Summary
De subretinale implantatie van retinaal gepigmenteerd epitheel (RPE) is een van de meest veelbelovende benaderingen voor de behandeling van degeneratieve retinale ziekten. De uitvoering van preklinische studies op diermodellen met grote ogen blijft echter een uitdaging. Dit rapport presenteert richtlijnen voor de subretinale transplantatie van RPE op een celdrager in minivarkens.
Abstract
Degeneratieve aandoeningen van het netvlies (waaronder leeftijdsgebonden maculaire degeneratie), die voornamelijk ontstaan op of in de retinale gepigmenteerde epitheellaag (RPE), leiden tot een progressieve desorganisatie van de retinale anatomie en de verslechtering van de visuele functie. De substitutie van beschadigde RPE-cellen (RPE's) door in vitro gekweekte RPE-cellen met behulp van een subretinale celdrager heeft potentieel aangetoond voor het herstellen van de anatomische structuur van de buitenste retinale lagen en wordt daarom verder bestudeerd. Hier presenteren we de principes van een chirurgische techniek die de effectieve subretinale transplantatie van een celdrager met gekweekte RPE's in minivarkens mogelijk maakt. De operaties werden uitgevoerd onder algemene anesthesie en omvatten een standaard lenssparende driepoorts pars plana vitrectomie (PPV), subretinale toepassing van een gebalanceerde zoutoplossing (BSS), een 2,7 mm retinotomie, implantatie van een nanovezelige celdrager in de subretinale ruimte door een extra 3,0 mm sclerotomie, vloeistof-luchtuitwisseling (FAX), siliconentamponade en sluiting van alle sclerotomieën. Deze chirurgische aanpak werd gebruikt in 29 operaties (18 dieren) in de afgelopen 8 jaar met een slagingspercentage van 93,1%. Anatomische verificatie van de chirurgische plaatsing werd uitgevoerd met behulp van in vivo fundus beeldvorming (fundusfotografie en optische coherentietomografie). De aanbevolen chirurgische stappen voor de subretinale implantatie van RPE's op een drager in minipigogen kunnen worden gebruikt in toekomstige preklinische studies met diermodellen met grote ogen.
Introduction
Leeftijdsgebonden maculaire degeneratie (AMD) wordt beschouwd als de belangrijkste oorzaak van centraal verlies van het gezichtsvermogen in ontwikkelde landen en is een van de vele aandoeningen die verband houden met retinale gepigmenteerde epitheel (RPE) disfunctie 1,2. De RPE bevindt zich op het basaal gelegen Bruch-membraan (BM) en zorgt voor het nodige onderhoud voor de fotoreceptoren. De progressieve degeneratie van de RPE-laag is een kenmerk van de vroege atrofische vorm van AMD, en het gaat ook gepaard met de ontwikkeling van de late exsudatieve vorm van AMD. Ondanks de vele vooruitgang in de behandeling van netvliesaandoeningen, blijft de ontwikkeling van een effectieve behandelingsmodaliteit een uitdaging3. Een van de veelbelovende methoden is RPE-vervanging met behulp van een in vitro gekweekte RPE-laag. Deze behandeling is geassocieerd met vooruitgang in stamcelonderzoek met behulp van van menselijke embryonale stamcellen afgeleide RPE (hESC-RPE) en geïnduceerde pluripotente stamcel-afgeleide RPE (iPSC-RPE)3,4,5,6,7. In de afgelopen jaren hebben veel onderzoeksgroepen zich gericht op het ontwikkelen van verschillende benaderingen voor RPE-vervanging met de aanvankelijk geaccepteerde proof-of-concept 8,9,10,11,12,13,14,15. De RPE-cellen (RPE's) worden meestal in de subretinale ruimte afgeleverd in de vorm van een celsuspensie, een zelfdragend celblad of een celmonolaag ondersteund door een kunstmatige drager 3,16,17,18,19,20,21. Het injecteren van een celsuspensie is de gemakkelijkste methode, maar de gecompromitteerde toestand van de BM kan vaak de aanhechting van de getransplanteerde cellen voorkomen. Dit kan resulteren in een onjuiste apicobasale oriëntatie van de RPE's en het niet vormen van een monolaag22,23. Het belangrijkste voordeel van de andere twee methoden (d.w.z. een zelfdragende celplaat en een celmonolaag ondersteund door een kunstmatig substraat) is dat de cellen zich al in een gedifferentieerde monolaagtoestand bevinden wanneer ze rechtstreeks in de subretinale ruimte worden geïmplanteerd24.
Veel chirurgische technieken die de levering van celdragers in de subretinale ruimte beschrijven, zijn de afgelopen jaren gepubliceerd 8,9,10,11,12,13,14,15. Deze studies beschreven het gebruik van diermodellen met grote ogen, de soorten cellulaire dragers, het gebruik van getransplanteerde cellulaire culturen, de implantatie-instrumenten, evenals de chirurgische technieken, en de auteurs richtten zich voornamelijk op de resultaten van subretinale implantatie. In 2015 rapporteerden Popelka et al. het gebruik van een frame-ondersteund ultradun elektrospun polymeermembraan voor de transplantatie van RPE's in varkenskadaverogen8. De hier beschreven chirurgische techniek met subretinale implantatie van de celdrager maakte een relatief nauwkeurige behandeling van de drager en eenvoudige positionering van de steiger in de subretinale ruimte mogelijk. Kozak et al. beoordeelden de haalbaarheid van de toedieningstechniek van een drager met een geschatte grootte van 2 mm x 5 mm in varkensogen9. Het unieke ontwerp van de celdrager maakte de juiste plaatsing mogelijk, waardoor de cellulaire monolaag niet kon vouwen en rimpelen6. Al-Nawaiseh et al. presenteerden eerst gedetailleerde stapsgewijze richtlijnen voor subretinale steigerimplantatie bij konijnen25. Stanzel et al. publiceerden vervolgens in 2019 een soortgelijk protocol voor transplantatie bij kleine knaagdieren, konijnen, varkens en niet-menselijke primaten26. Zoals eerder gepubliceerd, resulteerde de transplantatie van een gedifferentieerde en gepolariseerde RPE-monolaag op een solide drager in een verbeterde overleving en een betere integratie van het transplantaat in vergelijking met andere toedieningstechnieken (aanvullend dossier 1)27.
Het doel van alle preklinische dierstudies die in vivo worden uitgevoerd, is om de verschillende aspecten van chirurgische transvitreale subretinale implantatie van een celdrager te onthullen met een focus op de procedureveiligheid, de overleving van de getransplanteerde cellen, de weefselrespons op de subretinale manoeuvres en de postoperatieve resultaten op korte en lange termijn. Het gebruik van varkensogen als diermodel met grote ogen is naar verluidt relevant voor de reikwijdte van de verkregen gegevens, die nuttig en mogelijk van toepassing kunnen zijn op mensen10,11,14. Onze studie rapporteert de chirurgische techniek die wordt gebruikt voor de in vivo subretinale implantatie van een celdrager in een diermodel met grote ogen. We presenteren een gedetailleerde beschrijving van de preoperatieve preparaten, de chirurgische techniek van subretinale celdragerimplantatie en de postoperatieve zorg voor de minipig-ogen op basis van onze ervaring in de afgelopen 8 jaar. We beschrijven de fundamentele chirurgische principes die kunnen worden gebruikt voor in vivo experimentele studies met de implantatie van verschillende soorten cellen en celdragers.
Groot diermodel
De experimentele kudde Liběchov minivarkens werd opgericht door in 1967 vijf dieren van de Hormel-stam uit de VS te importeren. Deze dieren werden gekruist voor varkensbloedgroepstudies met verschillende andere rassen of stammen: Landras, Large White, Cornwall, Vietnamese varkens en miniatuurvarkens van Göttingen-oorsprong28,29. Op de leeftijd van 5 maanden en ongeveer 20 kg lichaamsgewicht (BW) bereiken de minivarkens geslachtsrijpheid. De overleving van de ouderlijke minipig-rassen (Hormel en Göttingen) is naar verluidt 12-20 jaar. De subretinale implantatie van de celdrager richt zich op het centrale deel van het netvlies. Het netvlies van minivarkens mist een macula en fovea. Het heeft echter regio's met sterk geconcentreerde kegelfotoreceptoren die het gebied centraal en visuele strepen 30,31 worden genoemd. Deze regio's zijn verantwoordelijk voor de hoogste gezichtsscherpte.
De operaties werden uitgevoerd door vier ervaren vitreoretinale chirurgen met de hulp van een ervaren chirurgische facilitaire assistent (TA). Vóór de in vivo experimenten werden de chirurgen opgeleid en verkregen ze speciale kennis van minipig ooganatomie, zoals met betrekking tot de lagere verhouding van lens tot glasvocht, de kortere axiale lengte (15-19 mm), de afwezigheid van het Bowman-membraan in het hoornvlies, het kleinere glasvochtvolume (2,8-3,2 ml), de afwezigheid van de macula en fovea, de afwezigheid van de annulus van Zinn en de diameter van de optische schijf (verticaal/horizontaal: 1,5 mm/2,1 mm). In alle gevallen werd de operatie uitgevoerd onder algemene anesthesie in een speciaal georganiseerde operatiekamer met de implementatie van standaard aseptische en antiseptische maatregelen.
Protocol
Deze studie houdt zich aan de principes van de richtlijnen van de Verklaring van Helsinki en ethische principes voor medisch onderzoek met menselijke proefpersonen. Alle experimenten zijn uitgevoerd volgens de Richtlijnen voor de Verzorging en Het Gebruik van Proefdieren en volgens de Vereniging voor Visie- en Oogheelkunde (ARVO) voor het gebruik van dieren in oogheelkundig en visueel onderzoek. Het onderzoeksprotocol werd goedgekeurd door de Resort Professional Commission van het CAS voor goedkeuring van projecten van dierproeven aan het Instituut voor Dierfysiologie en Genetica van de Tsjechische Academie van Wetenschappen (Liběchov, Tsjechië) (goedgekeurd protocol nr. 60/2016 en nr. 64/2019).
1. Overwegingen bij de subretinale transplantatie van cellen op een drager in minivarkens
- Selectie van dieren
- Verkrijg en gebruik Liběchov minivarkens die 12-36 maanden oud zijn, van beide geslachten en ongeveer 40-80 kg lichaamsgewicht (BW).
- Houd de minivarkens binnen in een dierenhok met airconditioning met temperaturen tussen 18-22 °C, blootstelling aan een kunstmatige licht/donkercyclus van 13 uur/11 uur, gestandaardiseerde individuele hokken, gratis toegang tot water en tweemaal daags voeren.
- Voorbereiding voorafgaand aan de operatie
- Controleer op de chirurgische oriëntatie van het oog en teken de fundusschema's. Om dit te doen, verdeelt u het netvlies van de minivarkens op de fundustekening schematisch met behulp van een pen met een verticale lijn in de temporele (van de optische schijf naar het oor), nasale (van de optische schijf naar de snuit van het varken) en centrale (tussen de belangrijkste retinale vaten aan de neuszijde) regio's (figuur 1A, B).
- Selecteer alleen gezonde dieren zonder enige gedrags- en neurologische pathologie en met een normale kwaliteit van de huid, lichaamsopeningen, uitwerpselen en voedselconsumptie. Laat een bekwame dierenarts de klinische observatie uitvoeren en selecteer de dieren.
- Injecteer intramusculair 3 mg/kg lichaamsgewicht van ceftiofurhydrochloride (1 ml/kg) op de dag van de operatie.
- Preoperatieve immunosuppressie
- Bereid tacrolimus-eluterende polymeermicrosferen zoals beschreven in Wang et al. en Sevc et al. 32,33 met modificatie.
- Zorg ervoor dat de concentratie tacrolimus in de polymeermicrosferen 51,3 mg/g is, zoals bepaald door HPLC (Table of Materials).
- Voer een subcutane injectie uit van tacrolimus-geladen polymeermicrosferen in een dosis van 0,25 mg/kg lichaamsgewicht 6 dagen vóór de oogoperatie om afstoting van celtransplantaat te belemmeren. Dit wordt gedaan om de overleving van de menselijke RPE-donorcellen tijdens xenogene transplantatie in de minipig-ogen te garanderen.
- Injecteer de dieren intramusculair op de dag van de operatie met 80 mg depo-medrol en benzylpenicilline bij 1 ml / 10 kg, afhankelijk van het lichaamsgewicht.
- Anesthesie
- Induceer algemene anesthesie met een intramusculaire injectie van een mengsel van tiletamine (2 mg / kg), zolazepam (2 mg / kg), ketamine (2 mg / kg) en xylazine (0, 4 mg / kg) - TKX34,35 voorafgaand aan de operatie. Controleer de diepte van de anesthesie door een staat van bewusteloosheid en door het controleren van de pedaalreflex (een snufje van de interdigitale huid van het achterbeen), de hoornvliesreflex (een lichte aanraking van het hoornvlies), de pupilreflex (reactie op het licht) en de palpebrale reflex (een aanraking met het ooglid). Zorg ervoor dat het dier niet knippert. Bevestig de regelmaat van het hart en de ademhaling.
- Na de inductie van anesthesie, vervoer het verdoofde dier naar de operatiekamer op een liftwagen (figuur 2A).
- Plaats het dier op de operatietafel aan de linkerkant om een operatie aan het rechteroog mogelijk te maken (figuur 2B).
- Voer de aanpassing van het hoofd van het dier uit met behulp van piepschuimkussens om de meest geschikte positie van het centrale netvlies te bereiken voor implantatie (d.w.z. horizontaal en parallel aan de vloer) (figuur 2C).
- Plaats oogdruppels van 0,5% proparacaïnehydrochloride oftalmische oplossing in de conjunctivale zak drie keer 1 minuut uit elkaar om lokale anesthesie te induceren.
- Breng een adercanule in en intuber het dier met een endotracheale buis voor het inademen van de anesthesie (1,5% isofluraan) met behulp van een anesthesieapparaat uitgerust met een patiëntmonitor (figuur 2A, B).
- Dien ongeveer 15 minuten voor het begin van de oogoperatie een intramusculaire injectie toe van 1 ml Eficur per 16 kg lichaamsgewicht en 20 mg Depo-Medrol 1 (tabel met materialen).
- Handhaaf de fysiologische lichaamstemperatuur door het dier te bedekken met isothermische folie en voer de operatie uit zoals beschreven in rubriek 3.
- Controleer tijdens de operatie de temperatuur van het dier, samen met de hartslag en de zuurstofverzadiging in het bloed met behulp van een oorclip en een patiëntmonitor. Vermijd het verlagen van de lichaamstemperatuur onder 38 °C tijdens de procedures, wat wordt beschouwd als een veilige limiet36. Handhaaf de zuurstofverzadiging (>96%) en polsslag (70-90 slagen per minuut) gedurende het hele experiment.
- Wanneer de operatie is voltooid, schakelt u de stroom isofluraan uit en extubeert u het dier.
- Na spontaan ademhalen en ontwaken, breng de dieren over naar hun hokken.
- Opstelling operatiekamer
- Richt de operatiekamer in volgens de behoeften van de operatie op de ogen van het diermodel met grote ogen (figuur 3A, B). Pas de hoogte van de stoelen van de chirurg aan, evenals de hoogte van de microscoop, om een comfortabele positie voor de chirurgen te bereiken met betrekking tot de positie van de snuit van het varken.
Figuur 1: Schematische tekening van de retinale zones in minivarkens. (A) Schematische tekening van de retinale zones ten opzichte van de kop van de minipig; de gele ellips toont het gewenste gebied van subretinale implantatie, T verwijst naar het temporale retinale gebied en N verwijst naar het nasale retinale gebied. (B) Voorbeeld van het fundusschema na subretinale implantatie van de celdrager (geel) door middel van retinotomie (rood). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Vervoer en plaatsing van het dier. (A) Vervoer van het verdoofde dier naar de operatiekamer. B) Plaatsing van het dier tijdens intubatie. (C) Afstelling van de kop van het dier voor optimale toegang tot het centrale netvlies tijdens de operatie (rode pijl). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: De standaard operatiekameropstelling. (A) Schematische weergave van de positie van de chirurg (S = chirurg, A = assistent) ten opzichte van de positie van de operatietafel met het minipig, de operatiemicroscoop (OM), het vitrectomieapparaat (VM), de instrumentele tafel (IT) en het anesthesiologieapparaat (AM). Er zijn twee mogelijke posities van de vitrectomiemachine (geel en grijs). (B) Real-life setting in de operatiekamer. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
2. Celdrager, gekweekte celculturen en implantatie-injector
- Celdrager
- Snijd het 30 μm brede ovale frame met buitenafmetingen van 1,7 mm x 4,8 mm, uitgerust met driehoekige uitsteeksels asymmetrisch op het frame (figuur 4A), uit een bi-axiaal georiënteerde 36 μm dikke polyethyleen-tereftalaat (PET) folie met behulp van een femtoseconde laser.
- Bereid poly(L-lactide-co-DL-lactide) (LLA/DLLA 90/10, MW 868, 270 g/mol) polymeeroplossing in pyridine in een concentratie van 11 wt% met toevoeging van 2,2 μL mierenzuur per 1 g oplossing.
- Bereid het nanovezelige membraan voor met een ingebed ondersteunend frame (figuur 4B) door de polymeeroplossing elektrospinnen in drie stappen8: (1) deponeer de eerste laag nanovezels op een siliciumsubstraat, (2) plaats het frame op de laag en (3) zet de tweede laag nanovezels af.
OPMERKING: Deponeer elke laag gedurende 7 minuten om een totale membraandikte van 3,7 μm te bereiken. Gebruik de volgende parameters om een membraan te verkrijgen dat bestaat uit 380 nm dikke vezels en met een gemiddelde poriegrootte van 0,4 μm en een porositeit van ongeveer 70%37: een naald van 20 G, een spanning van 7,1 kV, een opening van 10 cm, een stroomsnelheid van 250 μL/min en een temperatuur van 25,0 °C ± 0,5 °C. - Verwijder voorzichtig het membraan met het ingebedde frame van het siliciumsubstraat en bevestig het aan het lichaam van een commerciële 12-putcelcultuurinzet zonder het oorspronkelijke membraan om het zaaien en de groei van cellen te vergemakkelijken.
- Behandel het nanovezelmembraan vóór het zaaien van cellen in luchtplasma gedurende 30 s met een vermogen van 70 W in een plasmareiniger.
- Celculturen die worden gebruikt voor kweek op de celdrager
OPMERKING: De volgende celdragers kunnen worden gebruikt: 1) nanovezelige celdragers zonder cellen; 2) nanovezelige celdragers met primaire menselijke RPE's (hRPE's); 3) nanovezelige celdragers met menselijke iPSC-afgeleide RPE-cellen.- Het kweken van primaire hRPE's
- Isoleer primaire hRPE-cellen uit menselijke donorogen volgens een eerder gerapporteerde techniek38.
- Verkrijg de cellen door enzymatische behandeling van het netvlies gedurende 30 minuten. Kweek vervolgens de primaire hRPE-cellen (passage 0) gedurende maximaal 2 weken in DMEM / F12 aangevuld met 10% foetaal runderserum (FBS).
- Zodra de celculturen confluentie bereiken, verander je het medium in 1% FBS en kweek je gedurende nog eens 30 dagen.
- Zaai de primaire hRPE's op trans-well platen en op een met laminine gecoate nanovezelige celdrager met een dichtheid van 2.000 cellen / mm2. Na nog eens 30 dagen incubatie in 1% FBS, gebruik de celdragers met primaire hRPE's voor subretinale implantatie in minivarkens.
- Menselijke iPSC-afgeleide RPE's
- Gebruik hiPSC's afgeleid van MERTK geassocieerde retinitis pigmentosa patiënt-afgeleide fibroblasten 39 die gen-gecorrigeerd zijn in twee allelen met behulp van het CRISPR /Cas9-systeem (RP1-FiPS4F1-GC2)40, evenals hiPSC's afgeleid van de fibroblasten van een gezonde proefpersoon (Ctrl2-FiPS5F2)41 die als controle worden gebruikt.
- Genereer en differentieer vervolgens beide hiPSC-cellijnen naar RPE-cellen (hiPSC-RPE) zoals eerder gemeld42.
- Plaats de hiPSC-RPE's op 200.000 cellen / cm2 op met laminine gecoate celkweekinzetstukken met nanovezelmembranen van poly (L-lactide-co-DL-lactide) met ovale implantatieframes in RPE-medium met knock-out DMEM, 20% knock-out serum, 0,1 mM niet-essentiële aminozuren, 0,23 mM β-mercaptoethanol, 100 U / ml penicilline, 0,1 mg / ml streptomycine en 10 mM nicotinamide.
- Verander het medium om de dag en kweek de hiPSC-RPE gedurende 2 maanden voorafgaand aan de implantatie om gepolariseerde groei te stimuleren.
- Implantatie injector
- Bereid een kunststof capillair met een rechthoekige doorsnede van 2,8 mm x 0,8 mm door blaasgieten uit een plastic buis van OD 1,75 mm / ID 1,10 mm.
- Knip een laadvenster van 4 mm x 2,2 mm in het kunststof capillair op 6 mm van het uiteinde.
- Monteer de injector uit het plastic capillair, een siliconen handvat, een zuiger met stalen mes en een zuiger (figuur 5A).
- Laad de drager in de injector via een laadvenster en werp deze later in de subretinale ruimte door een druk op de zuiger, zoals beschreven in stap 3.5.2 (figuur 5B).
- Voorbereiding van de nanovezeldrager en belasting van de injector
- Vul een kleine plastic petrischaaltje met 2 ml fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS). Haal een inzetstuk met de voorbereide cellaag eruit, plaats het op een halfzachte polystyreenschaal en centreer het onder een lichtmicroscoop. Gebruik een aangepaste pons om de drager langs het ovale frame uit te snijden met behulp van een microscoop. De afmetingen van de drager moeten 2 mm x 5 mm zijn.
- Gebruik een op maat gemaakte injector met platte transparante slang voor het laden van de drager; 6 mm van het distale uiteinde van het capillair is er een venster voor het laden van de drager. Vul het venster van de injector met PBS.
- Laat met behulp van de tang het monster los van de bodem van de schaal, til het uit de vloeistof en transporteer het naar het venster van de injector terwijl u eerst de zijoriëntatiemarkeringen op het frame controleert om de bovenzijde van de drager met aanhangende cellen te detecteren. Een ovaal frame vergemakkelijkt manipulatie met de drager.
- Plaats met behulp van een tandheelkundige sonde (een roestvrijstalen tandheelkundig instrument met een scherp uiteinde) de drager in het venster van de injector. Gebruik de zuiger om de drager in het gesloten en veilige bovenste deel van de injector te duwen. Bereid vervolgens de drager voor op een operatie.
- Controleer bij elke stap de zijrichting van de drager. Ontlaad de nanovezeldrager uit de injector door op de metalen zuiger te drukken.
Figuur 4: Nanovezelige drager met een ingebed ondersteunend PET-frame. (A) Drie zichtbare markeringen op het frame maken het mogelijk om de zijoriëntatie van de drager te bepalen (witte pijlen). (B) Vergrotingsweergave van het PET-framefragment ingebed in het nanovezelmembraan (witte pijlen) van de celdrager. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Implantatie-injector. (A) Delen van de injector. (B) Nanovezelige celdrager met ingebed ondersteunend PET-frame belast met het plastic rechthoekige capillair van de implantatie-injector. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
3. Chirurgische ingreep
- Chirurgische apparatuur
- Gebruik de volgende chirurgische apparatuur: een oogheelkundige chirurgische microscoop, een besturingssysteem voor operaties aan de voorste en achterste oogsegmenten, een contactloos vitreoretinaal chirurgisch systeem, een laserfotocoagulatieapparaat en een digitale camera.
OPMERKING: De standaardparameters die worden gebruikt bij vitrectomie, exo- en endo-cauterie en laserfotocoagulatieapparatuur zijn weergegeven in tabel 1.
- Gebruik de volgende chirurgische apparatuur: een oogheelkundige chirurgische microscoop, een besturingssysteem voor operaties aan de voorste en achterste oogsegmenten, een contactloos vitreoretinaal chirurgisch systeem, een laserfotocoagulatieapparaat en een digitale camera.
- Chirurgische instrumenten
- Steriliseer de herbruikbare chirurgische instrumenten met een mobiele autoclaaf stoomsterilisator of iets dergelijks volgens een standaardprotocol. De chirurgische instrumenten en materialen voor eenmalig gebruik die nodig zijn tijdens de operatie staan vermeld in de Materiaaltabel.
- Voorbereiding op de chirurgische stappen
- Na het verdoven van het dier zoals beschreven in stap 1.4.1, breng 1% tropicamide-oplossing oogdruppels en 10% fenylefrinehydrochloride-oplossing aan in de conjunctivale zak 15 minuten vóór de procedure om door geneesmiddelen geïnduceerde mydriasis te veroorzaken.
- Benader de operatietafel met de chirurg in de bovenste positie en de assistent in de zijpositie (figuur 3).
- Scheer het gebied rond het oog met een scheermes voor eenmalig gebruik en verwijder het ruwe vuil.
- Desinfecteer de conjunctivale zak met 5% povidon-jodiumoplossing gedurende 5 minuten.
- Desinfecteer het periorbitale gebied met wattenstaafjes door van de oogleden naar de periferie te schrobben. Herhaal het proces drie keer met een 10% povidon-jodiumoplossing en laat het 5 minuten inwerken.
- Bedek het operatieveld met het oog in het midden met behulp van een standaard steriel oogheelkundig gordijn met kleverige transparante folie. Beweeg de wimpers weg van de oogbol. Vermijd het snijden van de wimpers om het risico op postoperatieve endoftalmitis te verminderen.
- Plaats het ooglidspeculum (Liberman-type of Cook eye speculum). Bevestig eventueel het nictitating membraan op de huid met 8-0 polyglactine hechtdraad.
- Open het bindvlies aan de neuszijde op 2 mm tot 3 mm van de limbus om de sclera voor de sclerotomieën bloot te leggen met behulp van een chirurgische tang en een Westcott conjunctivale schaar.
- Plaats de driekleps 25 G trocars op 2,5-3 mm van de limbus in het gebied van de pars plana (plaats ze op 7 uur, 10 uur en 11 uur). Gebruik roterende bewegingen tijdens het inbrengen op een enigszins schuine manier (100°-110°) naar het achterste netvlies en houd de trocar vast met de tang (figuur 6).
- Houd het hoornvlies nat of bedek het met methylcellulose tijdens de hele operatie om osmotisch hoornvliesoedeem te voorkomen.
- Pars plana vitrectomie (PPV)
- Verwijder het middelste gedeelte van het glasachtig lichaam met de standaard driepoorts pars plana vitrectomiebenadering. Verwijder voorzichtig het glasvocht achter de lens in het gebied van de toekomstige grote sclerotomie.
- Gebruik een intravitreale 2-4 mg triamcinolonacetonide (TA) injectie (50-100 μL) om het achterste glasvocht te kleuren, dat meestal aan het netvlies blijft kleven, om een gecontroleerde achterste glasvochtloslating uit te voeren.
- Voer daarna langzaam een subretinale injectie van 0,05-0,1 ml BSS uit met een canule van 41 G meer centraal, waarbij de vorming van een bleb naar de periferie wordt vermeden.
- Verlaag de intraoculaire drukinstellingen met het irrigatiesysteem tot 15 mmHg tijdens de subretinale injectie om een voorbijgaande retinale vasculaire occlusie te voorkomen.
- Voer een lineaire grote endodiathermie van het netvlies uit met een 27 G endodiathermiesonde 3 mm in de buurt van de neusblebbasis.
- Maak daarna een 3 mm grote retinotomie met een MVR-mes van 25 G of een verticale schaar met een verhoogde intraoculaire druk (IOP) instelling van het irrigatiesysteem tot 60 mmHg gedurende 3 minuten tot 5 minuten. Zorg ervoor dat er geen bloeding is van de retiotomie en verlaag vervolgens de IOP tot 25 mmHg.
- Voer een exodiathermie uit van de episclerale vaten tussen de twee neustrocars op 2,5-3 mm van de limbus met een 27 G endodiathermiesonde door een zachte aanraking op het oppervlak van de sclera aan te brengen.
- Controleer het vloeistofniveau van de infuusfles voordat u de sclerotomie vergroot, omdat na sclerotomievergroting het vochtverbruik tijdelijk hoog is.
- Maak een 3,0 mm grote sclerotomie, 3 mm van de limbus, met behulp van een 2,75 mm phaco-mes.
- Besteed aandacht aan mogelijke bloedingen uit de sclerale vaten en het ciliaire lichaam in de grote sclerotomie. Gebruik in het geval van bloeding een 27 G endodiathermiesonde om de beschadigde bloedvaten te stollen. Vergroot de sclerotomie tot 3,0 mm met een satijnen mes om plaats te bieden aan de punt van de injector (0,8 mm x 2,8 mm).
- Verwijder het verzakte glasachtig lichaam op de plaats van de grote sclerotomie met een vitrector. Houd de infusie van BSS op het niveau van 25-30 mmHg met het vitrectomiesysteem om instorting van de bol te voorkomen.
- Implantatie van de celdrager
- Steek de injector voorzichtig met de dominante hand in de glasachtige holte door de grote sclerotomie. In geval van resistentie, vergroot de grootte van de sclerotomie.
- Implanteer de celdrager via de retinotomie in de subretinale ruimte. Gebruik indien nodig een bimanuele techniek met extra sclerotomie en kroonluchterlicht om de controle van de implantatie te verbeteren.
- Trek de injector uit het oog en sluit de grote sclerotomie met een 8-0 Polyglactine-hechting om complicaties geassocieerd met intraoculaire hypotonie te voorkomen.
- Voer een volledige vloeistof-luchtuitwisseling (FAX) en drainage van de subretinale vloeistof uit met een canule met siliconenpunt.
- Injecteer daarna siliconenolie (1.000 cSt) in de glasvochtholte met behulp van het vitrectomiesysteem en het slangensysteem voor siliconenolie-injectie totdat de IOP normaal is.
- Intraoperatieve beeldvorming en documentatie
- Voer een video-opname uit tijdens de hele operatie met fotodocumentatie van de belangrijkste stappen van implantatie met behulp van een video-opnamesysteem.
- Voltooi de fundustekening door de locatie van de sclerotomieën, retinotomie, subretinale implantatie en eventuele complicaties die zich hebben voorgedaan te documenteren met behulp van fundustekenschema's.
- Stappen na de operatie
- Verwijder aan het einde van de operatie de trocars en sluit de drie sclerotomieën en het bindvlies met 8-0 polyglactine hechtingen.
- Spoel de conjunctivale zak af met 5% povidon-jodiumoplossing.
- Voer een 0,3 ml subconjunctivale injectie uit van 20 mg gentamicine, 2 mg dexamethason en 2% xylocaïne.
- Controleer de conditie van de fundus en lens met behulp van een microscopische weergave.
- Verwijder de hechtdraad(en) van het nictitating membraan met behulp van een chirurgische tang en Westcott conjunctivale schaar (optioneel).
- Breng neomycine zalf of ofloxacine oftalmische zalf aan in de conjunctivale zak.
Figuur 6: Inbrengen van de trocars in het oog van een minipig. (A) Schematische weergave van de trocars, die loodrecht in de sclera worden ingebracht in de richting van het midden van de glasvochtholte in het menselijk oog (grijze kleur) en op een schuine manier in de richting van het achterste netvlies in het minipigoog (blauwe kleur) om schade aan de lens te voorkomen. De lens van de minipig (blauw gekleurd) is groter dan die bij mensen en ten opzichte van de glasvochtholtegrootte. B) Intraoperatieve weergave van de ingebrachte trocars in een PPV met drie poorten. Het hoornvlies is bedekt met methylcellulose om uitdroging en zwelling te voorkomen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
4. Postoperatieve zorg
- Breng topisch bacitracine zink / hydrocortisonacetaat / neomycinesulfaat of 0,3% vanloxacine vijf keer per dag aan in de conjunctivale zak van de dieren.
- Controleer postoperatief de volgende oogparameters: turgor van de zachte weefsels van het oog met behulp van palpatie, ontstekingsreactie op het oogoppervlak en loensen als een beschermende reactie van de oogleden met behulp van een draagbare spleetlamp of indirecte oftalmoscoop.
- Gebruik voor systemische postoperatieve zorg de volgende antibiotica:
- Injecteer intramusculair ceftiofurhydrochloride in een dosis van 3 mg/kg lichaamsgewicht (1 ml/kg) op de tweede en derde dag van stabiliteit.
- Injecteer tulathromycine (1 ml/40 kg lichaamsgewicht) na 72 uur na de operatie voor de preventie van secundaire bacteriële infectie.
- Voer elke 24 uur na de operatie een intramusculaire injectie uit van flunixine (2 ml / 45 kg levend gewicht) en tramadolhydrochloride (100 mg) om 3 dagen na de operatie om pijn te voorkomen.
- Bewaar de minivarkens in een gespecialiseerde faciliteit met airconditioning met een temperatuurbereik van 18-22 °C en een kunstmatig licht/donker-regime van 13 uur/11 uur.
- Zorg ervoor dat ze vrije toegang hebben tot water en standaardvoeding (twee keer per dag).
5. Postoperatieve procedures
- Postoperatief oogheelkundig onderzoek
- Inspecteer in de postoperatieve periode de ogen met een indirecte oftalmoscoop op de aanwezigheid van ontsteking (d.w.z. roodheid, zwelling van het weefsel of slijmcongestie in de conjunctivale zak). Meet de intraoculaire druk in het geopereerde oog met behulp van de palpatiemethode.
- Postoperatieve beeldvorming
- Induceer sedatie in het minipig door de intramusculaire injectie van een TKX-mengsel vóór fundusfotografie en OCT-onderzoek. Inbreng 1% tropicamide en 10% fenylefrinehydrochloride oogdruppels in de conjunctivale zak van het minipig om mydriasis te induceren.
- Gebruik een ooglidspeculum om open ogen te houden. Voor het hydrateren van het oogoppervlak en voor het verkrijgen van een duidelijk OCT-beeld, wast u het hoornvlies van het dier elke 30-60 s met een zoutoplossing (0,9% NaCl).
- Plaats het minipig op dezelfde manier op de operatietafel als tijdens de operatie (figuur 2B,C, figuur 3A). De belangrijkste vereiste is om de kop aan de zijkant en loodrecht op het scanstuk van het OCT-apparaat te plaatsen. Gebruik piepschuimen pads onder de snuit van het dier om het hoofd te stabiliseren en het oogoppervlak in een horizontale positie te brengen.
- Verzamel kleurenfundusafbeeldingen met een niet-mydriatische funduscamera in kleur, omdat dit het mogelijk maakt om het voorste segment, het netvlies en de optische schijf te documenteren. Maak bovendien een roodvrije opname van het netvlies met de niet-mydriatische funduscamera.
- Voer optische coherentietomografie uit met behulp van het spectraal-domein OCT-systeem. Kantel tijdens de OCT- of fundusbeeldvorming het hoofd van de minipig handmatig in de richting van de OCT-lenzen of funduscameralenzen om het zicht op het achterste netvlies en het gebied van implantatie te optimaliseren (figuur 2C). Voor een optimale beeldvorming van de geïmplanteerde drager op de fundus, past u het infraroodreflectielicht van het OCT-apparaat toe om op het implantaat te focussen (figuur 2C). Gebruik de scanmodi OCT-kruislijn- en retinakaart.
- Breng ofloxacine oftalmische zalf aan het einde van het onderzoek aan onder het ooglid van het dier.
- Verplaats het minivarken naar de binnenfaciliteit en observeer voor zijn algemene toestand tot het einde van de sedatie (ongeveer 2 uur tot 5 uur).
6. Enucleatie van het oog post mortem na euthanasie
- Verdoof de minivarkens met een intramusculaire injectie van het TKX-mengsel gevolgd door een intraveneuze (via een 22-G oorcanule) bolustoediening van 1% propofol (20 ml / dier) gevolgd door exsanguinatie. Gebruik geen algemene fixatieven.
- Offer de dieren op door exsanguinatie tijdens diepe algemene anesthesie 7 dagen, 14 dagen, 28 dagen en 42 dagen na celtransplantatie.
- Gebruik een tang en een schaar om de bovenste en onderste oogleden te verwijderen. Verwijder het derde ooglid en snijd door het bindvlies. Snijd de oogspieren en de oogzenuw door.
- Enucleate de ogen post mortem met behulp van chirurgische schaar en chirurgische tang. Zorg ervoor dat de procedure wordt uitgevoerd door een ervaren persoon.
Representative Results
De resultaten van de subretinale implantatie van de celdrager bij Liběchov minivarkens worden gepresenteerd in T-able 2. Succesvolle implantatie werd gedefinieerd als het verkrijgen van voldoende gegevens voor histologisch en immunohistochemisch onderzoek. Mislukte gevallen werden gedefinieerd als ogen met ernstige intraoperatieve complicaties, die verdere observatie van de oogweefsels onmogelijk maakten.
De toepassing van de voorgestelde techniek met het gebruik van siliconentamponade maakt het mogelijk om de toestand van de subretinale transplantatie te beheersen met behulp van beeldvormingsmodaliteiten vanaf de volgende dag na de operatie tot het moment van enucleatie (figuur 7, figuur 8 en figuur 9).
Fundus imaging en SD-OCT
De minivarkens werden in de postoperatieve periode onderzocht met behulp van fundus imaging, roodvrije beeldvorming en spectrale domein optische coherente tomografie (figuur 7). Hoogwaardige fundusbeeldvorming werd mogelijk gemaakt door gebruik te maken van heldere optische media, waaronder een heldere lens en het gebruik van siliconentamponade (figuur 7A). De plaats van de retiotomie vertoonde geen tekenen van een proliferatieve reactie (figuur 7A, gele pijlen) en het PTE-frame van de celdrager was duidelijk zichtbaar door de semi-transparante lagen van het netvlies van varkens. Op de roodvrije beeldvorming verschilde de reflectiviteit van de gekweekte hRPE's op de drager niet van de reflectiviteit van de endogene RPE-laag van varkens (figuur 7B). Op de SD-OCT veroorzaakte het PTE-frame slechts een kleine schaduw van de onderliggende anatomische structuren en een lichte verdikking van het netvlies (figuur 7C, rode pijlen). Er werden geen atypische hypo- of hyperreflecterende zones opgemerkt op de SD-OCT en het membraan van de Bruch leek ook onbeschadigd te blijven. Figuur 8 toont fundus- en iOCT-beelden van de steiger gekweekt met primaire menselijke RPE-cellen 1 maand na de operatie (figuur 8). De celdrager zelf (zonder cellen) veroorzaakte geen significante toename van de netvliesdikte (figuur 9C). Deze bevindingen suggereren dat de intraoperatieve iatrogene impact van het implantaat minimaal was en dat de geïmplanteerde celdrager voldoende aanpassing van de geïmplanteerde cellen aan de bovenliggende fotoreceptorcellen en neuroretinale weefsel onderging.
Figuur 7: Postoperatieve beeldvorming van het netvlies bij minivarkens . (A) Fundus beeldvorming, (B) Rood-vrij beeld, en (C) optische coherentie tomografie beeldvorming van de nanofibrous drager met primaire menselijke RPE cellen in een follow-up van 1 week na subretinale transplantatie in een minipig oog. (A) De gele pijlen geven de plaats van retiotomie aan. (B) Rode pijlen tonen de marges van de nanovezelige celdrager. (C) De rode pijlen tonen de lichte schaduw van het OCT-signaal veroorzaakt door het ondersteunende PET-frame van de nanovezeldrager, die in de subretinale ruimte werd geïmplanteerd. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 8: Fundus beeldvorming en iOCT beelden van de steigers 30 dagen na subretinale implantatie in de minivarkens. A, B, C, D en E komen overeen met respectievelijk varkens 169, 182, 179, 199 en 224. De gele pijlen verbeelden het frame van de steiger. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Histologische en immunohistochemische analyse
Na de euthanasie van de dieren werden hele minipig-ogen verwijderd en gedurende 24 uur gefixeerd in 4% paraformaldehyde (PFA). Het voorste deel van het oog werd verwijderd en de geïmplanteerde nanovezeldrager werd geïdentificeerd in het centrale netvlies van de neus en geïsoleerd met de sclera bevestigd. Alle weefsels werden gecryoprotected in gegradeerde sucrose-oplossingen en verticale bevroren secties werden gesneden, zoals beschreven in detail43. Histologie van het nanofibrous membraan zonder RPE-cellen na 4 weken implantatie onthulde netvliezen zonder ontsteking en degeneratieve veranderingen (figuur 9A). De aanwezigheid van het nanovezelmembraan werd gedetecteerd in gepolariseerd licht (figuur 9B).
Figuur 9: Histologische analyse van het geïmplanteerde acellulaire nanovezelmembraan. Hematoxyline-eosine kleuring van het acellulaire nanofibrous membraan 4 weken na implantatie (A) met standaard verlichting en (B) met gepolariseerde lichtmicroscopie. De witte pijl geeft de nanovezelachtige membraanlokalisatie aan (schaalbalk: 50 μm). (C) In vivo optische coherentietomografiefoto's van het acellulaire nanovezelmembraan na 4 weken na implantatie tonen een goede acceptatie en hechting van het nanofibrous membraan in de subretinale ruimte. De witte pijl geeft de locatie van het implantaat aan in de dwarsdoorsnede van het netvlies. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 10 toont de hematoxyline-eosine (H&E) kleuring van het retinale gebied met de geïmplanteerde primaire hRPE-cellen op een nanovezelachtige drager (gele pijl) in het minipigoog. Het gepigmenteerde uiterlijk van de geïmplanteerde primaire hRPE's vormde een continue maar onregelmatig gepigmenteerde laag (figuur 10, rode pijlen). Na langere observatieperioden (6 weken) vertoonde het neuroretina onder de implantaten een rozetachtig of hypertrofisch reactie-achtig uiterlijk rond de retinotomieplaats, waarschijnlijk als gevolg van iatrogene manipulatie. Deze morfologische resultaten zijn vergelijkbaar met de SD-OCT-bevindingen en ondersteunen het bewijs voor de minimale impact van dragerschap op het netvliesweefsel.
Figuur 10: Histologische analyse van het geïmplanteerde nanovezelmembraan met de primaire hRPE's. Hematoxyline-eosinekleuring van het retinale gebied met de geïmplanteerde nanovezeldrager (gele pijl) met de primaire hRPE's in het minipigoog. Het dier werd 6 weken na implantatie geëuthanaseerd en geanalyseerd. De primaire hRPE's waren duidelijk te onderscheiden door hun grootte, ronde vorm en pigmentatie (rode pijlen) in de subretinale ruimte tegenover de fotoreceptoren. De fotoreceptorkernen in de ONL bouwen rozetachtige structuren. De subretinale ruimte lijkt hypertrofisch. Afkortingen: hRPE = primair menselijk retinaal gepigmenteerd epitheel, ONL = buitenste nucleaire laag, INL = binnenste kernlaag. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Immunostaining werd uitgevoerd met behulp van een indirecte methode in twee stappen. De secties werden 's nachts bij kamertemperatuur geïncubeerd in CRALBP, een monoklonaal primair antilichaam, met een verdunning van 1:100. Immunofluorescentie werd uitgevoerd met Alexa Fluor 488-geconjugeerd secundair antilichaam.
De geïmplanteerde primaire hRPE's waren aanwezig in het gebied van implantatie en drukten de typische RPE CRALBP-marker tot expressie vergelijkbaar met de endogene minipig RPE-cellen (figuur 11A). Daarentegen bleek de morfologie van de geïmplanteerde cellen na implantatie geen monolaagvorm aan te nemen, maar bleef gelokaliseerd binnen de gedefinieerde subretinale ruimte (figuur 11A, B, witte pijlen). De volgende RPE/retinale markers en morfologisch uiterlijk bleven positief na de periode van 6 weken na implantatie: de aanwezigheid van pigment/melaninekorrels, de eindstadium retinale specifieke neuronale markers voor de staaf bipolaire (PKC-alfa) en de kegelfotoreceptoren (PNA), en de GFAP-positiviteit - een teken van microgliale activering.
Figuur 11: Immunolabeling met de RPE-celmarker CRALBP (cellulair retinaldehydebindend eiwit) in een minipig 6 maanden na implantatie van primaire hRPE's. (A) Verticaal bevroren delen van het behandelde varkensoog werden immunogelabeld met CRALBP monoklonaal antilichaam (groen) en gecounterd met DAPI (blauw). (B) Enkele afbeelding van celkernen labeling met DAPI in zwart-wit, omdat hoog contrast de ronde vorm van de individuele hRPE-cellen onthult (sommige weergegeven met witte pijlen). Afkortingen: hRPE = menselijk retinale pigmentepitheel, ONL = buitenste nucleaire laag. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Oculaire complicaties
In totaal waren er 27 van de 29 (93,1%) succesvol uitgevoerde operaties. De definitie "met succes uitgevoerde operaties" werd toegepast op die gevallen waarin het geopereerde oog geen klinisch significante postoperatieve complicaties vertoonde tot het moment van enucleatie die het histologische en immunohistochemische onderzoek konden beïnvloeden. Verminderde transparantie van de optische media beïnvloedde de postoperatieve beeldvorming in vier gevallen (13,7%); Niettemin werden deze ogen verwerkt met verdere histologische en immunohistochemische analyse.
Intraoperatieve perifere netvliesloslating trad op in vier gevallen (13,8%). In twee gevallen werd het beheerd door aspiratie van de subretinale vloeistof tijdens vloeistof-gasuitwisseling en de toepassing van laserfotocoagulatie van het netvlies in het gebied van loslating. In de andere twee gevallen (6,9%) was de netvliesloslating geassocieerd met massale retinale en subretinale bloedingen, wat implantatie van de celdrager onmogelijk maakte en leidde tot de beëindiging van de operatie en onmiddellijke euthanasie van het minivarken terwijl het op de operatietafel lag.
| Nee | Parameters | Standaard gebruikte instellingen |
| 1 | Vitrectomie snelheid (snijsnelheid) | tot 20.000 sneden/min |
| 2 | Venturi pomp | 50-180 mmHg |
| 3 | Opkomsttijd | 1 sec |
| 4 | Irrigatiedruk | 18-25 mmHg |
| 5 | Luchtinfusiedruk | 20-25 mmHg |
| 6 | Bipolaire exodiathermie | 18-26% |
| 7 | Monopolaire endodiathermie | 16-18% |
| 8 | Laser fotocoagulatie van het netvlies, 532 nm | Vermogen 100-150 mW |
| Interval 100 ms | ||
| Duur 100 ms |
Tabel 1: Standaardparameters die worden gebruikt tijdens vitrectomie en laserfotocoagulatie.
| Totaal dieren, n | 18 |
| Totaal aantal ogen, n | 36 |
| Geopereerde ogen, n | 29 |
| Succesvolle implantatie, n | 27 |
| Mislukte zaken, n | 2 |
| Gemiddelde operatietijd, min | 57 |
| Slagingspercentage, % | 93.1 |
Tabel 2: Resultaten van de gestandaardiseerde chirurgische techniek met subretinale implantatie van de celdrager in Liběchov minivarkens tussen 2016 en 2020.
Aanvullend dossier 1: Samenvatting van de studies gewijd aan de subretinale implantatie van RPE-cellen op de celdrager. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Discussion
De subretinale implantatie van RPE-cellen met verschillende oorsprong is een veelbelovende trend in oogonderzoek voor de behandeling van retinale degeneratieve aandoeningen, zoals AMD 3,4,8,9,10,11,12,13,14,15,25 . Het belangrijkste idee van deze aanpak is om de beschadigde RPE's te vervangen door gezonde RPE's die ex vivo zijn gekweekt (Aanvullend Dossier 1)44,45,46,47,48. Het gebruik van celdragers om de gekweekte RPE-cellen te transplanteren is de meest redelijke benadering, omdat de poreuze membranen de gepolariseerde RPE-cellaag in de juiste oriëntatie houden ten opzichte van de fotosensorische laag.
Optimaal diermodel
Een cruciale stap in de ontwikkeling van dergelijke behandelingsbenaderingen is het gebruik van het optimale diermodel49. In het verleden zijn kleine en grote diermodellen gebruikt, waaronder konijnen, honden, varkens en niet-menselijke primaten 8,9,10,11,12,13,14,15,27,29. In dit artikel stellen we het gebruik van het Liběchov minipig-model voor en beschrijven we de preoperatieve, chirurgische en postoperatieve stappen die robuuste transplantatie-efficiëntie mogelijk maken. De Liběchov minipig werd oorspronkelijk ongeveer 20 jaar geleden gefokt en is veelvuldig gebruikt in biomedisch onderzoek op het gebied van neurodegeneratieve ziekten, zoals Parkinson en de ziekte van Huntington29,50. Omdat het varken een relatief groot brein bezit heeft met een bloedtoevoer en immunologische respons vergelijkbaar met die bij mensen, is het ook gebruikt als een diermodel voor allogene transplantatie-experimenten51,52,53,54. Hoewel het netvlies van de minivarkens geen mensachtige macula en fovea bezit, bevat het de centrale en visuele strepen van het gebied, die gebieden van het netvlies zijn met een hoge concentratie kegelfotoreceptoren30. De vergelijkbare grootte als het menselijk oog, de aanwezigheid van een met kegels verrijkt centraal netvlies, het goed beschreven immuunsysteem en de aanwezigheid van methoden om de morfologie en functie na de operatie te beoordelen, zijn belangrijke argumenten voor het gebruik van dit grote diermodel in de gepresenteerde studie.
Chirurgische ingreep
Voor zover bekend zijn er geen gestandaardiseerde en algemeen aanvaarde chirurgische technieken voor de vitreoretinale transplantatie van RPE-cellen op dragers. Een van de belangrijkste problemen van celvervangingstherapie is de uitdagende chirurgische techniek die een risico heeft op intraoperatieve en postoperatieve complicaties die verband houden met netvliesloslating, hypotonie, episclerale, choroïdale en / of retinale bloedingen en hoge intraoculaire turbulentie, wat kan leiden tot steigerschade. Postoperatief is er een risico op proliferatieve vitreoretinopathie, endoftalmitis, hypotonie, netvliesloslating en cataractvorming 4,10,13,14,15.
De eerste studies naar benaderingen met celdragers werden uitgevoerd bij chinchilla bastaardkonijnen13,16,25. Hoewel deze dieren een klein diermodel vertegenwoordigen, waren de resultaten gericht op de technische aspecten van de operatie cruciaal in de ontwikkeling van de procedures in grote diermodellen en worden daarom hieronder samengevat.
Een op maat gemaakte 23 G infusiecanule werd aanvankelijk gebruikt met twee zijpoorten om de straalstroom om te leiden, wat hielp om de ineenstorting van de bleb en de daaruit voortvloeiende netvliesloslating op te lossen13. In de huidige studie hebben we een dergelijke instorting van de bleb niet opgemerkt. De mogelijke reden daarvoor zou de grotere omvang van de oogbol kunnen zijn en de prestaties van de kernvitrectomie met gespaard glasvocht aan de periferie op de infuusplaats van de canule, wat de kracht van de gerichte straalstroom zou kunnen verminderen.
Moeilijkheden tijdens het uitwerpen van de celdrager uit het instrument waren een ander intraoperatief obstakel in de modellen voor kleine dieren, die werden gecategoriseerd als "gevangen met het instrument". Bovendien suggereerden de auteurs dat het resterende glasvocht op het netvliesoppervlak een achterwaartse "sprong" van de drager uit de retinotomieopening zou kunnen veroorzaken na implantatie. Dit probleem kan worden opgelost met een enzymondersteunde vitrectomie, die een soepele, continue uitwerping van de celdrager in de subretinale ruimte mogelijk maakt. In de meeste gevallen verplaatsten de auteurs de drager om een verder weg gelegen locatie van het implantaat te verkrijgen, weg van retinotomie. In onze casusserie hebben we ook een situatie meegemaakt waarbij de celdrager vast bleef zitten aan de punt van de injector. Dat werd echter beheerd door langzame en zachte manipulatie van de lichtpijp en de punt van de injector. Wij hebben in geen van onze gevallen resterend glasvocht waargenomen op de plaats van retinotomie. Het gebruik van TA-geassisteerde PPV in de operaties kan worden voorgesteld als een methode om het risico op restgehecht glasvocht te verminderen. Meervoudige kleuring met TA kan nodig zijn om het bovenliggende glasvocht volledig te verwijderen.
In een andere studie werden de resultaten van subretinale implantatie van menselijke RPE-stamcellen gekweekt als een gepolariseerde cellulaire monolaag op een polyestermembraan gerapporteerd24. Tijdens de experimenten werd dezelfde eerder beschreven chirurgische techniek gebruikt13, maar een PPV-benadering met twee poorten werd toegepast. Ten slotte werd vervolgens een stapsgewijs protocol voor de subretinale implantatie van celdragerchirurgie bij konijnen gepubliceerd25. Deze studie presenteert een zeer gedetailleerde en gemakkelijk herhaalbare beschrijving van de chirurgische procedure, inclusief preoperatieve en postoperatieve zorg, die ook gebaseerd zijn op eerdere ervaringen.
Tijdens het gebruik van grote diermodellen in latere studies werden niet alleen technische vragen behandeld, maar ook vragen over de immuunreactie op de getransplanteerde cellen, evenals celdragergrootte-gerelateerde problemen. Een studie met cynomolgusapen (Macaca fascicularis) beschreef de resultaten van de subretinale implantatie van van menselijke stamcellen afgeleide RPE-monolagen15. Alle dieren ondergingen systemische immunosuppressie, die bestond uit sirolimus (oplaaddosis van 2 mg, dagelijkse dosis van 1 mg) en tetracycline (7,5 mg/kg- LG) vanaf 7 dagen voorafgaand aan de operatie en 3 maanden na de operatie. De chirurgische ingreep werd uitgevoerd volgens eerder beschreven protocollen24,25. De auteurs gebruikten een 25 G driepoorts PPV-benadering met kroonluchter endo-verlichting. Belangrijk is dat een TA-geassisteerde PVD werd gebruikt om resterende vitreoretinale adhesie op het achterste netvlies uit te sluiten. Als aanvulling op de oorspronkelijk beschreven procedure verwijderden de auteurs de host RPE-laag op het gebied van toekomstige implantatie met behulp van een op maat gemaakt uitschuifbaar lusinstrument van 20 G.
In onze minipig-studie gebruikten we ook systemische immunosuppressie. Het type immunosuppressie verschilde echter van het hierboven beschreven type. We dienden een subcutane injectie van tacrolimus-eluterende polymeermicrosferen toe als depot in een dosis van 0,25 mg/kg lichaamsgewicht om afstoting van celtransplantaten en ontstekingsreacties te belemmeren. We hebben de gastheer RPE-cellaag niet verwijderd tijdens de operatie, omdat ons primaire doel was om de veiligheid van de procedure en de levensvatbaarheid van de geïmplanteerde cellen te analyseren, maar niet hun integratie in het netvlies van de gastheer.
Eerder werd de veiligheid en haalbaarheid van de subretinale implantatie van een monolaag van hESC-afgeleide RPE's op een opvouwbaar niet-afbreekbaar mesh-ondersteund submicron paryleen-C-membraan (6,25 mm x 3,5 mm, 0,4 μm dik) beoordeeld bij 14 vrouwelijke Yucatán-minivarkens10. Na de teelt werden de cellen gezaaid op een mesh-ondersteund membraan. Immunosuppressie werd uitgevoerd met behulp van de systemische toediening van tacrolimus (geen regime en dosis geïndiceerd) en intravitreale injecties van 0,7 mg van een dexamethasonimplantaat aan het einde van de operatie. PPV werd uitgevoerd met een 20 G-benadering. De auteurs gebruikten een intravitreale injectie van triamcinolonacetonid voor een betere visualisatie van het glasachtig lichaam. De grote sclerotomie was 2 mm tot 3 mm groot. Na de subretinale injectie werd het netvlies afgeplat met een tijdelijke injectie van perfluorkoolstofvloeistof. Na de vloeistof-luchtuitwisseling werd een siliconentamponade (1.000/5.000 cSt) uitgevoerd. Postoperatieve zorg omvatte de oculaire toepassing van dexamethason / neomycine / polymyxine B-zalf 1 week na de operatie. De auteurs rapporteerden een succespercentage van 91% (d.w.z. efficiënte subretinale implantatie en voldoende postoperatieve beeldvormingsgegevens). In onze studie werd de intravitreale injectie van TA-kristallen intraoperatief gebruikt en voornamelijk om het glasachtig lichaam te visualiseren. De lokale immunosuppressieve werking van dit medicijn blijft echter onduidelijk. De nanovezelige celdragers die in onze studie werden gebruikt, waren 5,2 mm x 2,1 mm en 3,7 μm dik, met poriegroottes van 0,4 μm. Tijdens de operatie voerden we directe FAX uit in plaats van perfluorkoolstofvloeistof te injecteren. Ons chirurgische succespercentage (93,1%) was consistent met en iets beter dan dat van Koss et al.10.
De subretinale transplantatie van volledig afbreekbare celdragers (scaffold) voor subretinale implantatie werd voor het eerst bestudeerd in 2019 bij Yorkshire-varkens14. De studie was vooral gericht op de biologisch afbreekbare eigenschappen van fibrine hydrogel implantaten. De auteurs merkten op dat de agressieve immunosuppressie die op de tamme varkens wordt gebruikt, een lokale ontstekingsreactie kan remmen die mogelijk wordt veroorzaakt tijdens de biologische afbraak van de fibrinehydrogelimplantaten. Ze specificeerden echter niet de immunosuppressieve therapie die bij de varkens werd gebruikt. Tijdens PPV voerden ze een 3,6 mm lange sclerotomie uit voor het inbrengen van het subretinale implantatieapparaat parallel aan en ongeveer 3,5 mm achter de limbus. Bovendien gebruikten ze een pneumatisch aangedreven injectiesysteem met als doel de instabiliteit van de handplaatsing veroorzaakt door vingermanipulatie te verminderen. In onze casusserie waren alle sclerotomieën 2,5 mm tot 3,0 mm van de limbus. De grote sclerotomie voor het inbrengen van de injector was 3 mm lang. De implantatie-injector die in ons onderzoek werd gebruikt, werd met de hand bediend. Grondige cautery van de pars plana van het ciliaire lichaam en een voldoende snee in de grote sclerotomie lijken cruciaal te zijn voor het voorkomen van intraoperatieve complicaties zoals iatrogene perifere netvliesloslating, bloeding en verlies van het implantaat.
Samenvattend beschrijven we het gebruik van het Liběchov minipig-model voor de transplantatie van RPE-cellen op biologisch afbreekbare dragers als een behandelingsoptie voor erfelijke en verworven netvliesaandoeningen. Overeenkomsten in ooganatomie en fysiologie, evenals met betrekking tot het immuunsysteem, stellen ons in staat om de chirurgische technieken en instrumentatie voor de subretinale implantatie van cellen te ontwikkelen en te verbeteren, die gemakkelijk kunnen worden overgedragen aan de behandeling van menselijke oogaandoeningen. Het is belangrijk om ervoor te zorgen dat operaties op minivarkens worden uitgevoerd met dezelfde instrumentatie (inclusief implantatietoedieningstools) wanneer ze worden gebruikt in menselijke operaties, waardoor de toepassing van opgedane ervaring en knowhow op mensen wordt vergemakkelijkt. Alternatieve diermodellen met grote ogen met de aanwezigheid van een maculagebied, zoals niet-menselijke primaten, kunnen nuttig zijn voor de follow-up en analyse van de anatomische en functionele veranderingen na subretinale implantatie in het centrale retinale gebied. De gedetailleerde beschrijving van de preoperatieve, chirurgische en postoperatieve zorgprocedures zal nuttig zijn voor toekomstige studies door het verhogen van efficiënte en gestandaardiseerde gegevensgeneratie.
Disclosures
Geen.
Acknowledgments
Het project werd ondersteund door de Czech Science Foundation (projectnummer 18-04393S) en het Norway Grants and Technology Agency of the Czech Republic (KAPPA-programma, projectnummer TO01000107).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Technical equipment | |||
| Wato EX-65 with a Mindray iMEC10 | Mindray, Shenzhen, China | Wato Ex-65 | anesthesia machine |
| R-Evolution CR | Optikon, Rome, Italy | R-Evolution CR | phacoemulsifier/vitrectome |
| Green laser Merilas 532α | Meridian, Thun, Switzerland | Merilas 532α | ophthalmic green laser |
| Microscope Hi-R NEO 900A | Haag-Streit Surgical, Wedel, Germany) | Hi-R NEO 900A | ophthalmic surgery microscope |
| Camera Sony PMW-10MD | Sony, Tokyo, Japan | PMW-10MD | full HD medical 2-piece |
| Non-contact vitreoretinal surgical system MERLIN BIOM | Volk, Mentor, OH, USA | MERLIN BIOM | BIOM |
| Steam sterilizer | Tuttnauer Europe B.V., Breda, NL | 3870 HSG | sterilizer |
| iCam100 | Optovue, Fremont, CA, USA | iCAM100 | funduscamera |
| iVue OCT100-2 | Optovue, Fremont, CA, USA | iVue OCT100-2 | OCT |
| Microsurgical instruments and devices | |||
| Cook Eye Speculum | Katena, New Jersey, US | K1-5403 | 15mm blades |
| Ophthalmology surgical drape | Hylyard, Alpharetta, Georgie, USA | 79304 | 132 x 142cm |
| Disposable Two step vitrectomy system. (23 gauge/ 0.6 mm) | DORC, Zuidland, Netherlands | 1272.ED06 | |
| Infusion line for 23G / 0.6 mm infusion cannula | DORC, Zuidland, Netherlands | 1279.P | |
| knife 2.75mm, IQ Geometry Tm Slit Knife Angled, Bevel Up | Surgical Specialties Corporation, Reading, USA | 72-2761G | |
| Extendible 41G subretinal injection needle. (23 gauge / 0.6 mm) | DORC, Zuidland, Netherlands | 1270.EXT | |
| Omnifix 3ml Luer Lock Solo siringe | BBraun, Melsungen, Germany | 4617022V | 3ml |
| 1ml soft-inject Tuberculin | Henke Sass Wolf, Tuttlingen, Germany | 5010.200V0 | 1ml |
| 8-0 Coated Vicryl | Ethicon, Puerto Rico, USA | J409G | |
| Purified Silicone Oil (in syringe) 10 ml | (FCI, Paris, France) | S5.7170 | 1000cSt |
| Pinnacle 360 Morris Vertical Scissors 23Ga | Synergetics, O'Fallon, USA | 10.24.23PIN | 23Ga |
| Revolution DSP 23Ga ILM forceps | Alcon, Geneva, Switzerland | 706.44 | Griesharber revolution |
| 23ga Straight Laser Probe | Synergetics, O’Fallon, USA | 55.21.23 | |
| FCI Protect 2.0% | FCI Ophthalmics, Paris, France | S5.9100 | viscoelastic |
| DK Westcott style Stitch Scissors, Curve | Duckworth & Kent, Hertfordshire, England | 1-501 | Curve |
| Pierse Notched Forceps, 0,3mm Straigh | Duckworth & Kent, Hertfordshire, England | 2-100-1E | 0,3mm straigh |
| DK Harms-Tubingen Straight Tying Forceps | Duckworth & Kent, Hertfordshire, England | 2-504E | 6mm |
| DK Needle Holder, Straigh | Duckworth & Kent, Hertfordshire, England | 3-201 | 9mm straigh |
| Medications and solutions | |||
| Unitropic 1% gtt. | UNIMED PHARMA spol. s r.o., Bratislava, Slovak republic | tropicamidum 10 mg/ml | eye drops |
| Diprophos | Merck Sharp & Dohme B.V., Haarlem, Netherlands | betamethasonum 7 mg/ml | 1ml |
| Alcon BSS Irrigation Solution | Alcon, Geneva, Switzerland | balance salt solution (BSS) | 500ml |
| Betaisodona | Mundipharma, Cambridge, United Kingdom | povidon-Iodine 1g/10ml | 30ml |
| Depo-medrol 120mg | Pfizer, New Yourk, USA | methylprednisolon | 5ml/200mg |
| Shotapen | Virbac Carros Cedex, France | benzylpenicillin, dihydrostreptomycin | 250ml |
| Flunixin a.u.v. | Norbrook, Newry, Northern Ireland | flunixinum 50,0 mg | 250ml |
| Tramal 100MG/2ML | Stada Arzneimittel AG, Bad Vilbel, Deutschland | tramadol | 2ml |
| Zoletil 100 | Virbac Carros Cedex, France | tiletamine, zolazepam | 100mg |
| Narkeran 10 | Vetoquinol, Magny-Vernois, France | ketamin | 2ml |
| Rometar 20mg/ml | Spofa pharmaceutica, Prague, Czech republic | xylazinum | 20mg |
| Braunol 75mg/g | B.Braun medical, Prague, Czech republic | povidone iodine | 75mg/g |
| Propofol 1% MCT/LCT | Fresenius Kabi, Bad Homburg, Deutschland | propofol | 10mg/1ml |
| Isoflurane 100% Inhalation vapour, liquid | Piramal Critical Care Limited, West Drayton, United Kingdom | isoflurane | 100% |
| Benoxi gtt. 4mg/1ml | Unimed pharma, Bratislava, Slovakia | oxybuprakaine | 10ml |
| Neosynephrin POS 10% gtt. | Ursapharm , Saarbrücken, Deutschland | fenylefrin chloride | 10ml |
| Ophthalmo-framykoin 1X5GM | Zentiva a.s., Prague, Czech republic | bacitracin zinc/hydrocortisone acetate/hydrocortisoneacetate/neomycin sulfate | 5mg |
| Floxal ung. | Dr. Gerhard Mann Chem.-Pharm. Fabrik, Berlin, Germany | ofloxacin | 0.30% |
| Eficur inj. | Hipra, Amer, Spain | ceftiofurum hydrochloridum | 50mg / 1ml |
| Draxxin | Zoetis Inc., New Jersey, USA | tulathromycinum | 100mg / 1ml |
| Tramal | Stada Arzneimittel AG, Bad Vilbel, Deutschland | tramadoli hydrochloridum | 100mg / 2ml |
| Xylapan | Vetoquinol, Magny-Vernois, France | xylazinum | 0.4 mg/kg |
| Proparacaine hydrochlorid ophthalmic solution 0,5% | Bausch&Lomb Incorporated Tampa, FL, USA | Proparacaine hydrochlorid | 0.50% |
| Prograf | Astellas Pharma, Deerfield, Illinois, USA | Tacrolimus powder | 1mg |
| Cell carrier, cultivated cells cultures, and implantation injector | |||
| Falcon Cell Culture Inserts | Corning Inc., Kenneburg, ME, USA | 353103 | |
| TrypLE Express Enzyme (1X) | Thermo Fisher Scientific, MA, USA | 12604021 | |
| DMEM/F-12 | Thermo Fisher Scientific, MA, USA | 11320033 | |
| Biolaminin 521 LN (LN521) | BioLamina, Sundbyberg, Sweden | LN521-02 | |
| GlutaMAX Supplement | Thermo Fisher Scientific, MA, USA | 35050061 | |
| 2-Mercaptoethanol | Thermo Fisher Scientific, MA, USA | J66742.0B | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich, San Luis, Mi, USA | P4333 | |
| CRALBP | Novus Biologicals, Abingdon, UK | NB100-74392 | |
| Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific, Germany | 21202 |
References
- Pascolini, D., Mariotti, S. P. Global estimates of visual impairment: 2010. British Journal of Ophthalmology. 96 (5), 614-618 (2011).
- Bressler, N. M., Bressler, S. B., Fine, S. L.
- Binder, S., Stanzel, B. V., Krebs, I., Glittenberg, C.
- Mano, F., et al. Methodological approach to improve surgical outcomes of a pig subretinal implantation model. Translational Vision Science & Technology. 11 (4), 24 (2022).
- Ramsden, C. M., et al. Stem cells in retinal regeneration: Past, present and future. Development. 140 (12), 2576-2585 (2013).
- Carr, A. -J. F., et al. Development of human embryonic stem cell therapies for age-related macular degeneration. Trends in Neurosciences. 36 (7), 385-395 (2013).
- Tezel, T. H., Kaplan, H. J., Del Priore, L. V. Fate of human retinal pigment epithelial cells seeded onto layers of human Bruch's membrane. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 40 (2), 467-476 (1999).
- Popelka, S., et al. A frame-supported ultrathin electrospun polymer membrane for transplantation of retinal pigment epithelial cells. Biomedical Materials. 10 (4), 045022 (2015).
- Kozak, I., et al. Safety and feasibility of new nanofiber subretinal delivery system with injector for RPE cell transplantation. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 59 (9), 5670 (2018).
- Koss, M. J., et al. Subretinal implantation of a monolayer of human embryonic stem cell-derived retinal pigment epithelium: a feasibility and safety study in Yucatan minipigs. Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology = Albrecht von Graefes Archiv fur Klinische und Experimentelle Ophthalmologie. 254 (8), 1553-1565 (2016).
- Ghosh, F., Wong, F., Johansson, K., Bruun, A., Petters, R. M. Transplantation of full-thickness retina in the rhodopsin transgenic pig. Retina. 24 (1), 98-109 (2004).
- Christiansen, A. T., et al. Subretinal implantation of electrospun, short nanowire, and smooth poly(epsilon-caprolactone) scaffolds to the subretinal space of porcine eyes. Stem Cells International. 2012, 454295 (2012).
- Stanzel, B. V., et al. Subretinal delivery of ultrathin rigid-elastic cell carriers using a metallic shooter instrument and biodegradable hydrogel encapsulation. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (1), 490-500 (2012).
- Gandhi, J. K., et al. Fibrin hydrogels are safe, degradable scaffolds for sub-retinal implantation. PloS One. 15 (1), 0227641 (2020).
- Liu, Z., et al. Surgical transplantation of human RPE stem cell-derived RPE monolayers into non-human primates with immunosuppression. Stem Cell Reports. 16 (2), 237-251 (2021).
- Mandai, M., et al. Autologous induced stem-cell-derived retinal cells for macular degeneration. New England Journal of Medicine. 376 (11), 1038-1046 (2017).
- Schwartz, S. D., et al. Human embryonic stem cell-derived retinal pigment epithelium in patients with age-related macular degeneration and Stargardt's macular dystrophy: Follow-up of two open-label phase 1/2 studies. Lancet. 385 (9967), 509-516 (2015).
- Kashani, A. H., et al. Surgical method for implantation of a biosynthetic retinal pigment epithelium monolayer for geographic atrophy: Experience from a phase 1/2a study. Ophthalmology Retina. 4 (3), 264-273 (2020).
- Kashani, A. H., et al. Subretinal implantation of a human embryonic stem cell-derived retinal pigment epithelium monolayer in a porcine model. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1185, 569-574 (2019).
- Kashani, A. H., et al. A bioengineered retinal pigment epithelial monolayer for advanced, dry age-related macular degeneration. Science Translational Medicine. 10 (435), 4097 (2018).
- da Cruz, L., et al. Phase 1 clinical study of an embryonic stem cell-derived retinal pigment epithelium patch in age-related macular degeneration. Nature Biotechnology. 36 (4), 328-337 (2018).
- Diniz, B., et al. Subretinal implantation of retinal pigment epithelial cells derived from human embryonic stem cells: Improved survival when implanted as a monolayer. Invest Ophthalmol Vis Sci. 54 (7), 5087-5096 (2013).
- Sharma, R., et al. Clinical-grade stem cell-derived retinal pigment epithelium patch rescues retinal degeneration in rodents and pigs. Science Translational Medicine. 11 (475), 7624 (2019).
- Stanzel, B., et al. Human RPE stem cells grown into polarized RPE monolayers on a polyester matrix are maintained after grafting into rabbit subretinal space. Stem Cell Reports. 2 (1), 64-77 (2014).
- Al-Nawaiseh, S., et al. A step by step protocol for subretinal surgery in rabbits. Journal of Visualized Experiments. (115), e53927 (2016).
- Stanzel, B., et al. Surgical approaches for cell therapeutics delivery to the retinal pigment epithelium and retina. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1186, 141-170 (2019).
- Yaji, N., Yamato, M., Yang, J., Okano, T., Hori, S. Transplantation of tissue-engineered retinal pigment epithelial cell sheets in a rabbit model. Biomaterials. 30 (5), 797-803 (2009).
- Hruban, V., et al. Inheritance of malignant melanoma in the MeLiM strain of miniature pigs. Veterinarni Medicina. 49 (12), 453-459 (2004).
- Vodicka, P., et al. The miniature pig as an animal model in biomedical research. Annals of the New York Academy of Sciences. 1049, 161-171 (2005).
- Vízina, M. Comparative Ocular Anatomy in Commonly Used Laboratory Animals. Ocular Toxicology in Laboratory Animals. Wier, A. B., Collins, M. , Humana Press. Totowa, NJ. 9-12 (2013).
- Chandler, M. J., Smith, P. J., Samuelson, D. A., MacKay, E. O. Photoreceptor density of the domestic pig retina. Veterinary Ophthalmology. 2 (3), 179-184 (1999).
- Wang, Q. X., et al. Biodegradable microsphere-loaded tacrolimus enhanced the effect on mice islet allograft and reduced the adverse effect on insulin secretion. American Journal of Transplantation. 4 (5), 721-727 (2004).
- Sevc, J., et al. Effective long-term immunosuppression in rats by subcutaneously implanted sustained-release tacrolimus pellet: Effect on spinally grafted human neural precursor survival. Experimental Neurology. 248, 85-99 (2013).
- Juhásová, J., et al. Osteogenic differentiation of miniature pig mesenchymal stem cells in 2D and 3D environment. Physiological Research. 60 (3), 559-571 (2011).
- Planka, L., et al. Nanotechnology and mesenchymal stem cells with chondrocytes in prevention of partial growth plate arrest in pigs. Biomedical Papers of the Medical Faculty of the University Palacky, Olomouc, Czech Republic. 156 (2), 128-134 (2012).
- Soerensen, D. D., Pedersen, L. J. Infrared skin temperature measurements for monitoring health in pigs: a review. Acta Veterinaria Scandinavica. 57 (1), 5 (2015).
- Eichhorn, S. J., Sampson, W. W. Statistical geometry of pores and statistics of porous nanofibrous assemblies. Journal of the Royal Society Interface. 2 (4), 309-318 (2005).
- Szatmári-Tóth, M., et al. Clearance of autophagy-associated dying retinal pigment epithelial cells - a possible source for inflammation in age-related macular degeneration. Cell Death & Disease. 7 (9), 2367 (2016).
- Lukovic, D., et al. Human iPSC derived disease model of MERTK-associated retinitis pigmentosa. Scientific Reports. 5, 12910 (2015).
- Artero Castro, A., et al. Generation of gene-corrected human induced pluripotent stem cell lines derived from retinitis pigmentosa patient with Ser331Cysfs*5 mutation in MERTK. Stem Cell Research. 34, 101341 (2019).
- Artero Castro, A., León, M., Del Buey Furió, V., Erceg, S., Lukovic, D. Generation of a human iPSC line by mRNA reprogramming. Stem Cell Research. 28, 157-160 (2018).
- Artero-Castro, A., et al. correction recovers phagocytosis in retinal pigment epithelium derived from retinitis pigmentosa-human-induced pluripotent stem cells. International Journal of Molecular Sciences. 22 (4), 2092 (2021).
- Müller, B., Wagner, F., Lorenz, B., Stieger, K. Organotypic cultures of adult mouse retina: Morphologic changes and gene expression. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 58 (4), 1930-1940 (2017).
- Sheridan, C. M., et al.
- Radtke, N. D., et al. Vision improvement in retinal degeneration patients by implantation of retina together with retinal pigment epithelium. American Journal of Ophthalmology. 146 (2), 172-182 (2008).
- Maaijwee, K. J. M., et al. Histological evidence for revascularisation of an autologous retinal pigment epithelium--choroid graft in the pig. The British Journal of Ophthalmology. 91 (4), 546-550 (2007).
- Ghosh, F., Engelsberg, K., English, R. V., Petters, R. M. Long-term neuroretinal full-thickness transplants in a large animal model of severe retinitis pigmentosa. Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology = Albrecht von Graefes Archiv fur Klinische und Experimentelle Ophthalmologie. 245 (6), 835-846 (2007).
- Radtke, N. D., Seiler, M. J., Aramant, R. B., Petry, H. M., Pidwell, D. J. Transplantation of intact sheets of fetal neural retina with its retinal pigment epithelium in retinitis pigmentosa patients. American Journal of Ophthalmology. 133 (4), 544-550 (2002).
- Slijkerman, R. W., et al. The pros and cons of vertebrate animal models for functional and therapeutic research on inherited retinal dystrophies. Progress in Retinal and Eye Research. 48, 137-159 (2015).
- Schramke, S., et al. The Libechov minipig as a large animal model for preclinical research in Huntington's disease - Thoughts and perspectives. Czech and Slovak Neurology and Neurosurgery. 78/111, Supplementum 2 55-60 (2015).
- Tohyama, S., Kobayashi, E. Age-appropriateness of porcine models used for cell transplantation. Cell Transplantation. 28 (2), 224-228 (2019).
- Dall, A. M., et al. Quantitative [18F] fluorodopa/PET and histology of fetal mesencephalic dopaminergic grafts to the striatum of MPTP-poisoned minipigs. Cell Transplantation. 11 (8), 733-746 (2002).
- Shrader, S. M., Greentree, W. F.
- Duarri, A., et al. Transplantation of human induced pluripotent stem cell-derived retinal pigment epithelium in a swine model of geographic atrophy. International Journal of Molecular Sciences. 22 (19), 10497 (2021).
