspektene ved smerte.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle eksperimenter som involverte bruk av mus og prosedyrene som fulgte der, ble godkjent av Institutional Animal Care and Use Committees ved MD Anderson Cancer Center og Stanford University, i henhold til National Institutes of Health's Guide for care and use of Laboratory Animals.
1. MCA-konstruksjon
- Konstruksjonskammer 1 med følgende dimensjoner: 125 mm x 125 mm x 125 mm (bredde x dybde x høyde) fra ugjennomsiktig hvit 3 mm tykk akryl som brukes til sidevegger, gulv, tak. Bruk en klar 3 mm tykk akryl til den fremre veggen. Lim alle sider sammen i god tid ved hjelp av dedikert akryllim.
FORSIKTIG: Akryllim regnes som farlig materiale (brannfarlig, damp skadelig, kan være skadelig hvis det svelges, kan irritere huden eller øynene). Slike lim skal kun brukes i henhold til produsentens anvisninger (dvs. med egnet verneutstyr i et godt ventilert område). - Fest lokket på kammer 1 med et hengsel, slik at mus lett kan plasseres i og hentes fra kammeret. Fest selvklebende lysdiodebånd (LED) til den indre overflaten av lokket for å gi belysning av ~ 4800 lux.
- Steng av kammer 1 fra resten av MCA ved å skyve et ugjennomsiktig akrylark inn og ut av posisjon.
- Konstruer MCA-testkammeret, kammer 2, som et 270 mm langt ubelyst kammer fremstilt av gjennomsiktig mørk rød akryl (3 mm tykk) på alle sider, med et hengslet lokk på toppen. Plasser et 13 x 31 gitter med 2 mm hull på gulvet i kammer 2, der en rekke stumpe sonder med 0,5 mm diameterspisser (f.eks. sløve kartpinner) kan stikke ut.
MERK: Stumpe pinner med en sandpapirblokk med 120 grit eller lignende. Rengjør dem i varmt vann med vaskemiddel før de desinfiseres med sporadisk desinfeksjonsmiddel. - Juster probens høyde ved å plassere flere akrylplater under probebaseplaten (figur 1). Bruk denne tilnærmingen til å konfigurere enheten med tre innstillinger: 0 mm, 2 mm og 5 mm sondehøyde.
- Som et alternativ til sløve kartpinner eller lignende materialer, bruk 3D-skriverfilene til å skrive ut gulvet i kammer 2 og sondeplaten (se Tilleggsfil 1: SpikeBed-MCA.stl som refererer til de mekaniske sondene, og Tilleggsfil 2: MCA_baseplate.stl som danner gulvet i kammer 2).
MERK: Hvis 3D-utskrift ikke er tilgjengelig, lim kartpinner til et akrylark ved hjelp av det samme akryllimet som brukes til å konstruere veggene på enheten. - Skriv ut med et vaskbart og biokompatibelt materiale, for eksempel nylon 12 plast eller lignende (anbefales).
- Konstruer kammer 3 med følgende dimensjoner: 125 mm x 125 mm x 125 mm som en ubelyst gjennomsiktig mørk rød akrylboks (på alle sider), plassert i motsatt ende til kammer 1. Plasser et hengslet lokk på kammeret, som ligner kamre 1 og 2. Dette kammeret fungerer som et mørkt rømningsområde fra de mekaniske sondene i kammer 2.
2. McA-beboelse og testing av mus
- Som med alle eksperimenter som involverer atferdsmessige resultater hos dyr, observere passende randomisering og blinding gjennom for å minimere potensielle skjevheter.
MERK: De representative resultatene ble generert ved å bruke 8-12 uker gamle mannlige og kvinnelige C57BL / 6J mus (Jackson Laboratories belastningsnummer 000664). Mus var sosialt plassert, opptil 5 per bur, med tilgang til mat og vann ad libitum og en 07:00 h til 19:00 h lyssyklus. MCA fant sted i lysperioden, mellom 09:00 og 12:00. - En dag før baseline testing er planlagt, akklimatisere mus til MCA-enheten i 5 min (minimum) til 15 min (maksimum) med sine burkamerater for å lette sosial utforskning av hele enheten.
- Gjennom hele prosessen må du sørge for at lysdiodene i kammer 1 er slått av, barrieren mellom kamre 1 og 2 er åpen, og sondene er satt til en høyde på null (dvs. ikke stikker ut gjennom gulvet i kammer 2).
- Utfør en baseline test av mus (valgfritt) hvis studien inneholder negative kontrolldyr (dvs. sham kirurgi, eller kjøretøy injeksjon kontroller). Bruk eventuelt en basistest for å utelukke uskadede ytterpunkter som aldri krysser inn i kammer 2, selv om dette ikke har vist seg nødvendig. Hvis det brukes, må du rapportere alle kriterier for utelukkelse og antall mus som er utelatt.
- Før du begynner å teste, må du konfigurere et videokamera som kan ta opp 1080p-opptak på et stativ med sidevendt visning av hele MCA-enheten. Juster synsfeltet slik at MCA fyller det innspilte bildet.
- Når opptaket begynner, holder du et håndholdt tørrslettingskort i kameraets synsfelt for å merke starten på videoen med identifiserende informasjon om dyrets testkjøring (f.eks. muse-ID, sondehøyde, dato, tidspunkt osv.).
- For første kjøring setter du probehøyden til null. Overfør musen som skal testes fra hjemmeburet til kammer 1 med barrieredøra på plass. Start en tidtaker som er synlig i de innspilte opptakene.
MERK: Timeren sørger for at intervallene mellom de ulike delene av testen er konsistente mellom løpene. - Etter 10 s, slå på kammer 1 lysdioder. Etter at musen har vært i det opplyste kammeret i 20 s, trekk barrieren mellom kamre 1 og 2.
- Vær oppmerksom på dyret i 2 min. Mål ventetider og/eller oppholdstider med en stoppeklokke mens testen pågår. Alternativt kan videoopptakene analyseres når testingen er fullført.
MERK: Av hensyn til gjennomstrømning og unngå langvarig eksponering for aversive stimuli, ble avskjæringen satt til 2 min. - Mål ett eller flere av de flere nyttige resultatene som er identifisert (se nedenfor; Figur 1). Anbefales å analysere alle de 5 utfallstiltakene når du begynner å teste, for å fastslå hvilke aspekter av atferd som er forskjellige i et gitt eksperimentelt oppsett.
- Alternativ I: Registrer ventetiden til den første oppføringen i kammer 2. Alternativ II: Registrer ventetiden for å krysse mer enn halvveis over kammer 2. Alternativ III: Registrer den totale oppholdstiden i kammer 2. Alternativ IV: Registrer ventetiden for å nå kammer 3 (flukt). Alternativ V: I likhet med alternativ II registrerer du den totale oppholdstiden i hvert kammer innen 2 minutter og konverterer dem til proporsjoner.
MERK: Siden hvert eksperiment er unikt og kan påvirkes av biologiske faktorer og atferdsendringer som er unike for sykdomsmodellen, kan etterforskere eksperimentere med disse og andre tiltak i egne hender.
- Alternativ I: Registrer ventetiden til den første oppføringen i kammer 2. Alternativ II: Registrer ventetiden for å krysse mer enn halvveis over kammer 2. Alternativ III: Registrer den totale oppholdstiden i kammer 2. Alternativ IV: Registrer ventetiden for å nå kammer 3 (flukt). Alternativ V: I likhet med alternativ II registrerer du den totale oppholdstiden i hvert kammer innen 2 minutter og konverterer dem til proporsjoner.
- Når testingen er fullført, returner musen til hjemmeburet, rengjør MCA-kamrene med 70% etanol, og la den tørke helt.
MERK: Fekal boli kan vanligvis rengjøres fra kammeret relativt enkelt med papirhåndklær før etanol/desinfeksjonsmiddel. Hvis det blir nødvendig med grundigere rengjøring, kan kamrene 2 og 3 demonteres og nedsenkes i varmt såpevann. - Etter å ha kjørt alle musene i en kohort med sondehøyden satt til null, sett inn et 3 mm ark akryl under den mekaniske sondebaseplaten og gjenta trinn 2,4,2 til 2,4,7 med en sondehøyde på 2 mm.
- Etter å ha kjørt alle musene med sondehøyden satt til 2 mm, sett inn et ekstra 3 mm ark med akryl under sondebaseplaten og gjenta trinn 2,4,2 til 2,4,7 med en sondehøyde på 5 mm.
MERK: En gruppe på 8 mus kan testes i ca. 2 timer ved hjelp av denne tilnærmingen. Bruk mindre gruppestørrelser hvis det kreves mer presis timing etter legemiddel (f.eks. for et kurseksperiment). - Utfør en sluttrengjøring med et desinfeksjonsmiddel på slutten av en testøkt.
- Gjenta testingen etter å ha fremkallt smerteoverfølsomhet og/eller med legemiddelbehandling.
- Sammenlign hver muss ytelse ved baseline med ytelsen etter at smerten er indusert. Vurder effekten av en farmakologisk intervensjon ved å sammenligne kjøretøybehandlede dyr med legemiddelbehandlede dyr samtidig.
- Utfør ikke-parametrisk statistisk analyse (f.eks. Mann Whitney U Test) hvis dyrene når 2 min cutoff uten å tilfredsstille ønsket resultatmål, noe som resulterer i ikke-kontinuerlige data.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
MCA-analysen har blitt brukt med hell med flere mekanistisk distinkte musesmerter. Figur 2 viser data der utfallsmål for valg krysset midtpunktet i kammer 2 (figur 2A). Dataene som oppnås ved å bruke halvveis versus unnslippe i kammer 3 er svært like, ~ 40 s for halvveis versus ~ 45 s for kammer 3 unnslippe i spart nerveskade (SNI) modell av nevropatisk smerte med 5 mm sonde høyde13.
I den CFA-induserte inflammatoriske smertemodellen endrer ikke kontroll bakpote (intraplantar) injeksjon av saltvann unnslippe latens versus baseline. De musene som ble injisert med CFA i en bakpote viste en betydelig økning i fluktforsinkelse 4 dager etter injeksjon, men bare når sondehøyden ble hevet til 5 mm. Avgjørende er at denne økte ventetiden for å unnslippe ved 5 mm ikke ble sett hos mus som fikk NSAID carprofen (10 mg/kg, dvs.) 90 min før teststart (figur 2B).
Den sparte nerveskademodellen (SNI) av traumatisk nevropatisk smerte er også forbundet med en betydelig økning i ventetiden for å unnslippe kontra baseline når sondehøyden ble satt til 5 mm. Denne effekten ble sett hos SNI-mus, men ikke deres sham kirurgi kontroller. Denne økte fluktforsinkelsen ble også forhindret ved systemisk administrering av opioid smertestillende buprenorfin (25 μg/kg, dvs.) 90 min før testing (figur 2C). Økt fluktforsinkelse ble også observert hos mus som ikke gjennomgikk en baseline runde med MCA-testing før nerveskade (figur 2D). I dette tilfellet ble den økte fluktventetiden hos SNI-mus ved 5 mm forhindret av gabapentin (30 mg/kg, dvs.) administrert 90 min før testing. Samlet antyder dette at MCA kan oppdage smerterelaterte endringer i stimulusaversjon og unngåelse i to mye brukte modeller av inflammatorisk og nevropatisk smerte.
MCA ble videre testet i brudd/støpemodell av kronisk smertetilstandskompleks regionalt smertesyndrom (CRPS) som er etablert ved et lukket høyre distal tibiabrudd etterfulgt av 3 uker med støping14. Denne klinisk informerte modellen utviser akutt fase perifer betennelse, samt langsiktig immunaktivitet i sentralnervesystemet med vedvarende bakbens allodyni. I likhet med CFA- og SNI-modellene ble det observert økte rømmingsforsinkelser i brudd/støpemodellen (figur 3A). Før skaden økte ventetiden for å unnslippe fra kammer 1 proporsjonalt med sondehøyden. Etter skaden forble rømningsventetiden uendret på 0 mm, men økte betydelig ved 2 mm og 5 mm sondehøyde for menn og 5 mm sondehøyde for kvinner sammenlignet med baseline (figur 3B).
Figur 1: Skjematisk og bilder av MCA-enheten. (A) Potensielle utfallsmål i MCA-analysen (merket med klokkesnittikoner): ventetid for å avslutte kammer 1 (I), ventetid for å krysse mer enn 50 % av kammer 2 (prikket linje; II), den totale tiden brukt i kammer 2 (III), ventetid for å nå rømningskammeret (IV) eller prosent tid brukt i hvert kammer (V). Dyr som opplever smerte i gjennomsnitt viser større verdier for I, II og IV, og reduserte verdier for III. En redusert verdi for III øker nødvendigvis andelen tid brukt i kammer 1 og/eller kammer 3, som vil bli fanget opp av resultatmål V. Opprettet med Biorender.com. (B) Bilder som illustrerer MCA-enheten (og kamrene nummerert 1, 2 og 3) med lysdiodene slått av (øverst til venstre), lysdiodene slått på (nederst til venstre). (C) Utsikt over kamrene ovenfra med dørene åpnet. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Inflammatorisk og nevropatisk smerteforstørrelsesunngåelse i MCA-analysen. (A) Skildring av det spesifikke utfallsmålet som brukes her: latens for å krysse kammeret 2 midtpunkt. (B) Intraplantarinjeksjon av CFA økte ventetiden betydelig for å unnslippe (røde firkanter) kontra saltvannskontroller (svarte sirkler) når sondehøyden ble satt til 5 mm. Intraperitoneal carprofen (10 mg/kg) svekket den CFA-induserte økningen i fluktventetid (blå trekanter). Data plottes inn som gjennomsnittlig fluktventetid ± standardfeil av gjennomsnittet (SEM); n = 7 menn/gruppe. (C) Spart nerveskade (SNI) kirurgi betydelig økt kammer 1 unnslippe latens versus sham kirurgi kontroller (svarte sirkler), når sonde høyde ble satt til 5 mm (røde firkanter). Intraperitoneal buprenorfin (25 mg/kg) svekket denne økningen betydelig i fluktforsinkelse (blå trekanter). Data plottes inn som gjennomsnittlig fluktventetid ± SEM; n = 6-7 menn per gruppe. (D) SNI-indusert økning i fluktventetid ble reversert ved bruk av smertestillende gabapentin (grønne trekanter). Data plottes inn som gjennomsnittlig fluktventetid ± SEM; n = 8 menn/gruppe. ## = p < 0,01, ***/### = p < .001, for de angitte sammenligningene (toveis ANOVA, Bonferroni post-hoc). Dette tallet er endret fra13. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Tibial brudd/støping induserte kronisk smerteforstørrelsesunngåelse i MCA-analysen. Brudd/støping økte fluktventetiden betydelig ved 3 uker etter skade (W3) versus baseline (BL) hos menn i 2 mm og 5 mm sondehøyder og hos kvinner i 5 mm sondehøyde (n = 5/kjønn). Data fra hver mus er avbildet i bleknet svart (menn) eller cayenne (kvinner) med gjennomsnitt representert av mørke linjer. **/*** = p < 0,01/< 0,001 versus kjønn- og sondehøydetilpasset basislinjeverdi med toveis ANOVA, Tukey post-hoc. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Tilleggsfil 1: 3D-skriverfil SpikeBed-MCA. Når spikebed-mca.stl er trykt i et egnet biokompatibelt og vaskbart materiale, for eksempel nylon 12, produserer spikebed-mca.stl plattformen med taktile sonder som stikker ut gjennom gulvet i kammer 2. Klikk her for å laste ned denne filen.
Tilleggsfil 2: 3D-skriverfil MCA_baseplate. Når det skrives ut i et passende biokompatibelt og vaskbart materiale, for eksempel nylon 12, produserer MCA_baseplate.stl gulvet i kammer 2, hvor de taktile sondene stikker ut. Klikk her for å laste ned denne filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Som med alle atferdstester er riktig håndtering, randomisering og blinding til behandling av dyr viktig gjennom hele. Gitt de multifaktorielle inngangene til kompleks atferd og beslutningstaking, er det viktig at dyr håndteres, vanedannes og testes så konsekvent som mulig mens de minimerer nød. Det bør også tas hensyn til å reprodusere tidspunktet for museplassering i kammer 1, slå på LED-lysene og fjerne barrieren, siden forskjeller her kan påvirke etterfølgende oppførsel.
Det skal bemerkes at de ulike utfallstiltakene som er avbildet i figur 1A , er interrelaterte. For eksempel krysser en mus som kommer inn i kammer 2 vanligvis halvveis i kammer 2 og fullfører nesten alltid flukt inn i kammer 3. Det betyr at utfallstiltakene I, II og IV er interrelaterte. Utfallsmål III og V måler den totale oppholdstiden i henholdsvis kammer 2, og andelen oppholdstid i alle de 3 kamrene. Derfor er disse tiltakene nært knyttet til hverandre. En mus kan imidlertid teoretisk opparbeide betydelig oppholdstid i kammer 2 om halvveis krysset eller flukten inn i kammer 3 hadde lav latens, høy latens eller ikke skjedde i det hele tatt.
Flere variasjoner eller modifikasjoner av denne metoden er rapportert. I tillegg til de ulike utfallstiltakene som er oppført her (figur 1), kan etterforskerne variere progresjonen av sondehøyden i et forsøk på å fremheve forskjeller i følsomhet. Siden det ikke var statistisk signifikante forskjeller med den mellomliggende 2 mm sondehøyden, kan det være mer effektivt å kjøre mus bare ved 0 mm og 5 mm. Alternativt kan en sondehøyde mellom 2 og 5 mm, eller gjentatte løp i en 5 mm sondehøyde begynne å avdekke forskjeller som ellers ikke var tydelige. I tillegg kan evaluering av oppholdstid i hvert kammer brukes som en avlesning av motivasjon og aktivitet. Dette kan være nyttig i tilfeller der noen mus løper raskt gjennom til kammer 3, men deretter går tilbake til kammer 1 for å utforske nærmere. I disse situasjonene ville ventetid for å komme inn i kammer 3 alene ikke fange denne subtiliteten. Å heve testfristen utover 2 min-grensen som er satt her, kan også vise seg å være verdt for noen etterforskere. Til slutt kan vi ikke utelukke muligheten for at gjentatt testing av de samme dyrene (mer enn de tre gangene som er beskrevet her), eller testing med større frekvens (færre enn 4-7 dager mellom tester) kan introdusere habituation eller læringseffekter. Av disse grunnene oppfordres inkludering av naive, umanipulerte kontrollgrupper til enhver tid. Til syvende og sist er variasjoner i atferd høyst sannsynlig å være smertemodellspesifikke og garanterer videre undersøkelse i disse og andre smertemodeller.
De smertefremkallende modellene som brukes her (CFA, SNI, brudd/støping) er vanligvis forbundet med overfølsomhet i andre smerteatferdstester, noe som tilsvarer en økning i unngåelse/fluktforsinkelse. MCA-analysen kan også være i stand til å oppdage tap av sensorisk skarphet (for eksempel via økt tid brukt i kammer 2), selv om dette ikke er formelt testet. MCA har noen begrensninger som garanterer vurdering. Aversjon mot sterkt lys er et viktig middel for å motivere inngang i kammer 2 og derfor en driver for påfølgende konflikt. Alle patologiske trekk forbundet med en bestemt musemodell som kan endre aversjon mot sterkt lys (f.eks. synshemming) bør vurderes nøye før du bruker denne testen. Bidraget av angst for å unnslippe latens har heller ikke blitt systematisk testet, selv om kroniske inflammatoriske og nevropatiske smertemodeller har blitt rapportert å vise tegn på angstlignende oppførsel hos mus i andre tester, fortsetter det å være en debatt om disse15,16. Når det er sagt, kan et bidrag av smerterelatert angst til disse atferdsutfallene ikke bekreftes eller utelukkes på dette tidspunktet. Siden MCA har flere innspill til utfallstiltakene, kommer dette med flere potensielle konfunderinger å vurdere.
Oppsummert gir MCA-testen en ikke-refleksiv avlesning av smertefølsomhet i musemodeller. Utfallstiltakene påvirkes av andre faktorer enn refleksiv følsomhet og gir et sammensatt mål på smertefølsomhet og affektiv/motiverende tilstand. Tiden som trengs for å kjøre hver test, og nivået av dyktighet og spesialisert utstyr som kreves, sammenlignes gunstig med andre ikke-refleksive smertemål, for eksempel ganganalyse eller betinget stedspreferanse 5,13. Selv om den fortsatt er noe ny, har tilnærmingen blitt vedtatt og uavhengig verifisert av flere team av etterforskere, hovedsakelig hos rotter. Delvis isjias nerve ligation økt exit latens17 og morfinavhengig abstinens i rotter7. En annen studie hos rotter foreslo at telling av antall kryssinger, ved hjelp av ryggmargsskade og kroniske innsnevringsskademodeller hos rotter, kan tjene som et nyttig utfallsmål8. Avgjørende er at denne studien også identifiserte en økning i sondeunngåelse i sham kirurgi kontroller, noe som indikerer at inkludering av en naiv gruppe sammen med sham / kjøretøy kontroller er berettiget. Fremtidige anvendelser av MCA kan fokusere på variasjonen mellom musestammer og/ eller smertemodeller, virkningen av angst på analyseytelse og integrering av holdningsanalyse eller gangkinematikk for bedre å forstå forskjeller i atferdstilpasninger til skadelige stimuli.
Det translasjonelle gapet mellom prekliniske musestudier og utviklingen av nye terapeutiske behandlinger fortsetter å utgjøre en grunn til bekymring. Med dette i tankene kompletterer MCA-analysen eksisterende verktøy i smerteforskning og bidrar til å gi et mer komplett bilde av de mange sensoriske og affektive dimensjonene av smerte.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen relevante interessekonflikter å avsløre.
Acknowledgments
GM støttes av et NDSEG Graduate Fellowship. VLT støttes av NIH NIGMS grant #GM137906 og Rita Allen Foundation. AJS støttes av Forsvarsdepartementets tilskudd W81XWH-20-1-0277, W81XWH-21-1-0197 og Rita Allen Foundation. Vi er takknemlige til Dr. Alexxai Kravitz ved Washington University School of Medicine for å designe og gjøre fritt tilgjengelige 3D-skriverfiler for kammeret 2 etasje og sondeplate.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 32.8ft 3000K-6000K Tunable White LED Strip Lights, Dimmable Super Bright LED Tape Lights with 600 SMD 2835 LEDs | Lepro | SKU: 410087-DWW-US | For lighting chamber 1. https://www.lepro.com/32ft-dimmable-tunable-white-led-strip-lights.html |
| 3D printed 'spike bed' and 'chamber 2 floor' | Shapeways | N/A | Optional, for mechanical probes as an alternative to blunted map pins. |
| 70% ethanol | Various | N/A | To clean MCA between mice. |
| Acryl-Hinge 2 | TAP Plastics | N/A | for attaching chamber lids to rear walls. https://www.tapplastics.com/product/plastics/handles_hinges_latches/acryl_hinge_2/122 |
| Chemcast Cast Acrylic Sheet, Clear | TAP Plastics | N/A | 3mm thick. For front wall of chamber 1. https://www.tapplastics.com/product/plastics/cut_to_size_plastic/acrylic_sheets_cast_clear/510 |
| Chemcast Cast Transparent Colored Acrylic, Transparent Dark Red - 50% | TAP Plastics | N/A | 3mm thick. 50% light transmission. For walls and lids of chambers 2 and 3. https://www.tapplastics.com/product/plastics/cut_to_size_plastic/acrylic_sheets_transparent_colors/519 |
| Chemcast Translucent & Opaque Colored Cast Acrylic, Sign Opaque White - 0.1% | TAP Plastics | N/A | 3mm thick. For side walls and lid of chamber 1. https://www.tapplastics.com/product/plastics/cut_to_size_plastic/acrylic_sheets_color/341 |
| Disinfectant (e.g. Quatricide) | Pharmacal Research Laboratories, Inc. | 65020F | To disinfect MCA at the end of a testing session. |
| Dry-erase markers and board | Various | N/A | To add experimental info to the beginning of video footage. |
| Map pins | Various | N/A | Optional, for mechanical probes. Use sandpaper to blunt sharp points before use. Can be used in place of 3D-printed parts. |
| Paper towels | Various | N/A | To clean/disinfect MCA. |
| SCIGRIP Weld-On #3 Acrylic Cement | TAP Plastics | N/A | For assembling acrylic sheets into chambers and affixing hinges. https://www.tapplastics.com/product/repair_products/plastic_adhesives/weld_on_3_cement/131 |
| Stopwatch | Various | N/A | To record escape latencies/dwell times in real-time or from recorded video. |
| Timer | Various | N/A | To ensure LED turn-on, barrier removal and test completion are timed consistently. |
| Video camera | Various | HDRCX405 Handycam Camcorder | To record mouse behavior in the MCA device. Can be substituted with any consumer-grade video camera capable of 1080p resolution. |
| Tripod | Famall | N/A | Any tripod that can hold the camera at bench height for recording MCA footage is acceptable. |
References
- Hargreaves, K., Dubner, R., Brown, F., Flores, C., Joris, J. A new and sensitive method for measuring thermal nociception in cutaneous hyperalgesia. Pain. 32 (1), 77-88 (1988).
- Chaplan, S. R., Bach, F. W., Pogrel, J. W., Chung, J. M., Yaksh, T. L. Quantitative assessment of tactile allodynia in the rat paw. Journal of Neuroscience Methods. 53 (1), 55-63 (1994).
- Sheahan, T. D., et al. Inflammation and nerve injury minimally affect mouse voluntary behaviors proposed as indicators of pain. Neurobiology of Pain. 2, 1-12 (2017).
- Wodarski, R., et al. Cross-centre replication of suppressed burrowing behaviour as an ethologically relevant pain outcome measure in the rat: a prospective multicentre study. Pain. 157 (10), 2350-2365 (2016).
- King, T., et al. Unmasking the tonic-aversive state in neuropathic pain. Nature Neuroscience. 12 (11), 1364-1366 (2009).
- Harte, S. E., Meyers, J. B., Donahue, R. R., Taylor, B. K., Morrow, T. J. Mechanical Conflict System: A Novel Operant Method for the Assessment of Nociceptive Behavior. PLoS One. 11 (2), 0150164 (2016).
- Pahng, A. R., Edwards, S. Measuring Pain Avoidance-Like Behavior in Drug-Dependent Rats. Current Protocols in Neuroscience. 85 (1), 53 (2018).
- Odem, M. A., et al. Sham surgeries for central and peripheral neural injuries persistently enhance pain-avoidance behavior as revealed by an operant conflict test. Pain. 160 (11), 2440-2455 (2019).
- LaBuda, C. J., Fuchs, P. N. A behavioral test paradigm to measure the aversive quality of inflammatory and neuropathic pain in rats. Experimental Neurology. 163 (2), 490-494 (2000).
- LaBuda, C. J., Fuchs, P. N. Morphine and gabapentin decrease mechanical hyperalgesia and escape/avoidance behavior in a rat model of neuropathic pain. Neuroscience Letters. 290 (2), 137-140 (2000).
- Vichaya, E. G., et al. Motivational changes that develop in a mouse model of inflammation-induced depression are independent of indoleamine 2,3 dioxygenase. Neuropsychopharmacology. 44 (2), 364-371 (2019).
- Hascoët, M., Bourin, M., Nic Dhonnchadha, B. A. The mouse light-dark paradigm: a review. Progress in Neuropsychopharmacology & Biological Psychiatry. 25 (1), 141-166 (2001).
- Shepherd, A. J., Mohapatra, D. P. Pharmacological validation of voluntary gait and mechanical sensitivity assays associated with inflammatory and neuropathic pain in mice. Neuropharmacology. 130, 18-29 (2018).
- Huck, N. A., et al. Temporal Contribution of Myeloid-Lineage TLR4 to the Transition to Chronic Pain: A Focus on Sex Differences. Journal of Neuroscience. 41 (19), 4349-4365 (2021).
- Pitzer, C., La Porta, C., Treede, R. D., Tappe-Theodor, A. Inflammatory and neuropathic pain conditions do not primarily evoke anxiety-like behaviours in C57BL/6 mice. European Journal of Pain. 23 (2), 285-306 (2019).
- Sieberg, C. B., et al. Neuropathic pain drives anxiety behavior in mice, results consistent with anxiety levels in diabetic neuropathy patients. Pain Reports. 3 (3), 651 (2018).
- Meuwissen, K. P. V., van Beek, M., Joosten, E. A. J. Burst and Tonic Spinal Cord Stimulation in the Mechanical Conflict-Avoidance System: Cognitive-Motivational Aspects. Neuromodulation. 23 (5), 605-612 (2020).
