Summary
Mekanik çatışmadan kaçınma testi, farelerde ağrı duyarlılığının refleksif olmayan bir okuması olarak kullanılır ve çeşitli fare ağrısı modellerinde duygusal-motivasyonel tepkileri daha iyi anlamak için kullanılabilir.
Abstract
Ağrı hem duyusal (nosiseptif) hem de duygusal (hoş olmayan) boyutlardan oluşur. Preklinik modellerde, ağrı geleneksel olarak ağrının nosiseptif bileşeni ile ilgili çıkarımlara izin veren, ancak ağrının duygusal veya motivasyonel bileşeni hakkında çok az bilgi sağlayan refleksif testler kullanılarak değerlendirilmiştir. Bu nedenle, ağrının bu bileşenlerini yakalayan testler geliştirmek translasyonel olarak önemlidir. Bu nedenle, araştırmacıların ağrı algısını bu düzeyde incelemek için refleksif olmayan davranışsal testler kullanmaları gerekir. Mekanik çatışmadan kaçınma (MCA), 3 odacıklı bir paradigmada zararlı bir mekanik uyarana motivasyonel tepkileri incelemek için kurulmuş gönüllü bir refleksif olmayan davranış testidir. Bir farenin konum tercihindeki bir değişiklik, rakip zararlı uyaranlarla karşı karşıya kaldığında, pençelerin dokunsal uyarımına karşı parlak ışığın algılanan tatsızlığını çıkarmak için kullanılır. Bu protokol, ağrı araştırmacılarının çeşitli fare ağrısı modellerinde duygusal-motivasyonel tepkileri anlamak için kullanabilecekleri MCA testinin değiştirilmiş bir versiyonunu özetlemektedir. Burada özel olarak tanımlanmamış olsa da, örnek MCA verilerimiz, MCA prosedürünü göstermek için ağrı modelleri olarak intraplantar tam Freund adjuvanını (CFA), korunmuş sinir hasarını (SNI) ve bir kırık / döküm modelini kullanır.
Introduction
Ağrı, duyusal ve duygusal bileşenlerle ilgili karmaşık bir deneyimdir. Ağrı algısı eşiğinde bir azalma ve termal ve / veya mekanik uyaranlara aşırı duyarlılık, uyaranla uyarılan ağrı davranış testlerinin yakalayabileceği bu deneyimin temel özellikleridir (Hargreaves'in ısı duyarlılığı testi ve von Frey mekanik duyarlılık testi gibi)1,2. Bu tür testler sağlam ve tekrarlanabilir sonuçlar vermesine rağmen, algılanan zararlı bir uyarandan refleksif geri çekilmeye güvenmeleri ile sınırlıdır. Bu, yalnızca bu testlere devam eden ağrı araştırmalarına güvenmeyi sorgulamıştır. Bu amaçla, ağrı araştırmacıları birkaç yıldır ağrının duygusal ve / veya motivasyonel bileşenlerinin daha fazlasını yakalamak için kemirgen ağrı modellerinde kullanılmak üzere alternatif / tamamlayıcı davranış testlerini araştırmaktadır. Bu uyarılmamış, gönüllü veya refleksif olmayan önlemler (örneğin, tekerlek koşma, yuvalama aktivitesi, şartlı yer tercihi 3,4,5), klinik öncesi ağrı araştırmalarının çevrilebilirliğini geliştirmek amacıyla uygulanmaktadır.
Mekanik çatışmadan kaçınma (MCA) testi ilk olarak Harte ve ark. tarafından 2016yılında 6, ağırlıklı olarak sıçanlarda 7,8'de kullanılır ve daha önceki bir yaklaşımın bir modifikasyonunu temsil eder - yerden kaçınma paradigması. Bu yaklaşımda, arka pençenin zararlı bir uyaranı, hayvanın bu tür bir uyarımdan kaçmak / kaçınmak için amaçlı davranışlarını yönlendirmek için başka türlü arzu edilen (karanlık) bir odada gerçekleştirilir 9,10. MCA testi, arka pençenin bir gözlemci tarafından manuel olarak zararlı bir şekilde uyarılmasına güvenmek yerine, fareleri engelleyici bir ortamdan kaçmak ve karanlık odaya ulaşmak için potansiyel olarak zararlı bir uyaranı müzakere etmeye zorlar. Tahlil testine adını veren çatışma / kaçınma şu iki rakip motivasyondan kaynaklanmaktadır: parlak aydınlatılmış alanlardan kaçmak ve pençelerin zararlı uyarılmasından kaçınmak. MCA testi ayrıca, ağrı kesici çevresel ipuçlarıyla eşleştirilmesinin, ağrı kesici / ödüllendirici bağlam11 için bir tercihi yansıtan davranış değişikliklerini yönlendirdiği şartlı yer tercihi testi ile özellikleri de paylaşır.
Temel olarak konuşursak, tüm bu analizler benzer bir yaklaşımı paylaşır: bir hayvanın bir aversif ortamı diğerine tercih etmesinde, duygusal / motivasyonel durumlarının bir göstergesi olarak bir kayma kullanmak. MCA testi, parlak bir şekilde aydınlatılmış bir odadan ve ardından ayarlanabilir yükseklik problarına sahip karanlık bir orta odadan ve herhangi bir engelleyici uyaran içermeyen karanlık bir üçüncü odadan oluşan 3 odalı bir paradigmadır. Yaralanmamış bir fare, kemirgenlerin parlak ışığa doğuştan gelen isteksizliği göz önüne alındığında, tipik olarak karanlık bir odaya kaçmak için motive edilir12. Bu örnekte, parlak aydınlatılmış bir ortamdan kaçmak için doğal motivasyon, yalnızca karanlık ortamda meydana gelen arka pençe stimülasyonuyla (ayarlanabilir yükseklik probları) karşılaşma konusundaki isteksizliğin üstesinden gelir. Buna karşılık, ağrı yaşayan bir fare (örneğin iltihaplanma veya nöropati nedeniyle), parlak aydınlatılmış ortamda daha fazla zaman geçirmeyi tercih edebilir, çünkü devam eden dokunsal aşırı duyarlılık ortamında mekanik probların hoş olmayan dokunsal deneyiminden kaçınmak için motivasyon vardır.
Bu makalede, MCA testinin değiştirilmiş bir sürümü açıklanır. Orijinal yöntemi (sıçanlardagerçekleştirilen 6) farelerde kullanılmak üzere uyarladık. Ayrıca, veri toplamayı kolaylaştırmak için test edilen prob yüksekliklerinin sayısını altıdan üçe (zemin yüksekliğinden 0, 2 ve 5 mm yüksek) düşürdük. Bu yaklaşım çoklu ağrı modellerinde test edilmiş ve bilinen analjeziklerle doğrulanmıştır, bu da ağrı aşırı duyarlılığının ve / veya ilişkili duygusal ve motivasyonel değişikliklerin davranıştaki bu değişiklikleri yönlendirdiğini göstermektedir. Bu yaklaşımın uygulanması nispeten hızlıdır ve diğer refleksif olmayan önlemlerle karşılaştırıldığında uyarlanabilir, bu da günlerce süren alışkanlık ve eğitim 1,2 gerektirebilir. Diğer ağrı ölçümleriyle uyum içinde, MCA ağrının duygusal ve motivasyonel yönleri hakkında değerli bilgiler üretebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Farelerin kullanımını içeren tüm deneyler ve burada izlenen prosedürler, MD Anderson Kanser Merkezi ve Stanford Üniversitesi'nin Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanım Komiteleri tarafından, Ulusal Sağlık Enstitüleri'nin Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Kılavuzu'na sıkı sıkıya bağlı kalınarak onaylanmıştır.
1. MCA inşaatı
- Aşağıdaki boyutlarda yapı haznesi 1: 125 mm x 125 mm x 125 mm (genişlik x derinlik x yükseklik) yan duvarlar, zemin, tavan için kullanılan opak beyazdan 3 mm kalınlığında akrilik. Öne bakan duvar için 3 mm kalınlığında şeffaf bir akrilik kullanın. Özel akrilik yapıştırıcı kullanarak her tarafı önceden birbirine yapıştırın.
DİKKAT: Akrilik yapıştırıcı tehlikeli madde olarak kabul edilir (yanıcı, buhara zararlı, yutulduğunda zararlı olabilir, cildi veya gözleri tahriş edebilir). Bu tür yapıştırıcılar yalnızca üreticinin talimatlarına uygun olarak kullanılmalıdır (yani, iyi havalandırılan bir alanda uygun KKD ile). - Oda 1'in kapağını bir menteşe ile takın, böylece fareler odaya kolayca yerleştirilebilir ve odadan alınabilir. ~ 4800 lüks aydınlatma sağlamak için kapağın iç yüzeyine kendinden yapışkanlı ışık yayan diyot (LED) bandı takın.
- Opak bir akrilik levhayı yerine ve konumundan kaydırarak MCA'nın geri kalanından 1 numaralı odayı kapatın.
- MCA test odasını, oda 2'yi, her tarafta yarı saydam koyu kırmızı akrilikten (3 mm kalınlığında) imal edilmiş, üstte menteşeli bir kapak bulunan 270 mm uzunluğunda aydınlatılmamış bir oda olarak inşa edin. 2 no'lu odanın tabanına, içinden 0,5 mm çapında uçlara sahip bir dizi künt probun (örneğin, körelmiş harita pimleri) çıkıntı yapabileceği 2 mm'lik deliklerden oluşan 13 x 31 ızgara yerleştirin.
NOT: 120 kumlu zımpara kağıdı bloğu veya benzeri bir yapıya sahip kör pimler. Sporisidal dezenfektan ile dezenfekte edilmeden önce deterjanla ılık suda temizleyin. - Prob taban plakasının altına ilave akrilik levhalar yerleştirerek probların yüksekliğini ayarlayın (Şekil 1). Bu yaklaşımı kullanarak cihazı üç ayarla yapılandırın: 0 mm, 2 mm ve 5 mm prob yüksekliği.
- Körelmiş harita pimlerine veya benzer malzemelere alternatif olarak, oda 2'nin zeminini ve prob plakasını yazdırmak için 3D yazıcı dosyalarını kullanın (bkz. Ek Dosya 1: mekanik problara atıfta bulunan SpikeBed-MCA.stl ve Ek Dosya 2: oda 2'nin tabanını oluşturan MCA_baseplate.stl).
NOT: 3D baskı mevcut değilse, cihazın duvarlarını inşa etmek için kullanılan aynı akrilik yapıştırıcıyı kullanarak pimleri akrilik bir tabakaya sabitleyin. - Naylon 12 plastik veya benzeri gibi yıkanabilir ve biyouyumlu bir malzemeyle yazdırın (önerilir).
- Aşağıdaki boyutlarda yapı haznesi 3: 125 mm x 125 mm x 125 mm, ışıksız yarı saydam koyu kırmızı akrilik kutu olarak (her tarafta), oda 1'in karşı ucuna yerleştirilmiştir. Odaya, oda 1 ve 2'ye benzer şekilde menteşeli bir kapak yerleştirin. Bu oda, oda 2'deki mekanik problardan karanlık bir kaçış alanı görevi görür.
2. Fare MCA alışkanlığı ve testi
- Hayvanlarda davranışsal sonuçları içeren tüm deneylerde olduğu gibi, potansiyel önyargıyı en aza indirmek için uygun randomizasyonu ve körleşmeyi gözlemleyin.
NOT: Temsili sonuçlar 8-12 haftalık erkek ve dişi C57BL/6J fareler kullanılarak elde edilmiştir (Jackson Laboratuvarları suş numarası 000664). Fareler, kafes başına 5'e kadar, yiyecek ve su ad libitumuna erişim ve 07: 00 saat ila 19: 00 saat ışık döngüsü ile sosyal olarak barındırıldı. MCA, ışık döneminde, saat 09:00 ile 12:00 arasında gerçekleşti. - Temel testlerin planlanmadan bir gün önce, tüm cihazın sosyal keşfini kolaylaştırmak için fareleri kafes arkadaşlarıyla birlikte 5 dakika (minimum) ila 15 dakika (maksimum) boyunca MCA ünitesine alıştırın.
- İşlem boyunca, oda 1'deki LED'lerin kapatıldığından, oda 1 ve 2 arasındaki bariyerin açık bırakıldığından ve probların sıfır yüksekliğe ayarlandığından (yani, oda 2'nin tabanından çıkıntı yapmadığından) emin olun.
- Çalışma negatif kontrol hayvanlarını içeriyorsa (yani, sahte cerrahi veya araç enjeksiyon kontrolleri) farelerin temel bir testini (isteğe bağlı) gerçekleştirin. İstenirse, oda 2'ye asla geçmeyen yaralanmamış aykırı değerleri hariç tutmak için bir taban çizgisi testi kullanın, ancak bunun gerekli olduğu kanıtlanmamıştır. Kullanılıyorsa, hariç tutulma için tüm ölçütleri ve hariç tutulan fare sayısını bildirin.
- Teste başlamadan önce, tüm MCA cihazının yana bakan görünümüyle bir tripoda 1080p çekim yapabilen bir video kamera kurun. Görüş alanını, MCA kaydedilen görüntüyü dolduracak şekilde ayarlayın.
- Kayıt başladıktan sonra, videonun başlangıcını hayvanın test çalışmasıyla ilgili tanımlayıcı bilgilerle (ör. fare kimliği, prob yüksekliği, tarih, saat noktası vb.) etiketlemek için kameranın görüş alanında elde taşınan bir kuru silme panosu tutun.
- İlk çalıştırma için prob yüksekliğini sıfıra ayarlayın. Test edilecek fareyi ev kafesinden bariyer kapısı yerinde olacak şekilde oda 1'e aktarın. Kaydedilen çekimde görünen bir zamanlayıcı başlatın.
NOT: Zamanlayıcı, testin farklı bölümleri arasındaki aralıkların çalıştırmalar arasında tutarlı olmasını sağlar. - 10 sn sonra, oda 1 LED'lerini açın. Fare 20 saniye boyunca yanan odada kaldıktan sonra, 1 ve 2 numaralı odalar arasındaki bariyeri geri çekin.
- Hayvanı 2 dakika boyunca gözlemleyin. Test devam ederken gecikme sürelerini ve/veya bekleme sürelerini bir kronometre ile ölçün. Alternatif olarak, test tamamlandıktan sonra video görüntüleri analiz edilebilir.
NOT: Verim ve engelleyici uyaranlara uzun süre maruz kalmaktan kaçınma nedenleriyle, kesinti 2 dakika olarak ayarlandı. - Tanımlanmış birkaç yararlı sonuçtan birini veya birkaçını ölçün (aşağıya bakın; Şekil 1). Belirli bir deney düzeneğinde davranışın hangi yönlerinin farklı olduğunu belirlemek için teste başlarken 5 sonuç ölçütünün tümünü analiz etmeniz önerilir.
- Seçenek I: Oda 2'ye ilk girişteki gecikmeyi kaydedin. Seçenek II: Oda 2'nin yarısından fazlasını geçme gecikmesini kaydedin. Seçenek III: Toplam bekleme süresini 2 numaralı odaya kaydedin. Seçenek IV: Oda 3'e ulaşmak için gecikmeyi kaydedin (kaçış). Seçenek V: Seçenek II'ye benzer şekilde, her odadaki toplam bekleme süresini 2 dakika içinde kaydedin ve bunları oranlara dönüştürün.
NOT: Her deney benzersiz olduğundan ve hastalık modeline özgü biyolojik faktörlerden ve davranış değişikliklerinden etkilenebileceğinden, araştırmacılar bu ve diğer önlemleri kendi ellerinde deneyebilirler.
- Seçenek I: Oda 2'ye ilk girişteki gecikmeyi kaydedin. Seçenek II: Oda 2'nin yarısından fazlasını geçme gecikmesini kaydedin. Seçenek III: Toplam bekleme süresini 2 numaralı odaya kaydedin. Seçenek IV: Oda 3'e ulaşmak için gecikmeyi kaydedin (kaçış). Seçenek V: Seçenek II'ye benzer şekilde, her odadaki toplam bekleme süresini 2 dakika içinde kaydedin ve bunları oranlara dönüştürün.
- Test tamamlandıktan sonra, fareyi ev kafesine geri getirin, MCA odalarını% 70 etanol ile temizleyin ve tamamen kurumasını bekleyin.
NOT: Fekal boli genellikle etanol/dezenfektan önce kağıt havlularla odadan nispeten kolay bir şekilde temizlenebilir. Daha kapsamlı temizlik gerekli hale gelirse, oda 2 ve 3 sökülebilir ve ılık, sabunlu suya batırılabilir. - Tüm fareleri prob yüksekliği sıfıra ayarlanmış bir kohortta çalıştırdıktan sonra, mekanik prob taban plakasının altına 3 mm'lik bir akrilik levha yerleştirin ve 2 mm'lik bir prob yüksekliği ile 2.4.2 ila 2.4.7 arasındaki adımları tekrarlayın.
- Prob yüksekliği 2 mm'ye ayarlanmış tüm fareleri çalıştırdıktan sonra, prob taban plakasının altına ikinci bir 3 mm akrilik tabaka yerleştirin ve prob yüksekliği 5 mm olan 2.4.2 ila 2.4.7 arasındaki adımları tekrarlayın.
NOT: 8 fareden oluşan bir grup, bu yaklaşım kullanılarak yaklaşık 2 saat içinde test edilebilir. Daha kesin ilaç sonrası zamanlama gerekiyorsa daha küçük grup boyutları kullanın (örneğin, bir ilaç zamanı kursu deneyi için). - Bir test seansının sonunda bir dezenfektan ile son bir temizlik yapın.
- Ağrıya aşırı duyarlılığı indükledikten sonra ve / veya ilaç tedavisi ile testi tekrarlayın.
- Her farenin performansını, başlangıçta ağrı indüklendikten sonraki performanslarıyla karşılaştırın. Farmakolojik bir müdahalenin etkisini, araçla tedavi edilen hayvanları ilaçla tedavi edilen hayvanlarla aynı zaman noktasında karşılaştırarak değerlendirin.
- Hayvanlar istenen sonuç ölçüsünü yerine getirmeden 2 dakikalık kesime ulaşırsa ve sürekli olmayan verilerle sonuçlanırsa, parametrik olmayan istatistiksel analiz (örneğin, Mann Whitney U Testi) gerçekleştirin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
MCA testi, mekanik olarak farklı birkaç fare ağrısı modeliyle başarıyla kullanılmıştır. Şekil 2, seçilen sonuç ölçüsünün oda 2'nin orta noktasını geçtiği verileri göstermektedir (Şekil 2A). Yarım nokta ve oda 3'e kaçış kullanılarak elde edilen veriler çok benzerdir, 5 mm prob yüksekliği13 olan nöropatik ağrının korunmuş sinir hasarı (SNI) modelinde oda 3 kaçışı için ~ 40 s, yarı yol için ~ 40 sn ve 45 s'dir.
CFA ile indüklenen inflamatuar ağrı modelinde, kontrol arka pençesi (intraplantar) salin enjeksiyonu, başlangıçtan kaçış gecikmesini değiştirmez. Bir arka pençeye CFA enjekte edilen fareler, enjeksiyondan 4 gün sonra kaçış gecikmesinde önemli bir artış gösterdi, ancak sadece prob yüksekliği 5 mm'ye yükseltildiğinde. En önemlisi, 5 mm'de kaçmak için bu artan gecikme, testin başlamasından 90 dakika önce NSAID karprofen (10 mg / kg, yani 10 mg / kg) alan farelerde görülmemiştir (Şekil 2B).
Travmatik nöropatik ağrının korunmuş sinir hasarı (SNI) modeli, prob yüksekliği 5 mm'ye ayarlandığında taban çizgisine karşı kaçma gecikmesinde önemli bir artışla da ilişkilidir. Bu etki SNI farelerde görüldü, ancak sahte cerrahi kontrolleri görülmedi. Bu artmış kaçış gecikmesi, opioid analjezik buprenorfinin (25 μg / kg, i.p.) testten 90 dakika önce sistemik olarak uygulanmasıyla da önlendi (Şekil 2C). Sinir hasarından önce MCA testinin temel turuna tabi tutulmayan farelerde de artmış kaçış gecikmesi gözlenmiştir (Şekil 2D). Bu durumda, SNI farelerinde 5 mm'de artan kaçış gecikmesi, testten 90 dakika önce uygulanan gabapentin (30 mg / kg, i.p.) ile önlenmiştir. Toplu olarak, bu, MCA'nın yaygın olarak kullanılan iki enflamatuar ve nöropatik ağrı modelinde uyarandan kaçınma ve kaçınmadaki ağrıya bağlı değişiklikleri tespit edebileceğini düşündürmektedir.
MCA, kapalı bir sağ distal tibia kırığı ve ardından 3 haftalık döküm14 ile kurulan kronik ağrı durumu kompleksi bölgesel ağrı sendromunun (CRPS) kırık / döküm modelinde daha fazla test edildi. Klinik olarak bilgilendirilmiş bu model, akut faz periferik inflamasyonun yanı sıra merkezi sinir sisteminde kalıcı arka bacak allodinisi ile uzun süreli immün aktivite sergiler. CFA ve SNI modellerine benzer şekilde, kırık/döküm modelinde de artmış kaçış gecikmeleri gözlenmiştir (Şekil 3A). Yaralanmadan önce, oda 1'den kaçma gecikmesi, prob yüksekliği ile orantılı olarak artmıştır. Yaralanmadan sonra, kaçış gecikmesi 0 mm'de değişmeden kaldı, ancak erkekler için 2 mm ve 5 mm prob yüksekliğinde ve kadınlar için 5 mm prob yüksekliğinde taban çizgisine kıyasla önemli ölçüde artmıştır (Şekil 3B).
Şekil 1: MCA cihazının şeması ve görüntüleri. (A) MCA testindeki potansiyel sonuç ölçümleri, (saat yüzü simgeleri ile işaretlenmiş): oda 1'den (I) çıkma gecikmesi, oda 2'nin% 50'sinden fazlasını geçme gecikmesi (noktalı çizgi; II), oda 2'de geçirilen toplam süre (III), kaçış odasına ulaşma gecikmesi (IV) veya her odada geçirilen sürenin yüzdesi (V). Ortalama olarak ağrı çeken hayvanlar I, II ve IV için daha yüksek değerler ve III için daha düşük değerler göstermektedir. III için azaltılmış bir değer, zorunlu olarak, oda 1 ve / veya oda 3'te harcanan zamanın oranını arttırır, bu da sonuç ölçüsü V. Biorender.com ile yaratılmıştır. (B) LED'ler kapalıyken (sol üstte), LED'ler açıkken (sol altta) MCA cihazını (ve 1, 2 ve 3 numaralı bölmeleri) gösteren görüntüler. (C) Kapılar açıkken odaların yukarıdan görünümü. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Enflamatuar ve nöropatik ağrı, MCA testinde kaçınmayı arttırır. (A) Burada kullanılan spesifik sonuç ölçüsünün tasviri: oda 2 orta noktasını geçmek için gecikme. (B) CFA'nın intraplantar enjeksiyonu, prob yüksekliği 5 mm'ye ayarlandığında salin kontrollerine (siyah daireler) karşı kaçma gecikmesini (kırmızı kareler) önemli ölçüde arttırdı. İntraperitoneal karprofen (10 mg / kg), kaçış gecikmesindeki CFA kaynaklı artışı (mavi üçgenler) zayıflattı. Veriler, ortalamanın standart hatası (SEM) ± kaçış gecikmesi olarak çizilir; n = 7 erkek/grup. (C) Korunmuş sinir hasarı (SNI) ameliyatı, prob yüksekliği 5 mm'ye (kırmızı kareler) ayarlandığında, sahte cerrahi kontrollere (siyah daireler) kıyasla oda 1 kaçış gecikmesini önemli ölçüde artırdı. İntraperitoneal buprenorfin (25 mg / kg), kaçış gecikmesindeki (mavi üçgenler) bu artışı önemli ölçüde azalttı. Veriler, SEM ± ortalama kaçış gecikmesi olarak çizilir; n = Grup başına 6-7 erkek. (D) Kaçış gecikmesindeki SNI kaynaklı artış, analjezik gabapentin (yeşil üçgenler) kullanılarak tersine çevrildi. Veriler, SEM ± ortalama kaçış gecikmesi olarak çizilir; n = 8 erkek/grup. ## = p < 0.01, ***/### = p < .001, belirtilen karşılaştırmalar için (iki yönlü ANOVA, Bonferroni post-hoc). Bu rakam13'ten değiştirilmiştir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Tibial kırık / döküm kaynaklı kronik ağrı, MCA testinde kaçınmayı arttırır. Kırık/döküm, yaralanma sonrası 3 haftada (W3) kaçış gecikmesini, erkeklerde 2 mm ve 5 mm prob yüksekliklerinde ve kadınlarda 5 mm prob yüksekliğinde (n = 5 / cinsiyet) taban çizgisine (BL) kıyasla anlamlı derecede arttırmıştır. Her fareden gelen veriler, koyu çizgilerle temsil edilen ortalamayla soluk siyah (erkekler) veya cayenne (dişiler) ile tasvir edilir. **/*** = p < 0,01/< 0,001 ile cinsiyet ve prob yüksekliği eşleştirilmiş taban çizgisi değeri iki yönlü ANOVA, Tukey post-hoc. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Ek Dosya 1: 3D yazıcı dosyası SpikeBed-MCA. Naylon 12 gibi uygun biyouyumlu ve yıkanabilir bir malzemeye basıldığında, SpikeBed-MCA.stl oda 2'nin tabanından çıkıntı yapan dokunsal probların platformunu üretir. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.
Ek Dosya 2: 3D Yazıcı dosya MCA_baseplate. Naylon 12 gibi uygun biyouyumlu ve yıkanabilir bir malzemeye basıldığında, MCA_baseplate.stl dokunsal probların içinden çıktığı oda 2'nin zeminini üretir. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Tüm davranış testlerinde olduğu gibi, hayvanların tedavisine uygun kullanım, randomizasyon ve körleştirme baştan sona esastır. Karmaşık davranışlara ve karar vermeye yönelik çok faktörlü girdiler göz önüne alındığında, hayvanların sıkıntıyı en aza indirirken mümkün olduğunca tutarlı bir şekilde ele alınması, alışkanlık haline getirilmesi ve test edilmesi zorunludur. Fare yerleştirme zamanlamasını oda 1'e yeniden üretmek, LED ışıklarını açmak ve bariyeri kaldırmak için de özen gösterilmelidir, çünkü buradaki farklılıklar sonraki davranışları etkileyebilir.
Şekil 1A'da gösterilen farklı sonuç ölçümlerinin birbiriyle ilişkili olduğu belirtilmelidir. Örneğin, oda 2'ye giren bir fare genellikle oda 2'nin yarı noktasını geçer ve daha sonra neredeyse her zaman oda 3'e kaçışı tamamlar. Bu, sonuç ölçümleri I, II ve IV'ün birbiriyle ilişkili olduğu anlamına gelir. Sonuç ölçümleri III ve V, sırasıyla oda 2'deki toplam bekleme süresini ve 3 odadaki bekleme süresinin oranını ölçer. Bu nedenle, bu önlemler birbirleriyle yakından ilişkilidir. Bununla birlikte, bir fare, oda 3'e yarıya kadar geçişin veya kaçışın düşük bir gecikme süresine, yüksek gecikmeye sahip olup olmadığına veya hiç gerçekleşmediğine bakılmaksızın, teorik olarak oda 2'de önemli bir bekleme süresi biriktirebilir.
Bu yöntemin çeşitli varyasyonları veya modifikasyonları bildirilmiştir. Burada listelenen farklı sonuç ölçümlerine ek olarak (Şekil 1), araştırmacılar duyarlılıktaki farklılıkları vurgulamak için prob yüksekliğinin ilerlemesini değiştirebilirler. Ara 2 mm prob yüksekliği ile istatistiksel olarak anlamlı bir fark olmadığından, fareleri sadece 0 mm ve 5 mm'de çalıştırmak daha verimli olabilir. Alternatif olarak, 2 ila 5 mm arasında bir prob yüksekliği veya 5 mm'lik bir prob yüksekliğinde tekrarlanan çalışmalar, aksi takdirde belirgin olmayan farklılıkların maskesini düşürmeye başlayabilir. Ek olarak, her odada bekleme süresinin değerlendirilmesi, motivasyon ve aktivitenin bir okuması olarak kullanılabilir. Bu, bazı farelerin hızlı bir şekilde oda 3'e doğru koştuğu ancak daha sonra daha fazla keşfetmek için oda 1'e geri döndüğü durumlarda yararlı olabilir. Bu gibi durumlarda, 3 numaralı odaya giriş gecikmesi tek başına bu inceliği yakalamaz. Test kesme süresini burada belirlenen 2 dakikalık sınırın ötesine yükseltmek, bazı araştırmacılar için de faydalı olabilir. Son olarak, aynı hayvanların tekrarlanan testlerinin (burada açıklanan üç defadan fazla) veya daha sık test etmenin (testler arasında 4-7 günden az) alışkanlık veya öğrenme etkileri getirebileceği olasılığını göz ardı edemeyiz. Bu nedenlerden dolayı, naif, manipüle edilmemiş kontrol gruplarının her zaman noktasında dahil edilmesi teşvik edilmektedir. Nihayetinde, davranıştaki değişikliklerin ağrı modeline özgü olması muhtemeldir ve bu ve diğer ağrı modellerinde daha fazla araştırma yapılmasını gerektirir.
Burada kullanılan ağrıya neden olan modeller (CFA, SNI, kırık / döküm) tipik olarak diğer ağrı davranış testlerinde aşırı duyarlılık ile ilişkilidir, bu da kaçınma / kaçış gecikmesindeki artışa karşılık gelir. MCA testi, duyusal keskinlik kaybını da tespit edebilir (örneğin, oda 2'de harcanan zamanın artmasıyla), ancak bu resmi olarak test edilmemiştir. MCA'nın dikkate alınmasını gerektiren bazı sınırlamaları vardır. Parlak ışığa karşı isteksizlik, 2 numaralı odaya girişi motive etmenin önemli bir yoludur ve bu nedenle sonraki çatışmaların itici gücüdür. Belirli bir fare modeliyle ilişkili olarak, parlak ışığa karşı isteksizliği (örneğin, görme bozukluğu) değiştirebilecek herhangi bir patolojik özellik, bu testi kullanmadan önce dikkatlice düşünülmelidir. Anksiyetenin gecikmeden kaçmaya katkısı da sistematik olarak test edilmemiştir, ancak kronik enflamatuar ve nöropatik ağrı modellerinin diğer testlerde farelerde anksiyete benzeri davranış belirtileri gösterdiği bildirilmiştir, bununla ilgili bir tartışma devam etmektedir15,16. Bununla birlikte, ağrıya bağlı kaygının bu davranışsal sonuçlara katkısı şu anda doğrulanamaz veya göz ardı edilemez. MCA'nın sonuç ölçütlerine birden fazla girdisi olduğundan, bu dikkate alınması gereken daha fazla potansiyel karışıklıkla birlikte gelir.
Özetle, MCA testi, fare modellerinde ağrı duyarlılığının refleksif olmayan bir okumasını sağlar. Sonuç ölçütleri refleksif duyarlılık dışındaki faktörlerden etkilenir ve ağrı duyarlılığı ve duyuşsal/motivasyonel durumun bileşik bir ölçüsünü sağlar. Her testi çalıştırmak için gereken süre ve gereken beceri ve özel ekipman seviyesi, yürüyüş analizi veya şartlı yer tercihi gibi diğer refleksif olmayan ağrı ölçümleriyle olumlu bir şekilde karşılaştırılır 5,13. Hala biraz yeni olmasına rağmen, yaklaşım ağırlıklı olarak sıçanlarda olmak üzere birden fazla araştırmacı ekibi tarafından benimsenmiş ve bağımsız olarak doğrulanmıştır. Parsiyel siyatik sinir ligasyonu sıçanlarda çıkış latansı17'yi ve morfine bağımlı yoksunluğu arttırdı7. Sıçanlarda yapılan bir başka çalışmada, sıçanlarda omurilik yaralanması ve kronik daralma yaralanması modellerini kullanarak geçiş sayısının sayılmasının yararlı birsonuç ölçüsü 8 olarak hizmet edebileceği öne sürülmüştür. En önemlisi, bu çalışma aynı zamanda sahte cerrahi kontrollerde probdan kaçınmada bir artış olduğunu tespit etti ve bu da sahte / araç kontrollerinin yanına naif bir grubun dahil edilmesinin garanti edildiğini gösterdi. MCA'nın gelecekteki uygulamaları, fare suşları ve / veya ağrı modelleri arasındaki varyasyona, kaygının tahlil performansı üzerindeki etkisine ve zararlı uyaranlara davranışsal adaptasyonlardaki farklılıkları daha iyi anlamak için duruş analizinin veya yürüyüş kinematiğinin entegrasyonuna odaklanabilir.
Preklinik fare çalışmaları ile yeni terapötiklerin geliştirilmesi arasındaki translasyonel boşluk, endişe kaynağı olmaya devam etmektedir. Bunu akılda tutarak, MCA testi ağrı araştırmalarında mevcut araçları tamamlar ve ağrının birçok duyusal ve duygusal boyutunun daha eksiksiz bir resmini vermeye yardımcı olur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklanacak ilgili çıkar çatışmaları yoktur.
Acknowledgments
GM, NDSEG Graduate Fellowship tarafından desteklenmektedir. VLT, NIH NIGMS hibe #GM137906 ve Rita Allen Vakfı tarafından desteklenmektedir. AJS, Savunma Bakanlığı hibeleri W81XWH-20-1-0277, W81XWH-21-1-0197 ve Rita Allen Vakfı tarafından desteklenmektedir. Washington Üniversitesi Tıp Fakültesi'nden Dr. Alexxai Kravitz'e, oda 2 kat ve prob plakası için 3D yazıcı dosyalarını tasarladığı ve serbestçe kullanılabilir hale getirdiği için minnettarız.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 32.8ft 3000K-6000K Tunable White LED Strip Lights, Dimmable Super Bright LED Tape Lights with 600 SMD 2835 LEDs | Lepro | SKU: 410087-DWW-US | For lighting chamber 1. https://www.lepro.com/32ft-dimmable-tunable-white-led-strip-lights.html |
| 3D printed 'spike bed' and 'chamber 2 floor' | Shapeways | N/A | Optional, for mechanical probes as an alternative to blunted map pins. |
| 70% ethanol | Various | N/A | To clean MCA between mice. |
| Acryl-Hinge 2 | TAP Plastics | N/A | for attaching chamber lids to rear walls. https://www.tapplastics.com/product/plastics/handles_hinges_latches/acryl_hinge_2/122 |
| Chemcast Cast Acrylic Sheet, Clear | TAP Plastics | N/A | 3mm thick. For front wall of chamber 1. https://www.tapplastics.com/product/plastics/cut_to_size_plastic/acrylic_sheets_cast_clear/510 |
| Chemcast Cast Transparent Colored Acrylic, Transparent Dark Red - 50% | TAP Plastics | N/A | 3mm thick. 50% light transmission. For walls and lids of chambers 2 and 3. https://www.tapplastics.com/product/plastics/cut_to_size_plastic/acrylic_sheets_transparent_colors/519 |
| Chemcast Translucent & Opaque Colored Cast Acrylic, Sign Opaque White - 0.1% | TAP Plastics | N/A | 3mm thick. For side walls and lid of chamber 1. https://www.tapplastics.com/product/plastics/cut_to_size_plastic/acrylic_sheets_color/341 |
| Disinfectant (e.g. Quatricide) | Pharmacal Research Laboratories, Inc. | 65020F | To disinfect MCA at the end of a testing session. |
| Dry-erase markers and board | Various | N/A | To add experimental info to the beginning of video footage. |
| Map pins | Various | N/A | Optional, for mechanical probes. Use sandpaper to blunt sharp points before use. Can be used in place of 3D-printed parts. |
| Paper towels | Various | N/A | To clean/disinfect MCA. |
| SCIGRIP Weld-On #3 Acrylic Cement | TAP Plastics | N/A | For assembling acrylic sheets into chambers and affixing hinges. https://www.tapplastics.com/product/repair_products/plastic_adhesives/weld_on_3_cement/131 |
| Stopwatch | Various | N/A | To record escape latencies/dwell times in real-time or from recorded video. |
| Timer | Various | N/A | To ensure LED turn-on, barrier removal and test completion are timed consistently. |
| Video camera | Various | HDRCX405 Handycam Camcorder | To record mouse behavior in the MCA device. Can be substituted with any consumer-grade video camera capable of 1080p resolution. |
| Tripod | Famall | N/A | Any tripod that can hold the camera at bench height for recording MCA footage is acceptable. |
References
- Hargreaves, K., Dubner, R., Brown, F., Flores, C., Joris, J. A new and sensitive method for measuring thermal nociception in cutaneous hyperalgesia. Pain. 32 (1), 77-88 (1988).
- Chaplan, S. R., Bach, F. W., Pogrel, J. W., Chung, J. M., Yaksh, T. L. Quantitative assessment of tactile allodynia in the rat paw. Journal of Neuroscience Methods. 53 (1), 55-63 (1994).
- Sheahan, T. D., et al. Inflammation and nerve injury minimally affect mouse voluntary behaviors proposed as indicators of pain. Neurobiology of Pain. 2, 1-12 (2017).
- Wodarski, R., et al. Cross-centre replication of suppressed burrowing behaviour as an ethologically relevant pain outcome measure in the rat: a prospective multicentre study. Pain. 157 (10), 2350-2365 (2016).
- King, T., et al. Unmasking the tonic-aversive state in neuropathic pain. Nature Neuroscience. 12 (11), 1364-1366 (2009).
- Harte, S. E., Meyers, J. B., Donahue, R. R., Taylor, B. K., Morrow, T. J. Mechanical Conflict System: A Novel Operant Method for the Assessment of Nociceptive Behavior. PLoS One. 11 (2), 0150164 (2016).
- Pahng, A. R., Edwards, S. Measuring Pain Avoidance-Like Behavior in Drug-Dependent Rats. Current Protocols in Neuroscience. 85 (1), 53 (2018).
- Odem, M. A., et al. Sham surgeries for central and peripheral neural injuries persistently enhance pain-avoidance behavior as revealed by an operant conflict test. Pain. 160 (11), 2440-2455 (2019).
- LaBuda, C. J., Fuchs, P. N. A behavioral test paradigm to measure the aversive quality of inflammatory and neuropathic pain in rats. Experimental Neurology. 163 (2), 490-494 (2000).
- LaBuda, C. J., Fuchs, P. N. Morphine and gabapentin decrease mechanical hyperalgesia and escape/avoidance behavior in a rat model of neuropathic pain. Neuroscience Letters. 290 (2), 137-140 (2000).
- Vichaya, E. G., et al. Motivational changes that develop in a mouse model of inflammation-induced depression are independent of indoleamine 2,3 dioxygenase. Neuropsychopharmacology. 44 (2), 364-371 (2019).
- Hascoët, M., Bourin, M., Nic Dhonnchadha, B. A. The mouse light-dark paradigm: a review. Progress in Neuropsychopharmacology & Biological Psychiatry. 25 (1), 141-166 (2001).
- Shepherd, A. J., Mohapatra, D. P. Pharmacological validation of voluntary gait and mechanical sensitivity assays associated with inflammatory and neuropathic pain in mice. Neuropharmacology. 130, 18-29 (2018).
- Huck, N. A., et al. Temporal Contribution of Myeloid-Lineage TLR4 to the Transition to Chronic Pain: A Focus on Sex Differences. Journal of Neuroscience. 41 (19), 4349-4365 (2021).
- Pitzer, C., La Porta, C., Treede, R. D., Tappe-Theodor, A. Inflammatory and neuropathic pain conditions do not primarily evoke anxiety-like behaviours in C57BL/6 mice. European Journal of Pain. 23 (2), 285-306 (2019).
- Sieberg, C. B., et al. Neuropathic pain drives anxiety behavior in mice, results consistent with anxiety levels in diabetic neuropathy patients. Pain Reports. 3 (3), 651 (2018).
- Meuwissen, K. P. V., van Beek, M., Joosten, E. A. J. Burst and Tonic Spinal Cord Stimulation in the Mechanical Conflict-Avoidance System: Cognitive-Motivational Aspects. Neuromodulation. 23 (5), 605-612 (2020).
