Summary
この論文の全体的な目標は、ニワトリ胚への外因性物質の卵管細胞内注入 において どのように行うかを記述することである。このアプローチは、ニワトリ胚の発生生物学を研究するのに非常に有用である。
Abstract
胚生物学の古典的なモデルシステムとして、ニワトリ胚は胚の発生と分化を調べるために使用されてきた。外因性物質をニワトリ胚に送達することは、胚発生中の遺伝子機能、トランスジェニック育種、およびキメラ調製を研究する上で大きな利点を有する。ここでは、プラスミドベクターや改変始原生殖細胞(PGC)などの外因性物質を発生初期の段階でドナーニワトリ胚に移入することができる in ovo 血管内注射の方法を示す。結果は、背側大動脈および頭部を介した血管内注射が、注入された物質が血液循環系を介して胚全体に拡散することを可能にすることを示している。提示されたプロトコールにおいて、外因性プラスミドおよびレンチウイルスベクター導入の有効性、ならびにレシピエント生殖巣における注射された外因性PGCのコロニー形成を、胚における蛍光を観察することによって決定した。この記事では、この方法の詳細な手順を説明し、それによって遺伝子機能、胚および発生生物学、および生殖腺キメラニワトリ産生を研究するための優れたアプローチを提供する。結論として、この記事は、研究者が大きな成功と再現性でニワトリ胚への外因性物質の 卵管 内注射を行うことを可能にします。
Introduction
ニワトリ胚は、発生学的、免疫学的、病理学的、および他の生物学的用途において何世紀にもわたって広く使用されてきた1,2,3。それらは、毒物学および細胞生物学の研究において、他の動物モデルよりも多くの固有の利点を有する4。ニワトリの胚は簡単にアクセスでき、インビトロで操作し、任意の発生段階で直接観察することができ、便利な胚研究モデルシステムを提供します。
一般に、エレクトロトランスフェクションや胚腔下注射などの現在のニワトリ胚送達方法は、専門機器や設計されたプログラムの要件、卵黄や卵白の存在による非効率性などの制限があります5,6,7。ここでは、外因性物質をニワトリ胚に送達するための簡単で効率的な取り扱い方法を示す。これは、発生生物学の研究に使用される強力なツールとなり得ます。注入された物質は、血液循環を介して胚全体に広がる。ニワトリ胚の初期発生の間、PGCは血液中を移動し、生殖器隆起に定着し、配偶子に発達し、外因性物質8を送達するための貴重な可能な経路を提供する。現在、この方法は、遺伝子機能、胚および発生生物学、ならびにキメラおよびトランスジェニックニワトリ産生の研究において広く使用されている9、10、11。
ニワトリ胚における卵管内注射において、十分に確立され、一般的に使用される方法12、13、14である。この論文では、注射材料、部位、投与量、および代表的な結果を含むこのプロトコルの包括的な説明を示す。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
動物の世話と使用に関するすべての手順は、米国国立衛生研究所のガイドライン(NIH Pub. No. 85-23、1996年改訂)に準拠し、ニワトリ胚プロトコルは、中国揚州大学の実験動物管理および実験動物倫理委員会(No.201803124)によって承認されました。
1. 受精卵の採取と準備
注:哺乳類とは異なり、鶏肉は単一の卵巣に何百万もの卵胞を持っていますが、これらの卵胞のほんの一部だけが排卵するのに十分成熟しています。各卵胞は1つの卵母細胞または生殖細胞を含む。卵胞が成熟して卵黄を放出するとすぐに、卵管の漏斗に取り込まれます。卵胞が卵管の頸部腹部に入ると、精液が鶏の体内の卵に結合し、鶏の体内のカルシウムが受精卵を包む殻を形成し、体内に柔らかい殻の卵を形成します。カルシウムの殻は、卵が生産されるまで徐々に厚くなります。
- 受精卵を地元の業者や機関から集め、16°Cで1週間保存することができます。
注:高い保存温度は胚の発達を助け、低温は胚の生存率を低下させる。胚は、保存時間が長すぎると発達しない。 - 卵をインキュベーターに移す前に、卵殻を75%エタノールで柔らかくゆっくりとこすります。
- 卵を横向きに、37.8°C、湿度60%のインキュベーター内のラックにきれいに置きます。60時間のインキュベーション(HHステージ17)の後、胚は目に見える血管を発達させ、心臓は15を鼓動し始めます。
注:2日間の孵化後、心臓の初期段階である小さな原始的な点が現れます。このプロセスはチェリービーズと呼ばれます。〜2.5日で、心臓および他の身体セグメントが目に見える血管で形成される。
2. 注射前の準備
- 針として使用するガラス毛細血管を準備します。注入前に、プーラーを使用して外径1mm、内径0.6mmの90mmのガラス毛細血管を引っ張る。鉗子(ガラス細管の角度は通常45°)を使用して先端を壊し、UV光の下で毛細血管を2時間滅菌します。
- プラスミド、パッケージ化されたレンチウイルス、PGCなどの外因性材料を調製する。
- プラスミドpEGFP-N1(GFP発現増強プラスミド、1μg/μL)とリポソームを1:3(m/v)の比率で穏やかに混合する。水を加えて、10 ng/μLの最終DNA濃度を得た。DNA混合物を注射前に37°Cで20分間座らせます。
- 注射前に氷の上でウイルスを解凍する。注射に使用するレンチウイルスの力価は、5 x 106 Tu/mL以上でなければなりません。
- 親または修飾生殖腺PGC(E4.5、HHステージ24)を2,000~5,000細胞/μLに希釈する。
注:ここでは、トリパンブルーを使用した注射手順を示しました。
3. ウィンドウイング
- 胚を露出させる前に、綿球を使って75%のアルコールで卵殻の表面を優しく柔らかく拭き取り、卵の鈍い縁を完全に滅菌してください。
- 滅菌後、鈍い端を鉗子で静かに叩いて、卵殻表面に小さな窓(0.5 cm x 0.5 cm)を作り、胚を露出させます。胚膜を除去し、解剖顕微鏡下でホルダーに卵子を置く。
4. インジェクション
- 顕微鏡下で血管を探し、解剖顕微鏡の焦点を調整して胚を見つけ、注射の準備ができている血管を見つけます。
- ガラスの針に外因性溶液(プラスミド、レンチウイルス、またはPGC)をピペットを使用してゆっくりと充填し、針の気泡を避けます。
- 外因性溶液を含む針を血管に向け、注射する血管と平行な針を向けます。
- 充填された針を容器に静かに挿入し、ポンプをオンにして溶液(通常、注入量は〜1〜5μL)を顕微鏡下で排出する。空気ポンプの圧力は、過度に高い空気圧が高速の流れにつながる血管を損傷するため、血管の破壊を防ぐのに十分低いべきである。
- 外因性溶液が容器に注入されたら、容器の色が溶液の色に変わり、2〜5秒で赤色に回復し、外因性溶液が血管に正常に送達されたことを示す。この時点で、溶液は動脈に入り、心臓の鼓動とともに動脈を通って胚に戻り、次いで静脈に循環する。
注:血管注射には2つの注射部位(図1B)があります:1つは頭部であり、外因性溶液が胚の頭部の静脈から血流を介して心臓に注入され、次いで心臓が鼓動しながら胚全体に循環する(図1B、矢印1)。もう一つは、胚血の背側大動脈を通してである。外因性溶液が注入され、胚全体に広がる(図1B.矢印2)胚性心臓の鼓動を伴う。
- 外因性溶液が容器に注入されたら、容器の色が溶液の色に変わり、2〜5秒で赤色に回復し、外因性溶液が血管に正常に送達されたことを示す。この時点で、溶液は動脈に入り、心臓の鼓動とともに動脈を通って胚に戻り、次いで静脈に循環する。
- 注射後、実体顕微鏡から卵を取り出し、卵殻の中に200μLのペニシリン溶液を滴下する。長さ3cmの医療用テープを切って窓を密閉します。はさみでテープを優しくこすり取って気泡を絞り出し、別の部分を切って開口部を密閉します。
- 注射した卵にラベルを付け、インキュベーターに戻し、必要な発達段階または孵化まで孵化させる。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ここではニワトリ胚の 卵 管内注射を示す。血管内注射の概略プロセスを 図1に示す。私たちの研究では、注射をテストおよび検証するためにさまざまな外因性溶液を使用しました。
注入された材料をよりよく視覚化するために、トリパンブルー(0.4%)をトレーサーとして胚に注入した。トレーサー(青色)は、背側大動脈または頭部注射のいずれかによって血液循環 を介して 胚全体に拡散することが観察された(図2)。2つの異なる部位に注入された物質は、胚全体に広がることができ、血液循環を介した拡散を示す。青色の視覚化は、注射の成功を確認する。
pEGFP-N1ベクターをPEIで包んで1μg/μLの濃度を達成し、レンチウイルスベクターpLVX-EGFPをPEIで包み、滴定後に希釈してウイルス濃度5 x106 Tu/μLを達成した。5日目(HHステージ24)において、胚を立体蛍光顕微鏡を用いて観察した。注射後のベクター発現を示す胚に緑色蛍光が観察された。結果は、リポソーム(PEI)およびパッケージングレンチウイルスによって内包されたプラスミドが、注射後2日目のニワトリ胚において発現したことを示す(図3)。プラスミドおよびレンチウイルスベクター注入の結果は、胚における外因性の遺伝子発現を証明し、遺伝子導入における適用の可能性を示唆している。
PGCsを胚の生殖器隆起(E4.5、HHステージ24)から単離し、以前の刊行物16と同様に精製のために培養した。注入されたPGCsを赤色蛍光タンパク質(RFP)で標識した。E6.0日目(HHステージ28)に、レシピエント胚の生殖巣を単離し、観察した。その結果、ドナーPGC(赤い点)がレシピエントの生殖腺に効果的に侵入し、コロニー形成できることが示されました(図4)。
図1:血管内注射の概略図。 (a)血管内注射のタイムライン;(b)黒矢印で示す2つの注射部位、頭部(1)および背側大動脈(2);(c)血管内注射の工程。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:異なる注射部位におけるトレーシング色素の拡散。 上: 背側大動脈;下: 頭。スケール バー = 50 mm。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:レンチウイルスベクターおよび封入プラスミド注入の2日後の胚におけるGFPの発現。 スケール バー = 100 mm。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図4:レシピエントニワトリ胚における注射された赤色蛍光標識PGCの可視化 (E6.0、HHステージ28)生殖巣。スケール バー = 500 μm。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ニワトリ胚のin ovo血管内注射の方法は、外因性物質(ベクター、ウイルス性、またはPGC)が胚に移植されるように最適化される。この手法に基づき、安定した遺伝子過剰発現または干渉(SpinZ、JUN、UBE2Iなど)を有するニワトリ胚モデルを構築した。17,18,19。これらの確立されたモデルは、このアプローチの実現可能性を証明しています。さらに、我々は単離されたPGCをレシピエントの胚生殖巣に移植しただけでなく、誘導PGCを移植した胚生殖腺で生存可能な子孫を産生することに成功し、これは将来この方法の壮大な適用を意味する20。
この方法の重要なステップは、注射である。外因性物質は、深すぎたり浅すぎたりせず、血管に直接注入する必要があります。したがって、ニワトリの胚を扱う経験と、練習を通じて容易に得ることができる高い注入技術が必要です。空気細胞注入と比較して、この方法を用いて高い注入有効性および精度がより容易に達成される。高コストで複雑な工程の限界に加えて、大きな窓を作ると生存率が低くなる可能性があるため、エレクトロトランスフェクションは適用されません。
ニワトリ胚における遺伝子操作のための方法として、この方法はまた、いくつかの制限を有する。卵の約半分は、注射後の孵化中に40%〜60%の生存率で死んでいた。一方、送達効率は、特にPGC注射の場合、考慮すべきもう1つの重要な要素です(私たちの場合、プラスミドおよびレンチウイルス注射の効率は〜50%〜60%であり、PGC注射の効率は〜30%〜40%です)。将来的には、プロトコルが最適化され、生存率が大幅に向上し、この方法の応用分野がさらに改善される可能性があります。
結論として、このプロトコールは、 in ovo chicken胚血管内注射が、胚に移植される外因性物質(ベクターまたはPGC)に特異的であることを実証する。さらに、この方法は容易に学習し、多くの分野に適用することができる。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
利益相反は宣言されませんでした。
Acknowledgments
この研究は、中国国家自然科学財団(31972547)の支援を受けた。Jing Wangによるコピーエディットと、米国ワシントン州立大学のMalik Donlicによるナレーションに感謝します。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fluorescence macro-microscope | OLYMPUS | MVX10 | |
| Glass Capillaries | Narishige | G1 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 12566014 | liposome |
| pEGFP-N1 vector | Clontech | #6085-1 | |
| PKH26 Red Fluorescent Cell Linker Kit | Sigma | PKH26GL | |
| pLVX-EGFP lentivirus vector | Addgene | 128652 | |
| Pneumatic Microinjector | Narishige | IM-11-2 | |
| Puller | Narishige | PC-100 | |
| Trypan Blue Stain | Gibco | 15250061 |
References
- Bednarczyk, M., Dunislawska, A., Stadnicka, K., Grochowska, E. Chicken embryo as a model in epigenetic research. Poultry Science. 100 (7), 101164 (2021).
- Darnell, D. K., Schoenwolf, G. C. The chick embryo as a model system for analyzing mechanisms of development. Developmental Biology Protocols. , Humana Press. New York, NY. 25-29 (2000).
- Fauzia, E., et al. Chick embryo: a preclinical model for understanding ischemia-reperfusion mechanism. Frontiers in Pharmacology. 9, 1034 (2018).
- Fonseca, B. B., da Silva, M. V., de Morais Ribeiro, L. N. The chicken embryo as an in vivo experimental model for drug testing: Advantages and limitations. Lab Animal. 50 (6), 138-139 (2021).
- Blank, M. C., Chizhikov, V., Millen, K. J. In ovo electroporations of HH stage 10 chicken embryos. Journal of Visualized Experiments. (9), e408 (2007).
- Islam, M. M., Doh, S. T., Cai, L. In ovo electroporation in embryonic chick retina. Journal of Visualized Experiments. (60), e3792 (2012).
- Lu, T., Cohen, A. L., Sanchez, J. T. In ovo electroporation in the chicken auditory brainstem. Journal of Visualized Experiments. (124), e55628 (2017).
- van de Lavoir, M. -C., et al. Germline transmission of genetically modified primordial germ cells. Nature. 441 (7094), 766-769 (2006).
- Ballantyne, M., et al. Avian primordial germ cells are bipotent for male or female gametogenesis. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 726827 (2021).
- Park, T. S., Han, J. Y. piggyBac transposition into primordial germ cells is an efficient tool for transgenesis in chickens. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (24), 9337-9341 (2012).
- Lee, H. J., et al. Targeted gene insertion into Z chromosome of chicken primordial germ cells for avian sexing model development. The FASEB Journal. 33 (7), 8519-8529 (2019).
- Han, J. Y., Lee, B. R. Isolation and characterization of chicken primordial germ cells and their application in transgenesis. Avian and Reptilian Developmental Biology: Methods and Protocols. , Humana Press. New York, NY. 229-242 (2017).
- Naito, M., Harumi, T., Kuwana, T. Long-term culture of chicken primordial germ cells isolated from embryonic blood and production of germline chimaeric chickens. Animal Reproduction Science. 153, 50-61 (2015).
- Yu, F., et al. Isolation, characterization and germline chimera preparation of primordial germ cells from the Chinese Meiling chicken. Poultry Science. 98 (2), 566-572 (2019).
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. Journal of Morphology. 88 (1), 49-92 (1951).
- Zhang, Z., et al. Crucial genes and pathways in chicken germ stem cell differentiation. The Journal of Biological Chemistry. 290 (21), 13605-13621 (2015).
- Jin, K., et al. UBE2I stimulates female gonadal differentiation in chicken (Gallus gallus) embryos. Journal of Integrative Agriculture. 20 (11), 2986-2994 (2021).
- Shi, X., et al. HMGCS1 promotes male differentiation of chicken embryos by regulating the generate of cholesterol. All Life. 14 (1), 577-587 (2021).
- Jiang, J., et al. Spin1z induces the male pathway in the chicken by down-regulating Tcf4. Gene. 780, 145521 (2021).
- Zhao, R., et al. Production of viable chicken by allogeneic transplantation of primordial germ cells induced from somatic cells. Nature Communications. 12 (1), 2989 (2021).
