Summary
המטרה הכוללת של מאמר זה היא לתאר כיצד לבצע בהזרקה תוך תאית של אובו של חומרים אקסוגניים לעוברי עוף. גישה זו שימושית מאוד כדי לחקור את הביולוגיה ההתפתחותית של עוברי תרנגולות.
Abstract
כמערכת מודל קלאסית של ביולוגיה של העובר, עובר העוף שימש לחקר ההתפתחות וההתמיינות העוברית. להעברת חומרים אקסוגניים לעוברי עוף יש יתרון גדול לחקר תפקוד הגנים, הרבייה המהונדסת והכנת הכימרה במהלך ההתפתחות העוברית. כאן אנו מראים את השיטה של הזרקה תוך-וסקולרית של אובו לפיה ניתן להעביר חומרים אקסוגניים כגון וקטורים פלסמידיים או תאי נבט ראשוניים שעברו שינוי (PGCs) לעוברי עוף תורמים בשלבים התפתחותיים מוקדמים. התוצאות מראות כי ההזרקה התוך-וסקולרית דרך אבי העורקים הגבי והראש מאפשרת לחומרים מוזרקים להתפזר לתוך העובר כולו דרך מערכת הדם. בפרוטוקול המוצג, היעילות של פלסמיד אקסוגני והכנסת וקטורים לנטי-ויראליים, והתיישבות של PGCs אקסוגניים מוזרקים בגונד המקבל, נקבעו על ידי התבוננות בפלואורסצנציה בעוברים. מאמר זה מתאר נהלים מפורטים של שיטה זו, ובכך מספק גישה מצוינת לחקר תפקוד הגנים, ביולוגיה עוברית והתפתחותית, וייצור עוף גונד-כימרי. לסיכום, מאמר זה יאפשר לחוקרים לבצע בהזרקה תוך-וסקולרית של חומרים אקסוגניים לעוברי עוף בהצלחה רבה ובשכפול.
Introduction
עוברי עוף נמצאים בשימוש נרחב במשך מאות שנים ביישומים התפתחותיים, אימונולוגיים, פתולוגיים וביולוגיים אחרים 1,2,3. יש להם יתרונות מובנים רבים על פני מודלים אחרים של בעלי חיים בחקר הטוקסיקולוגיה וביולוגיה של התא4. עוברי עוף נגישים בקלות וניתן לתמרן אותם במבחנה ולצפות בהם ישירות בכל שלב התפתחותי, מה שמספק מערכת מודל שימושית לחקר העוברים.
באופן כללי, לשיטות הנוכחיות של העברת עוברי עוף כגון אלקטרו-טרנספקציה והזרקת תת-קרקעית לחלל יש מגבלות כגון הדרישה לציוד מומחה ותוכנית מתוכננת, וחוסר יעילות בשל נוכחות של חלמון ואלבומן 5,6,7. כאן אנו מראים שיטת טיפול פשוטה ויעילה להעברת חומרים אקסוגניים לעוברי עוף. זה יכול להיות כלי רב עוצמה המשמש בחקר הביולוגיה ההתפתחותית. החומרים המוזרקים התפשטו לכל העובר באמצעות זרימת הדם. במהלך ההתפתחות המוקדמת של עוברי עוף, המחשבים האישיים יכלו לנדוד דרך הדם, ליישב את רכס איברי המין, ולאחר מכן להתפתח לגמטות, המספקות נתיב אפשרי רב ערך להעברת חומרים אקסוגניים8. כעת, שיטה זו שימשה באופן נרחב בחקר תפקוד הגנים, ביולוגיה עוברית והתפתחותית, וייצור עופות כימריים ומהונדסים 9,10,11.
ב ovo הזרקה תוך וסקולרית בעוברי עוף היא שיטה מבוססת היטב בשימוש נפוץ 12,13,14. במאמר זה אנו מציגים תיאור מקיף של פרוטוקול זה, כולל חומרי הזרקה, אתרים, מינון ותוצאות מייצגות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל ההליכים הכרוכים בטיפול בבעלי חיים ובשימוש בהם תאמו את הנחיות המכון הלאומי לבריאות של ארה"ב (NIH Pub. No. 85-23, תוקן ב-1996) ופרוטוקולי עוברי העוף אושרו על ידי הוועדה לניהול חיות מעבדה ואתיקה ניסיונית של בעלי חיים באוניברסיטת יאנגז'ו, סין (No.201803124).
1. איסוף והכנה של ביציות מופרות
הערה: בניגוד ליונקים, לתרנגולת יש מיליוני זקיקים בשחלה אחת, אך רק מעטים מהזקיקים האלה בוגרים מספיק כדי לבייץ. כל זקיק מכיל ביצית אחת או תא נבט אחד. ברגע שהזקיק מבשיל ומשחרר את החלמון שלו, הוא משולב במשפך של החצוצרה. כאשר הזקיק נכנס לבטן הג'וגולרית של האובידוקט, הזרע נקשר לביצית בגוף התרנגולת, והסידן בגוף התרנגולת יוצר קליפה שעוטפת את הביצית המופרית, ויוצרת ביצה בעלת קליפה רכה בגוף. קליפת הסידן מתעבה בהדרגה עד שהביצה מיוצרת.
- אספו ביציות מופרות ממוכר או ממוסד מקומי, אותן ניתן לאחסן בטמפרטורה של 16 מעלות צלזיוס למשך שבוע.
הערה: טמפרטורת האחסון הגבוהה תסייע לעובר להתפתח, בעוד שהטמפרטורה הנמוכה תפחית את כדאיות העובר. העוברים לא יצליחו להתפתח אם זמן האחסון ארוך מדי. - קרצפו את קליפת הביצה ברכות ובאיטיות עם 75% אתנול לפני העברת הביצים לאינקובטור.
- הניחו את הביצים לצדדים, בצורה מסודרת על מתלה באינקובטור בטמפרטורה של 37.8 מעלות צלזיוס ולחות של 60%. לאחר 60 שעות של דגירה (HH שלב 17), העוברים יפתחו כלי דם גלויים והלב יתחיל לפעום15.
הערה: לאחר יומיים של דגירה, מופיעות נקודות פרימורדיאליות קטנות, השלב המוקדם של הלב. תהליך זה נקרא דובדבן. ב~ 2.5 ימים, לב ומקטעי גוף אחרים נוצרים עם כלי דם גלויים.
2. הכנה לפני ההזרקה
- הכינו נימי זכוכית שישמשו כמחטים. לפני ההזרקה, למשוך נימי זכוכית 90 מ"מ עם קוטר חיצוני של 1 מ"מ וקוטר פנימי של 0.6 מ"מ באמצעות המושך. לשבור קצוות באמצעות מלקחיים (זווית נימי הזכוכית היא בדרך כלל 45°) ולעקר את הנימים תחת אור UV במשך 2 שעות.
- הכינו חומרים אקסוגניים כגון פלסמידים, לנטי-וירוסים ארוזים ומחשבים אישיים.
- ערבבו בעדינות את הפלסמיד pEGFP-N1 (GFP משופר המבטא פלסמיד, 1 מיקרוגרם/מיקרול) עם ליפוזום ביחס של 1:3 (m/v). הוסיפו מים כדי לקבל ריכוז דנ"א סופי של 10 ננוגרם/מיקרול. תנו לתערובת הדנ"א לשבת על 37 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות לפני ההזרקה.
- להפשיר וירוסים על קרח לפני ההזרקה. הטיטר של נגיף הלנטי המשמש להזרקה צריך להיות מעל 5 x 106 Tu/mL.
- דילול מחשבי PGCs הוריים או גונדים שעברו שינוי (E4.5, HH שלב 24) ל-2,000-5,000 תאים/μL.
הערה: כאן הראינו את הליך ההזרקה באמצעות טריפאן כחול.
3. חלונות
- לפני חשיפת העוברים, מעקרים אותם על ידי ניגוב עדין ורך של פני הביצים עם 75% אלכוהול באמצעות כדור צמר גפן, מה שמבטיח לעקר את הקצה הקהה של הביציות ביסודיות.
- לאחר העיקור, הקש בעדינות על הקצה הקהה עם מלקחיים כדי ליצור חלון קטן (0.5 ס"מ x 0.5 ס"מ) על פני קליפת הביצה כדי לחשוף את העובר. הסר את קרום העובר ולאחר מכן הנח את הביצית על המחזיק מתחת למיקרוסקופ הנתיחה.
4. הזרקה
- חפשו כלי דם מתחת למיקרוסקופ והתאימו את מוקד מיקרוסקופ הנתיחה כדי לאתר את העובר, ואז מצאו את כלי הדם מוכן להזרקה.
- מלאו את מחט הזכוכית בתמיסה האקסוגנית (פלסמיד, לנטי-וירוס או מחשבים אישיים) באמצעות פיפטה באיטיות, והימנעו מבועות אוויר במחט.
- כוון את המחט עם תמיסה אקסוגנית בכלי הדם, כאשר המחט מקבילה לכלי הדם מוזרק.
- הכנס בעדינות את המחט המלאה לתוך הכלי והפעל את המשאבה כדי להוציא את התמיסה (בדרך כלל הנפח המוזרק הוא ~ 1-5 μL) מתחת למיקרוסקופ. לחץ משאבת האוויר צריך להיות נמוך מספיק כדי למנוע הרס של כלי דם, שכן לחץ האוויר הגבוה מדי יפגע בכלי הדם ויוביל לזרימה במהירות גבוהה.
- לאחר הזרקת התמיסה האקסוגנית לכלי, ודא שצבע הכלי הופך לצבע הפתרון ומתאושש לאדום תוך 2-5 שניות, מה שמעיד על כך שהתמיסה האקסוגנית מועברת בהצלחה לכלי. בשלב זה הפתרון נכנס לעורק, ועם פעימות הלב מופץ בחזרה לעובר דרך העורק, ולאחר מכן לווריד.
הערה: ישנם שני אתרי הזרקה להזרקת כלי דם (איור 1B): האחד הוא הראש, שבו הזריקה האקסוגנית מוזרקת מהווריד בראש העובר וללב דרך זרימת הדם, ואז מופצת לכל העובר כשהלב פועם (איור 1B, חץ 1). דבר נוסף הוא דרך אבי העורקים הגבי של דם העובר; התמיסה האקסוגנית מוזרקת ומתפשטת לכל העובר (איור 1B). חץ 2) עם פעימות הלב העוברי.
- לאחר הזרקת התמיסה האקסוגנית לכלי, ודא שצבע הכלי הופך לצבע הפתרון ומתאושש לאדום תוך 2-5 שניות, מה שמעיד על כך שהתמיסה האקסוגנית מועברת בהצלחה לכלי. בשלב זה הפתרון נכנס לעורק, ועם פעימות הלב מופץ בחזרה לעובר דרך העורק, ולאחר מכן לווריד.
- לאחר ההזרקה, הסר את הביצה ממיקרוסקופ הסטריאו והטל 200 μL של תמיסת פניצילין בתוך קליפת הביצה. חותכים חתיכת סרט רפואי באורך 3 ס"מ ואוטמים את החלון. גרד בעדינות את הקלטת עם מספריים כדי לסחוט החוצה את כל בועות האוויר ולאחר מכן לחתוך חתיכה נוספת כדי לאטום את הפתח לרוחב.
- סמן והחזיר את הביצה המוזרקת לחממה והדגירה עד לשלב ההתפתחותי או הבקיעה הנדרשים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
אנו מראים כאן את ההזרקה התוך-וסקולרית של עוברי עוף. תהליך סכמטי של ההזרקה התוך-וסקולרית מוצג באיור 1; במחקר שלנו, השתמשנו בתמיסות אקסוגניות שונות כדי לבדוק ולאמת את ההזרקה.
כדי לדמיין טוב יותר את החומרים שהוזרקו, טריפאן בלו (0.4%) הוזרק כמעקב לעובר. העקיבה (הכחולה) נצפתה מתפזרת לכל העובר באמצעות זרימת הדם על ידי אבי העורקים הגבי או הזרקת הראש (איור 2). חומרים שהוזרקו בשני אתרים שונים הצליחו להתפשט לכל העובר, מה שמעיד על הדיפוזיה דרך זרימת הדם. ההדמיה של הצבע הכחול מאשרת את הצלחת ההזרקה.
וקטור ה-pEGFP-N1 נעטף ב-PEI כדי להגיע לריכוז של 1 מיקרוגרם/מיקרול, ואילו הווקטור הלנטי-ויראלי pLVX-EGFP נעטף ב-PEI ומדולל לאחר טיטרציה כדי להשיג ריכוז נגיף של 5 x 106 6 Tu/μL. העוברים בני 2.5 הימים (שלב HH 14-15) הוזרקו עם pEGFP-N1 עטוף או pLVX-EGFP. לאחר 4.5 ימים (HH שלב 24), העוברים נצפו באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית סטריאוסקופית. פלואורסצנציה ירוקה נצפתה בעובר המציינת את הביטוי הווקטורי לאחר ההזרקה. התוצאות מראות כי פלסמידים עטופים על ידי ליפוזומים (PEI) ונגיף לנטי ארוז באו לידי ביטוי בעובר העוף יומיים לאחר ההזרקה (איור 3). תוצאות ההזרקה הווקטורית הפלסמידית והלנטי-ויראלית הוכיחו את ביטוי הגנים האקסוגני בעובר, ורמזו על היישום האפשרי בהעברת גנים.
המחשבים האישיים בודדו מרכס איברי המין של העוברים (E4.5, HH שלב 24) ותורתו לטיהור כמו בפרסום הקודם16. מחשבי ה-PGCs שהוזרקו סומנו בחלבון הפלואורסצנטי האדום (RFP). בשעה E6.0 ימים (HH שלב 28), הגונד של העוברים המקבלים בודד ונצפה. התוצאות הראו כי מחשבי ה-PGCs של התורם (נקודות אדומות) הצליחו להזין וליישב ביעילות את הגונדות של המקבל (איור 4).
איור 1: הסכימה של ההזרקה התוך-וסקולרית. (א) ציר הזמן של ההזרקה התוך-וסקולרית; (ב) שני אתרי הזרקה המסומנים על ידי חצים שחורים, הראש (1) ואבי העורקים הגבי (2); (ג) תהליך ההזרקה התוך-וסקולרית. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 2: דיפוזיה של צבע העקיבה באתרי הזרקה שונים. למעלה: אבי העורקים הגבי; למטה: ראש. סרגל קנה מידה = 50 מ"מ. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 3: ביטוי של GFP בעוברים יומיים לאחר הזרקת וקטור לנטי-ויראלי והזרקת פלסמיד עטופה. סרגל קנה מידה = 100 מ"מ. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 4: הדמיה של מחשבים עם תווית פלואורסצנטית אדומה מוזרקת בעובר העוף המושתל. סרגל קנה מידה = 500 μm. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
השיטה של הזרקה תוך-וסקולרית של אובו של עוברי עוף מותאמת לחומרים אקסוגניים (וקטוריים, נגיפיים או מחשבים אישיים) שיועברו לעובר. בהתבסס על שיטה זו, בנינו מודלים של עוברי עוף עם ביטוי יתר או הפרעה יציבים של גנים (SpinZ, JUN, UBE2I וכו '). 17,18,19. מודלים מבוססים אלה מוכיחים את היתכנותה של גישה זו. בנוסף, לא רק העברנו מחשבים מבודדים לגונד העובר של המושתל, אלא גם ייצרנו בהצלחה את הצאצאים בני הקיימא עם גונאד עוברי שהושתל עם PGCs מושרים, מה שמרמז על היישום הגדול של שיטה זו בעתיד20.
השלב הקריטי של השיטה הוא ההזרקה. החומרים האקסוגניים חייבים להיות מוזרקים ישירות לתוך כלי הדם, לא עמוק מדי או רדוד מדי. לפיכך, זה דורש ניסיון בעבודה עם עוברי עוף ומיומנויות הזרקה גבוהות שניתן להשיג בקלות באמצעות תרגול. בהשוואה להזרקת תאי האוויר, יעילות ההזרקה והדיוק הגבוהים מושגים ביתר קלות בשיטה זו. בנוסף למגבלות של עלות גבוהה וצעדים מסובכים, אלקטרו-טרנספקציה אינה מיושמת כאשר נוצר חלון גדול, מכיוון שהיא עלולה להוביל לשיעור הישרדות נמוך.
כשיטה למניפולציה גנטית בעוברי עוף, לשיטה יש גם כמה מגבלות. כמחצית מהביצים מתו במהלך הדגירה לאחר ההזרקה עם שיעור הישרדות של 40%-60%. בינתיים, יעילות האספקה היא גורם חשוב נוסף שיש לקחת בחשבון, במיוחד עבור הזרקת PGC (במקרה שלנו, היעילות של הזרקת פלסמיד ולנטי-וירוס היא ~ 50%-60%, וזו של הזרקת PGC היא ~ 30%-40%). בעתיד, הפרוטוקול עשוי להיות ממוטב ושיעור ההישרדות עשוי להיות מוגבר במידה ניכרת, מה שישפר עוד יותר את תחום היישום של שיטה זו.
לסיכום, פרוטוקול זה מדגים כי ההזרקה התוך-וסקולרית של עובר עוף באובו היא ספציפית לחומרים אקסוגניים (וקטורים או מחשבים אישיים) שיש להעביר לעוברים. יתר על כן, שיטה זו ניתן ללמוד בקלות וליישם בתחומים רבים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
לא הוכרזו ניגודי עניינים.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (31972547). אנו מעריכים את ההעתקה של ג'ינג וואנג ואת הקריינות של מאליק דונליק באוניברסיטת מדינת וושינגטון, ארה"ב.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fluorescence macro-microscope | OLYMPUS | MVX10 | |
| Glass Capillaries | Narishige | G1 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 12566014 | liposome |
| pEGFP-N1 vector | Clontech | #6085-1 | |
| PKH26 Red Fluorescent Cell Linker Kit | Sigma | PKH26GL | |
| pLVX-EGFP lentivirus vector | Addgene | 128652 | |
| Pneumatic Microinjector | Narishige | IM-11-2 | |
| Puller | Narishige | PC-100 | |
| Trypan Blue Stain | Gibco | 15250061 |
References
- Bednarczyk, M., Dunislawska, A., Stadnicka, K., Grochowska, E. Chicken embryo as a model in epigenetic research. Poultry Science. 100 (7), 101164 (2021).
- Darnell, D. K., Schoenwolf, G. C. The chick embryo as a model system for analyzing mechanisms of development. Developmental Biology Protocols. , Humana Press. New York, NY. 25-29 (2000).
- Fauzia, E., et al. Chick embryo: a preclinical model for understanding ischemia-reperfusion mechanism. Frontiers in Pharmacology. 9, 1034 (2018).
- Fonseca, B. B., da Silva, M. V., de Morais Ribeiro, L. N. The chicken embryo as an in vivo experimental model for drug testing: Advantages and limitations. Lab Animal. 50 (6), 138-139 (2021).
- Blank, M. C., Chizhikov, V., Millen, K. J. In ovo electroporations of HH stage 10 chicken embryos. Journal of Visualized Experiments. (9), e408 (2007).
- Islam, M. M., Doh, S. T., Cai, L. In ovo electroporation in embryonic chick retina. Journal of Visualized Experiments. (60), e3792 (2012).
- Lu, T., Cohen, A. L., Sanchez, J. T. In ovo electroporation in the chicken auditory brainstem. Journal of Visualized Experiments. (124), e55628 (2017).
- van de Lavoir, M. -C., et al. Germline transmission of genetically modified primordial germ cells. Nature. 441 (7094), 766-769 (2006).
- Ballantyne, M., et al. Avian primordial germ cells are bipotent for male or female gametogenesis. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 726827 (2021).
- Park, T. S., Han, J. Y. piggyBac transposition into primordial germ cells is an efficient tool for transgenesis in chickens. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (24), 9337-9341 (2012).
- Lee, H. J., et al. Targeted gene insertion into Z chromosome of chicken primordial germ cells for avian sexing model development. The FASEB Journal. 33 (7), 8519-8529 (2019).
- Han, J. Y., Lee, B. R. Isolation and characterization of chicken primordial germ cells and their application in transgenesis. Avian and Reptilian Developmental Biology: Methods and Protocols. , Humana Press. New York, NY. 229-242 (2017).
- Naito, M., Harumi, T., Kuwana, T. Long-term culture of chicken primordial germ cells isolated from embryonic blood and production of germline chimaeric chickens. Animal Reproduction Science. 153, 50-61 (2015).
- Yu, F., et al. Isolation, characterization and germline chimera preparation of primordial germ cells from the Chinese Meiling chicken. Poultry Science. 98 (2), 566-572 (2019).
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. Journal of Morphology. 88 (1), 49-92 (1951).
- Zhang, Z., et al. Crucial genes and pathways in chicken germ stem cell differentiation. The Journal of Biological Chemistry. 290 (21), 13605-13621 (2015).
- Jin, K., et al. UBE2I stimulates female gonadal differentiation in chicken (Gallus gallus) embryos. Journal of Integrative Agriculture. 20 (11), 2986-2994 (2021).
- Shi, X., et al. HMGCS1 promotes male differentiation of chicken embryos by regulating the generate of cholesterol. All Life. 14 (1), 577-587 (2021).
- Jiang, J., et al. Spin1z induces the male pathway in the chicken by down-regulating Tcf4. Gene. 780, 145521 (2021).
- Zhao, R., et al. Production of viable chicken by allogeneic transplantation of primordial germ cells induced from somatic cells. Nature Communications. 12 (1), 2989 (2021).
