Summary
Субретинальная имплантация пигментного эпителия сетчатки (РПЭ) является одним из наиболее перспективных подходов к лечению дегенеративных заболеваний сетчатки. Тем не менее, проведение доклинических исследований на животных с большими глазами остается сложной задачей. В этом отчете представлены рекомендации по субретинальной трансплантации RPE на клеточном носителе минипигам.
Abstract
Дегенеративные нарушения сетчатки (включая возрастную макулярную дегенерацию), которые возникают в основном в слое пигментированного эпителия сетчатки (RPE) или внутри него, приводят к прогрессирующей дезорганизации анатомии сетчатки и ухудшению зрительной функции. Замена поврежденных клеток RPE (RPE) культивируемыми клетками RPE in vitro с использованием носителя субретинальных клеток показала потенциал для восстановления анатомической структуры наружных слоев сетчатки и, следовательно, в настоящее время изучается в дальнейшем. Здесь мы представляем принципы хирургической техники, которая позволяет проводить эффективную субретинальную трансплантацию клеточного носителя с культивируемыми RPE в мини-пиги. Операции проводились под общим наркозом и включали стандартную трехпортовую витрэктомию pars plana (PPV) с сохранением линзы, субретинальное применение сбалансированного солевого раствора (BSS), ретинотомию 2,7 мм, имплантацию нановолокнистого клеточного носителя в субретинальное пространство через дополнительную склеротомию 3,0 мм, жидкостно-воздушный обмен (FAX), тампонаду силиконового масла и закрытие всех склеротомий. Этот хирургический подход был использован в 29 операциях (18 животных) за последние 8 лет с вероятностью успеха 93,1%. Анатомическая верификация хирургического вмешательства проводилась с использованием визуализации глазного дна in vivo (фотография глазного дна и оптическая когерентная томография). Рекомендуемые хирургические шаги для субретинальной имплантации RPE на носитель в глазах мини-свиней могут быть использованы в будущих доклинических исследованиях с использованием моделей животных с большими глазами.
Introduction
Возрастная макулярная дегенерация (ВМД) считается основной причиной потери центрального зрения в развитых странах и является одним из многих состояний, связанных с дисфункцией пигментного эпителия сетчатки (РПЭ) 1,2. RPE находится на базально расположенной мембране Бруха (BM) и обеспечивает необходимое поддержание фоторецепторов. Прогрессирующая дегенерация слоя РПЭ является отличительной чертой ранней атрофической формы ВМД, а также сопровождает развитие поздней экссудативной формы ВМД. Несмотря на многие достижения в терапии заболеваний сетчатки, разработка эффективного метода лечения остается сложной задачей3. Одним из перспективных методов является замена СИЗОД с использованием культивируемого слоя СИЗОЭ in vitro. Это лечение связано с прогрессом в исследованиях стволовых клеток с использованием RPE, полученного из эмбриональных стволовых клеток человека (hESC-RPE), и индуцированного плюрипотентного RPE, полученного из стволовых клеток (iPSC-RPE)3,4,5,6,7. В последние годы многие исследовательские группы сосредоточились на разработке различных подходов к замене СИЗОД с первоначально принятым доказательством концепции 8,9,10,11,12,13,14,15. Клетки RPE (RPE) обычно доставляются в субретинальное пространство в виде клеточной суспензии, самонесущего клеточного листа или клеточного монослоя, поддерживаемого искусственным носителем 3,16,17,18,19,20,21. Инъекция клеточной суспензии является самым простым методом, но скомпрометированное состояние БМ часто может препятствовать прикреплению трансплантированных клеток. Это может привести к неправильной апикобазальной ориентации РПЭ и неформированию монослоя22,23. Основное преимущество двух других способов (т.е. самонесущего клеточного листа и клеточного монослоя, поддерживаемого искусственным субстратом) заключается в том, что клетки уже находятся в дифференцированном монослойном состоянии при имплантации непосредственно в субретинальное пространство24.
Многие хирургические методы, описывающие доставку клеточных носителей в субретинальное пространство, были опубликованы в последние годы 8,9,10,11,12,13,14,15. В этих исследованиях описывалось использование моделей животных с большим глазом, типы клеточных носителей, использование трансплантированных клеточных культур, инструментов имплантации, а также хирургических методов, и авторы сосредоточились в основном на результатах субретинальной имплантации. В 2015 году Popelka et al. сообщили об использовании ультратонкой электроформованной полимерной мембраны с каркасной опорой для трансплантации RPE в глаза трупов свиней8. Описанная здесь хирургическая техника с субретинальной имплантацией клеточного носителя позволила относительно точно обращаться с носителем и легко позиционировать каркас в субретинальном пространстве. Kozak et al. оценили осуществимость техники доставки носителя с приблизительным размером 2 мм x 5 мм в глаза свиньи9. Уникальная конструкция клеточного носителя позволила правильно разместить его, предотвратив складывание и сморщивание клеточного монослоя6. Al-Nawaiseh et al. впервые представили подробные пошаговые рекомендации по имплантации субретинального каркаса кроликам25. Затем Stanzel et al. опубликовали аналогичный протокол в 2019 году для трансплантации мелким грызунам, кроликам, свиньям и нечеловеческим приматам26. Как было опубликовано ранее, трансплантация дифференцированного и поляризованного монослоя РПЭ на твердый носитель привела к улучшению выживаемости и лучшей интеграции трансплантата по сравнению с другими методами доставки (Дополнительный файл 1)27.
Целью любых доклинических исследований на животных, проводимых in vivo, является выявление различных аспектов хирургической трансвитреальной субретинальной имплантации клеточного носителя с акцентом на безопасность процедуры, выживаемость трансплантированных клеток, реакцию тканей на субретинальные маневры, а также краткосрочные и долгосрочные послеоперационные результаты. Сообщалось, что использование свиных глаз в качестве модели животных с большими глазами имеет отношение к объему полученных данных, которые могут быть полезны и потенциально применимы к людям10,11,14. В нашем исследовании сообщается о хирургической технике, используемой для субретинальной имплантации in vivo клеточного носителя на животной модели с большим глазом. Мы представляем подробное описание предоперационной подготовки, хирургической техники имплантации субретинального клеточного носителя и послеоперационного ухода за глазами минипига, основанное на нашем опыте за последние 8 лет. Описаны основные хирургические принципы, которые могут быть использованы для экспериментальных исследований in vivo, включающих имплантацию различных типов клеток и клеточных носителей.
Модель крупного животного
Экспериментальное стадо либеховских минисвиней было основано путем импорта пяти животных из штамма Hormel из США в 1967 году. Эти животные были скрещены для исследований групп крови свиней с несколькими другими породами или линиями: ландрасом, крупной белой, корнуоллской, вьетнамской свиньями и миниатюрными свиньями геттингенского происхождения28,29. В 5-месячном возрасте и примерно 20 кг массы тела (МТ) мини-пиги достигают половой зрелости. Сообщается, что выживаемость родительских пород мини-свиней (Hormel и Göttingen) составляет 12-20 лет. Субретинальная имплантация клеточного носителя нацелена на центральную часть сетчатки. Сетчатка мини-пигов лишена макулы и ямки. Тем не менее, он имеет области высококонцентрированных фоторецепторов колбочек, называемые областью centralis, и визуальные полосы30,31. Эти области отвечают за самую высокую остроту зрения.
Операции проводились четырьмя опытными витреоретинальными хирургами с помощью опытного ассистента хирургического отделения (ТА). Перед экспериментами in vivo хирурги прошли обучение и получили специальные знания по анатомии глаза мини-пиги, такие как более низкое отношение хрусталика к объему стекловидного тела, более короткая осевая длина (15-19 мм), отсутствие мембраны Боумена в роговице, меньший объем стекловидного тела (2,8-3,2 мл), отсутствие макулы и ямки, отсутствие кольцевого кольца Цинна и диаметра диска зрительного нерва (по вертикали/горизонтали: 1,5 мм/2,1 мм). Во всех случаях операция проводилась под общим наркозом в специально организованной операционной с выполнением стандартных асептических и антисептических мероприятий.
Protocol
Это исследование придерживается принципов Руководящих принципов Хельсинкской декларации и этических принципов медицинских исследований с участием людей. Все эксперименты проводились в соответствии с Руководством по уходу и использованию лабораторных животных и в соответствии с Ассоциацией исследований в области зрения и офтальмологии (ARVO) для использования животных в офтальмологических и зрительных исследованиях. Протокол исследования был одобрен Курортной профессиональной комиссией КАН по утверждению проектов экспериментов на животных при Институте физиологии и генетики животных Чешской академии наук (г. Либехов, Чехия) (Утвержденные протоколы No 60/2016 и No 64/2019).
1. Соображения при субретинальной трансплантации клеток на носителе в минипиги
- Селекция животных
- Получите и используйте мини-пиги Liběchov в возрасте от 12 до 36 месяцев, любого пола и около 40-80 кг массы тела (МТ).
- Держите мини-свиней в помещении с кондиционером и температурой от 18 до 22 °C, подвергайтесь искусственному циклу света и темноты 13 часов / 11 часов, стандартизированным индивидуальным загонам, свободному доступу к воде и кормлению два раза в день.
- Подготовка к операции
- Проверьте хирургическую ориентацию глаза и нарисуйте схемы глазного дна. Для этого схематично разделите сетчатку минипигов на рисунке глазного дна с помощью ручки с вертикальной линией на височную (от диска зрительного нерва к уху), носовую (от диска зрительного нерва к морде свиньи) и центральную (между крупными сосудами сетчатки со стороны носа) области (рис. 1А, Б).
- Отбирайте только здоровых животных без какой-либо поведенческой и неврологической патологии и с нормальным качеством кожи, отверстий тела, фекалий и потребления пищи. Попросите квалифицированного ветеринара провести клиническое наблюдение и отобрать животных.
- Внутримышечно вводят 3 мг/кг массы тела цефтиофура гидрохлорида (1 мл/кг) в день операции.
- Предоперационная иммуносупрессия
- Приготовьте полимерные микросферы с такролимусовым покрытием, как описано в Wang et al. и Sevc et al. 32,33 с модификацией.
- Убедитесь, что концентрация такролимуса в полимерных микросферах составляет 51,3 мг/г, как определено ВЭЖХ (Таблица материалов).
- За 6 дней до операции на глазах проводят подкожную инъекцию полимерных микросфер, нагруженных такролимусом, в дозе 0,25 мг/кг массы тела для предотвращения отторжения клеточного трансплантата. Это делается для обеспечения выживания донорских клеток RPE человека при ксеногенной трансплантации в глаза минипига.
- В день операции животным внутримышечно вводят 80 мг депо-медрола и бензилпенициллина по 1 мл/10 кг в зависимости от массы тела.
- Анестезия
- Перед операцией индуцируют общую анестезию внутримышечной инъекцией смеси тилетамина (2 мг/кг), золазепама (2 мг/кг), кетамина (2 мг/кг) и ксилазина (0,4 мг/кг) -TKX 34,35. Проверьте глубину анестезии по состоянию бессознательного состояния и проверив педальный рефлекс (защемление межпальцевой кожи задней ноги), роговичный рефлекс (легкое прикосновение роговицы), зрачковый рефлекс (реакция на свет) и пальпебральный рефлекс (прикосновение к веку). Следите за тем, чтобы животное не моргало. Подтвердите регулярность сердечных сокращений и частоты дыхания.
- После индукции анестезии транспортируйте успокоенное животное в операционную на подъемной тележке (рис. 2А).
- Положите животное на операционный стол с левой стороны, чтобы можно было провести операцию на правом глазу (рис. 2B).
- Выполните регулировку головы животного с помощью прокладок из пенополистирола, чтобы добиться наиболее подходящего положения центральной сетчатки для имплантации (т.е. горизонтального и параллельного полу) (рис. 2C).
- Поместите глазные капли 0,5% офтальмологического раствора пропаракаина гидрохлорида в конъюнктивальный мешок три раза с интервалом в 1 минуту, чтобы вызвать местную анестезию.
- Вставьте венозную канюлю и интубируйте животное эндотрахеальной трубкой для ингаляционного поддержания анестезии (1,5% изофлурана) с помощью наркозного аппарата, оснащенного монитором пациента (рис. 2А, В).
- Введите внутримышечную инъекцию 1 мл Эфикура на 16 кг массы тела и 20 мг Депо-Медрола 1 примерно за 15 минут до начала операции на глазах (Таблица материалов).
- Поддерживайте физиологическую температуру тела, накрыв животное изотермической фольгой, и проведите операцию, как описано в разделе 3.
- Во время операции контролируйте температуру животного, а также частоту сердечных сокращений и насыщение крови кислородом с помощью ушного зажима и монитора пациента. Избегайте снижения температуры тела ниже 38 °C во время процедур, что считается безопасным пределом36. Поддерживайте насыщение кислородом (>96%) и частоту пульса (70-90 ударов в минуту) в течение всего эксперимента.
- Когда операция будет завершена, отключите поток изофлурана и экстубируйте животное.
- После спонтанного дыхания и пробуждения переведите животных в загоны.
- Обустройство операционной
- Организуйте операционную в соответствии с потребностями операции на глазах модели животного с большим глазом (рис. 3A, B). Отрегулируйте высоту кресел хирурга, а также высоту микроскопа, чтобы добиться удобного положения для хирургов по отношению к положению рыла свиньи.
Рисунок 1: Схематический рисунок зон сетчатки у минипигов. (А) Схематический рисунок зон сетчатки по отношению к голове минипига; желтый эллипс изображает желаемую область субретинальной имплантации, T относится к височной области сетчатки, а N относится к области носовой сетчатки. (B) Пример схемы глазного дна после субретинальной имплантации клеточного носителя (желтый цвет) с помощью ретинотомии (красный). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Транспортировка и размещение животного. (А) Транспортировка успокоенного животного в операционную. (B) Размещение животного во время интубации. (C) Регулировка головы животного для оптимального доступа к центральной сетчатке во время операции (красная стрелка). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Стандартная настройка операционной. (A) Схематическое изображение положения хирурга (S = хирург, A = ассистент) по отношению к положению операционного стола с минипигом, операционным микроскопом (OM), аппаратом для витрэктомии (VM), инструментальным столом (IT) и анестезиологическим аппаратом (AM). Существует два возможных положения аппарата для витрэктомии (желтое и серое). (B) Реальная обстановка в операционной. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
2. Носитель клеток, культивируемые клеточные культуры и имплантационный инъектор
- Оператор сотовой связи
- Вырежьте овальную рамку шириной 30 мкм с внешними размерами 1,7 мм x 4,8 мм, оснащенную треугольными выступами, асимметрично расположенными на раме (рис. 4А), из двухосево ориентированной фольги из полиэтилентерефталата (ПЭТ) толщиной 36 мкм с помощью фемтосекундного лазера.
- Готовят поли(L-лактид-ко-DL-лактид) (LLA/DLLA 90/10, MW 868, 270 г/моль) полимерный раствор в пиридине в концентрации 11 мас.% с добавлением 2,2 мкл муравьиной кислоты на 1 г раствора.
- Получают нановолокнистую мембрану со встроенной опорной рамой (рис. 4B) путем электроспиннинга полимерного раствора в три этапа8: (1) осаждают первый слой нановолокон на кремниевую подложку, (2) помещают каркас на слой и (3) осаждают второй слой нановолокон.
ПРИМЕЧАНИЕ: Нанесите каждый слой на 7 минут, чтобы достичь общей толщины мембраны 3,7 мкм. Используйте следующие параметры для получения мембраны, состоящей из волокон толщиной 380 нм и со средним размером пор 0,4 мкм и пористостью около 70%37: полностью стальная игла 20 G, напряжение 7,1 кВ, зазор 10 см, скорость потока 250 мкл / мин и температура 25,0 °C ± 0,5 °C. - Осторожно снимите мембрану со встроенной рамой с кремниевой подложки и прикрепите ее к корпусу коммерческой вставки для 12-луночной клеточной культуры, лишенной исходной мембраны, чтобы облегчить посев и рост клеток.
- Обработайте нановолокнистую мембрану перед посевом клеток в воздушно-плазменную камеру в течение 30 с при мощности 70 Вт в плазмоочистителе.
- Клеточные культуры, используемые для культивирования на клеточном носителе
ПРИМЕЧАНИЕ: Могут быть использованы следующие клеточные носители: 1) нановолокнистые клеточные носители без каких-либо клеток; 2) нановолокнистые клеточные носители с первичными РПЭ человека (hRPE); 3) нановолокнистые клеточные носители с клетками RPE, полученными из iPSC человека.- Культивирование первичных hRPE
- Изолируют первичные клетки hRPE из донорских глаз человека в соответствии с ранее описанным методом38.
- Получают клетки путем ферментативной обработки сетчатки в течение 30 мин. Затем культивируйте первичные клетки hRPE (пассаж 0) в течение 2 недель в DMEM/F12 с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS).
- Как только клеточные культуры достигнут слияния, измените среду на 1% FBS и культуру еще на 30 дней.
- Засейте первичные hRPE на транс-луночные пластины и на нановолокнистый клеточный носитель, покрытый ламинином, с плотностью 2,000 клеток/мм2. После следующих 30 дней инкубации в 1% FBS используйте клеточных носителей с первичными hRPE для субретинальной имплантации мини-пигсам.
- RPE, производные от iPSC человека
- Используйте ИПСК, полученные из фибробластов39 пациента, ассоциированных с пигментным ретинитом MERTK, которые генно скорректированы по двум аллелям с использованием системы CRISPR/Cas9 (RP1-FiPS4F1-GC2)40, а также ИПСК, полученные из фибробластов здорового субъекта (Ctrl2-FiPS5F2)41, которые используются в качестве контроля.
- Генерируют и впоследствии дифференцируют обе клеточные линии ИПСК в клетки РПЭ (HIPSC-RPE), как сообщалось ранее42.
- Планшет hiPSC-RPE в концентрации 200 000 клеток/см2 на вставках клеточных культур, покрытых ламинином, с нановолокнистыми мембранами из поли (L-лактида-ко-DL-лактида) с овальными имплантационными рамками в среде RPE, содержащей нокаутирующий DMEM, 20% нокаутную сыворотку, 0,1 мМ заменимых аминокислот, 0,23 мМ β-меркаптоэтанола, 100 ЕД/мл пенициллина, 0,1 мг/мл стрептомицина и 10 мМ никотинамида.
- Меняйте среду через день и культивируйте hiPSC-RPE в течение 2 месяцев до имплантации, чтобы стимулировать поляризованный рост.
- Имплантационный инжектор
- Подготовьте пластиковый капилляр прямоугольного сечения 2,8 мм х 0,8 мм методом выдувного формования из пластиковой трубки с наружным диаметром 1,75 мм/внутренним диаметром 1,10 мм.
- Вырежьте загрузочное окно размером 4 мм х 2,2 мм в пластиковом капилляре на расстоянии 6 мм от конца.
- Соберите инжектор из пластикового капилляра, силиконовой ручки, плунжера со стальным лезвием и поршня (рис. 5А).
- Загрузите носитель в инжектор через загрузочное окно, а затем вытолкните его в субретинальное пространство нажатием плунжера, как описано на шаге 3.5.2 (рис. 5B).
- Подготовка нановолокнистого носителя и загрузка инжектора
- Наполните небольшую пластиковую чашку Петри 2 мл фосфатно-буферного физиологического раствора (PBS). Выньте вставку с подготовленным клеточным слоем, поместите ее на полумягкую посуду из полистирола и центрируйте под световым микроскопом. Используйте специально модифицированный пуансон, чтобы вырезать носитель вдоль овальной рамки с помощью микроскопа. Размеры носителя должны быть 2 мм х 5 мм.
- Используйте изготовленный по индивидуальному заказу инжектор с плоской прозрачной трубкой для загрузки носителя; В 6 мм от дистального конца капилляра имеется окошко для нагружения носителя. Заполните окно форсунки PBS.
- С помощью щипцов освободите образец от дна чашки, поднимите его из жидкости и транспортируйте к окну инжектора, сначала проверив боковые ориентировочные метки на раме, чтобы обнаружить верхнюю сторону носителя с прилипшими клетками. Овальная рамка облегчает манипуляции с носителем.
- С помощью стоматологического зонда (стоматологический инструмент из нержавеющей стали с острым концом) расположите держатель в окне инжектора. С помощью плунжера вставьте держатель в закрытую и безопасную верхнюю часть инжектора. Затем подготовьте носителя к операции.
- Проверяйте боковую ориентацию держателя на каждом шаге. Выгрузите нановолокнистый носитель из инжектора, нажав на металлический поршень.
Рисунок 4: Нановолокнистый носитель со встроенной опорной рамой из ПЭТ. (A) Три видимые метки на раме позволяют контролировать боковую ориентацию носителя (белые стрелки). (B) Увеличенный вид фрагмента рамки ПЭТ, встроенного в нановолокнистую мембрану (белые стрелки) клеточного носителя. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 5: Имплантационный инжектор . (А) Части инжектора. (B) Нановолокнистый клеточный носитель со встроенной поддерживающей ПЭТ-рамой, загруженной в пластиковый прямоугольный капилляр имплантационного инжектора. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
3. Хирургическое вмешательство
- Хирургическое оборудование
- Используйте следующее хирургическое оборудование: офтальмологический хирургический микроскоп, операционную систему для операций на переднем и заднем отрезках глаза, бесконтактную витреоретинальную хирургическую систему, устройство для лазерной фотокоагуляции и цифровую камеру.
ПРИМЕЧАНИЕ: Стандартные параметры, используемые в витрэктомии, экзо- и эндоприжигании, а также в оборудовании для лазерной фотокоагуляции, показаны в таблице 1.
- Используйте следующее хирургическое оборудование: офтальмологический хирургический микроскоп, операционную систему для операций на переднем и заднем отрезках глаза, бесконтактную витреоретинальную хирургическую систему, устройство для лазерной фотокоагуляции и цифровую камеру.
- Хирургические инструменты
- Стерилизуйте многоразовые хирургические инструменты с помощью мобильного автоклавного парового стерилизатора или аналогичного в соответствии со стандартным протоколом. Одноразовые хирургические инструменты и материалы, необходимые во время операции, перечислены в Таблице материалов.
- Подготовка к хирургическим этапам
- После обезболивания животного, как описано в шаге 1.4.1, нанесите 1% раствор тропикамида глазные капли и 10% раствор фенилэфрина гидрохлорида в конъюнктивальный мешок за 15 минут до процедуры, чтобы спровоцировать лекарственный мидриаз.
- Подойдите к операционному столу так, чтобы хирург находился в верхнем положении, а ассистент — в боковом положении (рис. 3).
- Побрейте область вокруг глаз с помощью одноразовой бритвы и удалите грубую грязь.
- Конъюнктивальный мешок дезинфицируют 5% раствором повидон-йода в течение 5 мин.
- Продезинфицируйте периорбитальную область ватными тампонами, проведя скрабом от век к периферии. Повторите процесс три раза, используя 10% раствор повидон-йода, и оставьте на 5 минут.
- Накройте операционное поле глазом посередине, используя стандартную стерильную офтальмологическую простыню липкой прозрачной фольгой. Отодвиньте ресницы от глазного яблока. Избегайте стрижки ресниц, чтобы снизить риск послеоперационного эндофтальмита.
- Вставьте в крышку зеркало (типа Либермана или глаз Кука). По желанию зафиксируйте мигательную перепонку к коже с помощью 8-0 полиглактиновый шов.
- Откройте конъюнктиву со стороны носа на расстоянии от 2 мм до 3 мм от лимба, чтобы обнажить склеру для склеротомии с помощью хирургических щипцов и конъюнктивальных ножниц Уэсткотта.
- Вставьте трехклапанные троакары 25 G на расстоянии 2,5-3 мм от лимба в области pars plana (поместите их в положение «7 часов», «10 часов» и «11 часов»). Используйте вращательные движения во время введения слегка наклонным образом (100°-110°) по направлению к задней сетчатке и удерживайте троакар щипцами (рис. 6).
- Держите роговицу влажной или покрывайте ее метилцеллюлозой в течение всей операции, чтобы предотвратить осмотический отек роговицы.
- Витрэктомия Pars plana (PPV)
- Удалите среднюю часть стекловидного тела с помощью стандартного трехпортового подхода витрэктомии pars plana. Аккуратно удаляют стекловидное тело за хрусталиком в области будущей большой склеротомии.
- Используйте интравитреальную инъекцию 2-4 мг триамцинолона ацетонида (ТА) (50-100 мкл) для окрашивания заднего стекловидного тела, которое обычно остается прилипшим к сетчатке, чтобы выполнить контролируемую заднюю отслойку стекловидного тела.
- После этого медленно выполняйте субретинальную инъекцию 0,05-0,1 мл BSS с канюлей 41 G более центрально, избегая образования пузырьков к периферии.
- Уменьшите настройки внутриглазного давления с помощью ирригационной системы до 15 мм рт.ст. во время субретинальной инъекции, чтобы предотвратить преходящую окклюзию сосудов сетчатки.
- Выполните линейную большую эндодиатермию сетчатки с помощью датчика эндодиатермии 27 G на расстоянии 3 мм рядом с основанием носового пузыря.
- После этого сделайте ретинотомию размером 3 мм с помощью лезвия MVR 25 G или вертикальных ножниц с повышенным внутриглазным давлением (ВГД) ирригационной системы до 60 мм рт.ст. в течение от 3 до 5 минут. Убедитесь, что нет кровотечения из ретинотомии, а затем уменьшите ВГД до 25 мм рт.ст.
- Проведите экзодиатермию эписклеральных сосудов между двумя носовыми троакарами на расстоянии 2,5-3 мм от лимба с помощью эндодиатермионного зонда 27 G, слегка прикоснувшись к поверхности склеры.
- Проверьте уровень жидкости в флаконе для инфузии перед увеличением склеротомии, так как после увеличения склеротомии потребление жидкости временно увеличивается.
- Сделайте склеротомию размером 3,0 мм, в 3 мм от лимба, с помощью факоножа 2,75 мм.
- Обратите внимание на возможное кровотечение из сосудов склеры и цилиарного тела внутри большой склеротомии. В случае кровотечения используйте зонд для эндодиатермии 27 G для коагуляции поврежденных сосудов. Увеличьте склеротомию до 3,0 мм с помощью атласного ножа, чтобы разместить наконечник инжектора (0,8 мм x 2,8 мм).
- Удаляют выпавшее стекловидное тело на месте большой склеротомии с помощью виректора. Поддерживайте инфузию BSS на уровне 25-30 мм рт.ст. с помощью системы витрэктомии, чтобы избежать коллапса глобуса.
- Имплантация клеточного носителя
- Аккуратно введите инжектор доминирующей рукой в полость стекловидного тела через большую склеротомию. В случае резистентности увеличьте размер склеротомии.
- Имплантируйте носитель клеток через ретинотомию в субретинальное пространство. При необходимости используйте бимануальную технику с дополнительной склеротомией и подсветкой люстры, чтобы улучшить контроль имплантации.
- Извлеките инъектор из глаза и закройте большую склеротомию со счетом 8-0 полиглактиновый шов, чтобы избежать осложнений, связанных с внутриглазной гипотонией.
- Выполните полный жидкостно-воздушный обмен (FAX) и дренаж субретинальной жидкости с помощью канюли с силиконовым наконечником.
- После этого введите силиконовое масло (1,000 сСт) в полость стекловидного тела с помощью системы витрэктомии и системы трубок для инъекции силиконового масла до тех пор, пока ВГД не нормализуется.
- Интраоперационная визуализация и документирование
- Выполняйте видеозапись в течение всей операции с фотодокументированием ключевых этапов имплантации с помощью системы видеозаписи.
- Завершите рисунок глазного дна, задокументировав расположение склеротомии, ретинотомии, субретинального имплантата и любые осложнения, которые возникли, используя схемы рисования глазного дна.
- Послеоперационные этапы
- В конце операции удалите троакары и закройте три склеротомии и конъюнктиву с 8-0 полиглактиновые швы.
- Промыть конъюнктивальный мешок 5% раствором повидон-йода.
- Выполните субконъюнктивальную инъекцию 0,3 мл 20 мг гентамицина, 2 мг дексаметазона и 2% ксилокаина.
- Проверьте состояние глазного дна и хрусталика с помощью микроскопического обзора.
- Снимите швы с мигательной мембраны с помощью хирургических щипцов и конъюнктивальных ножниц Уэсткотта (по желанию).
- Нанесите неомициновую мазь или офлоксациновую офтальмологическую мазь в конъюнктивальный мешок.
Рисунок 6: Введение троакаров в глаз мини-пиги. (А) Схематическое изображение троакаров, которые вставляются перпендикулярно в склеру по направлению к центру стекловидного тела в человеческом глазу (серый цвет) и косым образом к задней сетчатке в глазу мини-пиги (синий цвет) во избежание повреждения хрусталика. Хрусталик минипига (синего цвета) больше, чем у человека, и по отношению к размеру полости стекловидного тела. (B) Интраоперационный вид вставленных троакаров в трехпортовом PPV. Роговица покрыта метилцеллюлозой для предотвращения высыхания и набухания. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
4. Послеоперационный уход
- Наносите местный бацитрацин цинк / гидрокортизона ацетат / неомицина сульфат или 0,3% офлоксацина в конъюнктивальный мешок животных пять раз в день.
- После операции проверяют следующие параметры глаза: тургор мягких тканей глаза с помощью пальпации, воспалительную реакцию на поверхности глаза и косоглазие как защитную реакцию век с помощью ручной щелевой лампы или непрямого офтальмоскопа.
- Для системного послеоперационного ухода используют следующие антибиотики:
- Внутримышечно вводят цефтиофура гидрохлорид в дозе 3 мг/кг массы тела (1 мл/кг) на второй и третий день стабильности.
- Вводите тулатромицин (1 мл/40 кг массы тела) через 72 ч после операции для профилактики вторичной бактериальной инфекции.
- Выполняйте внутримышечную инъекцию флуниксина (2 мл / 45 кг живого веса) и трамадола гидрохлорида (100 мг) каждые 24 ч в течение 3 дней после операции для предотвращения боли.
- Содержание мини-свиней в специализированном кондиционированном помещении с температурным режимом 18-22 °C и искусственным светлым/темным режимом 13 ч/11 ч.
- Обеспечьте им свободный доступ к воде и стандартному кормлению (два раза в день).
5. Послеоперационные процедуры
- Послеоперационные офтальмологические осмотры
- В послеоперационном периоде осмотрите глаза непрямым офтальмоскопом на наличие воспаления (т.е. покраснения, отека тканей или скопления слизи в конъюнктивальном мешке). Измерьте внутриглазное давление в прооперированном глазу методом пальпации.
- Послеоперационная визуализация
- Индуцировать седацию в минипиге путем внутримышечной инъекции смеси TKX перед фотографированием глазного дна и ОКТ-исследованием. Закапывайте 1% тропикамида и 10% фенилэфрина гидрохлорида глазных капель в конъюнктивальный мешок минипига, чтобы вызвать мидриаз.
- Используйте зеркало для век, чтобы поддерживать открытые глаза. Для увлажнения поверхности глаз и получения четкого ОКТ-изображения роговицу животного промывают физиологическим раствором (0,9% NaCl) каждые 30-60 с.
- Расположите минипига на операционном столе так же, как и во время операции (рис. 2B, C, рис. 3A). Основным требованием является размещение головки сбоку и перпендикулярно сканирующей части аппарата ОКТ. Используйте пенопластовые подушечки под мордой животного, чтобы стабилизировать голову, приведя поверхность глаза в горизонтальное положение.
- Соберите цветные изображения глазного дна с помощью цветной немидриатической камеры глазного дна, так как это позволяет документировать передний сегмент, сетчатку и диск зрительного нерва. Кроме того, сделайте снимок сетчатки без красных с помощью немидриатической камеры глазного дна.
- Выполняйте оптическую когерентную томографию с использованием системы ОКТ в спектральной области. Во время ОКТ или визуализации глазного дна наклоните голову минипига вручную к линзам ОКТ или линзам камеры глазного дна, чтобы оптимизировать обзор задней сетчатки и области имплантации (рис. 2C). Для оптимальной визуализации имплантированного носителя на глазном дне примените инфракрасный отражательный свет устройства ОКТ, чтобы сфокусироваться на имплантате (рис. 2C). Используйте режимы сканирования перекрестных линий ОКТ и карты сетчатки.
- Нанесите офтальмологическую мазь офлоксацин в конце осмотра под веко глаза животного.
- Переместите минипига в закрытое помещение и наблюдайте за его общим состоянием до окончания седации (примерно от 2 до 5 часов).
6. Энуклеация глазного вскрытия после эвтаназии
- Успокоите мини-свиней внутримышечной инъекцией смеси TKX с последующей внутривенной (через ушную канюлю 22-G) болюсным введением 1% пропофола (20 мл / животное) с последующим обескровливанием. Не используйте общие фиксаторы.
- Приносите животных в жертву путем обескровливания во время глубокой общей анестезии через 7 дней, 14 дней, 28 дней и 42 дня после имплантации клеточного трансплантата.
- Используйте щипцы и ножницы, чтобы удалить верхнее и нижнее веко. Снимите третье веко и прорежьте конъюнктиву. Разрежьте глазные мышцы и зрительный нерв.
- Энуклеировать глаза посмертно с помощью хирургических ножниц и хирургических щипцов. Убедитесь, что процедура выполняется опытным человеком.
Representative Results
Результаты субретинальной имплантации клеточного носителя у либеховских минипигов представлены в Table 2. Успешная имплантация определялась как получение достаточных данных для гистологического и иммуногистохимического исследования. Неудачные случаи были определены как глаза с тяжелыми интраоперационными осложнениями, что делало невозможным дальнейшее наблюдение за тканями глаза.
Применение предложенной методики с использованием тампонады силиконовым маслом позволяет контролировать состояние субретинального трансплантата с помощью методов визуализации, начиная со следующего дня после операции и до момента энуклеации (рис. 7, рис. 8 и рис. 9).
Визуализация глазного дна и SD-OCT
Минипиги исследовали в послеоперационном периоде с помощью визуализации глазного дна, визуализации без красного и оптической когерентной томографии в спектральной области (рис. 7). Высококачественная визуализация глазного дна была обеспечена за счет использования прозрачных оптических носителей, включая прозрачную линзу и тампонаду силиконовым маслом (рис. 7А). В месте ретинотомии не было обнаружено признаков пролиферативной реакции (рис. 7А, желтые стрелки), а рамка PTE клеточного носителя была хорошо видна через полупрозрачные слои сетчатки свиньи. На изображениях, полученных без красного цвета, отражательная способность культивируемых hRPE на носителе не отличалась от отражательной способности эндогенного слоя RPE свиньи (рис. 7B). На SD-OCT рамка PTE вызывала лишь незначительное затенение нижележащих анатомических структур и небольшое утолщение сетчатки (рис. 7C, красные стрелки). На SD-OCT не было обнаружено атипичных гипо- или гиперотражающих зон, и мембрана Бруха, по-видимому, также осталась неповрежденной. На рисунке 8 представлены изображения глазного дна и iOCT каркаса, культивируемого первичными клетками RPE человека через 1 месяц после операции (рис. 8). Сам клеточный носитель (без каких-либо клеток) не вызывал значительного увеличения толщины сетчатки (рис. 9C). Эти данные свидетельствуют о том, что интраоперационное ятрогенное воздействие имплантата было минимальным и что имплантированный клеточный носитель претерпел достаточную адаптацию имплантированных клеток к вышележащим фоторецепторным клеткам и нейроретинальной ткани.
Рисунок 7: Послеоперационная визуализация сетчатки у мини-пигов . (A) визуализация глазного дна, (B) изображение без красных и (C) оптическая когерентная томография нановолокнистого носителя с первичными клетками RPE человека в течение 1 недели наблюдения после субретинальной трансплантации в глаз мини-пиги. (A) Желтые стрелки указывают место ретинотомии. (B) Красные стрелки демонстрируют края нановолокнистого клеточного носителя. (C) Красные стрелки показывают небольшое затенение сигнала ОКТ, вызванное поддерживающим ПЭТ-каркасом нановолокнистого носителя, который был имплантирован в субретинальное пространство. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 8: Визуализация глазного дна и iOCT-изображения скаффолдов через 30 дней после субретинальной имплантации у мини-пигов. A, B, C, D и E соответствуют свиньям 169, 182, 179, 199 и 224 соответственно. Желтыми стрелками изображен каркас эшафота. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Гистологический и иммуногистохимический анализ
После эвтаназии животных удаляли целые глаза мини-пиги и фиксировали в 4% параформальдегиде (ПФА) в течение 24 часов. Передняя часть глаза была удалена, а имплантированный нановолокнистый носитель был идентифицирован в центральной сетчатке носа и изолирован с прикрепленной склерой. Все ткани были криопротекторированы в градуированных растворах сахарозы, а вертикальные замороженные срезы были вырезаны, как описано в деталях43. Гистология нановолокнистой мембраны без клеток РПЭ через 4 недели имплантации выявила сетчатку без воспаления и дегенеративных изменений (рис. 9А). Присутствие нановолокнистой мембраны было обнаружено в поляризованном свете (рис. 9B).
Рисунок 9: Гистологический анализ имплантированной бесклеточной нановолокнистой мембраны. Гематоксилин-эозиновое окрашивание бесклеточной нановолокнистой мембраны через 4 недели после имплантации (А) при стандартном освещении и (Б) при поляризованной световой микроскопии. Белая стрелка указывает на локализацию нановолокнистой мембраны (масштабная линейка: 50 мкм). (C) Снимки оптической когерентной томографии in vivo бесклеточной нановолокнистой мембраны через 4 недели после имплантации показывают хорошее принятие и адгезию нановолокнистой мембраны в субретинальном пространстве. Белая стрелка указывает на расположение имплантата на изображении поперечного сечения сетчатки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
На рисунке 10 показано окрашивание гематоксилин-эозином (H&E) области сетчатки, содержащей имплантированные первичные клетки hRPE, на нановолокнистом носителе (желтая стрелка) в глазу мини-пиги. Пигментированный вид имплантированных первичных hRPE сформировал непрерывный, но нерегулярный пигментированный слой (рис. 10, красные стрелки). После более длительных периодов наблюдения (6 недель) нейросетчатка под имплантатами показала розеточный или гипертрофический реакционный вид вокруг места ретинотомии, вероятно, в результате ятрогенных манипуляций. Эти морфологические результаты сопоставимы с результатами SD-OCT и подтверждают доказательства минимального воздействия доставки носителя на ткань сетчатки.
Рисунок 10: Гистологический анализ имплантированной нановолокнистой мембраны с первичными hRPE. Гематоксилин-эозиновое окрашивание участка сетчатки, содержащего имплантированный нановолокнистый носитель (желтая стрелка) с первичными hRPE в глазу минипига. Животное было усыплено и проанализировано через 6 недель после имплантации. Первичные hRPE были четко различимы по размеру, круглой форме и пигментации (красные стрелки) в субретинальном пространстве напротив фоторецепторов. Ядра фоторецепторов в ONL строят розеточные структуры. Субретинальное пространство проявляется гипертрофичным. Сокращения: hRPE = первичный пигментный эпителий сетчатки человека, ONL = внешний ядерный слой, INL = внутренний ядерный слой. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Иммуноокрашивание проводили двухэтапным непрямым методом. Срезы инкубировали при комнатной температуре в течение ночи в CRALBP, моноклональном первичном антителе, в разведении 1:100. Иммунофлуоресценцию проводили с использованием вторичного антитела, конъюгированного Alexa Fluor 488.
Имплантированные первичные hRPE присутствовали в области имплантации и экспрессировали типичный маркер RPE CRALBP, аналогичный эндогенным клеткам RPE minipig (рис. 11A). Напротив, морфология имплантированных клеток, по-видимому, не принимала монослойную форму после имплантации, но оставалась локализованной в определенном субретинальном пространстве (рис. 11A, B, белые стрелки). Следующие маркеры RPE/сетчатки и морфологический вид оставались положительными после 6-недельного периода после имплантации: наличие гранул пигмента/меланина, специфических для специфических нейронов сетчатки терминальной стадии для палочковидного биполярного (PKC-альфа) и колбочек фоторецепторов (PNA), а также положительность GFAP - признак активации микроглии.
Рисунок 11: Иммуномаркировка клеточным маркером RPE CRALBP (клеточный белок, связывающий сетчатый ретинальдегид) у минипига через 6 месяцев после имплантации первичных hRPE. (A) Вертикальные замороженные срезы обработанного глаза свиньи были иммуномечены моноклональным антителом CRALBP (зеленый) и окрашены DAPI (синий). (B) Однократное изображение ядер клеток, меченных DAPI в черно-белом цвете, так как высокая контрастность показывает круглую форму отдельных клеток hRPE (некоторые показаны белыми стрелками). Сокращения: hRPE = пигментный эпителий сетчатки человека, ONL = внешний ядерный слой. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Глазные осложнения
Всего из 29 (93,1%) успешно выполненных операций было 27. Определение «успешно проведенные операции» применялось к тем случаям, когда на прооперированном глазу до момента энуклеации не было выявлено клинически значимых послеоперационных осложнений, которые могли бы повлиять на гистологическое и иммуногистохимическое исследование. Снижение прозрачности оптических носителей повлияло на послеоперационную визуализацию в четырех случаях (13,7%); Тем не менее, эти глаза были обработаны с дальнейшим гистологическим и иммуногистохимическим анализом.
Интраоперационная периферическая отслойка сетчатки наблюдалась в четырех случаях (13,8%). В двух случаях это было сделано путем аспирации субретинальной жидкости во время жидкостно-газообмена и применения лазерной фотокоагуляции сетчатки в области отслойки. В двух других случаях (6,9%) отслоение сетчатки ассоциировалось с массивным кровотечением из сетчатки и субретинального кровотечения, что сделало невозможным имплантацию клеточного носителя и привело к прекращению операции и немедленной эвтаназии минипига на операционном столе.
| Нет | Параметры | Стандартные используемые настройки |
| 1 | Скорость витрэктомии (скорость реза) | до 20 000 отрубов/мин |
| 2 | Насос Вентури | 50-180 мм рт.ст. |
| 3 | Время нарастания | 1 сек |
| 4 | Давление орошения | 18-25 мм рт.ст. |
| 5 | Давление вливания воздуха | 20-25 мм рт.ст. |
| 6 | Биполярная экзодиатермия | 18-26% |
| 7 | Монополярная эндодиатермия | 16-18% |
| 8 | Лазерная коагуляция сетчатки, 532 нм | Мощность 100-150 мВт |
| Интервал 100 мс | ||
| Длительность 100 мс |
Таблица 1: Стандартные параметры, используемые при витрэктомии и лазерной коагуляции.
| Общее количество животных, n | 18 |
| Всего глаз, н | 36 |
| Прооперированные глаза, н | 29 |
| Успешная имплантация, n | 27 |
| Неудавшиеся случаи, n | 2 |
| Среднее время операции, мин | 57 |
| Коэффициент успеха, % | 93.1 |
Таблица 2: Результаты стандартизированной хирургической техники с субретинальной имплантацией клеточного носителя у либеховских минипигов в период с 2016 по 2020 год.
Дополнительный файл 1: Резюме исследований, посвященных субретинальной имплантации клеток RPE на клеточном носителе. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Discussion
Субретинальная имплантация клеток RPE различного происхождения является очень перспективным направлением в глазных исследованиях для лечения дегенеративных заболеваний сетчатки, таких какВМД 3,4,8,9,10,11,12,13,14,15,25 . Основная идея этого подхода заключается в замене поврежденных СИЗОЭ здоровыми СИЗЭ, культивируемыми ex vivo (Дополнительный файл 1)44,45,46,47,48. Использование клеточных носителей для трансплантации культивируемых клеток RPE представляет собой наиболее разумный подход, поскольку пористые мембраны поддерживают поляризованный клеточный слой RPE в правильной ориентации по отношению к фотосенсорному слою.
Оптимальная модель животного
Важнейшим шагом в разработке таких подходов к лечению является использование оптимальной модели49 на животных. В прошлом использовались модели мелких и крупных животных, включая кроликов, собак, свиней и нечеловекообразных приматов 8,9,10,11,12,13,14,15,27,29. В этой статье мы предлагаем использовать модель минипига Либехова и описываем предоперационные, хирургические и послеоперационные этапы, которые обеспечивают надежную эффективность трансплантации. Минипиг Либехов был первоначально выведен около 20 лет назад и часто использовался в биомедицинских исследованиях в области нейродегенеративных заболеваний, таких как болезни Паркинсона и Хантингтона29,50. Поскольку свинья обладает относительно большим мозгом с кровоснабжением и иммунологическим ответом, аналогичными таковым у людей, она также использовалась в качестве животной модели для экспериментов по аллогенной трансплантации51,52,53,54. Несмотря на то, что сетчатка мини-пигов не обладает человеческими макулой и ямкой, она содержит центральную область и зрительные полосы, которые являются областями сетчатки с высокой концентрацией колбочекфоторецепторов 30. Схожий размер с человеческим глазом, наличие обогащенной колбочками центральной сетчатки, хорошо описанная иммунная система и наличие методов оценки морфологии и функции после операции являются важными аргументами в пользу использования этой модели крупного животного в представленном исследовании.
Хирургическое вмешательство
Насколько нам известно, не существует стандартизированных и общепринятых хирургических методик витреоретинальной трансплантации клеток РПЭ на носителях. Одной из ключевых проблем клеточной заместительной терапии является сложная хирургическая техника, которая сопряжена с риском интраоперационных и послеоперационных осложнений, связанных с отслоением сетчатки, гипотонией, эписклеральным, хориоидальным и/или сетчаточным кровотечением, а также высокой внутриглазной турбулентностью, которая может привести к повреждению каркаса. В послеоперационном периоде существует риск развития пролиферативной витреоретинопатии, эндофтальмита, гипотонии, отслойки сетчатки и образования катаракты 4,10,13,14,15.
Первые исследования подходов с использованием клеточных носителей были проведены на кроликах-шишиллах-бастардах13,16,25. Несмотря на то, что эти животные представляют собой модель мелкого животного, результаты, посвященные техническим аспектам операции, имели решающее значение при разработке процедур на моделях крупных животных и поэтому кратко изложены ниже.
Первоначально использовалась изготовленная на заказ инфузионная канюля 23 G с двумя боковыми портами для перенаправления струйного потока, что помогло устранить коллапс пузыря и последующее отслоение сетчатки13. В настоящем исследовании мы не заметили такого коллапса пузыря. Возможной причиной этого может быть больший размер глазного яблока и выполнение основной витрэктомии с сохранением стекловидного тела на периферии в месте инфузии канюли, что может уменьшить силу направленного струйного потока.
Трудности при выталкивании клеточного носителя из прибора были еще одним интраоперационным препятствием на моделях мелких животных, которые были классифицированы как «захваченные с помощью инструмента». Кроме того, авторы предположили, что остаточное стекловидное тело на поверхности сетчатки может вызвать обратный «прыжок» носителя из отверстия ретинотомии после имплантации. Эта проблема может быть решена с помощью ферментной витрэктомии, которая обеспечивает плавный, непрерывный выброс клеточного носителя в субретинальное пространство. В большинстве случаев авторы перемещали носитель, чтобы получить более отдаленное расположение имплантата вдали от ретинотомии. В нашей серии случаев мы также столкнулись с ситуацией, когда носитель клетки оставался прикрепленным к наконечнику инжектора. Однако это удалось сделать с помощью медленных и осторожных манипуляций со световой трубкой и наконечником инжектора. Ни в одном из наших случаев мы не наблюдали остаточного стекловидного тела в месте ретинотомии. Использование ТА-ассистированного PPV в операциях может быть предложено в качестве метода снижения риска остаточного прикрепления стекловидного тела. Многократное окрашивание ТА может потребоваться для полного удаления вышележащего стекловидного тела.
В другом исследовании сообщалось о результатах субретинальной имплантации стволовых клеток RPE человека, выращенных в виде поляризованного клеточного монослоя на полиэфирной мембране24. В ходе экспериментов использовалась одна и та же хирургическая техника, описанная ранее13, но был применен двухпортовый подход PPV. Наконец, впоследствии был опубликован пошаговый протокол субретинальной имплантации хирургии клеточного носителя у кроликов25. В этом исследовании представлено очень подробное и легко воспроизводимое описание хирургической процедуры, включая предоперационный и послеоперационный уход, которые также основаны на предыдущем опыте.
При использовании моделей крупных животных в последующих исследованиях рассматривались не только технические вопросы, но и вопросы, касающиеся иммунной реакции на трансплантированные клетки, а также вопросы, связанные с размером клеточного носителя. В исследовании с использованием обезьян cynomolgus (Macaca fascicularis) описаны результаты субретинальной имплантации монослоев RPE, полученных из стволовых клетокчеловека15. Всем животным проводилась системная иммуносупрессия, состоящая из сиролимуса (нагрузочная доза 2 мг, суточная доза 1 мг) и тетрациклина (7,5 мг/кг массы тела), начиная с 7 дней до операции и продолжавшейся 3 месяца после операции. Хирургическое вмешательство проводилось в соответствии с протоколами, описанными ранее24,25. Авторы использовали трехпортовый PPV-подход 25 G с эндоподсветкой люстры. Важно отметить, что для исключения остаточной витреоретинальной адгезии на задней части сетчатки использовался TA-ассистированный PVD. В качестве дополнения к первоначально описанной процедуре авторы удалили слой РПЭ хозяина в области будущей имплантации с помощью специально изготовленного выдвижного петлевого инструмента 20 G.
В нашем исследовании минипиг мы также использовали системную иммуносупрессию. Однако тип иммуносупрессии отличался от описанного выше. Мы вводили подкожную инъекцию полимерных микросфер с такролимусовым покрытием в качестве депо в дозе 0,25 мг/кг массы тела, чтобы препятствовать отторжению клеточного трансплантата и воспалительным реакциям. Мы не удаляли слой клеток RPE хозяина во время операции, так как нашей основной целью был анализ безопасности процедуры и жизнеспособности имплантированных клеток, но не их интеграции в сетчатку хозяина.
Ранее безопасность и осуществимость субретинальной имплантации монослоя РПЭ, полученных из hESC, на складной неразлагаемой субмикронной мембране парилен-С с сетчатой подложкой (6,25 мм x 3,5 мм, толщина 0,4 мкм) оценивалась у 14 самок минипигов Юкатана10. После культивирования клетки высевали на сетчатую мембрану. Иммуносупрессию проводили с помощью системного введения такролимуса (режим и доза не указаны) и интравитреальных инъекций 0,7 мг имплантата дексаметазона в конце операции. PPV выполнялся с подходом 20 G. Авторы использовали интравитреальную инъекцию триамцинолона ацетонида для лучшей визуализации стекловидного тела. Большая склеротомия имела размер от 2 мм до 3 мм. После субретинальной инъекции сетчатку уплощали с помощью временной инъекции перфторуглеродной жидкости. После жидкостно-воздушного обмена проводилась тампонада силиконовым маслом (1 000/5 000 сСт). Послеоперационный уход включал глазное применение мази дексаметазон/неомицин/полимиксин В через 1 неделю после операции. Авторы сообщили об успешности 91% (т.е. эффективная субретинальная имплантация и достаточные данные послеоперационной визуализации). В нашем исследовании интравитреальное введение кристаллов ТА использовалось интраоперационно и в основном для визуализации стекловидного тела. Однако местное иммуносупрессивное действие этого препарата остается неясным. Нановолокнистые клеточные носители, использованные в нашем исследовании, имели размеры 5,2 мм x 2,1 мм и толщину 3,7 мкм с размером пор 0,4 мкм. Во время операции мы выполняли прямой факс вместо инъекции перфторуглеродной жидкости. Наш показатель успеха хирургического вмешательства (93,1%) соответствовал и немного лучше, чем у Koss et al.10.
Субретинальная трансплантация полностью разлагаемых клеточных носителей (скаффолда) для субретинальной имплантации была впервые изучена в 2019 году у йоркширских свиней14. Исследование было в основном сосредоточено на биоразлагаемых характеристиках фибриновых гидрогелевых имплантатов. Авторы отметили, что агрессивная иммуносупрессия, используемая на домашних свиньях, может ингибировать местную воспалительную реакцию, потенциально вызванную биодеградацией имплантатов гидрогеля фибрина. Однако они не указали иммуносупрессивную терапию, используемую у свиней. Во время PPV они выполнили склеротомию длиной 3,6 мм для введения субретинального имплантационного устройства параллельно лимбу и примерно на 3,5 мм позади него. Кроме того, они использовали систему впрыска с пневматическим приводом, направленную на уменьшение нестабильности положения рук, вызванной манипуляциями с пальцами. В нашей серии случаев все склеротомии были на расстоянии от 2,5 мм до 3,0 мм от лимба. Большая склеротомия для введения инжектора имела длину 3 мм. Имплантационный инжектор, использованный в нашем исследовании, управлялся вручную. Тщательное прижигание pars plana цилиарного тела и достаточный разрез внутри большой склеротомии, по-видимому, имеют решающее значение для предотвращения интраоперационных осложнений, таких как ятрогенная периферическая отслойка сетчатки, кровотечение и потеря имплантата.
Таким образом, мы описываем использование модели минипига Либехова для трансплантации клеток RPE на биодеградируемых носителях в качестве варианта лечения наследственных и приобретенных заболеваний сетчатки. Сходство в анатомии и физиологии глаза, а также в отношении иммунной системы позволяет нам разрабатывать и совершенствовать хирургические методы и инструменты для субретинальной имплантации клеток, которые могут быть легко перенесены на лечение заболеваний глаз человека. Важно обеспечить, чтобы операции на минипигах выполнялись с использованием тех же инструментов (включая инструменты для доставки имплантатов), что и при использовании в операциях на людях, что облегчает применение накопленного опыта и ноу-хау к людям. Альтернативные модели животных с большим глазом с наличием макулярной области, такие как нечеловеческие приматы, могут быть полезны для наблюдения и анализа анатомических и функциональных изменений после субретинальной имплантации в центральную область сетчатки. Подробное описание процедур предоперационного, хирургического и послеоперационного ухода будет полезно для будущих исследований за счет повышения эффективности и стандартизации генерации данных.
Disclosures
Никакой.
Acknowledgments
Проект был поддержан Чешским научным фондом (номер проекта 18-04393S) и Норвежским агентством грантов и технологий Чешской Республики (программа KAPPA, номер проекта TO01000107).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Technical equipment | |||
| Wato EX-65 with a Mindray iMEC10 | Mindray, Shenzhen, China | Wato Ex-65 | anesthesia machine |
| R-Evolution CR | Optikon, Rome, Italy | R-Evolution CR | phacoemulsifier/vitrectome |
| Green laser Merilas 532α | Meridian, Thun, Switzerland | Merilas 532α | ophthalmic green laser |
| Microscope Hi-R NEO 900A | Haag-Streit Surgical, Wedel, Germany) | Hi-R NEO 900A | ophthalmic surgery microscope |
| Camera Sony PMW-10MD | Sony, Tokyo, Japan | PMW-10MD | full HD medical 2-piece |
| Non-contact vitreoretinal surgical system MERLIN BIOM | Volk, Mentor, OH, USA | MERLIN BIOM | BIOM |
| Steam sterilizer | Tuttnauer Europe B.V., Breda, NL | 3870 HSG | sterilizer |
| iCam100 | Optovue, Fremont, CA, USA | iCAM100 | funduscamera |
| iVue OCT100-2 | Optovue, Fremont, CA, USA | iVue OCT100-2 | OCT |
| Microsurgical instruments and devices | |||
| Cook Eye Speculum | Katena, New Jersey, US | K1-5403 | 15mm blades |
| Ophthalmology surgical drape | Hylyard, Alpharetta, Georgie, USA | 79304 | 132 x 142cm |
| Disposable Two step vitrectomy system. (23 gauge/ 0.6 mm) | DORC, Zuidland, Netherlands | 1272.ED06 | |
| Infusion line for 23G / 0.6 mm infusion cannula | DORC, Zuidland, Netherlands | 1279.P | |
| knife 2.75mm, IQ Geometry Tm Slit Knife Angled, Bevel Up | Surgical Specialties Corporation, Reading, USA | 72-2761G | |
| Extendible 41G subretinal injection needle. (23 gauge / 0.6 mm) | DORC, Zuidland, Netherlands | 1270.EXT | |
| Omnifix 3ml Luer Lock Solo siringe | BBraun, Melsungen, Germany | 4617022V | 3ml |
| 1ml soft-inject Tuberculin | Henke Sass Wolf, Tuttlingen, Germany | 5010.200V0 | 1ml |
| 8-0 Coated Vicryl | Ethicon, Puerto Rico, USA | J409G | |
| Purified Silicone Oil (in syringe) 10 ml | (FCI, Paris, France) | S5.7170 | 1000cSt |
| Pinnacle 360 Morris Vertical Scissors 23Ga | Synergetics, O'Fallon, USA | 10.24.23PIN | 23Ga |
| Revolution DSP 23Ga ILM forceps | Alcon, Geneva, Switzerland | 706.44 | Griesharber revolution |
| 23ga Straight Laser Probe | Synergetics, O’Fallon, USA | 55.21.23 | |
| FCI Protect 2.0% | FCI Ophthalmics, Paris, France | S5.9100 | viscoelastic |
| DK Westcott style Stitch Scissors, Curve | Duckworth & Kent, Hertfordshire, England | 1-501 | Curve |
| Pierse Notched Forceps, 0,3mm Straigh | Duckworth & Kent, Hertfordshire, England | 2-100-1E | 0,3mm straigh |
| DK Harms-Tubingen Straight Tying Forceps | Duckworth & Kent, Hertfordshire, England | 2-504E | 6mm |
| DK Needle Holder, Straigh | Duckworth & Kent, Hertfordshire, England | 3-201 | 9mm straigh |
| Medications and solutions | |||
| Unitropic 1% gtt. | UNIMED PHARMA spol. s r.o., Bratislava, Slovak republic | tropicamidum 10 mg/ml | eye drops |
| Diprophos | Merck Sharp & Dohme B.V., Haarlem, Netherlands | betamethasonum 7 mg/ml | 1ml |
| Alcon BSS Irrigation Solution | Alcon, Geneva, Switzerland | balance salt solution (BSS) | 500ml |
| Betaisodona | Mundipharma, Cambridge, United Kingdom | povidon-Iodine 1g/10ml | 30ml |
| Depo-medrol 120mg | Pfizer, New Yourk, USA | methylprednisolon | 5ml/200mg |
| Shotapen | Virbac Carros Cedex, France | benzylpenicillin, dihydrostreptomycin | 250ml |
| Flunixin a.u.v. | Norbrook, Newry, Northern Ireland | flunixinum 50,0 mg | 250ml |
| Tramal 100MG/2ML | Stada Arzneimittel AG, Bad Vilbel, Deutschland | tramadol | 2ml |
| Zoletil 100 | Virbac Carros Cedex, France | tiletamine, zolazepam | 100mg |
| Narkeran 10 | Vetoquinol, Magny-Vernois, France | ketamin | 2ml |
| Rometar 20mg/ml | Spofa pharmaceutica, Prague, Czech republic | xylazinum | 20mg |
| Braunol 75mg/g | B.Braun medical, Prague, Czech republic | povidone iodine | 75mg/g |
| Propofol 1% MCT/LCT | Fresenius Kabi, Bad Homburg, Deutschland | propofol | 10mg/1ml |
| Isoflurane 100% Inhalation vapour, liquid | Piramal Critical Care Limited, West Drayton, United Kingdom | isoflurane | 100% |
| Benoxi gtt. 4mg/1ml | Unimed pharma, Bratislava, Slovakia | oxybuprakaine | 10ml |
| Neosynephrin POS 10% gtt. | Ursapharm , Saarbrücken, Deutschland | fenylefrin chloride | 10ml |
| Ophthalmo-framykoin 1X5GM | Zentiva a.s., Prague, Czech republic | bacitracin zinc/hydrocortisone acetate/hydrocortisoneacetate/neomycin sulfate | 5mg |
| Floxal ung. | Dr. Gerhard Mann Chem.-Pharm. Fabrik, Berlin, Germany | ofloxacin | 0.30% |
| Eficur inj. | Hipra, Amer, Spain | ceftiofurum hydrochloridum | 50mg / 1ml |
| Draxxin | Zoetis Inc., New Jersey, USA | tulathromycinum | 100mg / 1ml |
| Tramal | Stada Arzneimittel AG, Bad Vilbel, Deutschland | tramadoli hydrochloridum | 100mg / 2ml |
| Xylapan | Vetoquinol, Magny-Vernois, France | xylazinum | 0.4 mg/kg |
| Proparacaine hydrochlorid ophthalmic solution 0,5% | Bausch&Lomb Incorporated Tampa, FL, USA | Proparacaine hydrochlorid | 0.50% |
| Prograf | Astellas Pharma, Deerfield, Illinois, USA | Tacrolimus powder | 1mg |
| Cell carrier, cultivated cells cultures, and implantation injector | |||
| Falcon Cell Culture Inserts | Corning Inc., Kenneburg, ME, USA | 353103 | |
| TrypLE Express Enzyme (1X) | Thermo Fisher Scientific, MA, USA | 12604021 | |
| DMEM/F-12 | Thermo Fisher Scientific, MA, USA | 11320033 | |
| Biolaminin 521 LN (LN521) | BioLamina, Sundbyberg, Sweden | LN521-02 | |
| GlutaMAX Supplement | Thermo Fisher Scientific, MA, USA | 35050061 | |
| 2-Mercaptoethanol | Thermo Fisher Scientific, MA, USA | J66742.0B | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich, San Luis, Mi, USA | P4333 | |
| CRALBP | Novus Biologicals, Abingdon, UK | NB100-74392 | |
| Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific, Germany | 21202 |
References
- Pascolini, D., Mariotti, S. P. Global estimates of visual impairment: 2010. British Journal of Ophthalmology. 96 (5), 614-618 (2011).
- Bressler, N. M., Bressler, S. B., Fine, S. L.
- Binder, S., Stanzel, B. V., Krebs, I., Glittenberg, C.
- Mano, F., et al. Methodological approach to improve surgical outcomes of a pig subretinal implantation model. Translational Vision Science & Technology. 11 (4), 24 (2022).
- Ramsden, C. M., et al. Stem cells in retinal regeneration: Past, present and future. Development. 140 (12), 2576-2585 (2013).
- Carr, A. -J. F., et al. Development of human embryonic stem cell therapies for age-related macular degeneration. Trends in Neurosciences. 36 (7), 385-395 (2013).
- Tezel, T. H., Kaplan, H. J., Del Priore, L. V. Fate of human retinal pigment epithelial cells seeded onto layers of human Bruch's membrane. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 40 (2), 467-476 (1999).
- Popelka, S., et al. A frame-supported ultrathin electrospun polymer membrane for transplantation of retinal pigment epithelial cells. Biomedical Materials. 10 (4), 045022 (2015).
- Kozak, I., et al. Safety and feasibility of new nanofiber subretinal delivery system with injector for RPE cell transplantation. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 59 (9), 5670 (2018).
- Koss, M. J., et al. Subretinal implantation of a monolayer of human embryonic stem cell-derived retinal pigment epithelium: a feasibility and safety study in Yucatan minipigs. Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology = Albrecht von Graefes Archiv fur Klinische und Experimentelle Ophthalmologie. 254 (8), 1553-1565 (2016).
- Ghosh, F., Wong, F., Johansson, K., Bruun, A., Petters, R. M. Transplantation of full-thickness retina in the rhodopsin transgenic pig. Retina. 24 (1), 98-109 (2004).
- Christiansen, A. T., et al. Subretinal implantation of electrospun, short nanowire, and smooth poly(epsilon-caprolactone) scaffolds to the subretinal space of porcine eyes. Stem Cells International. 2012, 454295 (2012).
- Stanzel, B. V., et al. Subretinal delivery of ultrathin rigid-elastic cell carriers using a metallic shooter instrument and biodegradable hydrogel encapsulation. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (1), 490-500 (2012).
- Gandhi, J. K., et al. Fibrin hydrogels are safe, degradable scaffolds for sub-retinal implantation. PloS One. 15 (1), 0227641 (2020).
- Liu, Z., et al. Surgical transplantation of human RPE stem cell-derived RPE monolayers into non-human primates with immunosuppression. Stem Cell Reports. 16 (2), 237-251 (2021).
- Mandai, M., et al. Autologous induced stem-cell-derived retinal cells for macular degeneration. New England Journal of Medicine. 376 (11), 1038-1046 (2017).
- Schwartz, S. D., et al. Human embryonic stem cell-derived retinal pigment epithelium in patients with age-related macular degeneration and Stargardt's macular dystrophy: Follow-up of two open-label phase 1/2 studies. Lancet. 385 (9967), 509-516 (2015).
- Kashani, A. H., et al. Surgical method for implantation of a biosynthetic retinal pigment epithelium monolayer for geographic atrophy: Experience from a phase 1/2a study. Ophthalmology Retina. 4 (3), 264-273 (2020).
- Kashani, A. H., et al. Subretinal implantation of a human embryonic stem cell-derived retinal pigment epithelium monolayer in a porcine model. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1185, 569-574 (2019).
- Kashani, A. H., et al. A bioengineered retinal pigment epithelial monolayer for advanced, dry age-related macular degeneration. Science Translational Medicine. 10 (435), 4097 (2018).
- da Cruz, L., et al. Phase 1 clinical study of an embryonic stem cell-derived retinal pigment epithelium patch in age-related macular degeneration. Nature Biotechnology. 36 (4), 328-337 (2018).
- Diniz, B., et al. Subretinal implantation of retinal pigment epithelial cells derived from human embryonic stem cells: Improved survival when implanted as a monolayer. Invest Ophthalmol Vis Sci. 54 (7), 5087-5096 (2013).
- Sharma, R., et al. Clinical-grade stem cell-derived retinal pigment epithelium patch rescues retinal degeneration in rodents and pigs. Science Translational Medicine. 11 (475), 7624 (2019).
- Stanzel, B., et al. Human RPE stem cells grown into polarized RPE monolayers on a polyester matrix are maintained after grafting into rabbit subretinal space. Stem Cell Reports. 2 (1), 64-77 (2014).
- Al-Nawaiseh, S., et al. A step by step protocol for subretinal surgery in rabbits. Journal of Visualized Experiments. (115), e53927 (2016).
- Stanzel, B., et al. Surgical approaches for cell therapeutics delivery to the retinal pigment epithelium and retina. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1186, 141-170 (2019).
- Yaji, N., Yamato, M., Yang, J., Okano, T., Hori, S. Transplantation of tissue-engineered retinal pigment epithelial cell sheets in a rabbit model. Biomaterials. 30 (5), 797-803 (2009).
- Hruban, V., et al. Inheritance of malignant melanoma in the MeLiM strain of miniature pigs. Veterinarni Medicina. 49 (12), 453-459 (2004).
- Vodicka, P., et al. The miniature pig as an animal model in biomedical research. Annals of the New York Academy of Sciences. 1049, 161-171 (2005).
- Vízina, M. Comparative Ocular Anatomy in Commonly Used Laboratory Animals. Ocular Toxicology in Laboratory Animals. Wier, A. B., Collins, M. , Humana Press. Totowa, NJ. 9-12 (2013).
- Chandler, M. J., Smith, P. J., Samuelson, D. A., MacKay, E. O. Photoreceptor density of the domestic pig retina. Veterinary Ophthalmology. 2 (3), 179-184 (1999).
- Wang, Q. X., et al. Biodegradable microsphere-loaded tacrolimus enhanced the effect on mice islet allograft and reduced the adverse effect on insulin secretion. American Journal of Transplantation. 4 (5), 721-727 (2004).
- Sevc, J., et al. Effective long-term immunosuppression in rats by subcutaneously implanted sustained-release tacrolimus pellet: Effect on spinally grafted human neural precursor survival. Experimental Neurology. 248, 85-99 (2013).
- Juhásová, J., et al. Osteogenic differentiation of miniature pig mesenchymal stem cells in 2D and 3D environment. Physiological Research. 60 (3), 559-571 (2011).
- Planka, L., et al. Nanotechnology and mesenchymal stem cells with chondrocytes in prevention of partial growth plate arrest in pigs. Biomedical Papers of the Medical Faculty of the University Palacky, Olomouc, Czech Republic. 156 (2), 128-134 (2012).
- Soerensen, D. D., Pedersen, L. J. Infrared skin temperature measurements for monitoring health in pigs: a review. Acta Veterinaria Scandinavica. 57 (1), 5 (2015).
- Eichhorn, S. J., Sampson, W. W. Statistical geometry of pores and statistics of porous nanofibrous assemblies. Journal of the Royal Society Interface. 2 (4), 309-318 (2005).
- Szatmári-Tóth, M., et al. Clearance of autophagy-associated dying retinal pigment epithelial cells - a possible source for inflammation in age-related macular degeneration. Cell Death & Disease. 7 (9), 2367 (2016).
- Lukovic, D., et al. Human iPSC derived disease model of MERTK-associated retinitis pigmentosa. Scientific Reports. 5, 12910 (2015).
- Artero Castro, A., et al. Generation of gene-corrected human induced pluripotent stem cell lines derived from retinitis pigmentosa patient with Ser331Cysfs*5 mutation in MERTK. Stem Cell Research. 34, 101341 (2019).
- Artero Castro, A., León, M., Del Buey Furió, V., Erceg, S., Lukovic, D. Generation of a human iPSC line by mRNA reprogramming. Stem Cell Research. 28, 157-160 (2018).
- Artero-Castro, A., et al. correction recovers phagocytosis in retinal pigment epithelium derived from retinitis pigmentosa-human-induced pluripotent stem cells. International Journal of Molecular Sciences. 22 (4), 2092 (2021).
- Müller, B., Wagner, F., Lorenz, B., Stieger, K. Organotypic cultures of adult mouse retina: Morphologic changes and gene expression. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 58 (4), 1930-1940 (2017).
- Sheridan, C. M., et al.
- Radtke, N. D., et al. Vision improvement in retinal degeneration patients by implantation of retina together with retinal pigment epithelium. American Journal of Ophthalmology. 146 (2), 172-182 (2008).
- Maaijwee, K. J. M., et al. Histological evidence for revascularisation of an autologous retinal pigment epithelium--choroid graft in the pig. The British Journal of Ophthalmology. 91 (4), 546-550 (2007).
- Ghosh, F., Engelsberg, K., English, R. V., Petters, R. M. Long-term neuroretinal full-thickness transplants in a large animal model of severe retinitis pigmentosa. Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology = Albrecht von Graefes Archiv fur Klinische und Experimentelle Ophthalmologie. 245 (6), 835-846 (2007).
- Radtke, N. D., Seiler, M. J., Aramant, R. B., Petry, H. M., Pidwell, D. J. Transplantation of intact sheets of fetal neural retina with its retinal pigment epithelium in retinitis pigmentosa patients. American Journal of Ophthalmology. 133 (4), 544-550 (2002).
- Slijkerman, R. W., et al. The pros and cons of vertebrate animal models for functional and therapeutic research on inherited retinal dystrophies. Progress in Retinal and Eye Research. 48, 137-159 (2015).
- Schramke, S., et al. The Libechov minipig as a large animal model for preclinical research in Huntington's disease - Thoughts and perspectives. Czech and Slovak Neurology and Neurosurgery. 78/111, Supplementum 2 55-60 (2015).
- Tohyama, S., Kobayashi, E. Age-appropriateness of porcine models used for cell transplantation. Cell Transplantation. 28 (2), 224-228 (2019).
- Dall, A. M., et al. Quantitative [18F] fluorodopa/PET and histology of fetal mesencephalic dopaminergic grafts to the striatum of MPTP-poisoned minipigs. Cell Transplantation. 11 (8), 733-746 (2002).
- Shrader, S. M., Greentree, W. F.
- Duarri, A., et al. Transplantation of human induced pluripotent stem cell-derived retinal pigment epithelium in a swine model of geographic atrophy. International Journal of Molecular Sciences. 22 (19), 10497 (2021).
