Summary
Механический анализ избегания конфликтов используется в качестве нерефлексивного считывания болевой чувствительности у мышей, которое может быть использовано для лучшего понимания аффективно-мотивационных реакций в различных моделях боли у мышей.
Abstract
Боль включает в себя как сенсорные (ноцицептивные), так и аффективные (неприятные) измерения. В доклинических моделях боль традиционно оценивалась с использованием рефлексивных тестов, которые позволяют делать выводы относительно ноцицептивного компонента боли, но предоставляют мало информации об аффективном или мотивационном компоненте боли. Поэтому разработка тестов, которые фиксируют эти компоненты боли, важна с точки зрения трансляции. Следовательно, исследователи должны использовать нерефлексивные поведенческие анализы для изучения восприятия боли на этом уровне. Механическое избегание конфликтов (MCA) - это установленный добровольный нерефлексивный поведенческий анализ для изучения мотивационных реакций на вредный механический стимул в парадигме 3 камер. Изменение предпочтения мыши в отношении местоположения, когда она сталкивается с конкурирующими вредными стимулами, используется для вывода о воспринимаемой неприятности яркого света по сравнению с тактильной стимуляцией лап. Этот протокол описывает модифицированную версию анализа MCA, который исследователи боли могут использовать для понимания аффективно-мотивационных реакций в различных моделях боли у мышей. Хотя это конкретно не описано здесь, наши примеры данных MCA используют внутриплантарный полный адъювант Фройнда (CFA), травму сохраненного нерва (SNI) и модель перелома / литья в качестве моделей боли для иллюстрации процедуры MCA.
Introduction
Боль — это сложный опыт с сенсорными и аффективными компонентами. Снижение порога восприятия боли и гиперчувствительность к тепловым и/или механическим раздражителям являются ключевыми особенностями этого опыта, которые могут охватить тесты болевого поведения, вызванные стимулом (например, тест Харгривза на тепловую чувствительность и тест фон Фрея на механическую чувствительность)1,2. Хотя такие тесты дают надежные и воспроизводимые результаты, они ограничены их зависимостью от рефлексивного ухода от воспринимаемого вредного стимула. Это поставило под сомнение постоянную зависимость исследований боли только от этих тестов. С этой целью исследователи боли в течение нескольких лет изучали альтернативные / дополнительные поведенческие тесты для использования в моделях боли грызунов в попытке охватить больше аффективных и / или мотивационных компонентов боли. Эти невызываемые, добровольные или нерефлексивные меры (например, бег колес, роение, обусловленное предпочтение места 3,4,5) реализуются в попытке улучшить переводимость доклинических исследований боли.
Анализ механического предотвращения конфликтов (MCA) был первоначально описан Harte et al. в 2016году 6, используется преимущественно у крыс 7,8 и представляет собой модификацию более раннего подхода - парадигмы побега-избегания места. В этом подходе вредный стимул задней лапы выполняется в желательной (темной) камере, чтобы стимулировать целенаправленное поведение животного, чтобы избежать / избежать такой стимуляции 9,10. Вместо того, чтобы полагаться на ручную вредную стимуляцию задней лапы наблюдателем, анализ MCA заставляет мышей договариваться о потенциально вредном стимуле, чтобы избежать отвратительной среды и достичь темной камеры. Конфликт / избегание, которое дает анализу его название, возникает из этих двух конкурирующих мотиваций: избегать ярко освещенных областей и избегать вредной стимуляции лап. Анализ MCA также разделяет особенности с условным тестированием предпочтений места, где сочетание облегчения боли с сигналами окружающей среды приводит к изменениям в поведении, которые отражают предпочтение обезболивающего / вознаграждающего контекста11.
По сути, все эти анализы разделяют схожий подход: использование сдвига в предпочтении животного одной аверсивной среде перед другой в качестве индикатора их аффективного / мотивационного состояния. Анализ MCA представляет собой 3-камерную парадигму, состоящую из ярко освещенной камеры, за которой следует темная средняя камера с регулируемыми по высоте зондами и темная третья камера без каких-либо аверсивных стимулов. Неповрежденная мышь обычно мотивирована сбежать в затемненную камеру, учитывая врожденное отвращение грызунов к яркому свету12. В этом примере естественная мотивация к выходу из ярко освещенной среды преодолевает нежелание сталкиваться со стимуляцией задней лапы (регулируемые датчики высоты), которая возникает исключительно в затемненной среде. Напротив, мышь, испытывающая боль (например, из-за воспаления или невропатии), может предпочесть проводить больше времени в ярко освещенной среде, поскольку есть мотивация избегать неприятного тактильного опыта механических зондов в условиях продолжающейся тактильной гиперчувствительности.
В этой статье описывается модифицированная версия анализа MCA. Мы адаптировали оригинальный метод (который был выполнен на крысах6) для использования на мышах. Мы также сократили количество тестируемых зондов с шести до трех (0, 2 и 5 мм над высотой пола), чтобы упростить сбор данных. Этот подход был протестирован на нескольких моделях боли и подтвержден известными анальгетиками, что указывает на то, что гиперчувствительность к боли и / или связанные с ней аффективные и мотивационные изменения приводят к этим изменениям в поведении. Этот подход относительно быстр в проведении и адаптируем по сравнению с другими нерефлексивными мерами, которые могут занять много дней привыкания и обучения 1,2. В сочетании с другими мерами боли MCA может генерировать ценную информацию об аффективных и мотивационных аспектах боли.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все эксперименты, связанные с использованием мышей и процедурами, применяемыми в них, были одобрены институциональными комитетами по уходу за животными и их использованию Онкологическим центром MD Anderson и Стэнфордским университетом в строгом соответствии с Руководством Национальных институтов здравоохранения по уходу и использованию лабораторных животных.
1. Конструкция MCA
- Конструкция камеры 1 со следующими размерами: 125 мм x 125 мм x 125 мм (ширина x глубина x высота) из непрозрачного белого акрила толщиной 3 мм, используемого для боковин, пола, потолка. Используйте прозрачный акрил толщиной 3 мм для передней стены. Склейте все стороны заблаговременно, используя специальный акриловый клей.
ВНИМАНИЕ: Акриловый клей считается опасным материалом (легковоспламеняющийся, вредный пар, может быть вредным при проглатывании, может раздражать кожу или глаза). Такие клеи следует использовать только в соответствии с инструкциями производителя (т.е. с соответствующими СИЗ в хорошо проветриваемом помещении). - Прикрепите крышку камеры 1 шарниром, чтобы мышей можно было легко поместить в камеру и извлечь из нее. Прикрепите самоклеящуюся светодиодную (LED) ленту к внутренней поверхности крышки, чтобы обеспечить освещение ~4800 люкс.
- Закройте камеру 1 от остальной части MCA, сдвинув непрозрачный акриловый лист в положение и из него.
- Сконструируйте испытательную камеру MCA, камеру 2, в виде неосвещенной камеры длиной 270 мм, изготовленной из полупрозрачного темно-красного акрила (толщиной 3 мм) со всех сторон, с откидной крышкой сверху. Поместите сетку размером 13 x 31 из отверстий 2 мм на полу камеры 2, через которую может выступать массив тупых зондов с наконечниками диаметром 0,5 мм (например, затупленные булавки карты).
ПРИМЕЧАНИЕ: Тупые штифты с 120-зернистым блоком наждачной бумаги или аналогичным. Очистите их в теплой воде с моющим средством перед дезинфекцией спорицидным дезинфицирующим средством. - Отрегулируйте высоту зондов, поместив дополнительные акриловые листы под опорную плиту зонда (рисунок 1). Используя этот подход, настройте устройство с тремя параметрами: 0 мм, 2 мм и высотой зонда 5 мм.
- В качестве альтернативы притупленным штифтам карты или аналогичным материалам используйте файлы 3D-принтера для печати пола камеры 2 и пластины зонда (см. Дополнительный файл 1: SpikeBed-MCA.stl, который относится к механическим зондам, и Дополнительный файл 2: MCA_baseplate.stl, который образует пол камеры 2).
ПРИМЕЧАНИЕ: Если 3D-печать недоступна, приклейте булавки к акриловому листу с использованием того же акрилового клея, который использовался для строительства стен устройства. - Печать моющимся и биосовместимым материалом, таким как пластик нейлон 12 или аналогичный (рекомендуется).
- Конструкция камеры 3 со следующими размерами: 125 мм x 125 мм x 125 мм в виде неосвещенной полупрозрачной темно-красной акриловой коробки (со всех сторон), размещенной на противоположном конце камеры 1. Поместите на камеру откидную крышку, аналогичную камерам 1 и 2. Эта камера служит затемненной зоной выхода из механических зондов в камере 2.
2. Привыкание и тестирование МЫШИНОЙ MCA
- Как и во всех экспериментах, связанных с поведенческими результатами на животных, соблюдайте соответствующую рандомизацию и ослепление, чтобы свести к минимуму потенциальную предвзятость.
ПРИМЕЧАНИЕ: Репрезентативные результаты были получены с использованием 8-12-недельных самцов и самок мышей C57BL/6J (номер штамма Jackson Laboratories 000664). Мыши были социально размещены, до 5 на клетку, с доступом к пище и воде ad libitum и световым циклом с 07:00 ч до 19:00 ч. MCA проходила в световой период, между 09:00 ч и 12:00 ч. - За день до запланированного базового тестирования акклиматизируйте мышей к блоку MCA в течение 5 минут (минимум) до 15 минут (максимум) со своими товарищами по клетке, чтобы облегчить социальное исследование всего устройства.
- На протяжении всего процесса убедитесь, что светодиоды в камере 1 выключены, барьер между камерами 1 и 2 оставлен открытым, а зонды установлены на нулевую высоту (т.е. не выступают через пол камеры 2).
- Выполните базовый тест на мышах (необязательно), если исследование включает отрицательных контрольных животных (т. Е. Фиктивную хирургию или контроль впрыска транспортного средства). При желании используйте базовый тест, чтобы исключить любые неповрежденные выбросы, которые никогда не пересекают камеру 2, хотя это не оказалось необходимым. Если используется, сообщите обо всех критериях исключения и количестве исключенных мышей.
- Перед началом тестирования настройте видеокамеру, способную записывать кадры 1080p на штатив с боковым видом всего устройства MCA. Настройте поле зрения таким образом, чтобы MCA заполнял записанное изображение.
- После начала записи удерживайте ручную доску сухого стирания в поле зрения камеры, чтобы пометить начало видео идентифицирующей информацией о тестировании животного (например, идентификатор мыши, высота зонда, дата, точка времени и т. Д.).
- Для первого запуска установите высоту зонда равным нулю. Перенесите тестируемую мышь из домашней клетки в камеру 1 с барьерной дверцей на месте. Запустите таймер, который виден в записанных кадрах.
ПРИМЕЧАНИЕ: Таймер гарантирует, что интервалы между различными частями теста согласованы между запусками. - Через 10 с включите в камере 1 светодиод. После того, как мышь находилась в освещенной камере в течение 20 с, снимите барьер между камерами 1 и 2.
- Понаблюдайте за животным в течение 2 мин. Измеряйте задержки и/или время ожидания с помощью секундомера во время тестирования. Кроме того, видеозапись может быть проанализирована после завершения тестирования.
ПРИМЕЧАНИЕ: По соображениям пропускной способности и избежания длительного воздействия аверсивных раздражителей отсечка была установлена на 2 мин. - Измерить один или несколько из нескольких выявленных полезных результатов (см. ниже; Рисунок 1). Рекомендуется проанализировать все 5 показателей исхода при начале тестирования, чтобы выяснить, какие аспекты поведения отличаются в данной экспериментальной установке.
- Вариант I: Запишите задержку до первого входа в камеру 2. Вариант II: Запишите задержку при пересечении более чем на полпути через камеру 2. Вариант III: Регистрация общего времени выдержки в камере 2. Вариант IV: Запишите задержку для достижения камеры 3 (побег). Вариант V: Аналогично варианту II, запишите общее время выдержки в каждой камере в течение 2 минут и преобразуйте их в пропорции.
Поскольку каждый эксперимент уникален и может зависеть от биологических факторов и поведенческих изменений, уникальных для модели заболевания, исследователи могут экспериментировать с этими и другими мерами в своих руках.
- Вариант I: Запишите задержку до первого входа в камеру 2. Вариант II: Запишите задержку при пересечении более чем на полпути через камеру 2. Вариант III: Регистрация общего времени выдержки в камере 2. Вариант IV: Запишите задержку для достижения камеры 3 (побег). Вариант V: Аналогично варианту II, запишите общее время выдержки в каждой камере в течение 2 минут и преобразуйте их в пропорции.
- Как только тестирование будет завершено, верните мышь в ее домашнюю клетку, очистите камеры MCA 70% этанолом и дайте ей полностью высохнуть.
ПРИМЕЧАНИЕ: Фекальные боли обычно можно относительно легко очистить из камеры бумажными полотенцами перед этанолом / дезинфицирующим средством. Если требуется более тщательная очистка, камеры 2 и 3 можно разобрать и погрузить в теплую мыльную воду. - После запуска всех мышей в когорте с нулевой высотой зонда вставьте лист акрила толщиной 3 мм под механическую опорную пластину зонда и повторите шаги от 2.4.2 до 2.4.7 с высотой зонда 2 мм.
- После запуска всех мышей с высотой зонда, установленной на 2 мм, вставьте второй 3-миллиметровый лист акрила под опорную пластину зонда и повторите шаги от 2.4.2 до 2.4.7 с высотой зонда 5 мм.
ПРИМЕЧАНИЕ: Группа из 8 мышей может быть протестирована примерно за 2 часа с использованием этого подхода. Используйте меньшие размеры группы, если требуется более точное время после приема препарата (например, для эксперимента с курсом лекарственного времени). - Выполните заключительную очистку дезинфицирующим средством в конце сеанса тестирования.
- Повторное тестирование после индуцирования болевой гиперчувствительности и/или при медикаментозном лечении.
- Сравните производительность каждой мыши на исходном уровне с их производительностью после того, как боль вызвана. Оценить влияние фармакологического вмешательства путем сравнения животных, обработанных транспортным средством, с животными, обработанными лекарственными препаратами, в тот же момент времени.
- Выполняйте непараметрический статистический анализ (например, тест Манна Уитни U), если животные достигают 2-минутной отсечки без удовлетворения желаемой меры результата, что приводит к ненепрерывным данным.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Анализ MCA был успешно использован с несколькими механистически различными моделями боли у мышей. На рисунке 2 показаны данные, в которых мера выбора результата пересекала среднюю точку камеры 2 (рисунок 2А). Данные, полученные с помощью промежуточной точки по сравнению с выходом в камеру 3, очень похожи, ~ 40 с для половины пути против ~ 45 с для выхода из камеры 3 в модели невропатической боли с сохраненной нервной травмой (SNI) с высотой зонда5 мм 13.
В модели воспалительной боли, вызванной CFA, контрольная инъекция физиологического раствора в заднюю лапу (внутриплантарная) не изменяет латентность побега по сравнению с исходным уровнем. Те мыши, которым вводили CFA в одну заднюю лапу, показали значительное увеличение задержки побега через 4 дня после инъекции, но только тогда, когда высота зонда была поднята до 5 мм. Важно отметить, что эта повышенная задержка для побега при 5 мм не наблюдалась у мышей, которые получали карпрофен НПВП (10 мг / кг, т.е.) за 90 минут до начала тестирования (рисунок 2B).
Модель травмирующей невропатической боли при травмированном повреждении нерва (SNI) также связана со значительным увеличением латентности для побега по сравнению с исходным уровнем, когда высота зонда была установлена на 5 мм. Этот эффект наблюдался у мышей SNI, но не у их фиктивного хирургического контроля. Эта повышенная латентность побега также была предотвращена системным введением опиоидного анальгетика бупренорфина (25 мкг/кг, т.е.) за 90 мин до тестирования (рисунок 2C). Повышенная задержка побега также наблюдалась у мышей, которые не проходили базовый раунд тестирования MCA до повреждения нерва (рисунок 2D). В этом случае повышенная задержка побега у мышей СНИ на 5 мм была предотвращена габапентином (30 мг/кг, т.п.), введенным за 90 мин до тестирования. В совокупности это говорит о том, что MCA может обнаруживать связанные с болью изменения в отвращении и избегании стимулов в двух широко используемых моделях воспалительной и невропатической боли.
MCA был дополнительно протестирован в модели перелома / кастинга сложного регионарного болевого синдрома (CRPS), который устанавливается закрытым переломом правой дистальной голени с последующим 3 неделями кастинга14. Эта клинически обоснованная модель демонстрирует острую фазу периферического воспаления, а также долгосрочную иммунную активность в центральной нервной системе со стойкой аллодинией задних конечностей. Подобно моделям CFA и SNI, в модели разрушения/литья наблюдалось увеличение аварийных задержек (рисунок 3A). До травмы задержка при выходе из камеры 1 увеличивалась пропорционально высоте зонда. После травмы задержка побега осталась неизменной на уровне 0 мм, но значительно увеличилась на высоте зонда 2 мм и 5 мм для самцов и высоте зонда 5 мм для самок по сравнению с исходным уровнем (рисунок 3B).
Рисунок 1: Схема и изображения устройства MCA. (A) Показатели потенциального результата в анализе MCA (отмечены значками циферблата): задержка до выхода из камеры 1 (I), задержка для пересечения более 50% камеры 2 (пунктирная линия; II), общее количество времени, проведенного в камере 2 (III), задержка для достижения эвакуационной камеры (IV) или процент времени, проведенного в каждой камере (V). Животные, испытывающие боль, в среднем показывают большие значения для I, II и IV и пониженные значения для III. Уменьшенное значение для III обязательно увеличивает долю времени, проведенного в камере 1 и/или камере 3, которая будет фиксироваться мерой результата V. Создается с Biorender.com. (B) Изображения, иллюстрирующие устройство MCA (и камеры под номерами 1, 2 и 3) с выключенными светодиодами (вверху слева), включенными светодиодами (внизу слева). (C) Вид на камеры сверху с открытыми дверями. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Воспалительная и невропатическая боль усиливают избегание в анализе MCA. (A) Изображение конкретного показателя результата, используемого здесь: латентность для пересечения средней точки камеры 2. (B) Внутриплантарная инъекция CFA значительно увеличивала латентность для побега (красные квадраты) по сравнению с солевым контролем (черные круги), когда высота зонда была установлена на 5 мм. Внутрибрюшинный карпрофен (10 мг/кг) ослаблял вызванное CFA увеличение задержки побега (синие треугольники). Данные отображаются как средняя задержка побега ± стандартной ошибке среднего значения (SEM); n = 7 самцов на группу. (C) Хирургия избавления от повреждения нерва (SNI) значительно увеличила задержку побега в камере 1 по сравнению с фиктивными хирургическими контрольными элементами (черные круги), когда высота зонда была установлена на 5 мм (красные квадраты). Внутрибрюшинный бупренорфин (25 мг/кг) значительно ослаблял это увеличение задержки побега (синие треугольники). Данные строятся как средняя задержка побега ± SEM; n = 6-7 самцов в группе. (D) Вызванное СНИ увеличение задержки побега было обращено вспять с помощью анальгетика габапентина (зеленые треугольники). Данные строятся как средняя задержка побега ± SEM; n = 8 самцов на группу. ## = p < 0,01, ***/### = p < 0,001, для указанных сравнений (двустороннее ANOVA, Bonferroni post-hoc). Эта цифра была изменена с13. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Перелом большеберцовой кости / гипс, вызванный хронической болью, усиливает избегание в анализе MCA. Перелом/литье значительно увеличили задержку побега через 3 недели после травмы (W3) по сравнению с исходным уровнем (BL) у мужчин на высоте зонда 2 мм и 5 мм и у женщин на высоте зонда 5 мм (n = 5 / пол). Данные от каждой мыши изображены в выцветшем черном (самцы) или кайенском (самки) со средним, представленным темными линиями. **/*** = p < 0,01/< 0,001 по сравнению с базовым значением, соответствующим полу и высоте зонда, с помощью двустороннего ANOVA, Tukey post-hoc. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Дополнительный файл 1: Файл 3D-принтера SpikeBed-MCA. При печати в подходящем биосовместимом и моющемся материале, таком как нейлон 12, SpikeBed-MCA.stl производит платформу тактильных зондов, которые выступают через пол камеры 2. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Дополнительный файл 2: файл 3D-принтера MCA_baseplate. При печати в подходящем биосовместимом и моющемся материале, таком как нейлон 12, MCA_baseplate.stl создает пол камеры 2, через который выступают тактильные зонды. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Как и во всех поведенческих тестах, правильное обращение, рандомизация и ослепление обращения с животными имеют важное значение во всем. Учитывая многофакторные входные данные в сложном поведении и принятии решений, крайне важно, чтобы животные обрабатывались, привыкали и тестировались как можно более последовательно, сводя к минимуму дистресс. Следует также позаботиться о воспроизведении времени размещения мыши в камере 1, включении светодиодных индикаторов и устранении барьера, поскольку различия здесь могут повлиять на последующее поведение.
Следует отметить, что различные показатели результатов, показанные на рисунке 1А , взаимосвязаны. Например, мышь, входящая в камеру 2, обычно пересекает половину камеры 2, а затем почти всегда завершает выход в камеру 3. Это означает, что итоговые показатели I, II и IV взаимосвязаны. Итоговые показатели III и V измеряют общее время ожидания в камере 2 и долю времени выдержки во всех 3 камерах, соответственно. Поэтому эти меры тесно связаны друг с другом. Тем не менее, мышь теоретически может накапливать значительное время ожидания в камере 2, независимо от того, имело ли пересечение на полпути или выход в камеру 3 с низкой задержкой, высокой задержкой или вообще не происходило.
Сообщалось о нескольких вариациях или модификациях этого метода. В дополнение к различным показателям результатов, перечисленным здесь (рисунок 1), исследователи могут варьировать прогрессию высоты зонда, чтобы подчеркнуть различия в чувствительности. Поскольку не было статистически значимых различий с промежуточной высотой зонда 2 мм, может быть более эффективным запускать мышей только на 0 мм и 5 мм. В качестве альтернативы, высота зонда от 2 до 5 мм или повторные прогоны на высоте зонда 5 мм могут начать разоблачать различия, которые в противном случае не были бы очевидными. Кроме того, оценка времени пребывания в каждой камере может быть использована в качестве считывания мотивации и активности. Это может быть полезно в тех случаях, когда некоторые мыши быстро пробегают в камеру 3, но затем возвращаются в камеру 1 для дальнейшего исследования. В этих ситуациях задержка при входе в камеру 3 сама по себе не отражает эту тонкость. Повышение времени отсечения тестирования сверх установленного здесь предела в 2 минуты также может оказаться полезным для некоторых исследователей. Наконец, мы не можем исключить возможность того, что повторное тестирование одних и тех же животных (более трех раз, описанных здесь) или тестирование с большей частотой (менее 4-7 дней между тестами) может привести к привыканию или эффектам обучения. По этим причинам поощряется включение наивных, неуправляемых контрольных групп в каждый момент времени. В конечном счете, вариации в поведении, скорее всего, будут специфичными для модели боли и требуют дальнейшего изучения в этих и других моделях боли.
Модели, вызывающие боль, используемые здесь (CFA, SNI, перелом / кастинг), обычно связаны с гиперчувствительностью в других тестах на обезболивающее поведение, что соответствует увеличению латентности избегания / побега. Анализ MCA также может быть в состоянии обнаружить потерю остроты чувств (например, через увеличение времени, проведенного в камере 2), хотя это не было официально проверено. MCA имеет некоторые ограничения, которые требуют рассмотрения. Отвращение к яркому свету является ключевым средством мотивации входа в камеру 2 и, следовательно, движущей силой последующего конфликта. Любая патологическая особенность, связанная с конкретной моделью мыши, которая может изменить отвращение к яркому свету (например, нарушение зрения), должна быть тщательно рассмотрена перед использованием этого теста. Вклад тревоги в избавление от латентности также не был систематически протестирован, хотя модели хронической воспалительной и невропатической боли, как сообщается, показывают признаки тревожного поведения у мышей в других тестах, продолжаются дебаты относительно этого15,16. Тем не менее, вклад тревоги, связанной с болью, в эти поведенческие результаты не может быть подтвержден или исключен в настоящее время. Поскольку MCA имеет несколько входных данных в показатели результатов, это сопряжено с большим количеством потенциальных путаниц для рассмотрения.
Таким образом, тест MCA обеспечивает нерефлексивное считывание болевой чувствительности в мышиных моделях. На показатели результатов влияют факторы, отличные от рефлексивной чувствительности, и они обеспечивают составную меру болевой чувствительности и аффективного / мотивационного состояния. Количество времени, необходимое для выполнения каждого теста, а также уровень мастерства и требуемого специализированного оборудования выгодно отличаются от других нерефлексивных показателей боли, таких как анализ походки или обусловленное предпочтение места 5,13. Хотя этот подход все еще несколько новый, он был принят и независимо проверен несколькими группами исследователей, преимущественно на крысах. Частичная перевязка седалищного нерва увеличивала задержку выхода17 и морфинозависимую абстиненцию у крыс7. Другое исследование на крысах показало, что подсчет количества пересечений с использованием моделей повреждения спинного мозга и хронического сужения у крыс может служить полезным показателем результата8. Важно отметить, что это исследование также выявило увеличение уклонения от зондов в фиктивном хирургическом контроле, что указывает на то, что включение наивной группы наряду с фиктивным / транспортным контролем оправдано. Будущие приложения MCA могут быть сосредоточены на вариациях между мышиными штаммами и / или моделями боли, влиянии тревоги на производительность анализа и интеграции анализа осанки или кинематики походки, чтобы лучше понять различия в поведенческих адаптациях к вредным раздражителям.
Трансляционный разрыв между доклиническими исследованиями на мышах и разработкой новых терапевтических средств продолжает представлять собой причину для беспокойства. Имея это в виду, анализ MCA дополняет существующие инструменты в исследовании боли и помогает дать более полную картину многих сенсорных и аффективных измерений боли.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
У авторов нет соответствующих конфликтов интересов для раскрытия.
Acknowledgments
GM поддерживается стипендией NDSEG Graduate Fellowship. VLT поддерживается грантовыми #GM137906 NIH NIGMS и Фондом Риты Аллен. AJS поддерживается грантами Министерства обороны W81XWH-20-1-0277, W81XWH-21-1-0197 и Фондом Риты Аллен. Мы благодарны доктору Алексаю Кравицу из Медицинской школы Вашингтонского университета за разработку и предоставление в свободный доступ файлов 3D-принтера для пола камеры 2 и пластины зонда.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 32.8ft 3000K-6000K Tunable White LED Strip Lights, Dimmable Super Bright LED Tape Lights with 600 SMD 2835 LEDs | Lepro | SKU: 410087-DWW-US | For lighting chamber 1. https://www.lepro.com/32ft-dimmable-tunable-white-led-strip-lights.html |
| 3D printed 'spike bed' and 'chamber 2 floor' | Shapeways | N/A | Optional, for mechanical probes as an alternative to blunted map pins. |
| 70% ethanol | Various | N/A | To clean MCA between mice. |
| Acryl-Hinge 2 | TAP Plastics | N/A | for attaching chamber lids to rear walls. https://www.tapplastics.com/product/plastics/handles_hinges_latches/acryl_hinge_2/122 |
| Chemcast Cast Acrylic Sheet, Clear | TAP Plastics | N/A | 3mm thick. For front wall of chamber 1. https://www.tapplastics.com/product/plastics/cut_to_size_plastic/acrylic_sheets_cast_clear/510 |
| Chemcast Cast Transparent Colored Acrylic, Transparent Dark Red - 50% | TAP Plastics | N/A | 3mm thick. 50% light transmission. For walls and lids of chambers 2 and 3. https://www.tapplastics.com/product/plastics/cut_to_size_plastic/acrylic_sheets_transparent_colors/519 |
| Chemcast Translucent & Opaque Colored Cast Acrylic, Sign Opaque White - 0.1% | TAP Plastics | N/A | 3mm thick. For side walls and lid of chamber 1. https://www.tapplastics.com/product/plastics/cut_to_size_plastic/acrylic_sheets_color/341 |
| Disinfectant (e.g. Quatricide) | Pharmacal Research Laboratories, Inc. | 65020F | To disinfect MCA at the end of a testing session. |
| Dry-erase markers and board | Various | N/A | To add experimental info to the beginning of video footage. |
| Map pins | Various | N/A | Optional, for mechanical probes. Use sandpaper to blunt sharp points before use. Can be used in place of 3D-printed parts. |
| Paper towels | Various | N/A | To clean/disinfect MCA. |
| SCIGRIP Weld-On #3 Acrylic Cement | TAP Plastics | N/A | For assembling acrylic sheets into chambers and affixing hinges. https://www.tapplastics.com/product/repair_products/plastic_adhesives/weld_on_3_cement/131 |
| Stopwatch | Various | N/A | To record escape latencies/dwell times in real-time or from recorded video. |
| Timer | Various | N/A | To ensure LED turn-on, barrier removal and test completion are timed consistently. |
| Video camera | Various | HDRCX405 Handycam Camcorder | To record mouse behavior in the MCA device. Can be substituted with any consumer-grade video camera capable of 1080p resolution. |
| Tripod | Famall | N/A | Any tripod that can hold the camera at bench height for recording MCA footage is acceptable. |
References
- Hargreaves, K., Dubner, R., Brown, F., Flores, C., Joris, J. A new and sensitive method for measuring thermal nociception in cutaneous hyperalgesia. Pain. 32 (1), 77-88 (1988).
- Chaplan, S. R., Bach, F. W., Pogrel, J. W., Chung, J. M., Yaksh, T. L. Quantitative assessment of tactile allodynia in the rat paw. Journal of Neuroscience Methods. 53 (1), 55-63 (1994).
- Sheahan, T. D., et al. Inflammation and nerve injury minimally affect mouse voluntary behaviors proposed as indicators of pain. Neurobiology of Pain. 2, 1-12 (2017).
- Wodarski, R., et al. Cross-centre replication of suppressed burrowing behaviour as an ethologically relevant pain outcome measure in the rat: a prospective multicentre study. Pain. 157 (10), 2350-2365 (2016).
- King, T., et al. Unmasking the tonic-aversive state in neuropathic pain. Nature Neuroscience. 12 (11), 1364-1366 (2009).
- Harte, S. E., Meyers, J. B., Donahue, R. R., Taylor, B. K., Morrow, T. J. Mechanical Conflict System: A Novel Operant Method for the Assessment of Nociceptive Behavior. PLoS One. 11 (2), 0150164 (2016).
- Pahng, A. R., Edwards, S. Measuring Pain Avoidance-Like Behavior in Drug-Dependent Rats. Current Protocols in Neuroscience. 85 (1), 53 (2018).
- Odem, M. A., et al. Sham surgeries for central and peripheral neural injuries persistently enhance pain-avoidance behavior as revealed by an operant conflict test. Pain. 160 (11), 2440-2455 (2019).
- LaBuda, C. J., Fuchs, P. N. A behavioral test paradigm to measure the aversive quality of inflammatory and neuropathic pain in rats. Experimental Neurology. 163 (2), 490-494 (2000).
- LaBuda, C. J., Fuchs, P. N. Morphine and gabapentin decrease mechanical hyperalgesia and escape/avoidance behavior in a rat model of neuropathic pain. Neuroscience Letters. 290 (2), 137-140 (2000).
- Vichaya, E. G., et al. Motivational changes that develop in a mouse model of inflammation-induced depression are independent of indoleamine 2,3 dioxygenase. Neuropsychopharmacology. 44 (2), 364-371 (2019).
- Hascoët, M., Bourin, M., Nic Dhonnchadha, B. A. The mouse light-dark paradigm: a review. Progress in Neuropsychopharmacology & Biological Psychiatry. 25 (1), 141-166 (2001).
- Shepherd, A. J., Mohapatra, D. P. Pharmacological validation of voluntary gait and mechanical sensitivity assays associated with inflammatory and neuropathic pain in mice. Neuropharmacology. 130, 18-29 (2018).
- Huck, N. A., et al. Temporal Contribution of Myeloid-Lineage TLR4 to the Transition to Chronic Pain: A Focus on Sex Differences. Journal of Neuroscience. 41 (19), 4349-4365 (2021).
- Pitzer, C., La Porta, C., Treede, R. D., Tappe-Theodor, A. Inflammatory and neuropathic pain conditions do not primarily evoke anxiety-like behaviours in C57BL/6 mice. European Journal of Pain. 23 (2), 285-306 (2019).
- Sieberg, C. B., et al. Neuropathic pain drives anxiety behavior in mice, results consistent with anxiety levels in diabetic neuropathy patients. Pain Reports. 3 (3), 651 (2018).
- Meuwissen, K. P. V., van Beek, M., Joosten, E. A. J. Burst and Tonic Spinal Cord Stimulation in the Mechanical Conflict-Avoidance System: Cognitive-Motivational Aspects. Neuromodulation. 23 (5), 605-612 (2020).
