Summary
El objetivo general de este artículo es describir cómo realizar la inyección intracelular ovo de materiales exógenos en embriones de pollo. Este enfoque es muy útil para estudiar la biología del desarrollo de los embriones de pollo.
Abstract
Como un sistema modelo clásico de biología embrionaria, el embrión de pollo se ha utilizado para investigar el desarrollo embrionario y la diferenciación. La entrega de materiales exógenos en embriones de pollo tiene una gran ventaja para estudiar la función génica, la reproducción transgénica y la preparación de quimeras durante el desarrollo embrionario. Aquí mostramos el método de inyección intravascular in ovo mediante el cual los materiales exógenos como los vectores plásmidos o las células germinales primordiales modificadas (PGC) pueden transferirse a embriones de pollo de donantes en etapas tempranas de desarrollo. Los resultados muestran que la inyección intravascular a través de la aorta dorsal y la cabeza permite que los materiales inyectados se difundan en todo el embrión a través del sistema circulatorio sanguíneo. En el protocolo presentado, la eficacia de la introducción de plásmidos exógenos y vectores lentivirales, y la colonización de PGC exógenos inyectados en la gónada receptora, se determinaron mediante la observación de fluorescencia en los embriones. Este artículo describe procedimientos detallados de este método, proporcionando así un excelente enfoque para estudiar la función génica, la biología embrionaria y del desarrollo, y la producción de pollos quiméricos de gónadas. En conclusión, este artículo permitirá a los investigadores realizar in ovo inyección intravascular de materiales exógenos en embriones de pollo con gran éxito y reproducibilidad.
Introduction
Los embriones de pollo se han utilizado ampliamente durante siglos en aplicaciones biológicas, inmunológicas, patológicas y de desarrollo 1,2,3. Tienen muchas ventajas inherentes sobre otros modelos animales en el estudio de la toxicología y la biología celular4. Los embriones de pollo son fácilmente accesibles y pueden manipularse in vitro y observarse directamente en cualquier etapa del desarrollo, lo que proporciona un práctico sistema de modelo de investigación embrionaria.
En general, los métodos actuales de administración de embriones de pollo, como la electrotransfección y la inyección de cavidad subgerminal, tienen limitaciones como el requisito de equipos especializados y un programa diseñado, y la ineficiencia debido a la presencia de yema y albúmina 5,6,7. Aquí mostramos un método de manejo simple y eficiente para entregar materiales exógenos en embriones de pollo. Esta puede ser una herramienta poderosa utilizada en el estudio de la biología del desarrollo. Los materiales inyectados se propagan a todo el embrión a través de la circulación sanguínea. Durante el desarrollo temprano de los embriones de pollo, los PGC podrían migrar a través de la sangre, colonizar la cresta genital y luego convertirse en gametos, que proporcionan un valioso camino posible para entregar materiales exógenos8. Ahora, este método ha sido ampliamente utilizado en el estudio de la función génica, la biología embrionaria y del desarrollo, y la producción de pollos quiméricos y transgénicos 9,10,11.
La inyección intravascular in ovo en embriones de pollo es un método bien establecido y de uso común 12,13,14. En este documento, mostramos una descripción completa de este protocolo que incluye materiales de inyección, sitios, dosis y resultados representativos.
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Protocol
Todos los procedimientos relacionados con el cuidado y el uso de animales se ajustaron a las directrices del Instituto Nacional de Salud de los Estados Unidos (NIH Pub. No. 85-23, revisado en 1996) y los protocolos de embriones de pollo fueron aprobados por el Comité de Ética de Animales experimentales y manejo de animales de laboratorio de la Universidad de Yangzhou, China (No.201803124).
1. Recolección y preparación de óvulos fertilizados
NOTA: A diferencia de los mamíferos, el pollo tiene millones de folículos en un solo ovario, pero solo unos pocos de estos folículos son lo suficientemente maduros como para ovular. Cada folículo contiene un ovocito o célula germinal. Tan pronto como el folículo madura y libera su yema, se incorpora al embudo de la trompa de Falopio. A medida que el folículo entra en el abdomen yugular del oviducto, el semen se une al huevo en el cuerpo de la gallina, y el calcio en el cuerpo de la gallina forma una cáscara que envuelve el huevo fertilizado, formando un huevo de cáscara blanda en el cuerpo. La cáscara de calcio se espesa gradualmente hasta que se produce el huevo.
- Recolecte óvulos fertilizados de un vendedor o institución local, que se pueden almacenar a 16 ° C durante 1 semana.
NOTA: La alta temperatura de almacenamiento ayudará al embrión a desarrollarse, mientras que la baja temperatura disminuirá la viabilidad del embrión. Los embriones no se desarrollarán si el tiempo de almacenamiento es demasiado largo. - Frote la cáscara del huevo suave y lentamente con etanol al 75% antes de transferir los huevos a la incubadora.
- Coloque los huevos de lado, cuidadosamente en una rejilla en una incubadora a 37.8 ° C y 60% de humedad. Después de 60 h de incubación (etapa 17 de HH), los embriones desarrollarán vasos sanguíneos visibles y el corazón comenzará a latir15.
NOTA: Después de 2 días de incubación, aparecen pequeños puntos primordiales, la etapa temprana del corazón. Este proceso se llama cherrybeading. A ~ 2.5 días, el corazón y otros segmentos del cuerpo se forman con vasos visibles.
2. Preparación antes de la inyección
- Prepare capilares de vidrio que se utilizarán como agujas. Antes de la inyección, tire de los capilares de vidrio de 90 mm con un diámetro exterior de 1 mm y un diámetro interior de 0,6 mm con el extractor. Rompe las puntas con fórceps (el ángulo del capilar de vidrio suele ser de 45°) y esteriliza los capilares bajo luz UV durante 2 h.
- Prepare materiales exógenos como plásmidos, lentivirus envasados y PGC.
- Mezcle suavemente el plásmido pEGFP-N1 (un plásmido que expresa GFP mejorado, 1μg / μL) con liposoma en una proporción de 1: 3 (m / v). Añadir agua para obtener una concentración final de ADN de 10 ng/μL. Deje reposar la mezcla de ADN a 37 °C durante 20 min antes de la inyección.
- Descongelar los virus en hielo antes de la inyección. El título de lentivirus utilizado para la inyección debe ser superior a 5 x 106 Tu/mL.
- Diluir los PGC parentales o de gónadas modificadas (E4.5, HH etapa 24) a 2,000-5,000 células / μL.
NOTA: Aquí hemos mostrado el procedimiento de inyección usando azul tripano.
3. Ventanas
- Antes de exponer los embriones, esterilícelos limpiando suave y suavemente la superficie de las cáscaras de huevo con alcohol al 75% con una bola de algodón, asegurándose de esterilizar el borde romo de los huevos a fondo.
- Después de la esterilización, golpee suavemente el extremo romo con fórceps para crear una pequeña ventana (0,5 cm x 0,5 cm) en la superficie de la cáscara del huevo para exponer el embrión. Retire la membrana embrionaria y luego coloque el óvulo en el soporte bajo el microscopio de disección.
4. Inyección
- Busque vasos sanguíneos bajo el microscopio y ajuste el enfoque del microscopio de disección para localizar el embrión, y luego encuentre el vaso sanguíneo listo para la inyección.
- Llene la aguja de vidrio con la solución exógena (plásmido, lentivirus o PGC) usando una pipeta lentamente, evitando burbujas de aire en la aguja.
- Apunte la aguja con solución exógena al vaso sanguíneo, con la aguja paralela al vaso sanguíneo que se inyecta.
- Inserte suavemente la aguja llena en el recipiente y encienda la bomba para expulsar la solución (generalmente el volumen inyectado es de ~ 1-5 μL) bajo el microscopio. La presión de la bomba de aire debe ser lo suficientemente baja como para evitar la destrucción de los vasos, ya que la presión de aire excesivamente alta dañaría los vasos sanguíneos, lo que llevaría a un flujo de alta velocidad.
- Una vez que la solución exógena se inyecta en el vaso, asegúrese de que el color del vaso se convierta en el color de la solución y se recupere a rojo en 2-5 s, lo que indica que la solución exógena se entrega con éxito al vaso. En este punto, la solución ingresa a la arteria, y con el latido del corazón circula de regreso al embrión a través de la arteria y luego a la vena.
NOTA: Hay dos sitios de inyección para inyección vascular (Figura 1B): uno es la cabeza, donde la solución exógena se inyecta desde la vena en la cabeza del embrión y en el corazón a través del flujo sanguíneo, luego circula a todo el embrión con el corazón latiendo (Figura 1B, Flecha 1). Otra es a través de la aorta dorsal de la sangre embrionaria; la solución exógena se inyecta y se extiende a todo el embrión (Figura 1B. Flecha 2) con el latido del corazón embrionario.
- Una vez que la solución exógena se inyecta en el vaso, asegúrese de que el color del vaso se convierta en el color de la solución y se recupere a rojo en 2-5 s, lo que indica que la solución exógena se entrega con éxito al vaso. En este punto, la solución ingresa a la arteria, y con el latido del corazón circula de regreso al embrión a través de la arteria y luego a la vena.
- Después de la inyección, retire el óvulo del microscopio estereoscópico y deje caer 200 μL de solución de penicilina dentro de la cáscara del huevo. Cortar un trozo de cinta médica de 3 cm de largo y sellar la ventana. Raspe suavemente la cinta con tijeras para exprimir las burbujas de aire y luego corte otra pieza para sellar la abertura.
- Etiquete y coloque el huevo inyectado de nuevo en la incubadora e incube hasta la etapa de desarrollo requerida o la eclosión.
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Representative Results
Mostramos aquí la inyección intravascular in ovo de embriones de pollo. En la Figura 1 se muestra un proceso esquemático de la inyección intravascular; en nuestro estudio, utilizamos varias soluciones exógenas para probar y verificar la inyección.
Para visualizar mejor los materiales inyectados, se inyectó Trypan Blue (0,4%) como trazador en el embrión. Se observó que el marcador (azul) se difunde a todo el embrión a través de la circulación sanguínea mediante la aorta dorsal o la inyección en la cabeza (Figura 2). Los materiales inyectados en dos sitios diferentes pudieron propagarse a todo el embrión, lo que indica la difusión a través de la circulación sanguínea. La visualización del color azul confirma el éxito de la inyección.
El vector pEGFP-N1 se envolvió con PEI para lograr una concentración de 1 μg/μL, mientras que el vector lentiviral pLVX-EGFP se envolvió con PEI y se diluyó después de la titulación para lograr una concentración de virus de 5 x 106 Tu/μL. Los embriones de 2,5 días (estadio HH 14-15) se inyectaron con pEGFP-N1 envuelto o pLVX-EGFP. A los 4,5 días (estadio 24 de HH), los embriones fueron observados mediante microscopía de fluorescencia estereoscópica. Se observó fluorescencia verde en el embrión indicando la expresión del vector después de la inyección. Los resultados muestran que los plásmidos encapsulados por liposomas (PEI) y lentivirus envasados se expresaron en el embrión de pollo 2 días después de la inyección (Figura 3). Los resultados de la inyección de plásmidos y vectores lentivirales demostraron la expresión génica exógena en el embrión, lo que implica la posible aplicación en la transferencia de genes.
Los PGC fueron aislados de la cresta genital de embriones (E4.5, HH etapa 24) y cultivados para purificación como en la publicación anterior16. Los PGC inyectados fueron marcados con la proteína fluorescente roja (RFP). A los 6,0 días E (estadio 28 de HH), se aisló y observó la gónada de los embriones receptores. Los resultados mostraron que los PGC (puntos rojos) del donante fueron capaces de entrar y colonizar eficazmente las gónadas del receptor (Figura 4).
Figura 1: El esquema de la inyección intravascular. (A) La línea de tiempo de la inyección intravascular; (B) Dos sitios de inyección indicados por flechas negras, la cabeza (1) y la aorta dorsal (2); (C) El proceso de la inyección intravascular. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Difusión del tinte de trazado en diferentes sitios de inyección. Arriba: aorta dorsal; Abajo: Cabeza. Barra de escala = 50 mm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Expresión de GFP en embriones 2 días después del vector lentiviral y la inyección de plásmido encapsulado. Barra de escala = 100 mm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Visualización de pgCs inyectados marcados con fluorescencia roja en el embrión de pollo receptor. (E6.0, HH etapa 28) gónada. Barra de escala = 500 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
El método de inyección in ovo intravascular de embriones de pollo está optimizado para materiales exógenos (vectores, virales o PGC) que se transfieren al embrión. Basándonos en este método, construimos modelos de embriones de pollo con sobreexpresión o interferencia genética estable (SpinZ, JUN, UBE2I, etc.) 17,18,19. Estos modelos bien establecidos demuestran la viabilidad de este enfoque. Además, no solo transferimos PGC aislados a la gónada embrionaria del receptor, sino que también producimos con éxito la descendencia viable con gónada embrionaria trasplantada con PGC inducidos, lo que implica la gran aplicación de este método en el futuro20.
El paso crítico del método es la inyección. Los materiales exógenos deben inyectarse directamente en los vasos sanguíneos, no demasiado profundos o demasiado poco profundos. Por lo tanto, requiere experiencia trabajando con embriones de pollo y altas habilidades de inyección que podrían obtenerse fácilmente a través de la práctica. En comparación con la inyección de células de aire, la alta eficacia y precisión de la inyección se logran más fácilmente utilizando este método. Además de las limitaciones de alto costo y pasos complicados, la electrotransfección no se aplica cuando se hace una gran ventana, ya que puede conducir a una baja tasa de supervivencia.
Como método para la manipulación de genes en embriones de pollo, el método también tiene algunas limitaciones. Alrededor de la mitad de los huevos estaban muertos durante la incubación después de la inyección con una tasa de supervivencia del 40% -60%. Mientras tanto, la eficiencia de la entrega es otro factor importante a considerar, especialmente para la inyección de PGC (en nuestro caso, la eficiencia de la inyección de plásmidos y lentivirus es de ~ 50% -60%, y la de la inyección de PGC es de ~ 30% -40%). En el futuro, el protocolo puede optimizarse y la tasa de supervivencia puede aumentar considerablemente, mejorando aún más el campo de aplicación de este método.
En conclusión, este protocolo demuestra que la inyección intravascular del embrión de pollo in ovo es específica para materiales exógenos (vectores o PGC) que se transfieren a los embriones. Además, este método se puede aprender y aplicar fácilmente en muchos campos.
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Disclosures
No se declararon conflictos de intereses.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (31972547). Agradecemos la edición de Jing Wang y la voz en off de Malik Donlic en la Universidad Estatal de Washington, Estados Unidos.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fluorescence macro-microscope | OLYMPUS | MVX10 | |
| Glass Capillaries | Narishige | G1 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 12566014 | liposome |
| pEGFP-N1 vector | Clontech | #6085-1 | |
| PKH26 Red Fluorescent Cell Linker Kit | Sigma | PKH26GL | |
| pLVX-EGFP lentivirus vector | Addgene | 128652 | |
| Pneumatic Microinjector | Narishige | IM-11-2 | |
| Puller | Narishige | PC-100 | |
| Trypan Blue Stain | Gibco | 15250061 |
References
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