Summary
Det overordnede målet med dette papiret er å beskrive hvordan man skal prestere i ovo intracellulær injeksjon av eksogene materialer i kyllingembryoer. Denne tilnærmingen er veldig nyttig for å studere utviklingsbiologien til kyllingembryoer.
Abstract
Som et klassisk modellsystem for embryobiologi har kyllingembryoet blitt brukt til å undersøke embryonal utvikling og differensiering. Å levere eksogene materialer til kyllingembryoer har en stor fordel for å studere genfunksjon, transgen avl og chimera-forberedelse under embryonal utvikling. Her viser vi metoden for i ovo intravaskulær injeksjon der eksogene materialer som plasmidvektorer eller modifiserte primordiale bakterieceller (PGCs) kan overføres til donor kyllingembryoer i tidlige utviklingsstadier. Resultatene viser at den intravaskulære injeksjonen gjennom dorsal aorta og hode gjør det mulig for injiserte materialer å spre seg inn i hele embryoet gjennom blodsirkulasjonssystemet. I den presenterte protokollen ble effekten av eksogen plasmid og lentiviral vektorintroduksjon, og koloniseringen av injiserte eksogene PGCer i mottakerens gonad, bestemt ved å observere fluorescens i embryoene. Denne artikkelen beskriver detaljerte prosedyrer for denne metoden, og gir dermed en utmerket tilnærming til å studere genfunksjon, embryo- og utviklingsbiologi og gonad-chimerisk kyllingproduksjon. Til slutt vil denne artikkelen tillate forskere å utføre i ovo intravaskulær injeksjon av eksogene materialer i kyllingembryoer med stor suksess og reproduserbarhet.
Introduction
Kyllingembryoer har blitt mye brukt i århundrer i utviklingsmessige, immunologiske, patologiske og andre biologiske applikasjoner 1,2,3. De har mange iboende fordeler i forhold til andre dyremodeller i studiet av toksikologi og cellebiologi4. Kyllingembryoer er lett tilgjengelige og kan manipuleres in vitro og observeres direkte på ethvert utviklingsstadium, noe som gir et praktisk embryoforskningsmodellsystem.
Generelt har nåværende kyllingembryoleveringsmetoder som elektrotransfeksjon og subgerminal-hulromsinjeksjon begrensninger som krav til spesialutstyr og et designet program, og ineffektivitet på grunn av tilstedeværelsen av eggeplomme og albumen 5,6,7. Her viser vi en enkel og effektiv håndteringsmetode for å levere eksogene materialer til kyllingembryoer. Dette kan være et kraftig verktøy som brukes i studiet av utviklingsbiologi. De injiserte materialene sprer seg til hele embryoet via blodsirkulasjonen. Under den tidlige utviklingen av kyllingembryoer kunne PGC-ene migrere gjennom blod, kolonisere kjønnsryggen og deretter utvikle seg til gameter, noe som gir en verdifull mulig vei for å levere eksogene materialer8. Nå har denne metoden blitt mye brukt i studiet av genfunksjon, embryo og utviklingsbiologi, og chimerisk og transgen kyllingproduksjon 9,10,11.
I ovo intravaskulær injeksjon i kyllingembryoer er en veletablert og vanlig brukt metode 12,13,14. I dette dokumentet viser vi en omfattende beskrivelse av denne protokollen, inkludert injeksjonsmaterialer, steder, dosering og representative resultater.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle prosedyrer som involverer pleie og bruk av dyr i samsvar med U.S. National Institute of Health retningslinjer (NIH Pub. Nr. 85-23, revidert 1996) og kylling embryo protokoller ble godkjent av Laboratory Animal Management og Experimental Animal Ethics Committee av Yangzhou University, Kina (No.201803124).
1. Befruktet eggsamling og forberedelse
MERK: I motsetning til pattedyr har kyllingen millioner av follikler i en enkelt eggstokk, men bare noen få av disse folliklene er modne nok til å eggløsning. Hver follikkel inneholder en oocytt eller bakteriecelle. Så snart follikkelen modnes og frigjør eggeplommen, er den innlemmet i trakten til egglederen. Når follikkelen kommer inn i oviduktens jugulære underliv, binder sæd til egget i hønsens kropp, og kalsiumet i hønsens kropp danner et skall som omslutter det befruktede egget og danner et mykt skallet egg i kroppen. Kalsiumskallet tykner gradvis til egget produseres.
- Samle befruktede egg fra en lokal leverandør eller institusjon, som kan lagres ved 16°C i 1 uke.
MERK: Den høye lagringstemperaturen vil hjelpe embryoet til å utvikle seg, mens den lave temperaturen vil redusere embryoens levedyktighet. Embryoene vil ikke utvikle seg hvis lagringstiden er for lang. - Skrubb eggeskallet mykt og sakte med 75% etanol før du overfører eggene til inkubatoren.
- Plasser eggene sidelengs, pent på et stativ i en inkubator ved 37,8 °C og 60 % fuktighet. Etter 60 h inkubasjon (HH trinn 17) vil embryoer utvikle synlige blodkar og hjertet begynner å slå15.
MERK: Etter 2 dager med inkubasjon vises små primordiale prikker, hjertets tidlige stadium. Denne prosessen kalles kirsebærbeading. På ~ 2,5 dager dannes hjerte- og andre kroppssegmenter med synlige kar.
2. Tilberedning før injeksjon
- Forbered glass kapillærer som skal brukes som nåler. Før injeksjonen trekker du 90 mm glasskapillær med en ytre diameter på 1 mm og en indre diameter på 0,6 mm ved hjelp avtrekkeren. Bryt spissene ved hjelp av tang (vinkelen på glasskapillæren er vanligvis 45°) og steriliser kapillærene under UV-lys i 2 timer.
- Forbered eksogene materialer som plasmider, pakkede lentivirus og PGCer.
- Bland forsiktig den plasmide pEGFP-N1 (en forbedret GFP som uttrykker plasmid, 1μg / μL) med liposome med et 1: 3-forhold (m / v). Tilsett vann for å oppnå en endelig DNA-konsentrasjon på 10 ng/μL. La DNA-blandingen sitte ved 37 °C i 20 minutter før injeksjon.
- Tine virus på is før injeksjon. Titeret av lentivirus som brukes til injeksjon bør være over 5 x 106 Tu / ml.
- Fortynn foreldre eller modifiserte gonad PGCer (E4.5, HH trinn 24) til 2,000-5,000 celler / μL.
MERK: Her har vi vist injeksjonsprosedyren ved hjelp av trypan blå.
3. Vindu
- Før du utsetter embryoene, steriliser dem ved å tørke forsiktig og mykt overflaten av eggeskallene med 75% alkohol ved hjelp av en bomullsdott, og sørg for å sterilisere eggets stumpe kant grundig.
- Etter steriliseringen trykker du forsiktig på den stumpe enden med tang for å lage et lite vindu (0,5 cm x 0,5 cm) på eggeskalloverflaten for å eksponere embryoet. Fjern embryomembranen og legg deretter egget på holderen under disseksjonsmikroskopet.
4. Injeksjon
- Se etter blodkar under mikroskopet og juster fokuset på disseksjonsmikroskopet for å finne embryoet, og finn deretter blodkaret klar til injeksjon.
- Fyll glassnålen med den eksogene løsningen (plasmid, lentivirus eller PGCer) ved hjelp av en pipette sakte, og unngå luftbobler i nålen.
- Sikt nålen med eksogen løsning på blodkaret, med nålen parallelt med blodkaret som injiseres.
- Sett forsiktig den fylte nålen inn i karet og slå på pumpen for å løse ut løsningen (vanligvis er det injiserte volumet ~ 1-5 μL) under mikroskopet. Luftpumpetrykket skal være lavt nok til å forhindre ødeleggelse av kar, da det for høye lufttrykket vil skade blodårene som fører til høyhastighetsstrøm.
- Når den eksogene løsningen injiseres i fartøyet, må du sørge for at fartøyets farge blir til løsningsfargen og gjenoppretter til rødt i 2-5 s, noe som indikerer at den eksogene løsningen leveres til fartøyet. På dette tidspunktet kommer løsningen inn i arterien, og med hjertets slag sirkuleres tilbake til embryoet gjennom arterien, og deretter til venen.
MERK: Det er to injeksjonssteder for vaskulær injeksjon (figur 1B): Den ene er hodet, hvor den eksogene løsningen injiseres fra venen i embryoets hode og inn i hjertet gjennom blodstrømmen, og sirkulerer deretter til hele embryoet med hjerteslag (figur 1B, pil 1). En annen er gjennom dorsal aorta av embryoblod; den eksogene løsningen injiseres og sprer seg til hele embryoet (figur 1B. Pil 2) med slag av det embryonale hjertet.
- Når den eksogene løsningen injiseres i fartøyet, må du sørge for at fartøyets farge blir til løsningsfargen og gjenoppretter til rødt i 2-5 s, noe som indikerer at den eksogene løsningen leveres til fartøyet. På dette tidspunktet kommer løsningen inn i arterien, og med hjertets slag sirkuleres tilbake til embryoet gjennom arterien, og deretter til venen.
- Etter injeksjon, fjern egget fra stereomikroskopet og slipp 200 μL Penicillin-oppløsning inne i eggeskallet. Klipp et 3 cm langt stykke medisinsk tape og forsegle vinduet. Skrap forsiktig båndet med saks for å klemme ut eventuelle luftbobler og kutt deretter et annet stykke for å forsegle åpningen over.
- Merk og legg det injiserte egget tilbake i inkubatoren og inkuber til ønsket utviklingsstadium eller klekking.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi viser her in ovo intravaskulær injeksjon av kyllingembryoer. En skjematisk prosess for intravaskulær injeksjon er vist i figur 1; I studien vår brukte vi ulike eksogene løsninger for å teste og verifisere injeksjon.
For bedre å visualisere de injiserte materialene ble Trypan Blue (0,4%) injisert som en tracer i embryoet. Traceren (blå) ble observert for å spre seg til hele embryoet via blodsirkulasjonen ved enten dorsal aorta eller hodeinjeksjon (figur 2). Materialer injisert på to forskjellige steder var i stand til å spre seg til hele embryoet, noe som indikerer diffusjonen gjennom blodsirkulasjonen. Visualiseringen av den blå fargen bekrefter suksessen til injeksjonen.
pEGFP-N1-vektoren ble pakket inn med PEI for å oppnå en konsentrasjon på 1 μg/μL, mens lentiviral vektor pLVX-EGFP ble pakket inn med PEI og fortynnet etter titrering for å oppnå en viruskonsentrasjon på 5 x 106 Tu/μL. De 2,5 dagers embryoene (HH trinn 14-15) ble injisert med innpakket pEGFP-N1 eller pLVX-EGFP. Ved 4,5 dager (HH trinn 24) ble embryoene observert ved hjelp av stereoskopisk fluorescensmikroskopi. Grønn fluorescens ble observert i embryoet som indikerer vektoruttrykket etter injeksjon. Resultatene viser at innkapslede plasmider av liposomer (PEI) og pakket lentivirus ble uttrykt i kyllingembryoet 2 dager etter injeksjon (figur 3). Resultatene av plasmid og lentiviral vektorinjeksjon viste det eksogene genuttrykket i embryoet, noe som antydet mulig anvendelse i genoverføring.
PGCene ble isolert fra kjønnsryggen av embryoer (E4.5, HH trinn 24) og dyrket for rensing som i forrige publikasjon16. De injiserte PGCene ble merket med det røde fluorescerende proteinet (RFP). På E6,0 dager (HH trinn 28) ble gonaden av mottakerembryoer isolert og observert. Resultatene viste at donor-PGCene (røde punkter) effektivt kunne gå inn i og kolonisere mottakerens gonader (figur 4).
Figur 1: Skjematisk for intravaskulær injeksjon. (A) Tidslinjen for den intravaskulære injeksjonen; (B) To injeksjonssteder indikert med svarte piler, hodet (1) og dorsal aorta (2); (C) Prosessen med intravaskulær injeksjon. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Spredning av sporingsfargen på forskjellige injeksjonssteder. Topp: dorsal aorta; Bunn: Hode. Skalastang = 50 mm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Uttrykk for GFP i embryoer 2 dager etter lentiviral vektor og innkapslet plasmidinjeksjon. Skalastang = 100 mm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Visualisering av injiserte røde fluorescensmerkede PGCer i mottakerens kyllingembryo. (E6.0, HH trinn 28) gonad. Skalalinje = 500 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Metoden for in ovo intravaskulær injeksjon av kyllingembryoer er optimalisert for eksogene materialer (vektor, viral eller PGC) som skal overføres til embryoet. Basert på denne metoden konstruerte vi kyllingembryomodeller med stabil genovertrykk eller interferens (SpinZ, JUN, UBE2I, etc.) 17,18,19. Disse veletablerte modellene viser muligheten for denne tilnærmingen. I tillegg overførte vi ikke bare isolerte PGCer til mottakerens embryo gonad, men produserte også vellykket levedyktige avkom med embryo gonad transplantert med induserte PGCer, noe som innebærer den store anvendelsen av denne metoden i fremtiden20.
Det kritiske trinnet i metoden er injeksjonen. De eksogene materialene må injiseres direkte i blodårene, ikke for dype eller for grunne. Dermed krever det erfaring med å jobbe med kyllingembryoer og høye injeksjonsferdigheter som lett kan oppnås gjennom praksis. Sammenlignet med luftcelleinjeksjonen oppnås høy injeksjonseffekt og nøyaktighet lettere ved hjelp av denne metoden. I tillegg til begrensningene for høye kostnader og kompliserte trinn, brukes elektrotransfeksjon ikke når et stort vindu er laget, da det kan føre til lav overlevelsesrate.
Som en metode for genmanipulering i kyllingembryoer har metoden også noen begrensninger. Rundt halvparten av eggene var døde under inkubasjonen etter injeksjon med en overlevelsesrate på 40% -60%. I mellomtiden er leveringseffektiviteten en annen viktig faktor å vurdere, spesielt for PGC-injeksjon (i vårt tilfelle er effektiviteten av plasmid- og lentivirusinjeksjon ~ 50% -60%, og pgc-injeksjon er ~ 30% -40%). I fremtiden kan protokollen optimaliseres og overlevelsesraten kan økes betydelig, noe som ytterligere forbedrer anvendelsesfeltet for denne metoden.
Til slutt viser denne protokollen at in ovo kylling embryo intravaskulær injeksjon er spesifikk for eksogene materialer (vektorer eller PGCer) som skal overføres til embryoene. Videre kan denne metoden lett læres og brukes på mange felt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter ble erklært.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av National Natural Science Foundation of China (31972547). Vi setter pris på kopieringen av Jing Wang og voiceover av Malik Donlic ved Washington State University, USA.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fluorescence macro-microscope | OLYMPUS | MVX10 | |
| Glass Capillaries | Narishige | G1 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 12566014 | liposome |
| pEGFP-N1 vector | Clontech | #6085-1 | |
| PKH26 Red Fluorescent Cell Linker Kit | Sigma | PKH26GL | |
| pLVX-EGFP lentivirus vector | Addgene | 128652 | |
| Pneumatic Microinjector | Narishige | IM-11-2 | |
| Puller | Narishige | PC-100 | |
| Trypan Blue Stain | Gibco | 15250061 |
References
- Bednarczyk, M., Dunislawska, A., Stadnicka, K., Grochowska, E. Chicken embryo as a model in epigenetic research. Poultry Science. 100 (7), 101164 (2021).
- Darnell, D. K., Schoenwolf, G. C. The chick embryo as a model system for analyzing mechanisms of development. Developmental Biology Protocols. , Humana Press. New York, NY. 25-29 (2000).
- Fauzia, E., et al. Chick embryo: a preclinical model for understanding ischemia-reperfusion mechanism. Frontiers in Pharmacology. 9, 1034 (2018).
- Fonseca, B. B., da Silva, M. V., de Morais Ribeiro, L. N. The chicken embryo as an in vivo experimental model for drug testing: Advantages and limitations. Lab Animal. 50 (6), 138-139 (2021).
- Blank, M. C., Chizhikov, V., Millen, K. J. In ovo electroporations of HH stage 10 chicken embryos. Journal of Visualized Experiments. (9), e408 (2007).
- Islam, M. M., Doh, S. T., Cai, L. In ovo electroporation in embryonic chick retina. Journal of Visualized Experiments. (60), e3792 (2012).
- Lu, T., Cohen, A. L., Sanchez, J. T. In ovo electroporation in the chicken auditory brainstem. Journal of Visualized Experiments. (124), e55628 (2017).
- van de Lavoir, M. -C., et al. Germline transmission of genetically modified primordial germ cells. Nature. 441 (7094), 766-769 (2006).
- Ballantyne, M., et al. Avian primordial germ cells are bipotent for male or female gametogenesis. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 726827 (2021).
- Park, T. S., Han, J. Y. piggyBac transposition into primordial germ cells is an efficient tool for transgenesis in chickens. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (24), 9337-9341 (2012).
- Lee, H. J., et al. Targeted gene insertion into Z chromosome of chicken primordial germ cells for avian sexing model development. The FASEB Journal. 33 (7), 8519-8529 (2019).
- Han, J. Y., Lee, B. R. Isolation and characterization of chicken primordial germ cells and their application in transgenesis. Avian and Reptilian Developmental Biology: Methods and Protocols. , Humana Press. New York, NY. 229-242 (2017).
- Naito, M., Harumi, T., Kuwana, T. Long-term culture of chicken primordial germ cells isolated from embryonic blood and production of germline chimaeric chickens. Animal Reproduction Science. 153, 50-61 (2015).
- Yu, F., et al. Isolation, characterization and germline chimera preparation of primordial germ cells from the Chinese Meiling chicken. Poultry Science. 98 (2), 566-572 (2019).
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. Journal of Morphology. 88 (1), 49-92 (1951).
- Zhang, Z., et al. Crucial genes and pathways in chicken germ stem cell differentiation. The Journal of Biological Chemistry. 290 (21), 13605-13621 (2015).
- Jin, K., et al. UBE2I stimulates female gonadal differentiation in chicken (Gallus gallus) embryos. Journal of Integrative Agriculture. 20 (11), 2986-2994 (2021).
- Shi, X., et al. HMGCS1 promotes male differentiation of chicken embryos by regulating the generate of cholesterol. All Life. 14 (1), 577-587 (2021).
- Jiang, J., et al. Spin1z induces the male pathway in the chicken by down-regulating Tcf4. Gene. 780, 145521 (2021).
- Zhao, R., et al. Production of viable chicken by allogeneic transplantation of primordial germ cells induced from somatic cells. Nature Communications. 12 (1), 2989 (2021).
