本方案描述了一种利用可重复使用的单个细胞进行多轮表观基因组分析的单细胞方法。这种可重复使用的单个细胞允许在同一个单细胞中分析多种表观遗传标记，并对结果进行统计学验证。
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摘要
摘要
目前的单细胞表观基因组分析设计为一次性使用。细胞在单次使用后即被丢弃，无法在同一个细胞中分析多个表观遗传标记，且需要依赖其他细胞的数据来区分单个细胞中的信号与实验背景噪声。本文描述了一种可对同一个个细胞进行多次表观基因组分析的重复使用方法。
在该实验方法中，首先将细胞蛋白锚定在聚丙烯酰胺聚合物上，而非将其交联至蛋白和DNA上，从而减轻了结构偏差。这一关键步骤使得对同一个单细胞可进行多次重复实验。接着，将带有邻近连接接头序列的随机引物退火至基因组DNA，并利用DNA聚合酶通过延伸反应将基因组序列添加至引物上。随后，在同一个单细胞中，分别用携带不同DNA探针标记的针对表观遗传标记物的抗体和对照IgG抗体结合各自的靶标。
通过添加一段连接DNA，使其与随机引物的支架序列以及抗体-DNA探针互补，从而诱导随机引物与抗体之间的邻近连接。该方法将抗体信息与邻近的基因组序列整合到单一的邻近连接DNA产物中。通过允许对同一个单细胞进行重复实验，此方法可提高稀有细胞的数据密度，并仅利用同一细胞内的IgG和抗体数据进行统计分析。采用该方法制备的可重复使用单细胞可保存至少数月，并可在后续重新使用，以拓展表观遗传学特征分析并提高数据密度。该方法为研究人员及其研究项目提供了灵活性。
引言
单细胞技术正在进入单细胞多组学时代，该时代整合了多种独立的单细胞组学技术1。近年来，单细胞转录组学已与检测染色质可及性（scNMT-seq2 和 SHARE-seq3）或组蛋白修饰（Paired-seq4 和 Paired-Tag5）的方法相结合。最近，单细胞转录组学和蛋白质组学进一步与染色质可及性检测实现了整合（DOGMA-seq6）。这些方法均采用基于转座酶的标记技术来检测染色质可及性或组蛋白修饰。
基于转座酶的方法可切割基因组DNA，并在基因组DNA片段末端添加DNA条形码。每个被切割的基因组片段最多只能连接两个DNA条形码（即每个切割位点对应一个表观遗传标记），且切割位点处的基因组DNA会丢失。因此，基于切割的方法在检测的表观遗传标记数量与信号密度之间存在权衡。这限制了在同一单细胞中对多个表观遗传标记的分析。为克服这一问题，已开发出一种不切割基因组DNA的单细胞表观基因组学方法7,8。
除了上述由切割引起的问 题之....
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方案
注意：该方法的示意图见图1。
图1：实验方案流程的示意图。 步骤7.2–13通过示意图进行说明。每一行代表方案中的一个步骤。以绿色显示的细胞蛋白是基于晶体结构（PDB: 6M4G）生成的人类核小体。请点击此处查看该图的放大版本。
1. 脱盐柱的平衡
注意：脱盐离心柱按以下步骤进行平衡。平衡后的脱盐离心柱用于步骤 2.1、3.4 和 4.6 中。
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结果
使用第8步所述方案制备K562单细胞（见图5）。将单细胞包埋于聚丙烯酰胺微球的外层。采用DNA嵌入染料对细胞DNA进行染色并可视化观察。
图 5：生成的可重复使用单细胞。 细胞使用DNA嵌入染料染色（绿色荧光）。白色箭头指示嵌入聚丙烯酰胺微珠外层的单细胞。可重复使用的单细胞被置于96孔平底板中。图像由BZ-X710扫描显微镜拍摄。比例尺 = 1 mm。
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讨论
本文介绍了近期报道的利用可重复使用单细胞进行单细胞多表观基因组分析的逐步实验方案7。在接下来的段落中，我们将讨论该方案的关键要点，并强调其中可能存在的局限性。
在整个实验方案中（从步骤 7.2 到 13），一个关键点是避免 DNase 污染。单个细胞仅含有两份基因组 DNA，因此基因组 DNA 的损伤会显著降低信号数量。避免 DNase 污染对于保护基因组 DNA 的完整性至关重要。
试剂穿过细胞膜/细胞壁的通透性在整个实验过程中也至关重要。REpi-seq 被设计用于在单细胞水平上分析小鼠和人类细胞的表观基因组。该实验方法的最佳条件可能因不同细胞类型以及核膜对各种试剂的通透性差异而有所不同。因此，当该方法应用于小鼠和人类细胞以外的细胞（如植物细胞、酵母和细菌）时，需对每一步的实验条件进行优化。
我们认为，第9.5步（退火第一个随机引物）的一个关键点在于基因组DNA变性后的快速冷却速度。变性后若缓慢渐进地冷却，可能会降低随机.......
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披露
Ohnuki 博士和 Tosato 博士是专利“用于制备可重复使用的单细胞以及用于分析单细胞表观基因组、转录组和基因组的方法”（EP3619307 和 US20200102604）的共同发明人。该专利申请部分基于与本文所述技术相关的初步研究结果。本专利申请中描述并主张的发明是在发明人作为美国政府全职雇员期间完成的。因此，根据《美国联邦法规》第45篇第7部分，该专利申请的全部权利、所有权和权益已依法归属或应依法归属于美国政府。美国政府根据《美国法典》第15篇的规定，将其所获部分专利使用费授予其雇员发明人。 § 3710c
致谢
我们感谢 David Sanchez-Martin 博士和 Christopher B. Buck 博士在本项目构思阶段提出的宝贵意见。我们还感谢美国国立卫生研究院国家癌症研究所癌症研究中心基因组学核心实验室在初步实验中提供的帮助，以及癌症研究中心协作生物信息资源（CCR, NCI, NIH）在计算分析方面给予的建议。我们感谢 Anna Word 女士在优化本方法所用DNA聚合酶过程中提供的协助。本研究使用了美国国立卫生研究院高性能计算生物云集群（NIHHPC Biowulf cluster，http://hpc.nih.gov）的计算资源。本项目得到了国家癌症研究所癌症研究中心院内计划、国家癌症研究所主任创新奖（#397172）以及美国国家癌症研究所合同编号 HHSN261200800001E 项下联邦资金的资助。我们感谢 Tom Misteli 博士、Carol Thiele 博士、Douglas R. Lowy 博士以及细胞肿瘤学实验室全体成员提出的富有建设性的意见。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 10x CutSmart 缓冲液 | New England BioLabs | B6004 | 10x 消化缓冲液 |
| 200 proof 乙醇 | 华纳-格雷厄姆公司 | 200 proof | 乙醇 |
| 5-羟甲基胞嘧啶（5-hmC）单克隆抗体 [HMC/4D9] | Epigentek | A-1018-100 | 抗-5hmC |
| 吖啶橙/碘化丙啶染色 | Logos Biosystems | F23001 | 细胞计数仪 |
| 丙烯酰胺溶液，40% 溶于 H2O，分子生物学用 | MilliporeSigma | 01697-500ML | 40% 丙烯酰胺溶液 |
| 一体化荧光显微镜BZ-X710 | Keyence | BZ-X710 | 扫描显微镜 |
| Amicon Ultra-0.5 离心滤过装置 | MilliporeSigma | UFC510024 | 超滤离心管 |
| 分子生物学用过硫酸铵 | MilliporeSigma | A3678-100G | 过硫酸铵粉末 |
| 无水 DMF | Vector Laboratories | S-4001-005 | 无水 N,N-二甲基甲酰胺（DMF） |
| 抗RNA聚合酶II CTD重复序列YSPTSPS（磷酸化S5）抗体 [4H8] | Abcam | ab5408 | 抗Pol II |
| 抗TRAP220/MED1（磷酸化T1457）抗体 | Abcam | ab60950 | 抗Med1 |
| BciVI | New England BioLabs | R0596L | BciVI |
| 牛血清白蛋白溶液，20 mg/mL，溶于 H2O，低生物负载，无蛋白酶，用于分子生物学 | MilliporeSigma | B8667-5ML | 20% BSA（表7） |
| Bst DNA聚合酶，大片段 | New England BioLabs | M0275L | Bst DNA聚合酶 |
| BT10 系列 10 µl 屏障尖端 | NEPTUNE | BT10 | P10 低吸附吸头 |
| CellCelector | 自动化实验室解决方案 | N/A | 自动化单细胞挑选机器人 |
| CellCelector 4 nl 微孔板，用于单细胞克隆，型号 S200-100 100K，24 孔，超低吸附 | 自动化实验室解决方案 | CC0079 | 4 nL 纳米孔板 |
| 氯仿 | MilliporeSigma | 氯仿 | |
| 康宁科斯特96孔细胞培养处理平底微孔板 | 康宁 | 3596 | 平底96孔板 |
| Deep Vent (exo-) DNA聚合酶 | New England BioLabs | M0259L | 外泌体- DNA聚合酶 |
| DNA LoBind 离心管，0.5 mL | Eppendorf | 30108035 | 0.5 mL DNA低吸附管 |
| DNA寡核苷酸，第一随机引物 | Integrated DNA Technologies | N/A，参见表3 | 第一随机引物 |
| DNA寡核苷酸，第二轮随机引物 Cell#01 | Integrated DNA Technologies | N/A，参见表3 | 第二轮随机引物 |
| DNA寡核苷酸，第二轮随机引物 Cell#02 | Integrated DNA Technologies | N/A，参见表3 | 第二轮随机引物 |
| DNA寡核苷酸，第二轮随机引物 细胞编号03 | Integrated DNA Technologies | N/A，参见表3 | 第二轮随机引物 |
| DNA寡核苷酸，第二轮随机引物 Cell#04 | Integrated DNA Technologies | N/A，参见表3 | 第二轮随机引物 |
| DNA寡核苷酸，第二轮随机引物 Cell#05 | Integrated DNA Technologies | N/A，参见表3 | 第二轮随机引物 |
| DNA寡核苷酸，第二轮随机引物 细胞编号06 | Integrated DNA Technologies | N/A，参见表3 | 第二轮随机引物 |
| DNA寡核苷酸，第二轮随机引物 Cell#07 | Integrated DNA Technologies | N/A，参见表3 | 第二轮随机引物 |
| DNA寡核苷酸，第二轮随机引物 细胞#08 | Integrated DNA Technologies | N/A，参见表3 | 第二轮随机引物 |
| DNA寡核苷酸，第二轮随机引物 细胞#09 | Integrated DNA Technologies | N/A，参见表3 | 第二轮随机引物 |
| DNA寡核苷酸，第二轮随机引物 细胞#10 | Integrated DNA Technologies | N/A，参见表3 | 第二轮随机引物 |
| DNA寡核苷酸，第二轮随机引物 细胞#11 | Integrated DNA Technologies | N/A，参见表3 | 第二轮随机引物 |
| DNA寡核苷酸，第二轮随机引物 细胞#12 | Integrated DNA Technologies | N/A，参见表3 | 第二轮随机引物 |
| DNA寡核苷酸，第二条合成引物 | Integrated DNA Technologies | N/A，参见表3 | 第二条合成引物 |
| DNA 寡核苷酸，连接接头 | Integrated DNA Technologies | N/A，参见表3 | 连接接头 |
| DNA寡核苷酸，逆转录引物 | Integrated DNA Technologies | N/A，参见表3 | 反转录引物 |
| DNase I（无RNase） | 新英格兰生物实验室 | M0303L | DNase I（无RNase，4 U） |
| DNase I 反应缓冲液 | New England BioLabs | B0303S | 10x DNase I 缓冲液（NEB） |
| dNTP混合液（各10 mM） | 赛默飞世尔科技 | R0192 | 10 mM dNTPs |
| 胎牛血清，美国来源，已灭活处理 | MilliporeSigma | F4135-500ML | 胎牛血清 |
| HiScribe T7 高产 RNA 合成试剂盒 | 新英格兰生物实验室 | E2040S | 体外转录主混合液 |
| 组蛋白H3K27ac抗体 | 活性基序 | 39133 | 抗H3K27ac |
| 组蛋白H3K27me3抗体 | 活性基序 | 39155 | 抗H3K27me3 |
| 兔血清中的IgG | Millipore Sigma | I5006-10MG | 对照 IgG |
| 四氧化三铁磁性纳米粉末，平均粒径30 nm（TEM），N-羟基琥珀酰亚胺酯功能化 | MilliporeSigma | 747467-1G | NHS酯功能化的30 nm氧化铁粉末 |
| K-562 | 美国典型培养物保藏中心（ATCC） | CCL-243 | 细胞 |
| 线性聚丙烯酰胺（5 mg/mL） | 赛默飞世尔科技 | AM9520 | 线性丙烯酰胺 |
| LUNA-FL 双荧光细胞计数仪 | Logos Biosystems | L20001 | 细胞计数仪 |
| LUNA 细胞计数板，50 片 | Logos Biosystems | L12001 | 细胞计数仪 |
| 矿物油，生物试剂，分子生物学用，轻质油 | MilliporeSigma | M5904-500ML | 矿物油 |
| N,N,N′，N′-分子生物学用四甲基乙二胺 | MilliporeSigma | T7024-100ML | N,N,N′，N′四甲基乙二胺 |
| NaCl (5 M)，无RNase | 赛默飞世尔科技 | AM9760G | 5M NaCl |
| NanoDrop Lite | 赛默飞世尔科技 | 2516 | 微量分光光度计 |
| NEST 2 mL 96孔深孔板，V型底 | Opentrons | N/A | 96孔深孔板，每孔2 mL |
| 无裙边96孔PCR板 | Genesee Scientific | 27-405 | 96孔PCR板 |
| NuSive GTG 琼脂糖 | Lonza | 50081 | 琼脂糖 |
| OmniPur 丙烯酰胺：双丙烯酰胺 19:1，40% 溶液 | MilliporeSigma | 1300-500毫升 | 40%丙烯酰胺/双丙烯酰胺 |
| OT-2 实验室机器人 | Opentrons | OT2 | 自动化液体处理机器人 |
| 多聚甲醛，电镜级，纯化，20% 水溶液 | 电子显微镜科学公司 | 15713 | 20% 甲醛 |
| PBS（10倍浓度），pH 7.4 | 赛默飞世尔科技 | 70011044 | 10x PBS |
| PIPETMAN Classic P1000 | GILSON | F123602 | 一个P1000移液器 |
| 蛋白低吸附管，1.5 mL | Eppendorf | 925000090 | 1.5 mL 蛋白低吸附管 |
| QIAgen 胶回收试剂盒 | Qiagen | 28706 | 一个P1000移液器 |
| Quant-iT PicoGreen dsDNA 检测试剂盒 | 赛默飞世尔科技 | P11495 | dsDNA特异性嵌入染料 |
| 快速连接试剂盒 | New England BioLabs | M2200L | T4 DNA连接酶（NEB） |
| RNaseOUT 重组核糖核酸酶抑制剂 | 赛默飞世尔科技 | 10777019 | RNase抑制剂 |
| S-4FB 交联剂（DMF 可溶） | Vector Laboratories | S-1004-105 | 琥珀酰亚胺基-4-甲醛苯甲酸酯（S-4FB） |
| S-HyNic | Vector Laboratories | S-1002-105 | 乙酰丙酮腙琥珀酰亚胺-6-酰肼基烟酸酯（S-HyNic） |
| 醋酸钠，3 M，pH 5.2，分子生物学级 | MilliporeSigma | 567422-100ML | 3M 醋酸钠（pH 5.2） |
| 碳酸氢钠，1 M 缓冲液，pH 8.5 | Alfa Aesar | J60408 | 1 M 碳酸氢钠缓冲液，pH 8.5 |
| 分子生物学用磷酸氢二钠 | MilliporeSigma | S3264-250G | Na2HPO4 |
| 分子生物学用磷酸二氢钠 | MilliporeSigma | S3139-250G | NaH2PO4 |
| SuperScript IV 逆转录酶 | 赛默飞世尔科技 | 18090050 | 逆转录酶 |
| SYBR Gold 核酸凝胶染料（DMSO 中 10,000 倍浓缩液） | 赛默飞世尔科技 | S11494 | 一种用于DNA的嵌入染料 |
| T4 DNA连接酶反应缓冲液 | New England BioLabs | B0202S | 10x T4 DNA连接酶反应缓冲液 |
| ThermoPol反应缓冲液套装 | New England BioLabs | B9004S | 10倍TPM-T缓冲液（Tris-HCl/氯化钾/硫酸镁/Triton X-100） |
| TRIzol LS 试剂 | 赛默飞世尔科技 | 10296-028 | 异硫氰酸胍-苯酚-氯仿抽提法 |
| TruSeq Nano DNA文库制备试剂盒 | Illumina | 20015965 | DNA文库制备试剂盒（另请参阅生产商说明书） |
| Ultramer DNA 寡核苷酸，Anti-5hmC_Ab#005 | Integrated DNA Technologies | N/A，参见表3 | 用于抗体的氨基修饰DNA探针 |
| Ultramer DNA 寡核苷酸，Anti-H3K27ac_Ab#002 | Integrated DNA Technologies | N/A，参见表3 | 用于抗体的胺基修饰DNA探针 |
| Ultramer DNA 寡核苷酸，Anti-H3K27me3_Ab#003 | Integrated DNA Technologies | N/A，参见表3 | 用于抗体的氨基修饰DNA探针 |
| Ultramer DNA 寡核苷酸，Anti-Med1_Ab#004 | Integrated DNA Technologies | N/A，参见表3 | 用于抗体的氨基修饰DNA探针 |
| Ultramer DNA 寡核苷酸，抗 Pol II_Ab#006 | Integrated DNA Technologies | N/A，参见表3 | 用于抗体的氨基修饰DNA探针 |
| Ultramer DNA 寡核苷酸，对照 IgG_Ab#001 | Integrated DNA Technologies | N/A，参见表3 | 用于对照 IgG 的胺基修饰 DNA 探针 |
| UltraPure 0.5 M EDTA，pH 8.0 | 赛默飞世尔科技 | 15575020 | 0.5 M EDTA，pH 8.0 |
| UltraPure 无DNase/RNase纯水 | 赛默飞世尔科技 | 10977023 | 超纯水 |
| Zeba™ 脱盐柱，7K 分子量截留值，0.5 mL | 赛默飞世尔科技 | 89882 | 脱盐柱 |
参考文献
- Perkel, J. M. Single-cell analysis enters the multiomics age. Nature. 595 (7868), 614-616 (2021).
- Clark, S. J., et al. scNMT-seq enables joint profiling of chromatin accessibility DNA methylation and transcription in single cells. Nature Com....
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