Summary
Den subretinala implantationen av retinalt pigmenterat epitel (RPE) är en av de mest lovande metoderna för behandling av degenerativa näthinnesjukdomar. Utförandet av prekliniska studier på storögda djurmodeller är dock fortfarande utmanande. Denna rapport presenterar riktlinjer för subretinal transplantation av RPE på en cellbärare till minigrisar.
Abstract
Degenerativa störningar i näthinnan (inklusive åldersrelaterad makuladegeneration), som huvudsakligen har sitt ursprung vid eller inom det retinala pigmenterade epitelskiktet (RPE), leder till en progressiv disorganisering av näthinnans anatomi och försämringen av visuell funktion. Substitutionen av skadade RPE-celler (RPE) med in vitro-odlade RPE-celler med hjälp av en subretinal cellbärare har visat potential för att återupprätta den anatomiska strukturen hos de yttre näthinnelagren och studeras därför ytterligare. Här presenterar vi principerna för en kirurgisk teknik som möjliggör effektiv subretinal transplantation av en cellbärare med odlade RPE till minigrisar. Operationerna utfördes under generell anestesi och inkluderade en standard linssparande tre-port pars plana vitrektomi (PPV), subretinal applicering av en balanserad saltlösning (BSS), en 2,7 mm retinotomi, implantation av en nanofibrös cellbärare i subretinalutrymmet genom ytterligare 3,0 mm sklerotomi, vätske-luftutbyte (FAX), silikonoljetamponad och stängning av alla sklerotomier. Detta kirurgiska tillvägagångssätt användes i 29 operationer (18 djur) under de senaste 8 åren med en framgångsgrad på 93,1%. Anatomisk verifiering av den kirurgiska placeringen utfördes med hjälp av in vivo fundus-avbildning (fundusfotografering och optisk koherenstomografi). De rekommenderade kirurgiska stegen för subretinal implantation av RPE på en bärare i minigrisögon kan användas i framtida prekliniska studier med storögda djurmodeller.
Introduction
Åldersrelaterad makuladegeneration (AMD) anses vara den främsta orsaken till central synförlust i utvecklade länder och är ett av många tillstånd relaterade till retinal pigmenterat epitel (RPE) dysfunktion 1,2. RPE finns på det basalt belägna Bruchs membran (BM) och ger det nödvändiga underhållet för fotoreceptorerna. Den progressiva degenerationen av RPE-skiktet är ett kännetecken för den tidiga atrofiska formen av AMD, och den åtföljer också utvecklingen av den sena exsudativa formen av AMD också. Trots många framsteg inom retinal sjukdomsbehandling är utvecklingen av en effektiv behandlingsmodalitet fortfarande utmanande3. En av de lovande metoderna är RPE-ersättning med hjälp av ett in vitro-odlat RPE-lager. Denna behandling är förknippad med framsteg inom stamcellsforskning med humant embryonalt stamcellshärlett RPE (hESC-RPE) och inducerat pluripotent stamcellshärlett RPE (iPSC-RPE)3,4,5,6,7. Under de senaste åren har många forskargrupper fokuserat på att utveckla olika metoder för RPE-ersättning med det ursprungligen accepterade proof-of-concept 8,9,10,11,12,13,14,15. RPE-cellerna (RPE) levereras vanligtvis in i subretinalutrymmet i form av en cellsuspension, ett självbärande cellark eller ett cellmonolager som stöds av en artificiell bärare 3,16,17,18,19,20,21. Injektion av en cellsuspension är den enklaste metoden, men BM: s komprometterade tillstånd kan ofta förhindra fästning av de transplanterade cellerna. Detta kan resultera i felaktig apicobasal orientering av RPE och misslyckande med att bilda ett monolager22,23. Den största fördelen med de andra två metoderna (dvs ett självbärande cellark och ett cellmonolager som stöds av ett konstgjort substrat) är att cellerna redan är i ett differentierat monolagertillstånd när de implanteras direkt i subretinalutrymmet24.
Många kirurgiska tekniker som beskriver leverans av cellbärare till subretinalutrymmet har publicerats de senaste åren 8,9,10,11,12,13,14,15. Dessa studier beskrev användningen av storögda djurmodeller, typerna av cellulära bärare, användningen av transplanterade cellulära kulturer, implantationsinstrumenten samt kirurgiska tekniker, och författarna fokuserade huvudsakligen på resultaten av subretinal implantation. År 2015 rapporterade Popelka et al. användningen av ett ramstött ultratunt elektrospunnet polymermembran för transplantation av RPE i svinkadaverögon8. Den kirurgiska tekniken som beskrivs här med subretinal implantation av cellbäraren möjliggjorde relativt exakt hantering av bäraren och enkel positionering av ställningen i subretinalutrymmet. Kozak et al. bedömde genomförbarheten av leveranstekniken hos en bärare med en ungefärlig storlek på 2 mm x 5 mm i svinögon9. Den unika utformningen av cellbäraren möjliggjorde korrekt placering, vilket förhindrade att det cellulära monolagret viks och skrynklas6. Al-Nawaiseh et al. presenterade först detaljerade steg-för-steg-riktlinjer för subretinal ställningsimplantation hos kaniner25. Stanzel et al. publicerade sedan ett liknande protokoll 2019 för transplantation hos små gnagare, kaniner, grisar och icke-mänskliga primater26. Som tidigare publicerats resulterade transplantationen av ett differentierat och polariserat RPE-monolager på en fast bärare i förbättrad överlevnad och bättre integration av transplantatet jämfört med andra leveranstekniker (kompletterande fil 1)27.
Syftet med alla prekliniska djurstudier som utförs in vivo är att avslöja de olika aspekterna av kirurgisk transvitreal subretinal implantation av en cellbärare med fokus på procedursäkerheten, överlevnaden av de transplanterade cellerna, vävnadssvaret på de subretinala manövrarna och de kort- och långsiktiga postoperativa resultaten. Användningen av svinögon som en storögd djurmodell har rapporterats vara relevant när det gäller omfattningen av de erhållna uppgifterna, vilket kan vara användbart och potentiellt tillämpligt på människor10,11,14. Vår studie rapporterar den kirurgiska tekniken som används för in vivo subretinal implantation av en cellbärare i en storögd djurmodell. Vi presenterar en detaljerad beskrivning av de preoperativa preparaten, den kirurgiska tekniken för implantation av subretinal cellbärare och den postoperativa vården av minigrisögonen baserat på vår erfarenhet under de senaste 8 åren. Vi beskriver de grundläggande kirurgiska principer som kan användas för in vivo experimentella studier som involverar implantation av olika typer av celler och cellbärare.
Stor djurmodell
Den experimentella besättningen av Liběchov minigrisar grundades genom att importera fem djur från Hormel-stammen från USA 1967. Dessa djur korsades för svinblodgruppsstudier med flera andra raser eller stammar: Landrace, Large White, Cornwall, vietnamesiska grisar och miniatyrgrisar av Göttingen-ursprung28,29. Vid 5 månaders ålder och cirka 20 kg kroppsvikt (BW) når minigrisarna sexuell mognad. Överlevnaden av föräldrarnas minigrisraser (Hormel och Göttingen) rapporteras vara 12-20 år. Den subretinala implantationen av cellbäraren riktar sig mot den centrala delen av näthinnan. Minisvinens näthinna saknar en makula och fovea. Det har emellertid regioner med högkonade konfotoreceptorer som kallas området centralis och visuella streck30,31. Dessa regioner ansvarar för högsta synskärpa.
Operationerna utfördes av fyra erfarna vitreoretinala kirurger med hjälp av en erfaren kirurgisk anläggningsassistent (TA). Före in vivo-experimenten utbildades kirurgerna och fick särskild kunskap om minipigögonanatomi, såsom avseende det lägre förhållandet mellan lins och glaskroppsvolym, den kortare axiella längden (15-19 mm), frånvaron av Bowmans membran i hornhinnan, den mindre glaskroppen (2,8-3,2 ml), frånvaron av makula och fovea, frånvaron av ringformen av Zinn och den optiska skivans diameter (vertikal/horisontell: 1,5 mm/2,1 mm). I samtliga fall utfördes operationen under generell anestesi i ett speciellt organiserat operationsrum med genomförande av standard aseptiska och antiseptiska åtgärder.
Protocol
Denna studie följer principerna i riktlinjerna i Helsingforsdeklarationen och etiska principer för medicinsk forskning som involverar människor. Alla försök utfördes enligt riktlinjerna för vård och användning av försöksdjur och enligt Association for Research in Vision and Ophthalmology (ARVO) för användning av djur i oftalmisk och visuell forskning. Studieprotokollet godkändes av Resort Professional Commission of the CAS för godkännande av projekt för djurförsök vid Institutet för djurfysiologi och genetik vid den tjeckiska vetenskapsakademin (Liběchov, Tjeckien) (godkänt protokoll nr 60/2016 och nr 64/2019).
1. Överväganden vid subretinal transplantation av celler på en bärare till minigrisar
- Val av djur
- Skaffa och använd Liběchov minigrisar som är 12-36 månader gamla, antingen kön, och cirka 40-80 kg kroppsvikt (BW).
- Håll minigrisarna inomhus i ett luftkonditionerat djurhus med temperaturer mellan 18-22 °C, exponering för en konstgjord 13 h / 11 h ljus / mörk cykel, standardiserade individuella pennor, fri tillgång till vatten och två gånger dagligen utfodring.
- Förberedelse före operationen
- Kontrollera om ögat är kirurgiskt orienterat och rita fundussystemen. För att göra det, dela schematiskt näthinnan hos minigrisarna på fundusritningen med en penna med en vertikal linje i de temporala (från optisk skiva mot örat), nasala (från optisk skiva mot grisens nos) och centrala (mellan de stora retinala kärlen på nässidan) regioner (figur 1A, B).
- Välj endast friska djur utan beteendemässig och neurologisk patologi och med normal kvalitet på hud, kroppsöppningar, avföring och matkonsumtion. Låt en skicklig veterinär utföra den kliniska observationen och välja djuren.
- Injicera intramuskulärt 3 mg/kg kroppsvikt ceftiofurhydroklorid (1 ml/kg) på operationsdagen.
- Preoperativ immunsuppression
- Bered takrolimuseluerande polymermikrosfärer enligt beskrivningen i Wang et al. och Sevc et al. 32,33 med modifiering.
- Se till att koncentrationen av takrolimus i polymermikrosfärerna är 51,3 mg/g enligt HPLC (Table of Materials).
- Utför en subkutan injektion av takrolimusladdade polymermikrosfärer i en dos på 0,25 mg/kg kroppsvikt 6 dagar före ögonoperationen för att förhindra avstötning av celltransplantat. Detta görs för att säkerställa överlevnaden av de mänskliga RPE-donatorcellerna under xenogen transplantation i minigrisögonen.
- Injicera djuren intramuskulärt på operationsdagen med 80 mg depo-medrol och bensylpenicillin vid 1 ml/10 kg beroende på kroppsvikt.
- Anestesi
- Inducera generell anestesi med en intramuskulär injektion av en blandning av tiletamin (2 mg/kg), zolazepam (2 mg/kg), ketamin (2 mg/kg) och xylazin (0,4 mg/kg)-TKX34,35 före operationen. Kontrollera anestesidjupet genom ett tillstånd av medvetslöshet och genom att kontrollera pedalreflexen (en nypa av bakbenets interdigitala hud), hornhinnereflexen (en liten beröring av hornhinnan), pupillreflexen (reaktion på ljuset) och palpebralreflexen (en beröring av ögonlocket). Se till att djuret inte blinkar. Bekräfta hjärtat och andningsfrekvensens regelbundenhet.
- Efter induktion av anestesi, transportera det sederade djuret till operationssalen på en lyftvagn (figur 2A).
- Placera djuret på operationsbordet på vänster sida för att möjliggöra operation på höger öga (figur 2B).
- Utför justeringen av djurets huvud med hjälp av styrofoamkuddar för att uppnå den lämpligaste positionen för den centrala näthinnan för implantation (dvs. horisontellt och parallellt med golvet) (figur 2C).
- Placera ögondroppar av 0,5% proparakainhydroklorid oftalmisk lösning i konjunktivalsäcken tre gånger 1 min mellanrum för att inducera lokalbedövning.
- Sätt in en venkanyl och intubera djuret med ett endotrakealt rör för inhalationsunderhåll av anestesi (1,5% isofluran) med hjälp av en anestesimaskin utrustad med en patientmonitor (figur 2A, B).
- Administrera en intramuskulär injektion av 1 ml Eficur per 16 kg kroppsvikt och 20 mg Depo-Medrol 1 cirka 15 minuter före ögonoperationens början (materialtabell).
- Bibehålla den fysiologiska kroppstemperaturen genom att täcka djuret med isotermisk folie och utföra operationen enligt beskrivningen i avsnitt 3.
- Under operationen, övervaka djurets temperatur tillsammans med hjärtfrekvensen och blodets syremättnad med hjälp av en öronklämma och patientmonitor. Undvik att sänka kroppstemperaturen under 38 °C under procedurerna, vilket anses vara en säker gräns36. Behåll syremättnaden (>96%) och pulsfrekvensen (70-90 slag per minut) under hela experimentet.
- När operationen är klar, stäng av flödet av isofluran och extubera djuret.
- Efter spontan andning och uppvaknande, överför djuren till sina pennor.
- Inställning av operationssal
- Ordna operationssalen enligt operationens behov på ögonen på den stora ögondjurmodellen (figur 3A, B). Justera höjden på kirurgens stolar, liksom mikroskopets höjd, för att uppnå en bekväm position för kirurgerna med avseende på positionen för grisens snut.
Figur 1: Schematisk ritning av näthinnans zoner hos minigrisar. A) Schematisk ritning av näthinnans zoner i förhållande till minigrisens huvud. den gula ellipsen visar det önskade området för subretinal implantation, T hänvisar till det temporala retinalområdet och N hänvisar till näsnäthinnan. (B) Exempel på fundus-schemat efter subretinal implantation av cellbäraren (gul) genom retinotomi (röd). Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Transport och placering av djuret . (A) Transport av det sederade djuret till operationssalen. b) Djurets placering under intubationen. (C) Justering av djurets huvud för optimal åtkomst till den centrala näthinnan under operationen (röd pil). Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Standardinställningen för operationssalen. (A) Schematisk bild av kirurgernas position (S = kirurg, A = assistent) i förhållande till operationsbordets position med minigrisen, operationsmikroskopet (OM), vitrektomimaskinen (VM), instrumentbordet (IT) och anestesiologimaskinen (AM). Det finns två möjliga positioner för vitrektomimaskinen (gul och grå). (B) Verklig miljö i operationssalen. Klicka här för att se en större version av denna figur.
2. Cellbärare, odlade cellkulturer och implantationsinjektor
- Cell bärare
- Skär den 30 μm breda ovala ramen med yttermåtten 1,7 mm x 4,8 mm, utrustad med triangulära utsprång asymmetriskt placerade på ramen (figur 4A), från en biaxiellt orienterad 36 μm tjock polyetentereftalatfolie (PET) med en femtosekundlaser.
- Bered poly(L-laktid-co-DL-laktid) (LLA/DLLA 90/10, MW 868, 270 g/mol) polymerlösning i pyridin i en koncentration av 11 viktprocent med tillsats av 2,2 μl myrsyra per 1 g lösning.
- Förbered det nanofibrösa membranet med en inbäddad stödram (figur 4B) genom elektrospinning av polymerlösningen i tre steg8: (1) deponera det första lagret av nanofibrer på ett kiselsubstrat, (2) placera ramen på skiktet och (3) deponera det andra lagret av nanofibrer.
OBS: Deponera varje lager i 7 minuter för att nå en total membrantjocklek på 3,7 μm. Använd följande parametrar för att erhålla ett membran bestående av 380 nm tjocka fibrer och med en genomsnittlig porstorlek på 0,4 μm och en porositet på cirka 70%37: en 20 G stålnål, en spänning på 7,1 kV, ett mellanrum på 10 cm, en flödeshastighet på 250 μl / min och en temperatur på 25,0 ° C ± 0,5 ° C. - Ta försiktigt bort membranet med den inbäddade ramen från kiselsubstratet och fixera det på kroppen av en kommersiell 12-brunnscellkulturinsats utan det ursprungliga membranet för att underlätta sådd och tillväxt av celler.
- Behandla det nanofibrösa membranet före cellsådd i luftplasma i 30 s med en effekt av 70 W i en plasmarenare.
- Cellkulturer som används för odling på cellbäraren
OBS: Följande cellbärare kan användas: 1) nanofibrösa cellbärare utan några celler; 2) nanofibrösa cellbärare med primära humana RPE (hRPE), 3) nanofibrösa cellbärare med humana iPSC-härledda RPE-celler.- Odling av primära hRPEs
- Isolera primära hRPE-celler från mänskliga donatorögon enligt en tidigare rapporterad teknik38.
- Hämta cellerna genom enzymatisk behandling av näthinnan i 30 minuter. Odla sedan de primära hRPE-cellerna (passage 0) i upp till 2 veckor i DMEM / F12 kompletterat med 10% fetalt bovint serum (FBS).
- När cellkulturerna når sammanflöde, byt medium till 1% FBS och kultur i ytterligare 30 dagar.
- Frö de primära hRPE: erna på transbrunnsplattor och på en lamininbelagd nanofibrös cellbärare med en densitet av 2,000 celler / mm2. Efter ytterligare 30 dagars inkubation i 1% FBS, använd cellbärarna med primära hRPE för subretinal implantation i minigrisar.
- Mänskliga iPSC-härledda RPE:er
- Använd hiPSC härledda från MERTK-associerade retinitpigmentosa patienthärledda fibroblaster 39 som är genkorrigerade i två alleler med hjälp av CRISPR/Cas9-systemet (RP1-FiPS4F1-GC2)40, samt hiPSC härledda från fibroblaster hos en frisk försöksperson (Ctrl2-FiPS5F2)41 som används som kontroll.
- Generera och därefter differentiera båda hiPSCs-cellinjerna mot RPE-celler (hiPSC-RPE) som rapporterats tidigare42.
- Platta hiPSC-RPE vid 200 000 celler/cm2 på lamininbelagda cellodlingsinsatser med nanofibrösa membran av poly(L-laktid-co-DL-laktid) med ovala implantationsramar i RPE-medium innehållande knockout DMEM, 20% knockoutserum, 0,1 mM icke-essentiella aminosyror, 0,23 mM β-merkaptoetanol, 100 E/ml penicillin, 0,1 mg/ml streptomycin och 10 mM nikotinamid.
- Byt medium varannan dag och odla hiPSC-RPE i 2 månader före implantation för att uppmuntra polariserad tillväxt.
- Injektor för implantation
- Förbered en plastkapillär med ett rektangulärt tvärsnitt på 2,8 mm x 0,8 mm genom formblåsning från ett plaströr med OD 1,75 mm / ID 1,10 mm.
- Skär ett lastfönster på 4 mm x 2,2 mm i plastkapillären 6 mm från änden.
- Montera injektorn från plastkapillären, ett silikonhandtag, en stålbladkolv och en kolv (figur 5A).
- Ladda bäraren i injektorn genom ett laddningsfönster och mata senare ut den i det subretinala utrymmet genom ett tryck på kolven, enligt beskrivningen i steg 3.5.2 (figur 5B).
- Beredning av den nanofibrösa bäraren och laddning av injektorn
- Fyll en liten petriskål av plast med 2 ml fosfatbuffrad saltlösning (PBS). Ta ut en insats med det förberedda cellskiktet, placera det på en halvmjuk polystyrenskål och centrera den under ett ljusmikroskop. Använd en specialmodifierad stans för att klippa ut bäraren längs den ovala ramen med hjälp av ett mikroskop. Bärarens mått ska vara 2 mm x 5 mm.
- Använd en skräddarsydd injektor med platt transparent slang för lastning av bäraren; 6 mm från kapillärens distala ände finns ett fönster för lastning av bäraren. Fyll injektorns fönster med PBS.
- Släpp provet från botten av skålen med hjälp av pincetten, lyft det från vätskan och transportera det till injektorns fönster medan du först kontrollerar sidoorienteringsmärkena på ramen för att upptäcka bärarens ovansida med vidhäftande celler. En oval ram underlättar manipulation med bäraren.
- Använd en tandsond (ett tandinstrument i rostfritt stål med en skarp ände) och placera bäraren i injektorns fönster. Använd kolven för att trycka in bäraren i den stängda och säkra övre delen av injektorn. Förbered sedan bäraren för operation.
- Kontrollera bärarens sidoorientering vid varje steg. Lossa den nanofibrösa bäraren från injektorn genom att trycka på metallkolven.
Figur 4: Bärare av nanofibrös styrka med en inbäddad stödjande PET-ram. (A) Tre synliga märken på ramen gör det möjligt att styra bärarens sidoorientering (vita pilar). (B) Utvidgningsvy av PET-ramfragmentet inbäddat i cellbärarens nanofibrösa membran (vita pilar). Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 5: Insprutningsinjektor . a) Injektorns delar. (B) Nanofibrös cellbärare med inbäddad stödjande PET-ram laddad till implantationsinjektorns rektangulära kapillär. Klicka här för att se en större version av denna figur.
3. Kirurgiskt ingrepp
- Kirurgisk utrustning
- Använd följande kirurgiska utrustning: ett oftalmiskt kirurgiskt mikroskop, ett operativsystem för operationer på de främre och bakre ögonsegmenten, ett kontaktfritt vitreoretinalt kirurgiskt system, en laserfotokoagulationsanordning och en digitalkamera.
De standardparametrar som används vid vitrektomi, exo- och endokauteri samt laserfotokoagulationsutrustning visas i tabell 1.
- Använd följande kirurgiska utrustning: ett oftalmiskt kirurgiskt mikroskop, ett operativsystem för operationer på de främre och bakre ögonsegmenten, ett kontaktfritt vitreoretinalt kirurgiskt system, en laserfotokoagulationsanordning och en digitalkamera.
- Kirurgiska instrument
- Sterilisera de återanvändbara kirurgiska instrumenten med en mobil autoklavångsterilisator eller liknande enligt ett standardprotokoll. De kirurgiska engångsinstrument och material som krävs under operationen listas i materialtabellen.
- Förberedelse för de kirurgiska stegen
- Efter bedövning av djuret enligt beskrivningen i steg 1.4.1, applicera 1% tropicamidlösning ögondroppar och 10% fenylefrinhydrokloridlösning i konjunktivalsäcken 15 minuter före proceduren för att provocera läkemedelsinducerad mydriasis.
- Närma dig operationsbordet med kirurgen i det övre läget och assistenten i sidoläget (figur 3).
- Raka området runt ögat med en rakhyvel för engångsbruk och ta bort grov smuts.
- Desinficera konjunktivalsäcken med 5% povidon-jodlösning i 5 minuter.
- Desinficera periorbitalområdet med bomullspinne genom att skrubba från ögonlocken till periferin. Upprepa processen tre gånger med en 10% povidon-jodlösning och låt stå i 5 minuter.
- Täck operationsfältet med ögat i mitten med ett vanligt sterilt oftalmiskt draperi med klibbig transparent folie. Flytta ögonfransarna bort från ögongloben. Undvik att skära ögonfransarna för att minska risken för postoperativ endoftalmit.
- Sätt i lockspekulum (Liberman-typ eller Cook ögonspekulum). Eventuellt fixera det nictiterande membranet på huden med 8-0 polyglaktin sutur.
- Öppna bindhinnan på nässidan 2 mm till 3 mm från limbus för att exponera sclera för sklerotomier med kirurgiska pincett och Westcott konjunktival sax.
- Sätt in de treventilerade 25 G-trokarkerna 2,5-3 mm från limbus i pars plana-området (placera dem klockan 7, klockan 10 och klockan 11). Använd roterande rörelser under insättningen på ett något snett sätt (100°-110°) mot den bakre näthinnan och håll trokaren med pincetten (figur 6).
- Håll hornhinnan våt eller belägg den med metylcellulosa under hela operationen för att förhindra osmotiskt hornhinneödem.
- Pars plana vitrektomi (PPV)
- Ta bort den mellersta delen av glaskroppen med standard tre-port pars plana vitrektomi-metoden. Ta försiktigt bort glaskroppen bakom linsen i området för den framtida stora sklerotomin.
- Använd en intravitreal 2-4 mg triamcinolonacetonid (TA) injektion (50-100 μL) för att fläcka den bakre glaskroppen, som vanligtvis förblir vidhäftande till näthinnan, för att utföra en kontrollerad bakre glaskroppsavlossning.
- Därefter utför långsamt en subretinal injektion av 0,05-0,1 ml BSS med en 41 G kanyl mer centralt, vilket undviker bildandet av en bleb mot periferin.
- Minska inställningarna för intraokulärt tryck med bevattningssystemet ner till 15 mmHg under subretinal injektion för att förhindra en övergående retinal vaskulär ocklusion.
- Utför en linjär stor endodiatermi i näthinnan med en 27 G endodiatermi sond 3 mm nära näsbotten.
- Gör sedan en 3 mm stor retinotomi med ett 25 G MVR-blad eller vertikal sax med en förhöjd intraokulär tryckinställning (IOP) av bevattningssystemet upp till 60 mmHg i 3 minuter till 5 minuter. Se till att det inte finns någon blödning från retinotomi och minska sedan IOP till 25 mmHg.
- Utför en exodiatermi av episklerala kärl mellan de två nästrokar 2,5-3 mm från limbus med en 27 G endodiatermi sond genom att applicera en mild beröring på ytan av sclera.
- Kontrollera vätskenivån i infusionsflaskan innan du förstorar sklerotomin, eftersom vätskeförbrukningen är tillfälligt hög efter sklerotomiförstoring.
- Gör en 3,0 mm stor sklerotomi, 3 mm från limbus, med en 2,75 mm phacokniv.
- Var uppmärksam på eventuell blödning från sklerala kärl och ciliary kropp inuti den stora sklerotomin. Vid blödning, använd en 27 G endodiatermisond för att koagulera de skadade kärlen. Förstora sklerotomin till 3,0 mm med en satinkniv för att rymma injektorns spets (0,8 mm x 2,8 mm).
- Ta bort den prolapsed glaskroppen på platsen för den stora sklerotomin med en vitrector. Håll infusionen av BSS i nivå med 25-30 mmHg med vitrektomisystemet för att undvika klotkollaps.
- Implantation av cellbäraren
- Sätt försiktigt in injektorn med den dominerande handen i glaskroppen genom den stora sklerotomin. Vid motstånd, förstora storleken på sklerotomin.
- Implantera cellbäraren genom retinotomi i subretinalutrymmet. Använd vid behov en bimanuell teknik med ytterligare sklerotomi och ljuskrona för att förbättra kontrollen av implantationen.
- Dra ut injektorn från ögat och stäng den stora sklerotomin med en 8-0 polyglaktinsutur för att undvika komplikationer i samband med intraokulär hypotoni.
- Utför ett fullständigt vätske-luftutbyte (FAX) och dränering av subretinalvätskan med en silikonspetsad kanyl.
- Därefter injiceras silikonolja (1 000 cSt) i glaskroppen med hjälp av vitrektomisystemet och slangsystemet för injektion av silikonolja tills IOP är normalt.
- Intraoperativ avbildning och dokumentation
- Utför en videoinspelning under hela operationen med fotodokumentation av de viktigaste stegen för implantation med hjälp av ett videoinspelningssystem.
- Slutför fundusritningen genom att dokumentera platsen för sklerotomier, retinotomi, subretinalt implantat och eventuella komplikationer som inträffade med hjälp av fundusritningsscheman.
- Steg efter operationen
- I slutet av operationen, ta bort trokarerna och stäng de tre sklerotomierna och konjunktiva med 8-0 polyglaktin suturer.
- Skölj konjunktivalsäcken med 5% povidon-jodlösning.
- Utför en 0,3 ml subkonjunktival injektion av 20 mg gentamicin, 2 mg dexametason och 2% xylocain.
- Kontrollera fundus och linsens tillstånd med hjälp av en mikroskopisk vy.
- Ta bort suturen (suturerna) från det nictiterande membranet med kirurgiska pincett och Westcott-konjunktivalsax (valfritt).
- Applicera neomycinsalva eller ofloxacin oftalmisk salva i konjunktivalsäcken.
Figur 6: Insättning av trokar i ögat på en minigris . (A) Schematisk avbildning av trokar, som sätts in vinkelrätt i sclera mot mitten av glaskroppen i det mänskliga ögat (grå färg) och på ett snett sätt mot den bakre näthinnan i minipigögat (blå färg) för att undvika skador på linsen. Minigrisens lins (blåfärgad) är större än hos människor och i förhållande till glaskroppsstorleken. (B) Intraoperativ vy av de införda trokar i en PPV med tre portar. Hornhinnan är täckt med metylcellulosa för att förhindra torkning och svullnad. Klicka här för att se en större version av denna figur.
4. Postoperativ vård
- Applicera aktuell bacitracin zink / hydrokortisonacetat / neomycinsulfat eller 0,3% ofloxacin i konjunktivalsäcken hos djuren fem gånger per dag.
- Kontrollera postoperativt följande ögonparametrar: turgor i ögonmjukvävnaderna med palpation, inflammatorisk reaktion på ögonytan och kisning som en skyddande reaktion av ögonlocken med hjälp av en handhållen slitslampa eller indirekt oftalmoskop.
- För systemisk postoperativ vård, använd följande antibiotika:
- Injicera intramuskulärt ceftiofurhydroklorid i dosen 3 mg/kg kroppsvikt (1 ml/kg) på den andra och tredje stabila dagen.
- Injicera tulatromycin (1 ml/40 kg kroppsvikt) efter 72 timmar efter operationen för förebyggande av sekundär bakteriell infektion.
- Utför en intramuskulär injektion av flunixin (2 ml / 45 kg levande vikt) och tramadolhydroklorid (100 mg) var 24: e timme i 3 dagar efter operationen för att förhindra smärta.
- Förvara minigrisarna i en specialiserad luftkonditionerad anläggning med ett temperaturintervall på 18-22 °C och en konstgjord 13 h/11 h ljus/mörk regim.
- Se till att de har fri tillgång till vatten och standardmatning (två gånger per dag).
5. Postoperativa förfaranden
- Postoperativa oftalmiska undersökningar
- Under den postoperativa perioden, inspektera ögonen med ett indirekt oftalmoskop för förekomst av inflammation (dvs rodnad, vävnadsvullnad eller slemstoppning i konjunktivalsäcken). Mät det intraokulära trycket i det opererade ögat med palpationsmetoden.
- Postoperativ avbildning
- Inducera sedering i minigrisen genom intramuskulär injektion av en TKX-blandning före fundusfotografering och OCT-undersökning. Instill 1% tropikamid och 10% fenylefrinhydroklorid ögondroppar i konjunktivalsäcken hos minigrisen för att inducera mydriasis.
- Använd ett lockspekulum för att hålla öppna ögon. För att fukta ögonytan och för att få en tydlig OCT-bild, tvätta djurets hornhinna med saltlösning (0,9% NaCl) var 30-60 s.
- Placera minigrisen på operationsbordet på samma sätt som under operationen (figur 2B, C, figur 3A). Huvudkravet är att placera huvudet på sidan och vinkelrätt mot skanningsstycket på OCT-enheten. Använd styrofoamkuddar under djurets nos för att stabilisera huvudet, vilket ger ögonytan i ett horisontellt läge.
- Samla in fundusbilder i färg med en icke-mydriatisk funduskamera i färg, eftersom detta gör det möjligt att dokumentera det främre segmentet, näthinnan och optisk skiva. Ta dessutom en rödfri bild av näthinnan med den icke-mydriatiska funduskameran.
- Utföra optisk koherenstomografiavbildning med hjälp av spektraldomänens OCT-system. Under OCT- eller fundusavbildning, luta minigrisens huvud manuellt mot OCT-linserna eller funduskameralinserna för att optimera utsikten över den bakre näthinnan och implantationsområdet (figur 2C). För optimal avbildning av den implanterade bäraren på fundus, applicera OCT-enhetens infraröda reflektansljus för att fokusera på implantatet (figur 2C). Använd OCT-korslinje- och näthinnekartskanningslägena.
- Applicera ofloxacin oftalmisk salva vid slutet av undersökningen under locket på djurets öga.
- Flytta minigrisen till inomhusanläggningen och observera dess allmänna tillstånd till slutet av sederingen (cirka 2 timmar till 5 timmar).
6. Enukleation av ögat post mortem efter eutanasi
- Lugna minisvinen med en intramuskulär injektion av TKX-blandningen följt av en intravenös (genom en 22 G öronkanyl) bolusapplicering av 1 % propofol (20 ml/djur) följt av exsanguinering. Använd inte allmänna fixeringsmedel.
- Offra djuren genom exsanguination under djup generell anestesi 7 dagar, 14 dagar, 28 dagar och 42 dagar efter celltransplantatimplantation.
- Använd pincett och sax för att ta bort de övre och nedre ögonlocken. Ta bort det tredje ögonlocket och skär genom bindhinnan. Skär ögonmusklerna och synnerven.
- Enucleate ögonen post mortem med kirurgisk sax och kirurgiska pincett. Se till att proceduren utförs av en erfaren person.
Representative Results
Resultaten av subretinal implantation av cellbäraren i Liběchov minipigs presenteras i Table 2. Framgångsrik implantation definierades som att erhålla tillräckliga data för histologisk och immunhistokemisk studie. Misslyckade fall definierades som ögon med allvarliga intraoperativa komplikationer, vilket gjorde ytterligare observation av ögonvävnaderna omöjlig.
Tillämpningen av den föreslagna tekniken med användning av silikonoljetamponad möjliggör kontroll av tillståndet för subretinal transplantation med hjälp av avbildningsmetoder från och med nästa dag efter operationen till tidpunkten för enukleation (figur 7, figur 8 och figur 9).
Fundusavbildning och SD-OCT
Minigrisarna undersöktes i den postoperativa perioden med hjälp av fundusavbildning, rödfri avbildning och spektral domänoptisk koherent tomografi (figur 7). Högkvalitativ fundusavbildning möjliggjordes genom att använda klara optiska medier, inklusive en klar lins och användning av silikonoljetamponad (figur 7A). Platsen för retinotomi visade inga tecken på en proliferativ reaktion (figur 7A, gula pilar), och cellbärarens PTE-ram var tydligt synlig genom de halvtransparenta skikten i svinnäthinnan. Vid den röda fria avbildningen skilde sig inte reflektiviteten hos de odlade hRPE:erna på bäraren från reflektiviteten hos det endogena RPE-skiktet hos svin (figur 7B). På SD-OCT orsakade PTE-ramen endast mindre skuggning av de underliggande anatomiska strukturerna och lätt förtjockning av näthinnan (figur 7C, röda pilar). Inga atypiska hypo- eller hyperreflekterande zoner noterades på SD-OCT, och Bruchs membran verkade också förbli oskadat. Figur 8 visar fundus- och iOCT-bilder av ställningen odlad med primära humana RPE-celler 1 månad efter operationen (figur 8). Cellbäraren i sig (utan några celler) orsakade ingen signifikant ökning av näthinnans tjocklek (figur 9C). Dessa fynd tyder på att implantatets intraoperativa iatrogena påverkan var minimal och att den implanterade cellbäraren genomgick tillräcklig anpassning av de implanterade cellerna till de överliggande fotoreceptorcellerna och neuroretinal vävnad.
Figur 7: Postoperativ avbildning av näthinnan hos minigrisar . (A) Fundusavbildning, (B) Rödfri bild, och (C) optisk koherenstomografiavbildning av den nanofibrösa bäraren med primära humana RPE-celler i en 1 veckas uppföljning efter subretinal transplantation i ett minigrisöga. (A) De gula pilarna anger platsen för retinotomi. (B) Röda pilar visar marginalerna för den nanofibrösa cellbäraren. (C) De röda pilarna visar den svaga skuggningen av OCT-signalen orsakad av den stödjande PET-ramen hos den nanofibrösa bäraren, som implanterades i subretinalutrymmet. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 8: Fundusavbildning och iOCT-bilder av byggnadsställningarna 30 dagar efter subretinal implantation hos minigrisarna. A, B, C, D och E motsvarar grisarna 169, 182, 179, 199 respektive 224. De gula pilarna visar ställningens ram. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Histologisk och immunohistokemisk analys
Efter avlivning av djuren avlägsnades hela minigrisögon och fixerades i 4% paraformaldehyd (PFA) i 24 timmar. Den främre delen av ögat avlägsnades, och den implanterade nanofibrösa bäraren identifierades i den nasala centrala näthinnan och isolerades med sclera fäst. Alla vävnader var kryoskyddade i graderade sackaroslösningar och vertikala frysta sektioner skars, vilket beskrivs i detalj43. Histologi av det nanofibrösa membranet utan RPE-celler efter 4 veckors implantation avslöjade näthinnor utan inflammation och degenerativa förändringar (figur 9A). Närvaron av det nanofibrösa membranet detekterades i polariserat ljus (figur 9B).
Figur 9: Histologisk analys av det implanterade acellulära nanofibrösa membranet. Hematoxylin-eosinfärgning av det acellulära nanofibrösa membranet 4 veckor efter implantation (A) med standardbelysning och (B) med polariserad ljusmikroskopi. Den vita pilen indikerar lokaliseringen av nanofibröst membran (skalstapel: 50 μm). (C) In vivo optiska koherenstomografibilder av det acellulära nanofibrösa membranet efter 4 veckor efter implantation visar god acceptans och vidhäftning av det nanofibrösa membranet i subretinalutrymmet. Den vita pilen indikerar implantatets placering i näthinnans tvärsnittsbild. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 10 visar hematoxylin-eosin (H&E) färgning av näthinnan som innehåller de implanterade primära hRPE-cellerna på en nanofibrös bärare (gul pil) i minipigögat. Det pigmenterade utseendet på de implanterade primära hRPE: erna bildade ett kontinuerligt men oregelbundet pigmenterat skikt (figur 10, röda pilar). Efter längre observationsperioder (6 veckor) visade neuronäthinnan under implantaten ett rosettliknande eller hypertrofiskt reaktionsliknande utseende runt retinotomistället, troligen som ett resultat av iatrogen manipulation. Dessa morfologiska resultat är jämförbara med SD-OCT-fynden och stöder bevisen för den minimala effekten av bärarleverans på näthinnans vävnad.
Figur 10: Histologisk analys av det implanterade nanofibrösa membranet med de primära hRPE. Hematoxylin-eosinfärgning av näthinnan innehållande den implanterade nanofibrösa bäraren (gul pil) med de primära hRPE: erna i minipigögat. Djuret avlivades och analyserades 6 veckor efter implantation. De primära hRPE: erna kunde tydligt särskiljas genom sin storlek, runda form och pigmentering (röda pilar) i subretinalutrymmet mittemot fotoreceptorerna. Fotoreceptorkärnorna i ONL bygger rosettliknande strukturer. Det subretinala utrymmet verkar hypertrofiskt. Förkortningar: hRPE = primärt humant retinalt pigmenterat epitel, ONL = yttre kärnskikt, INL = inre kärnskikt. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Immunfärgning utfördes med hjälp av en tvåstegs indirekt metod. Sektionerna inkuberades vid rumstemperatur över natten i CRALBP, en monoklonal primär antikropp, vid en spädning av 1:100. Immunofluorescens utfördes med användning av Alexa Fluor 488-konjugerad sekundär antikropp.
De implanterade primära hRPE-värdena fanns i implantationsområdet och uttryckte den typiska RPE CRALBP-markören som liknar de endogena minipig-RPE-cellerna (figur 11A). Däremot verkade morfologin hos de implanterade cellerna inte anta en monolagerform efter implantation men förblev lokaliserad inom det definierade subretinala utrymmet (figur 11A, B, vita pilar). Följande RPE/retinala markörer och morfologiska utseende förblev positiva efter 6 veckors postimplantationsperiod: närvaron av pigment/melaninkorn, retinalspecifika neuronmarkörer i slutstadiet för stavbipolär (PKC-alfa) och konfotoreceptorerna (PNA) och GFAP-positiviteten – ett tecken på mikrogliaaktivering.
Figur 11: Immunmärkning med RPE-cellmarkören CRALBP (cellulärt retinaldehydbindande protein) i en minigris 6 månader efter implantation av primära hRPE. (A) Vertikala frysta sektioner av det behandlade grisögat immunmärktes med CRALBP monoklonal antikropp (grön) och motfärgades med DAPI (blått). (B) Enkel avbildning av cellkärnor med DAPI i svartvitt, eftersom hög kontrast avslöjar den runda formen på de enskilda hRPE-cellerna (vissa visas med vita pilar). Förkortningar: hRPE = humant retinalt pigmentepitel, ONL = yttre kärnskikt. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Okulära komplikationer
Totalt genomfördes 27 av 29 (93,1%) framgångsrikt genomförda operationer. Definitionen "framgångsrikt utförda operationer" tillämpades på de fall där det opererade ögat inte visade några kliniskt signifikanta postoperativa komplikationer fram till tidpunkten för enukleation som kunde påverka den histologiska och immunhistokemiska studien. Minskad transparens av det optiska mediet påverkade den postoperativa avbildningen i fyra fall (13,7%); Ändå bearbetades dessa ögon med ytterligare histologisk och immunohistokemisk analys.
Intraoperativ perifer näthinneavlossning förekom i fyra fall (13,8%). I två fall hanterades det genom aspiration av subretinalvätskan under utbyte av vätska och gas och applicering av laserfotokoagulering av näthinnan i frigöringsområdet. I de andra två fallen (6,9%) var näthinneavlossningen associerad med massiv retinal och subretinal blödning, vilket gjorde implantation av cellbäraren omöjlig och ledde till att operationen avbröts och omedelbar eutanasi av minigrisen medan den låg på operationsbordet.
| Nej | Parametrar | Standard använda inställningar |
| 1 | Vitrektomi hastighet (skärhastighet) | upp till 20 000 nedskärningar/min |
| 2 | Venturipump | 50-180 mmHg |
| 3 | Stig tid | 1 sek |
| 4 | Bevattningstryck | 18-25 mmHg |
| 5 | Luftinfusionstryck | 20-25 mmHg |
| 6 | Bipolär exodiatermi | 18-26% |
| 7 | Monopolär endodiatermi | 16-18% |
| 8 | Laserfotokoagulering av näthinnan, 532 nm | Effekt 100-150 mW |
| Intervall 100 ms | ||
| Varaktighet: 100 ms |
Tabell 1: Standardparametrar som används vid vitrektomi och laserfotokoagulering.
| Totalt antal djur, n | 18 |
| Totalt antal ögon, n | 36 |
| Opererade ögon, n | 29 |
| Framgångsrik implantation, n | 27 |
| Misslyckade ärenden, n | 2 |
| Genomsnittlig operationstid, min | 57 |
| Framgångsgrad, % | 93.1 |
Tabell 2: Resultat av den standardiserade kirurgiska tekniken med subretinal implantation av cellbäraren i Liběchov minigrisar mellan 2016 och 2020.
Kompletterande fil 1: Sammanfattning av studierna tillägnad subretinal implantation av RPE-celler på cellbäraren. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Discussion
Subretinal implantation av RPE-celler med olika ursprung är en mycket lovande trend inom ögonforskning för behandling av retinala degenerativa störningar, såsom AMD 3,4,8,9,10,11,12,13,14,15,25 . Huvudidén med detta tillvägagångssätt är att ersätta de skadade RPE: erna med friska RPE odlade ex vivo (kompletterande fil 1) 44,45,46,47,48. Användningen av cellbärare för att transplantera de odlade RPE-cellerna representerar det mest rimliga tillvägagångssättet, eftersom de porösa membranen håller det polariserade RPE-cellskiktet i rätt orientering med avseende på det fotosensoriska skiktet.
Optimal djurmodell
Ett kritiskt steg i utvecklingen av sådana behandlingsmetoder är användningen av den optimala djurmodellen49. Tidigare har små och stora djurmodeller använts, inklusive kaniner, hundar, grisar och icke-mänskliga primater 8,9,10,11,12,13,14,15,27,29. I denna uppsats föreslår vi användning av Liběchov minipig-modellen och beskriver de preoperativa, kirurgiska och postoperativa stegen som möjliggör robusta transplantationseffektiviteter. Minigrisen Liběchov föddes ursprungligen för cirka 20 år sedan och har ofta använts inom biomedicinsk forskning inom neurodegenerativa sjukdomar, såsom Parkinsons och Huntingtons sjukdom29,50. Eftersom grisen har en relativt stor hjärna med en blodtillförsel och immunologiskt svar som liknar dem hos människor, har den använts som djurmodell för allogen transplantationsexperiment samt51,52,53,54. Även om minigrisens näthinna inte har en människoliknande makula och fovea, innehåller den området centralis och visuella streck, som är regioner i näthinnan med en hög koncentration av konfotoreceptorer30. Den liknande storleken på det mänskliga ögat, närvaron av en konberikad central näthinna, det väl beskrivna immunsystemet och förekomsten av metoder för att bedöma morfologi och funktion efter operationen är viktiga argument för användningen av denna stora djurmodell i den presenterade studien.
Kirurgiskt ingrepp
Så vitt vi vet finns det inga standardiserade och allmänt accepterade kirurgiska tekniker för vitreoretinal transplantation av RPE-celler på bärare. En av de viktigaste frågorna med cellersättningsterapi är den utmanande kirurgiska tekniken som har risk för intraoperativa och postoperativa komplikationer kopplade till näthinneavlossning, hypotoni, episkleral, koroidal och / eller retinal blödning och hög intraokulär turbulens, vilket kan leda till ställningsskador. Postoperativt finns det risk för proliferativ vitreoretinopati, endoftalmit, hypotoni, näthinneavlossning och kataraktbildning 4,10,13,14,15.
De första studierna på tillvägagångssätt med cellbärare utfördes på chinchilla bastard kaniner13,16,25. Även om dessa djur representerar en smådjursmodell var resultaten med fokus på de tekniska aspekterna av operationen avgörande för utvecklingen av procedurerna i stora djurmodeller och sammanfattas därför nedan.
En skräddarsydd 23 G infusionskanyl användes ursprungligen med två sidoportar för att omdirigera jetströmmen, vilket hjälpte till att lösa kollapsen av bleb och därmed näthinneavlossning13. I den aktuella studien märkte vi inte någon sådan kollaps av bleb. Den möjliga orsaken till det kan vara ögonglobens större storlek och prestandan hos kärnvitrektomi med sparat glaskropp i periferin vid kanylinfusionsstället, vilket kan minska kraften hos den riktade jetströmmen.
Svårigheter under utstötningen av cellbäraren från instrumentet var ett annat intraoperativt hinder i smådjursmodellerna, som kategoriserades som "fångade med instrumentet". Dessutom föreslog författarna att resterande glaskropp på näthinnans yta kan orsaka ett bakåt "hopp" av bäraren ur retinotomiöppningen efter implantation. Detta problem kan lösas med en enzymassisterad vitrektomi, vilket möjliggör en jämn, kontinuerlig utstötning av cellbäraren i subretinalutrymmet. I de flesta fall flyttade författarna bäraren för att få en mer avlägsen plats för implantatet bort från retinotomi. I vår fallserie upplevde vi också en situation där cellbäraren förblev fäst vid injektorns spets. Det hanterades dock genom långsam och mild manipulation av ljusröret och injektorns spets. Vi observerade inte någon kvarvarande glaskropp på platsen för retinotomi i något av våra fall. Användningen av TA-assisterad PPV vid operationerna kan föreslås som en metod för att minska risken för kvarvarande glaskropp. Flera färgningar med TA kan vara nödvändiga för att helt avlägsna det överliggande glaskroppen.
I en annan studie rapporterades resultaten av subretinal implantation av humana RPE-stamceller odlade som ett polariserat cellulärt monolager på ett polyestermembran24. Under experimenten användes samma kirurgiska teknik som beskrivitstidigare 13, men en två-port PPV-metod tillämpades. Slutligen publicerades ett steg-för-steg-protokoll för subretinal implantation av cellbärarkirurgi hos kaniner senare25. Denna studie presenterar en mycket detaljerad och lätt repeterbar beskrivning av det kirurgiska ingreppet, inklusive preoperativ och postoperativ vård, som också bygger på tidigare erfarenheter.
Vid användning av stordjursmodeller i efterföljande studier behandlades inte bara tekniska frågor utan även frågor om immunreaktionen mot de transplanterade cellerna, samt cellbärarstorleksrelaterade frågor. En studie med cynomolgusapor (Macaca fascicularis) beskrev resultaten av subretinal implantation av humana stamcellshärledda RPE-monolager15. Alla djuren genomgick systemisk immunsuppression, som bestod av sirolimus (laddningsdos på 2 mg, daglig dos på 1 mg) och tetracyklin (7,5 mg/kg- kroppsvikt) med start 7 dagar före operationen och 3 månader efter operationen. Det kirurgiska ingreppet utfördes enligt protokoll som beskrivits tidigare24,25. Författarna använde en 25 G tre-port PPV-strategi med ljuskrona endo-belysning. Viktigt är att en TA-assisterad PVD användes för att utesluta kvarvarande vitreoretinal vidhäftning på den bakre näthinnan. Som ett tillägg till den ursprungligen beskrivna proceduren tog författarna bort värd-RPE-skiktet i området för framtida implantation med hjälp av ett 20 G skräddarsytt utdragbart loopinstrument.
I vår minipig-studie använde vi också systemisk immunsuppression. Emellertid skilde sig typen av immunsuppression från den som beskrivits ovan. Vi administrerade en subkutan injektion av takrolimuseluerande polymermikrosfärer som en depå i en dos av 0,25 mg/kg kroppsvikt för att hämma celltransplantatavstötning och inflammatoriska reaktioner. Vi tog inte bort värd-RPE-cellskiktet under operationen, eftersom vårt primära mål var att analysera procedurens säkerhet och livskraften hos de implanterade cellerna men inte deras integration i värdnäthinnan.
Tidigare utvärderades säkerheten och genomförbarheten av subretinal implantation av ett monolager av hESC-härledda RPE på ett vikbart icke-nedbrytbart mesh-stött submikronparylen-C-membran (6,25 mm x 3,5 mm, 0,4 μm tjockt) hos 14 kvinnliga Yucatán-minigrisar10. Efter odling såddes cellerna på ett nätstött membran. Immunsuppression utfördes med systemisk administrering av takrolimus (ingen regim och dos indikerad) och intravitreala injektioner av 0,7 mg dexametasonimplantat vid slutet av operationen. PPV utfördes med en 20 G-strategi. Författarna använde en intravitreal injektion av triamcinolonacetonid för bättre visualisering av glaskroppen. Den stora sklerotomin var 2 mm till 3 mm stor. Efter subretinalinjektionen plattades näthinnan med en tillfällig injektion av perfluorkarbonvätska. Efter utbytet mellan vätska och luft utfördes en silikonoljetamponad (1 000/5 000 cSt). Postoperativ vård inkluderade okulär applicering av dexametason/neomycin/polymyxin B salva 1 vecka efter operationen. Författarna rapporterade en framgångsgrad på 91% (dvs. effektiv subretinal implantation och tillräcklig postoperativ bilddata). I vår studie användes intravitreal injektion av TA-kristaller intraoperativt och främst för att visualisera glaskroppen. Den lokala immunsuppressiva effekten av detta läkemedel är emellertid fortfarande oklar. De nanofibrösa cellbärarna som användes i vår studie var 5,2 mm x 2,1 mm och 3,7 μm tjocka, med porstorlekar på 0,4 μm. Under operationen utförde vi direkt FAX istället för att injicera perfluorkarbonvätska. Vår kirurgiska framgångsgrad (93,1%) överensstämde med och var något bättre än Koss et al.10.
Subretinal transplantation av helt nedbrytbara cellbärare (byggnadsställning) för subretinal implantation studerades först 2019 i Yorkshire grisar14. Studien var huvudsakligen inriktad på de biologiskt nedbrytbara egenskaperna hos fibrinhydrogelimplantat. Författarna noterade att den aggressiva immunsuppressionen som används på tamsvin kan hämma en lokal inflammatorisk reaktion som potentiellt orsakas under biologisk nedbrytning av fibrinhydrogelimplantaten. De specificerade dock inte den immunsuppressiva behandlingen som användes hos grisarna. Under PPV utförde de en 3,6 mm lång sklerotomi för införande av den subretinala implantationsanordningen parallellt med och cirka 3,5 mm bakom limbus. Dessutom använde de ett pneumatiskt drivet injektionssystem som syftade till att minska handplaceringsinstabiliteten orsakad av fingermanipulation. I vår fallserie var alla sklerotomier 2,5 mm till 3,0 mm från limbus. Den stora sklerotomin för införandet av injektorn var 3 mm lång. Implantationsinjektorn som användes i vår studie opererades för hand. Grundlig cautery av pars plana i ciliärkroppen och ett tillräckligt snitt inuti den stora sklerotomin verkar vara avgörande för att undvika intraoperativa komplikationer såsom iatrogen perifer retinalavskiljning, blödning och förlust av implantatet.
Sammanfattningsvis beskriver vi användningen av Liběchov minipig-modellen för transplantation av RPE-celler på biologiskt nedbrytbara bärare som ett behandlingsalternativ för ärftliga och förvärvade näthinnesjukdomar. Likheter i ögonanatomi och fysiologi, liksom med avseende på immunsystemet, tillåter oss att utveckla och förbättra kirurgiska tekniker och instrument för subretinal implantation av celler, som lätt kan överföras till behandling av mänskliga ögonsjukdomar. Det är viktigt att säkerställa att operationer på minigrisar utförs med samma instrument (inklusive implantationsleveransverktyg) när de används vid mänskliga operationer, vilket underlättar tillämpningen av vunnen erfarenhet och kunskap på människor. Alternativa storögda djurmodeller med närvaro av ett makulärt område, såsom icke-mänskliga primater, kan vara användbara för uppföljning och analys av de anatomiska och funktionella förändringarna efter subretinal implantation i det centrala retinala området. Den detaljerade beskrivningen av preoperativa, kirurgiska och postoperativa vårdprocedurer kommer att vara användbar för framtida studier genom att öka effektiv och standardiserad datagenerering.
Disclosures
Ingen.
Acknowledgments
Projektet stöddes av The Czech Science Foundation (projektnummer 18-04393S) och Norway Grants and Technology Agency of the Czech Republic (KAPPA Programme, projektnummer TO01000107).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Technical equipment | |||
| Wato EX-65 with a Mindray iMEC10 | Mindray, Shenzhen, China | Wato Ex-65 | anesthesia machine |
| R-Evolution CR | Optikon, Rome, Italy | R-Evolution CR | phacoemulsifier/vitrectome |
| Green laser Merilas 532α | Meridian, Thun, Switzerland | Merilas 532α | ophthalmic green laser |
| Microscope Hi-R NEO 900A | Haag-Streit Surgical, Wedel, Germany) | Hi-R NEO 900A | ophthalmic surgery microscope |
| Camera Sony PMW-10MD | Sony, Tokyo, Japan | PMW-10MD | full HD medical 2-piece |
| Non-contact vitreoretinal surgical system MERLIN BIOM | Volk, Mentor, OH, USA | MERLIN BIOM | BIOM |
| Steam sterilizer | Tuttnauer Europe B.V., Breda, NL | 3870 HSG | sterilizer |
| iCam100 | Optovue, Fremont, CA, USA | iCAM100 | funduscamera |
| iVue OCT100-2 | Optovue, Fremont, CA, USA | iVue OCT100-2 | OCT |
| Microsurgical instruments and devices | |||
| Cook Eye Speculum | Katena, New Jersey, US | K1-5403 | 15mm blades |
| Ophthalmology surgical drape | Hylyard, Alpharetta, Georgie, USA | 79304 | 132 x 142cm |
| Disposable Two step vitrectomy system. (23 gauge/ 0.6 mm) | DORC, Zuidland, Netherlands | 1272.ED06 | |
| Infusion line for 23G / 0.6 mm infusion cannula | DORC, Zuidland, Netherlands | 1279.P | |
| knife 2.75mm, IQ Geometry Tm Slit Knife Angled, Bevel Up | Surgical Specialties Corporation, Reading, USA | 72-2761G | |
| Extendible 41G subretinal injection needle. (23 gauge / 0.6 mm) | DORC, Zuidland, Netherlands | 1270.EXT | |
| Omnifix 3ml Luer Lock Solo siringe | BBraun, Melsungen, Germany | 4617022V | 3ml |
| 1ml soft-inject Tuberculin | Henke Sass Wolf, Tuttlingen, Germany | 5010.200V0 | 1ml |
| 8-0 Coated Vicryl | Ethicon, Puerto Rico, USA | J409G | |
| Purified Silicone Oil (in syringe) 10 ml | (FCI, Paris, France) | S5.7170 | 1000cSt |
| Pinnacle 360 Morris Vertical Scissors 23Ga | Synergetics, O'Fallon, USA | 10.24.23PIN | 23Ga |
| Revolution DSP 23Ga ILM forceps | Alcon, Geneva, Switzerland | 706.44 | Griesharber revolution |
| 23ga Straight Laser Probe | Synergetics, O’Fallon, USA | 55.21.23 | |
| FCI Protect 2.0% | FCI Ophthalmics, Paris, France | S5.9100 | viscoelastic |
| DK Westcott style Stitch Scissors, Curve | Duckworth & Kent, Hertfordshire, England | 1-501 | Curve |
| Pierse Notched Forceps, 0,3mm Straigh | Duckworth & Kent, Hertfordshire, England | 2-100-1E | 0,3mm straigh |
| DK Harms-Tubingen Straight Tying Forceps | Duckworth & Kent, Hertfordshire, England | 2-504E | 6mm |
| DK Needle Holder, Straigh | Duckworth & Kent, Hertfordshire, England | 3-201 | 9mm straigh |
| Medications and solutions | |||
| Unitropic 1% gtt. | UNIMED PHARMA spol. s r.o., Bratislava, Slovak republic | tropicamidum 10 mg/ml | eye drops |
| Diprophos | Merck Sharp & Dohme B.V., Haarlem, Netherlands | betamethasonum 7 mg/ml | 1ml |
| Alcon BSS Irrigation Solution | Alcon, Geneva, Switzerland | balance salt solution (BSS) | 500ml |
| Betaisodona | Mundipharma, Cambridge, United Kingdom | povidon-Iodine 1g/10ml | 30ml |
| Depo-medrol 120mg | Pfizer, New Yourk, USA | methylprednisolon | 5ml/200mg |
| Shotapen | Virbac Carros Cedex, France | benzylpenicillin, dihydrostreptomycin | 250ml |
| Flunixin a.u.v. | Norbrook, Newry, Northern Ireland | flunixinum 50,0 mg | 250ml |
| Tramal 100MG/2ML | Stada Arzneimittel AG, Bad Vilbel, Deutschland | tramadol | 2ml |
| Zoletil 100 | Virbac Carros Cedex, France | tiletamine, zolazepam | 100mg |
| Narkeran 10 | Vetoquinol, Magny-Vernois, France | ketamin | 2ml |
| Rometar 20mg/ml | Spofa pharmaceutica, Prague, Czech republic | xylazinum | 20mg |
| Braunol 75mg/g | B.Braun medical, Prague, Czech republic | povidone iodine | 75mg/g |
| Propofol 1% MCT/LCT | Fresenius Kabi, Bad Homburg, Deutschland | propofol | 10mg/1ml |
| Isoflurane 100% Inhalation vapour, liquid | Piramal Critical Care Limited, West Drayton, United Kingdom | isoflurane | 100% |
| Benoxi gtt. 4mg/1ml | Unimed pharma, Bratislava, Slovakia | oxybuprakaine | 10ml |
| Neosynephrin POS 10% gtt. | Ursapharm , Saarbrücken, Deutschland | fenylefrin chloride | 10ml |
| Ophthalmo-framykoin 1X5GM | Zentiva a.s., Prague, Czech republic | bacitracin zinc/hydrocortisone acetate/hydrocortisoneacetate/neomycin sulfate | 5mg |
| Floxal ung. | Dr. Gerhard Mann Chem.-Pharm. Fabrik, Berlin, Germany | ofloxacin | 0.30% |
| Eficur inj. | Hipra, Amer, Spain | ceftiofurum hydrochloridum | 50mg / 1ml |
| Draxxin | Zoetis Inc., New Jersey, USA | tulathromycinum | 100mg / 1ml |
| Tramal | Stada Arzneimittel AG, Bad Vilbel, Deutschland | tramadoli hydrochloridum | 100mg / 2ml |
| Xylapan | Vetoquinol, Magny-Vernois, France | xylazinum | 0.4 mg/kg |
| Proparacaine hydrochlorid ophthalmic solution 0,5% | Bausch&Lomb Incorporated Tampa, FL, USA | Proparacaine hydrochlorid | 0.50% |
| Prograf | Astellas Pharma, Deerfield, Illinois, USA | Tacrolimus powder | 1mg |
| Cell carrier, cultivated cells cultures, and implantation injector | |||
| Falcon Cell Culture Inserts | Corning Inc., Kenneburg, ME, USA | 353103 | |
| TrypLE Express Enzyme (1X) | Thermo Fisher Scientific, MA, USA | 12604021 | |
| DMEM/F-12 | Thermo Fisher Scientific, MA, USA | 11320033 | |
| Biolaminin 521 LN (LN521) | BioLamina, Sundbyberg, Sweden | LN521-02 | |
| GlutaMAX Supplement | Thermo Fisher Scientific, MA, USA | 35050061 | |
| 2-Mercaptoethanol | Thermo Fisher Scientific, MA, USA | J66742.0B | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich, San Luis, Mi, USA | P4333 | |
| CRALBP | Novus Biologicals, Abingdon, UK | NB100-74392 | |
| Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific, Germany | 21202 |
References
- Pascolini, D., Mariotti, S. P. Global estimates of visual impairment: 2010. British Journal of Ophthalmology. 96 (5), 614-618 (2011).
- Bressler, N. M., Bressler, S. B., Fine, S. L.
- Binder, S., Stanzel, B. V., Krebs, I., Glittenberg, C.
- Mano, F., et al. Methodological approach to improve surgical outcomes of a pig subretinal implantation model. Translational Vision Science & Technology. 11 (4), 24 (2022).
- Ramsden, C. M., et al. Stem cells in retinal regeneration: Past, present and future. Development. 140 (12), 2576-2585 (2013).
- Carr, A. -J. F., et al. Development of human embryonic stem cell therapies for age-related macular degeneration. Trends in Neurosciences. 36 (7), 385-395 (2013).
- Tezel, T. H., Kaplan, H. J., Del Priore, L. V. Fate of human retinal pigment epithelial cells seeded onto layers of human Bruch's membrane. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 40 (2), 467-476 (1999).
- Popelka, S., et al. A frame-supported ultrathin electrospun polymer membrane for transplantation of retinal pigment epithelial cells. Biomedical Materials. 10 (4), 045022 (2015).
- Kozak, I., et al. Safety and feasibility of new nanofiber subretinal delivery system with injector for RPE cell transplantation. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 59 (9), 5670 (2018).
- Koss, M. J., et al. Subretinal implantation of a monolayer of human embryonic stem cell-derived retinal pigment epithelium: a feasibility and safety study in Yucatan minipigs. Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology = Albrecht von Graefes Archiv fur Klinische und Experimentelle Ophthalmologie. 254 (8), 1553-1565 (2016).
- Ghosh, F., Wong, F., Johansson, K., Bruun, A., Petters, R. M. Transplantation of full-thickness retina in the rhodopsin transgenic pig. Retina. 24 (1), 98-109 (2004).
- Christiansen, A. T., et al. Subretinal implantation of electrospun, short nanowire, and smooth poly(epsilon-caprolactone) scaffolds to the subretinal space of porcine eyes. Stem Cells International. 2012, 454295 (2012).
- Stanzel, B. V., et al. Subretinal delivery of ultrathin rigid-elastic cell carriers using a metallic shooter instrument and biodegradable hydrogel encapsulation. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (1), 490-500 (2012).
- Gandhi, J. K., et al. Fibrin hydrogels are safe, degradable scaffolds for sub-retinal implantation. PloS One. 15 (1), 0227641 (2020).
- Liu, Z., et al. Surgical transplantation of human RPE stem cell-derived RPE monolayers into non-human primates with immunosuppression. Stem Cell Reports. 16 (2), 237-251 (2021).
- Mandai, M., et al. Autologous induced stem-cell-derived retinal cells for macular degeneration. New England Journal of Medicine. 376 (11), 1038-1046 (2017).
- Schwartz, S. D., et al. Human embryonic stem cell-derived retinal pigment epithelium in patients with age-related macular degeneration and Stargardt's macular dystrophy: Follow-up of two open-label phase 1/2 studies. Lancet. 385 (9967), 509-516 (2015).
- Kashani, A. H., et al. Surgical method for implantation of a biosynthetic retinal pigment epithelium monolayer for geographic atrophy: Experience from a phase 1/2a study. Ophthalmology Retina. 4 (3), 264-273 (2020).
- Kashani, A. H., et al. Subretinal implantation of a human embryonic stem cell-derived retinal pigment epithelium monolayer in a porcine model. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1185, 569-574 (2019).
- Kashani, A. H., et al. A bioengineered retinal pigment epithelial monolayer for advanced, dry age-related macular degeneration. Science Translational Medicine. 10 (435), 4097 (2018).
- da Cruz, L., et al. Phase 1 clinical study of an embryonic stem cell-derived retinal pigment epithelium patch in age-related macular degeneration. Nature Biotechnology. 36 (4), 328-337 (2018).
- Diniz, B., et al. Subretinal implantation of retinal pigment epithelial cells derived from human embryonic stem cells: Improved survival when implanted as a monolayer. Invest Ophthalmol Vis Sci. 54 (7), 5087-5096 (2013).
- Sharma, R., et al. Clinical-grade stem cell-derived retinal pigment epithelium patch rescues retinal degeneration in rodents and pigs. Science Translational Medicine. 11 (475), 7624 (2019).
- Stanzel, B., et al. Human RPE stem cells grown into polarized RPE monolayers on a polyester matrix are maintained after grafting into rabbit subretinal space. Stem Cell Reports. 2 (1), 64-77 (2014).
- Al-Nawaiseh, S., et al. A step by step protocol for subretinal surgery in rabbits. Journal of Visualized Experiments. (115), e53927 (2016).
- Stanzel, B., et al. Surgical approaches for cell therapeutics delivery to the retinal pigment epithelium and retina. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1186, 141-170 (2019).
- Yaji, N., Yamato, M., Yang, J., Okano, T., Hori, S. Transplantation of tissue-engineered retinal pigment epithelial cell sheets in a rabbit model. Biomaterials. 30 (5), 797-803 (2009).
- Hruban, V., et al. Inheritance of malignant melanoma in the MeLiM strain of miniature pigs. Veterinarni Medicina. 49 (12), 453-459 (2004).
- Vodicka, P., et al. The miniature pig as an animal model in biomedical research. Annals of the New York Academy of Sciences. 1049, 161-171 (2005).
- Vízina, M. Comparative Ocular Anatomy in Commonly Used Laboratory Animals. Ocular Toxicology in Laboratory Animals. Wier, A. B., Collins, M. , Humana Press. Totowa, NJ. 9-12 (2013).
- Chandler, M. J., Smith, P. J., Samuelson, D. A., MacKay, E. O. Photoreceptor density of the domestic pig retina. Veterinary Ophthalmology. 2 (3), 179-184 (1999).
- Wang, Q. X., et al. Biodegradable microsphere-loaded tacrolimus enhanced the effect on mice islet allograft and reduced the adverse effect on insulin secretion. American Journal of Transplantation. 4 (5), 721-727 (2004).
- Sevc, J., et al. Effective long-term immunosuppression in rats by subcutaneously implanted sustained-release tacrolimus pellet: Effect on spinally grafted human neural precursor survival. Experimental Neurology. 248, 85-99 (2013).
- Juhásová, J., et al. Osteogenic differentiation of miniature pig mesenchymal stem cells in 2D and 3D environment. Physiological Research. 60 (3), 559-571 (2011).
- Planka, L., et al. Nanotechnology and mesenchymal stem cells with chondrocytes in prevention of partial growth plate arrest in pigs. Biomedical Papers of the Medical Faculty of the University Palacky, Olomouc, Czech Republic. 156 (2), 128-134 (2012).
- Soerensen, D. D., Pedersen, L. J. Infrared skin temperature measurements for monitoring health in pigs: a review. Acta Veterinaria Scandinavica. 57 (1), 5 (2015).
- Eichhorn, S. J., Sampson, W. W. Statistical geometry of pores and statistics of porous nanofibrous assemblies. Journal of the Royal Society Interface. 2 (4), 309-318 (2005).
- Szatmári-Tóth, M., et al. Clearance of autophagy-associated dying retinal pigment epithelial cells - a possible source for inflammation in age-related macular degeneration. Cell Death & Disease. 7 (9), 2367 (2016).
- Lukovic, D., et al. Human iPSC derived disease model of MERTK-associated retinitis pigmentosa. Scientific Reports. 5, 12910 (2015).
- Artero Castro, A., et al. Generation of gene-corrected human induced pluripotent stem cell lines derived from retinitis pigmentosa patient with Ser331Cysfs*5 mutation in MERTK. Stem Cell Research. 34, 101341 (2019).
- Artero Castro, A., León, M., Del Buey Furió, V., Erceg, S., Lukovic, D. Generation of a human iPSC line by mRNA reprogramming. Stem Cell Research. 28, 157-160 (2018).
- Artero-Castro, A., et al. correction recovers phagocytosis in retinal pigment epithelium derived from retinitis pigmentosa-human-induced pluripotent stem cells. International Journal of Molecular Sciences. 22 (4), 2092 (2021).
- Müller, B., Wagner, F., Lorenz, B., Stieger, K. Organotypic cultures of adult mouse retina: Morphologic changes and gene expression. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 58 (4), 1930-1940 (2017).
- Sheridan, C. M., et al.
- Radtke, N. D., et al. Vision improvement in retinal degeneration patients by implantation of retina together with retinal pigment epithelium. American Journal of Ophthalmology. 146 (2), 172-182 (2008).
- Maaijwee, K. J. M., et al. Histological evidence for revascularisation of an autologous retinal pigment epithelium--choroid graft in the pig. The British Journal of Ophthalmology. 91 (4), 546-550 (2007).
- Ghosh, F., Engelsberg, K., English, R. V., Petters, R. M. Long-term neuroretinal full-thickness transplants in a large animal model of severe retinitis pigmentosa. Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology = Albrecht von Graefes Archiv fur Klinische und Experimentelle Ophthalmologie. 245 (6), 835-846 (2007).
- Radtke, N. D., Seiler, M. J., Aramant, R. B., Petry, H. M., Pidwell, D. J. Transplantation of intact sheets of fetal neural retina with its retinal pigment epithelium in retinitis pigmentosa patients. American Journal of Ophthalmology. 133 (4), 544-550 (2002).
- Slijkerman, R. W., et al. The pros and cons of vertebrate animal models for functional and therapeutic research on inherited retinal dystrophies. Progress in Retinal and Eye Research. 48, 137-159 (2015).
- Schramke, S., et al. The Libechov minipig as a large animal model for preclinical research in Huntington's disease - Thoughts and perspectives. Czech and Slovak Neurology and Neurosurgery. 78/111, Supplementum 2 55-60 (2015).
- Tohyama, S., Kobayashi, E. Age-appropriateness of porcine models used for cell transplantation. Cell Transplantation. 28 (2), 224-228 (2019).
- Dall, A. M., et al. Quantitative [18F] fluorodopa/PET and histology of fetal mesencephalic dopaminergic grafts to the striatum of MPTP-poisoned minipigs. Cell Transplantation. 11 (8), 733-746 (2002).
- Shrader, S. M., Greentree, W. F.
- Duarri, A., et al. Transplantation of human induced pluripotent stem cell-derived retinal pigment epithelium in a swine model of geographic atrophy. International Journal of Molecular Sciences. 22 (19), 10497 (2021).
