Mekanisk konfliktundvikande analys för att mäta smärtbeteende hos möss

Summary

Den mekaniska konfliktundvikande analysen används som en icke-reflexiv avläsning av smärtkänslighet hos möss som kan användas för att bättre förstå affektiva motivationssvar i en mängd olika mussmärtmodeller.

Abstract

Smärta består av både sensoriska (nociceptiva) och affektiva (obehagliga) dimensioner. I prekliniska modeller har smärta traditionellt bedömts med hjälp av reflexiva tester som möjliggör slutsatser om smärtans nociceptiva komponent men ger lite information om den affektiva eller motiverande komponenten av smärta. Att utveckla tester som fångar dessa komponenter av smärta är därför translationellt viktigt. Därför måste forskare använda icke-reflexiva beteendeanalyser för att studera smärtuppfattning på den nivån. Mekanisk konfliktundvikande (MCA) är en etablerad frivillig icke-reflexiv beteendeanalys för att studera motiverande svar på en skadlig mekanisk stimulans i ett 3-kammarparadigm. En förändring i en mus platspreferens, när den står inför konkurrerande skadliga stimuli, används för att härleda den upplevda obehagligheten hos starkt ljus kontra taktil stimulering av tassarna. Detta protokoll beskriver en modifierad version av MCA-analysen som smärtforskare kan använda för att förstå affektiva motivationssvar i en mängd olika mussmärtmodeller. Även om det inte specifikt beskrivs här, använder våra exempel MCA-data det intraplantära fullständiga Freunds adjuvans (CFA), skonad nervskada (SNI) och en fraktur / gjutningsmodell som smärtmodeller för att illustrera MCA-proceduren.

Introduction

Smärta är en komplex upplevelse med sensoriska och affektiva komponenter. En minskning av tröskeln för smärtuppfattning och överkänslighet mot termiska och / eller mekaniska stimuli är viktiga funktioner i denna upplevelse, vilka stimulansframkallade smärtbeteendetester kan fånga (som Hargreaves test av värmekänslighet och von Frey-testet av mekanisk känslighet)^1,2. Även om sådana tester ger robusta och reproducerbara resultat, begränsas de av deras beroende av reflexivt tillbakadragande från en uppfattad skadlig stimulans. Detta har ifrågasatt ett pågående beroende av smärtforskning på dessa tester ensam. För detta ändamål har smärtforskare i flera år undersökt alternativa / kompletterande beteendetester för användning i gnagare smärtmodeller i ett försök att fånga mer av de affektiva och / eller motiverande komponenterna i smärta. Dessa o-framkallade, frivilliga eller icke-reflexiva åtgärder (t.ex. hjullöpning, grävningsaktivitet, konditionerad platspreferens ^3,4,5) genomförs i ett försök att förbättra översättningsbarheten av preklinisk smärtforskning.

Den mekaniska konfliktundvikande (MCA) -analysen beskrevs ursprungligen av Harte et al. 2016⁶, används främst hos råttor ^7,8 och representerar en modifiering av ett tidigare tillvägagångssätt - platsflykt-undvikande paradigm. I detta tillvägagångssätt utförs en skadlig stimulans av baktassen i en annars önskvärd (mörk) kammare för att driva målmedvetet beteende hos djuret för att fly / undvika sådan stimulering ^9,10. Istället för att förlita sig på manuell skadlig stimulering av baktassen av en observatör, tvingar MCA-analysen möss att förhandla om en potentiellt skadlig stimulans för att undkomma en aversiv miljö och nå den mörka kammaren. Konflikten /undvikandet som ger analysen sitt namn härrör från dessa två konkurrerande motiv: fly från starkt upplysta områden och undvik skadlig stimulering av tassarna. MCA-analysen delar också funktioner med konditionerad platspreferenstestning, där parningen av smärtlindring med miljösignaler driver förändringar i beteende som återspeglar en preferens för det smärtlindrande / givande sammanhanget¹¹.

I grund och främst delar alla dessa analyser ett liknande tillvägagångssätt: att använda ett skifte i ett djurs preferens för en aversiv miljö framför en annan som en indikator på deras affektiva / motiverande tillstånd. MCA-analysen är ett 3-kammarparadigm som består av en starkt upplyst kammare följt av en mörk mittkammare med justerbara höjdsonder och en mörk tredje kammare utan några aversiva stimuli. En oskadad mus är vanligtvis motiverad att fly till en mörkare kammare, med tanke på gnagarnas medfödda motvilja mot starkt ljus¹². I det här exemplet övervinner den naturliga motivationen att fly från en starkt upplyst miljö oviljor att stöta på bakpotstimulering (de justerbara höjdsonderna), som uteslutande förekommer i den mörka miljön. Däremot kan en mus som upplever smärta (till exempel på grund av inflammation eller neuropati) välja att spendera mer tid i den starkt upplysta miljön, eftersom det finns motivation att undvika den obehagliga taktila upplevelsen av de mekaniska sonderna i inställningen av pågående taktil överkänslighet.

I den här artikeln beskrivs en modifierad version av MCA-analysen. Vi har anpassat den ursprungliga metoden (som utfördes på råttor⁶) för användning på möss. Vi har också minskat antalet testade sondhöjder från sex till tre (0, 2 och 5 mm över golvhöjd) för att effektivisera datainsamlingen. Detta tillvägagångssätt har testats över flera smärtmodeller och validerats med kända smärtstillande medel, vilket indikerar att smärtöverkänslighet och / eller tillhörande affektiva och motiverande förändringar driver dessa förändringar i beteende. Detta tillvägagångssätt är relativt snabbt att genomföra och anpassningsbart jämfört med andra icke-reflexiva åtgärder, vilket kan ta många dagar av tillvänjning och träning ^1,2. I samklang med andra mått på smärta kan MCA generera värdefulla insikter i de affektiva och motiverande aspekterna av smärta.

Protocol

Alla experiment som involverar användning av möss och de förfaranden som följs däri godkändes av institutionala djurvårds- och användningskommittéer vid MD Anderson Cancer Center och Stanford University, i strikt överensstämmelse med National Institutes of Health's Guide for the Care and Use of Laboratory Animals.

1. MCA-konstruktion

1. Konstruktionskammare 1 med följande mått: 125 mm x 125 mm x 125 mm (bredd x djup x höjd) från ogenomskinlig vit 3 mm tjock akryl som används för sidoväggar, golv, tak. Använd en klar 3 mm tjock akryl för den framåtvända väggen. Limma ihop alla sidor i god tid med dedikerat akryllim.
   VARNING: Akryllim anses vara farligt material (brandfarligt, ångskadligt, kan vara skadligt vid förtäring, kan irritera hud eller ögon). Sådana lim bör endast användas i enlighet med tillverkarens instruktioner (dvs. med lämplig personlig skyddsutrustning i ett väl ventilerat område).
2. Fäst locket på kammare 1 med ett gångjärn, så att möss enkelt kan placeras i och hämtas från kammaren. Fäst självhäftande LED-tejp (Light Emitting Diode) på lockets inre yta för att ge belysning på ~ 4800 lux.
3. Stäng av kammare 1 från resten av MCA genom att skjuta ett ogenomskinligt akrylark in och ut ur läge.
4. Konstruera MCA-testkammaren, kammare 2, som en 270 mm lång oupplyst kammare tillverkad av genomskinlig mörkröd akryl (3 mm tjock) på alla sidor, med ett gångjärnslock ovanpå. Placera ett 13 x 31 rutnät med 2 mm hål på golvet i kammare 2 genom vilket en rad trubbiga sonder med 0,5 mm diameterspetsar (t.ex. trubbiga kartstift) kan sticka ut.
   OBS: Trubbiga stift med ett 120-kornigt sandpappersblock eller liknande. Rengör dem i varmt vatten med tvättmedel innan de desinficeras med sporicidalt desinfektionsmedel.
5. Justera sondernas höjd genom att placera ytterligare akrylplåtar under sondens basplatta (figur 1). Med hjälp av detta tillvägagångssätt konfigurerar du enheten med tre inställningar: 0 mm, 2 mm och 5 mm sondhöjd.
6. Som ett alternativ till trubbiga kartstift eller liknande material, använd 3D-skrivarfilerna för att skriva ut golvet i kammare 2 och sondplattan (se Kompletterande fil 1: SpikeBed-MCA.stl som hänvisar till de mekaniska sonderna och tilläggsfil 2: MCA_baseplate.stl som bildar golvet i kammare 2).
   OBS: Om 3D-utskrift inte är tillgänglig, lim kartlägg stift på ett akrylark med samma akryllim som används för att konstruera enhetens väggar.
7. Skriv ut med ett tvättbart och biokompatibelt material, t.ex. nylon 12-plast eller liknande (rekommenderas).
8. Konstruera kammare 3 med följande mått: 125 mm x 125 mm x 125 mm som en oupplyst genomskinlig mörkröd akryllåda (på alla sidor), placerad i motsatt ände till kammare 1. Placera ett gångjärnslock på kammaren, som liknar kamrarna 1 och 2. Denna kammare fungerar som ett mörkt flyktområde från de mekaniska sonderna i kammare 2.

2. Mus MCA-tillvänjning och testning

1. Som med alla experiment som involverar beteendemässiga resultat hos djur, observera lämplig randomisering och blindning hela tiden för att minimera potentiell bias.
   OBS: De representativa resultaten genererades genom att använda 8-12 veckor gamla manliga och kvinnliga C57BL / 6J-möss (Jackson Laboratories stamnummer 000664). Möss var socialt inrymda, upp till 5 per bur, med tillgång till mat och vatten ad libitum och en ljuscykel från 07:00 till 19:00. MCA ägde rum under ljusperioden, mellan 09:00 och 12:00 h.
2. En dag innan baslinjetestning planeras, acklimatisera möss till MCA-enheten i 5 minuter (minst) till 15 minuter (maximalt) med sina burkamrater för att underlätta social utforskning av hela enheten.
3. Under hela processen, se till att lysdioderna i kammare 1 är avslagna, barriären mellan kamrarna 1 och 2 lämnas öppen och sonderna är inställda på en höjd av noll (dvs inte utskjutande genom golvet i kammare 2).
4. Utför ett baslinjetest av möss (valfritt) om studien innehåller negativa kontrolldjur (dvs. skenkirurgi eller fordonsinjektionskontroller). Om så önskas, använd ett baslinjetest för att utesluta eventuella oskadade avvikande värden som aldrig passerar in i kammare 2, även om detta inte har visat sig nödvändigt. Om det används, rapportera alla kriterier för uteslutning och antalet möss som uteslutits.
   1. Innan du börjar testa, ställ in en videokamera som kan spela in 1080p-bilder på ett stativ med en sidovänd vy av hela MCA-enheten. Justera synfältet så att MCA fyller den inspelade bilden.
   2. När inspelningen börjar håller du ett handhållet torrraderingskort i kamerans synfält för att märka början av videon med identifierande information om djurets testkörning (t.ex. mus-ID, sondhöjd, datum, tidpunkt etc.).
   3. För den första körningen ställer du in sondhöjden till noll. Överför musen som ska testas från sin hembur till kammare 1 med barriärdörren på plats. Starta en timer som syns i de inspelade bilderna.
      OBS: Timern säkerställer att intervallen mellan de olika delarna av testet är konsekventa mellan körningarna.
   4. Efter 10 s, slå på kammaren 1 lysdioder. När musen har varit i den upplysta kammaren i 20 s, dra tillbaka barriären mellan kamrarna 1 och 2.
   5. Observera djuret i 2 minuter. Mät latenser och/eller uppehållstider med ett stoppur medan testet pågår. Alternativt kan videofilmen analyseras när testningen är klar.
      OBS: Av hänsyn till genomströmning och undvikande av långvarig exponering för aversiva stimuli sattes avstängningen till 2 min.
   6. Mät ett eller flera av de flera användbara resultat som har identifierats (se nedan; Figur 1). Rekommenderas att analysera alla 5 resultatmått när man börjar testa, för att fastställa vilka aspekter av beteende som skiljer sig åt i en given experimentell inställning.
      1. Alternativ I: Registrera svarstiden till den första posten till kammare 2. Alternativ II: Registrera svarstiden för att korsa mer än halvvägs över kammare 2. Alternativ III: Registrera den totala uppehållstiden i kammare 2. Alternativ IV: Registrera svarstiden för att nå kammare 3 (escape). Alternativ V: I likhet med alternativ II, registrera den totala uppehållstiden i varje kammare inom 2 minuter och konvertera dem till proportioner.
         OBS: Eftersom varje experiment är unikt och kan påverkas av biologiska faktorer och beteendeförändringar som är unika för sjukdomsmodellen, kan utredare experimentera med dessa och andra åtgärder i sina egna händer.
   7. När testningen är klar, sätt tillbaka musen till sin hembur, rengör MCA-kamrarna med 70% etanol och låt den torka helt.
      OBS: Fekal boli kan vanligtvis rengöras från kammaren relativt enkelt med pappershanddukar före etanol / desinfektionsmedel. Om noggrannare rengöring blir nödvändig kan kamrarna 2 och 3 demonteras och nedsänkas i varmt tvålvatten.
   8. Efter att ha kört alla möss i en kohort med sondhöjden inställd på noll, sätt in ett 3 mm akrylark under den mekaniska sondbasplattan och upprepa steg 2.4.2 till 2.4.7 med en sondhöjd på 2 mm.
   9. Efter att ha kört alla möss med sondens höjd inställd på 2 mm, sätt in ett andra 3 mm akrylark under sondens bottenplatta och upprepa steg 2.4.2 till 2.4.7 med en sondhöjd på 5 mm.
      OBS: En grupp på 8 möss kan testas på cirka 2 timmar med hjälp av detta tillvägagångssätt. Använd mindre gruppstorlekar om mer exakt tidpunkt efter läkemedel krävs (t.ex. för ett drogtidskursexperiment).
   10. Utför en slutrengöring med ett desinfektionsmedel i slutet av en testsession.
5. Upprepa testning efter att ha framkallat smärtöverkänslighet och / eller med läkemedelsbehandling.
6. Jämför varje muss prestanda vid baslinjen med deras prestanda efter att smärtan har inducerats. Bedöm effekterna av en farmakologisk intervention genom att jämföra fordonsbehandlade djur med läkemedelsbehandlade djur vid samma tidpunkt.
7. Utför icke-parametrisk statistisk analys (t.ex. Mann Whitney U-testet) om djur når 2 minuters cutoff utan att uppfylla det önskade resultatmåttet, vilket resulterar i icke-kontinuerliga data.

Representative Results

MCA-analysen har använts framgångsrikt med flera mekaniskt distinkta mussmärtmodeller. Figur 2 visar data där utfallsmåttet för valet passerade mittpunkten i kammare 2 (figur 2A). De data som erhållits genom att använda halvvägspunkten kontra flykten in i kammare 3 är mycket lika, ~ 40 s för halvvägs mot ~ 45 s för kammare 3 flykt i den sparade nervskadan (SNI) -modellen av neuropatisk smärta med 5 mm sondhöjd¹³.

I den CFA-inducerade inflammatoriska smärtmodellen förändrar kontroll av baktass (intraplantär) injektion av saltlösning inte flyktlatens jämfört med baslinjen. De möss som injicerades med CFA i en baktass visade en signifikant ökning av flyktlatens 4 dagar efter injektionen, men endast när sondhöjden höjdes till 5 mm. Avgörande var att denna ökade latens för att fly vid 5 mm inte sågs hos möss som fick NSAID-karprofen (10 mg / kg, i.p.) 90 minuter före testets början (Figur 2B).

Den sparade nervskadan (SNI) -modellen för traumatisk neuropatisk smärta är också förknippad med en signifikant ökning av latensen för att fly jämfört med baslinjen när sondhöjden var inställd på 5 mm. Denna effekt sågs hos SNI-möss, men inte deras bluffkirurgiska kontroller. Denna ökade flyktfördröjning förhindrades också genom systemisk administrering av opioidanalgetika buprenorfin (25 μg/kg, i.p.) 90 min före testning (figur 2C). Ökad flyktlatens observerades också hos möss som inte genomgick en baslinjerunda av MCA-testning före nervskada (figur 2D). I detta fall förhindrades den ökade flyktfördröjningen hos SNI-möss vid 5 mm av gabapentin (30 mg/kg, i.p.) administrerat 90 minuter före testning. Sammantaget tyder detta på att MCA kan upptäcka smärtrelaterade förändringar i stimulansaversion och undvikande i två allmänt använda modeller av inflammatorisk och neuropatisk smärta.

MCA testades vidare i fraktur/gjutningsmodellen för det kroniska smärttillståndet complex regional pain syndrome (CRPS) som fastställs av en sluten höger distal tibiafraktur följt av 3 veckors^{gjutning 14}. Denna kliniskt informerade modell uppvisar akut fas perifer inflammation, liksom långvarig immunaktivitet i centrala nervsystemet med ihållande bakbensalodyni. I likhet med CFA- och SNI-modellerna observerades ökade flyktlatenser i fraktur-/gjutningsmodellen (figur 3A). Före skadan ökade latensen för att fly från kammare 1 proportionellt mot sondhöjden. Efter skadan förblev flyktfördröjningen oförändrad vid 0 mm men ökade signifikant vid 2 mm och 5 mm sondhöjd för hanar och 5 mm sondhöjd för honor jämfört med baslinjen (figur 3B).

Figur 1: Schematiska och bilder av MCA-enheten. (A) Potentiella utfallsmått i MCA-analysen, (markerade med urtavlans ikoner): latens till utgångskammare 1 (I), latens för att korsa mer än 50% av kammare 2 (prickad linje; II), den totala tiden som spenderas i kammare 2 (III), latens för att nå flyktkammaren (IV) eller procentuell tid som spenderas i varje kammare (V). Djur som upplever smärta i genomsnitt visar högre värden för I, II och IV och reducerade värden för III. Ett reducerat värde för III ökar nödvändigtvis andelen tid som spenderas i kammare 1 och/ eller kammare 3, vilket skulle fångas av utfallsmått V. Skapad med Biorender.com. (B) Bilder som illustrerar MCA-enheten (och kamrarna numrerade 1, 2 och 3) med lysdioderna avslagna (uppe till vänster), lysdioderna tända (nere till vänster). (C) Utsikt över kamrarna ovanifrån med dörrarna öppnade. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figur 2: Inflammatorisk och neuropatisk smärtförstärkning i MCA-analysen. (A) Skildring av det specifika utfallsmåttet som används här: latens för att korsa kammaren 2 mittpunkt. (B) Intraplantär injektion av CFA ökade signifikant latensen för att fly (röda rutor) jämfört med saltlösningskontroller (svarta cirklar) när sondens höjd var inställd på 5 mm. Intraperitoneal karprofen (10 mg/kg) dämpade den CFA-inducerade ökningen av flyktlatens (blå trianglar). Data ritas som genomsnittlig flyktfördröjning ± standardfel för medelvärdet (SEM); n = 7 män/grupp. (C) Sparad nervskada (SNI) kirurgi ökade signifikant kammare 1 flyktlatens jämfört med bluffkirurgiska kontroller (svarta cirklar), när sondhöjden var inställd på 5 mm (röda rutor). Intraperitoneal buprenorfin (25 mg/kg) dämpade signifikant denna ökning av flyktlatens (blå trianglar). Data ritas som genomsnittlig flyktfördröjning ± SEM; n = 6-7 män per grupp. (D) SNI-inducerad ökning av flyktlatensen reverserades genom användning av det smärtstillande gabapentinet (gröna trianglar). Data ritas som genomsnittlig flyktfördröjning ± SEM; n = 8 män/grupp. ## = p < 0,01, ***/### = p < .001, för de angivna jämförelserna (tvåvägs ANOVA, Bonferroni post-hoc). Denna siffra har ändrats från¹³. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figur 3: Tibialfraktur / gjutning inducerad kronisk smärtförstärkningsundvikande i MCA-analysen. Fraktur/gjutning ökade signifikant flyktlatensen vid 3 veckor efter skada (W3) jämfört med baslinjen (BL) hos män vid 2 mm och 5 mm sondhöjder och hos kvinnor vid 5 mm sondhöjd (n = 5 / kön). Data från varje mus avbildas i blekt svart (män) eller cayenne (honor) med medelvärde representerat av mörka linjer. **/*** = p < 0,01/< 0,001 jämfört med köns- och sondhöjdsmatchat baslinjevärde med tvåvägs ANOVA, Tukey post-hoc. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Kompletterande fil 1: 3D-skrivarfil SpikeBed-MCA. När SpikeBed-MCA.stl skrivs ut i ett lämpligt biokompatibelt och tvättbart material, såsom nylon 12, producerar de plattformen av taktila sonder som sticker ut genom golvet i kammare 2. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Kompletterande fil 2: 3D-skrivarfil MCA_baseplate. När den skrivs ut i ett lämpligt biokompatibelt och tvättbart material, såsom nylon 12, producerar MCA_baseplate.stl golvet i kammare 2, genom vilket de taktila sonderna sticker ut. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Discussion

Som med alla beteendetester är korrekt hantering, randomisering och blindning för behandling av djur avgörande hela tiden. Med tanke på de multifaktoriella ingångarna i komplexa beteenden och beslutsfattande är det absolut nödvändigt att djur hanteras, vanes och testas så konsekvent som möjligt samtidigt som nöd minimeras. Försiktighet bör också vidtas för att reproducera tidpunkten för musplacering i kammare 1, slå på LED-lamporna och ta bort barriären, eftersom skillnader här kan påverka efterföljande beteende.

Det bör noteras att de olika utfallsmått som visas i figur 1A är inbördes relaterade. Till exempel passerar en mus som kommer in i kammare 2 vanligtvis halvvägs i kammare 2 och slutför sedan nästan alltid flykten till kammare 3. Detta innebär att utfallsmåtten I, II och IV är inbördes relaterade. Utfallsmåtten III och V mäter den totala uppehållstiden i kammare 2 respektive andelen uppehållstid i alla tre kamrarna. Därför är dessa åtgärder nära besläktade med varandra. En mus kan emellertid teoretiskt ackumulera betydande uppehållstid i kammare 2 oavsett om halvvägskorsningen eller flykten in i kammare 3 hade låg latens, hög latens eller inte inträffade alls.

Flera variationer eller modifieringar av denna metod har rapporterats. Förutom de olika utfallsmåtten som listas här (figur 1) kan utredarna variera utvecklingen av sondhöjd i ett försök att belysa skillnader i känslighet. Eftersom det inte fanns några statistiskt signifikanta skillnader med den mellanliggande 2 mm sondhöjden kan det vara effektivare att köra möss endast vid 0 mm och 5 mm. Alternativt kan en sondhöjd mellan 2 och 5 mm eller upprepade körningar i en 5 mm sondhöjd börja avslöja skillnader som inte annars var uppenbara. Dessutom kan utvärdering av uppehållstid i varje kammare användas som en avläsning av motivation och aktivitet. Detta kan vara användbart i fall där vissa möss springer snabbt igenom till kammare 3 men sedan återvänder till kammare 1 för att utforska ytterligare. I dessa situationer skulle latens till inträde i kammare 3 ensam inte fånga denna subtilitet. Att höja testavbrottstiden utöver den gräns på 2 minuter som anges här kan också visa sig vara värt för vissa utredare. Slutligen kan vi inte utesluta möjligheten att upprepade tester av samma djur (mer än de tre gånger som beskrivs här) eller testning med större frekvens (mindre än 4-7 dagar mellan testerna) kan införa tillvänjnings- eller inlärningseffekter. Av dessa skäl uppmuntras inkludering av naiva, omanipulerade kontrollgrupper vid varje tidpunkt. I slutändan är variationer i beteende mycket sannolikt att vara smärtmodellspecifika och motiverar ytterligare undersökning i dessa och andra smärtmodeller.

De smärtframkallande modellerna som används här (CFA, SNI, fraktur / gjutning) är vanligtvis förknippade med överkänslighet i andra smärtbeteendetester, vilket motsvarar en ökning av undvikande / flyktlatens. MCA-analysen kan också kunna upptäcka en förlust av sensorisk skärpa (till exempel via ökad tid i kammare 2), även om detta inte har testats formellt. MCA har vissa begränsningar som motiverar övervägande. Aversion mot starkt ljus är ett viktigt sätt att motivera inträde i kammare 2 och därför en drivkraft för efterföljande konflikt. Alla patologiska egenskaper som är associerade med en viss musmodell som kan förändra motviljan mot starkt ljus (t.ex. synnedsättning) bör noggrant övervägas innan detta test används. Bidraget från ångest för att undkomma latens har inte heller testats systematiskt, även om kroniska inflammatoriska och neuropatiska smärtmodeller har rapporterats visa tecken på ångestliknande beteende hos möss i andra tester, fortsätter det att finnas en debatt om dessa^15,16. Som sagt, ett bidrag av smärtrelaterad ångest till dessa beteendemässiga resultat kan inte bekräftas eller uteslutas just nu. Eftersom MCA har flera ingångar i resultatmåtten kommer detta med fler potentiella förvirringar att överväga.

Sammanfattningsvis ger MCA-testet en icke-reflexiv avläsning av smärtkänslighet i musmodeller. Utfallsmåtten påverkas av andra faktorer än reflexiv känslighet och ger ett sammansatt mått på smärtkänslighet och affektivt/motiverande tillstånd. Den tid som krävs för att köra varje test och nivån på skicklighet och specialutrustning som krävs jämförs positivt med andra icke-reflexiva mått på smärta, såsom gånganalys eller konditionerad platspreferens ^5,13. Även om det fortfarande är något nytt, har tillvägagångssättet antagits och oberoende verifierats av flera team av utredare, främst hos råttor. Partiell ischiasnervligering ökade utgångslatensen¹⁷ och morfinberoende uttag hos råttor⁷. En annan studie på råttor föreslog att räkning av antalet korsningar, med hjälp av ryggmärgsskada och kroniska förträngningsskademodeller hos råttor, kan fungera som ett användbart resultatmått⁸. Avgörande var att denna studie också identifierade en ökning av sondundvikande i bluffkirurgiska kontroller, vilket indikerar att inkludering av en naiv grupp tillsammans med bluff / fordonskontroller är motiverad. Framtida tillämpningar av MCA kan fokusera på variationen mellan musstammar och / eller smärtmodeller, effekten av ångest på analysprestanda och integration av hållningsanalys eller gångkinematik för att bättre förstå skillnader i beteendemässiga anpassningar till skadliga stimuli.

Det translationella gapet mellan prekliniska musstudier och utvecklingen av nya terapier fortsätter att utgöra en anledning till oro. Med detta i åtanke kompletterar MCA-analysen befintliga verktyg inom smärtforskning och hjälper till att ge en mer fullständig bild av de många sensoriska och affektiva dimensionerna av smärta.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
32.8ft 3000K-6000K Tunable White LED Strip Lights, Dimmable Super Bright LED Tape Lights with 600 SMD 2835 LEDs	Lepro	SKU: 410087-DWW-US	For lighting chamber 1. https://www.lepro.com/32ft-dimmable-tunable-white-led-strip-lights.html
3D printed 'spike bed' and 'chamber 2 floor'	Shapeways	N/A	Optional, for mechanical probes as an alternative to blunted map pins.
70% ethanol	Various	N/A	To clean MCA between mice.
Acryl-Hinge 2	TAP Plastics	N/A	for attaching chamber lids to rear walls. https://www.tapplastics.com/product/plastics/handles_hinges_latches/acryl_hinge_2/122
Chemcast Cast Acrylic Sheet, Clear	TAP Plastics	N/A	3mm thick. For front wall of chamber 1. https://www.tapplastics.com/product/plastics/cut_to_size_plastic/acrylic_sheets_cast_clear/510
Chemcast Cast Transparent Colored Acrylic, Transparent Dark Red - 50%	TAP Plastics	N/A	3mm thick. 50% light transmission. For walls and lids of chambers 2 and 3. https://www.tapplastics.com/product/plastics/cut_to_size_plastic/acrylic_sheets_transparent_colors/519
Chemcast Translucent & Opaque Colored Cast Acrylic, Sign Opaque White - 0.1%	TAP Plastics	N/A	3mm thick. For side walls and lid of chamber 1. https://www.tapplastics.com/product/plastics/cut_to_size_plastic/acrylic_sheets_color/341
Disinfectant (e.g. Quatricide)	Pharmacal Research Laboratories, Inc.	65020F	To disinfect MCA at the end of a testing session.
Dry-erase markers and board	Various	N/A	To add experimental info to the beginning of video footage.
Map pins	Various	N/A	Optional, for mechanical probes. Use sandpaper to blunt sharp points before use. Can be used in place of 3D-printed parts.
Paper towels	Various	N/A	To clean/disinfect MCA.
SCIGRIP Weld-On #3 Acrylic Cement	TAP Plastics	N/A	For assembling acrylic sheets into chambers and affixing hinges. https://www.tapplastics.com/product/repair_products/plastic_adhesives/weld_on_3_cement/131
Stopwatch	Various	N/A	To record escape latencies/dwell times in real-time or from recorded video.
Timer	Various	N/A	To ensure LED turn-on, barrier removal and test completion are timed consistently.
Video camera	Various	HDRCX405 Handycam Camcorder	To record mouse behavior in the MCA device. Can be substituted with any consumer-grade video camera capable of 1080p resolution.
Tripod	Famall	N/A	Any tripod that can hold the camera at bench height for recording MCA footage is acceptable.