Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

ניתוחים של פרוטאינוריה, חדירה כלייתית של לויקוציטים ותצהיר כלייתי של חלבונים בעכברי MRL/lpr המועדים לזאבת

Published: June 8, 2022 doi: 10.3791/63506
Automatic Translation
1, 1
1Department of Biomedical Sciences and Pathobiology, Virginia-Maryland College of Veterinary Medicine, Virginia Polytechnic Institute and State University

Summary

הפרוטוקול הנוכחי מתאר שיטה למעקב אחר התקדמות זאבת בעכברים. שני הליכים נוספים מוצגים כדי לאפיין זאבת נפריטיס בהתבסס על חדירת תאים ותצהיר חלבון בכליות.

Abstract

זאבת אדמנתית מערכתית (SLE) היא הפרעה אוטואימונית ללא תרופה ידועה ומאופיינת בדלקת מתמשכת באיברים רבים, כולל הכליות. בנסיבות כאלה, הכליה מאבדת את יכולתה לנקות פסולת מהדם ולווסת את ריכוזי המלח והנוזלים, מה שמוביל בסופו של דבר לאי ספיקת כליות. נשים, במיוחד אלה בגיל הפוריות, מאובחנות פי תשעה יותר מאשר גברים. מחלת כליות היא הגורם המוביל לתמותה בחולי SLE. הפרוטוקול הנוכחי מתאר שיטה מהירה ופשוטה למדידת רמות החלבון המופרש בשתן שנאסף, תוך מעקב אחר התקדמות הזאבת לאורך זמן. בנוסף, גישה לבידוד תאים חד-גרעיניים בכליות מסופקת על בסיס בחירת גודל וצפיפות כדי לחקור חדירה כלייתית של לויקוציטים. יתר על כן, פותחה שיטה אימונוהיסטוכימית לאפיון תצהיר חלבונים בחדירת גלומרולי ולויקוציטים במרחב הטובולואינטרסטיציאלי. יחד, שיטות אלה יכולות לעזור לחקור את ההתקדמות של דלקת כרונית הקשורה לכליות של עכברי MRL/lpr המועדים לזאבת.

Introduction

תפקידה העיקרי של הכליה הוא חיסול חומרים רעילים באמצעות שתן תוך שמירה על הומאוסטזיס של מים ומלחים1. פונקציה זו מאוימת בחולים עם זאבת אדמנתית מערכתית (SLE), מה שמוביל למה שמכונה זאבת נפריטיס (LN). LN הוא תוצאה של מערכת החיסון התוקפת את הכליה, מה שמוביל לדלקת כליות מתמשכת, ולכן מאבד את יכולתו לנקות פסולת מהדם ולווסת את ריכוזי המלח והנוזלים. זה יוביל בסופו של דבר לאי ספיקת כליות, אשר יכול להיות קטלני. במהלך התהליך הנפריטי, תאי B במחזור, תאי T ומונוציטים מגויסים לכליה, ומפרישים כימוקינים, ציטוקינים ונוגדנים עצמיים יוצרי קומפלקס חיסוני. התוצאה היא בסופו של דבר נזק לתאי האנדותל, פציעות ממברניות, ניוון צינורית הכליה ופיברוזיס2.

עכברי MRL/Mp-Faslpr (MRL/lpr) הנוטים לזאבת הם מודל עכברים קלאסי המציג סימנים קליניים דמויי זאבת הדומים ל-SLE3 אנושי. מודל זה סייע בהבנת אחד הגורמים המובילים לתמותה בחולי SLE, זאבת נפריטיס (LN)4. הן ב- SLE אנושי והן בעכבר, LN מאופיין בדלקת הדרגתית המופעלת על ידי תצהיר כלייתי של מתחמי חיסון, ואחריו הפעלה משלימה, גיוס תאי דלקת ואובדן תפקוד כלייתי5. תצהיר הקומפלקס החיסוני הוא הצעד הראשון להשראת ייצור כימוקין וציטוקינים על ידי תאי כליה פנימיים, המרחיבים את התגובה הדלקתית על ידי גיוס תאי חיסון6. הפרוטוקול הנוכחי מציג מספר טכניקות למעקב אחר התקדמות מחלת כליות המנתחות חדירת תאים ותצהיר קומפלקס חיסוני.

שתן שנאסף מדי שבוע מאפשר זיהוי והדמיה של מהלך הזמן של פרוטאינוריה לפני, במהלך ואחרי הופעת זאבת. פרוטאינוריה כסמן ביולוגי יכולה לקבוע את ההתקדמות הביולוגית של LN. יתרונות נוספים של טכניקה זו הם שהיא לא פולשנית, חסכונית וקלה ליישום7. כאשר הכליה פועלת בצורה מושלמת, רמת הפרוטאינוריה נמוכה באופן עקבי; עם זאת, בעכברי MRL/lpr, לאחר 8-9 שבועות של גיל, נצפתה עלייה הדרגתית של רמת הפרוטאינוריה, שבסופו של דבר גבוהה מספיק כדי לגרום לאי ספיקת כליות8. רצועות ריאגנטים מרובות וריאגנטים צבעוניים זמינים מסחרית לניטור הבעיה. עם זאת, מבחן ברדפורד הוא זול ומדויק מאוד בקביעת הופעת פרוטאינוריה ואת מהלך זאבת נפריטיס. בדיקה זו היא מהירה, והמגיב אינו מושפע מנוכחותם של ממסים, מאגרים, חומרים מחזרים וחומרים מטאליים שעשויים להיות במדגםשלך 9,10,11.

היבט חשוב אחד שיש לקחת בחשבון הוא חדירת תאים לכליה. חדירות אלה מקדמות פתוגנזה על ידי הפעלת הפרשת גורמים מסיסים כגון ציטוקינים כדי להחמיר את הדלקת12. כדי להבין טוב יותר אילו אוכלוסיות תאים נמצאות בחדירות, שיטה שימושית היא לבודד לויקוציטים13. כאן, זיהוי של חדירה כלייתית של תאי B משמש כדוגמה. ההליך מתחיל בתהליך עיכול עם deoxyribonuclease (DNase) ו collagenase, ואחריו הפרדת גרדיאנט צפיפות המסירה פסולת, כדוריות דם אדומות, גרנולוציטים צפופים. הסיבה לבידוד תאי B (CD19+) ותאי פלזמה (CD138+) היא שכליות זאבת יכולות לרכז את התאים האלה14. הוא הציע כי נוכחות של תאי B באגרגטים קטנים בכליה יכולה להצביע על התרחבות clonal, וכתוצאה מכך, ייצור אימונוגלובולין (Ig). ידוע כי תאי פלזמה נמצאים באגרגטים אלה גם15. לאחר בידוד לויקוציטים, ניתן להשתמש במיון תאים המופעל על ידי פלואורסצנציה (FACS) כדי לנתח את התאים המעניינים בעת צביעה בנוגדנים מצומדים פלואורסצנטיים שונים.

אימונופלואורסצנציה היא אחת משיטות הזיהוי האימונוהיסטוכימיה (IHC) המאפשרת הדמיה פלואורסצנטית של חלבונים בדגימות רקמת כליה בעובי 4 מיקרומטר. שיטות גילוי IHC אחרות תלויות באופי האנליטים, בכימיה המחייבת ובגורמים אחרים16. אימונופלואורסצנציה היא שיטת זיהוי מהירה החושפת את האנטיגן לנוגדן מקבילו המסומן בפלואורוכרום ספציפי (או צבע פלואורסצנטי). כאשר הוא מתרגש, הוא מייצר אור שמיקרוסקופ פלואורסצנטי יכול לזהות. טכניקה זו יכולה לשמש כדי לבחון את התצהיר של משלים C3 ו IgG2a17. הפעלה מוגזמת של מפל משלים יכולה להיות קשורה לתגובה חיסונית בלתי מבוקרת ולאובדן תפקוד18. תצהיר חיסוני של נוגדנים עצמיים נגד דנ"א דו-גדילי (anti-dsDNA) בכליה הוא דאגה מרכזית19, כאשר אלה עם איזוטיפ IgG2a נקשרו ל-LN20. באופן ספציפי, נוגדנים נגד dsDNA מפגינים יותר פתוגניות וזיקה לחומרים גרעיניים, ויוצרים קומפלקסים חיסוניים21. כאשר IgG2a קיים, מפל המשלים, כולל C3, מופעל כדי לנקות את מתחמי החיסון22. ניתן לכמת את סמני C3 ו- IgG2a בנפרד או לכסות אותם כדי לבסס את המתאם ביניהם.

יש לציין כי מדידת קריאטינין בסרום היא טכניקה אמינה נוספת שניתן להשתמש בה יחד עם המטוריה מיקרוסקופית וביופסיות כליות לאבחון LN23. עם זאת, נוכחות של פרוטאינוריה היא אינדיקטור חזק של נזק גלומרולרי. במובן זה, ניטור רמת הפרוטאינוריה במהלך זאבת יכול לזהות התפרצות מחלה ולהשלים שיטות אחרות לאבחון זאבת. בנוסף, קומפלקסים חיסוניים שהופקדו glomeruli יכול לעורר תגובה דלקתית, להפעיל את מערכת המשלים, ולגייס תאים דלקתיים נוספים. נקודה נוספת ראויה לציון של פרוטוקול זה היא חדירת תאי B לכליה. זה, יחד עם תאי ה-T החודרים, מגביר את התגובות החיסוניות המקומיות שגורמות נזק לאיברים. חשוב לציין כי הסיווג של LN אינו מבוסס רק על שינויים מורפולוגיים גלומרולריים הנראים במיקרוסקופיה, אלא גם על משקעים חיסוניים שנצפו עם אימונופלואורסצנציה. לכן, בפרוטוקול זה, שיטות מדויקות וחסכוניות לניתוח תפקוד הכליות מוצעות במסגרות מעבדה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

הפרוטוקול הנוכחי מאושר על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים (IACUC) בווירג'יניה טק. מאחר שלמחלת הזאבת יש שכיחות גבוהה יותר אצל נקבות, נעשה שימוש רק בנקבות עכברי MRL/lpr. איסוף הדגימות החל בגיל 4 שבועות והסתיים בגיל 15 שבועות. העכברים התקבלו ממקורות מסחריים (ראו טבלת חומרים) וגודלו ותוחזקו בסביבה ספציפית נטולת פתוגנים בהתאם להנחיות המוסדיות.

1. בדיקת פרוטאינוריה

  1. לאסוף שתן בעקבות השלבים הבאים.
    1. יש לעקר את מכסה המנוע על ידי ריסוס 70% אתנול. מניחים יריעת פלסטיק סטרילית על פני השטח. הכינו טיפים, צינורות 1.5 מ"ל ופיפטה לאיסוף כ-20 מיקרון ליטר מהנוזל.
      הערה: טיפים וצינורות חייבים להיות סטריליים וללא כל טיפול מקדים.
    2. קח את הכלוב ורסס 70% אתנול לפני שתכניס אותו לתוך מכסה המנוע.
    3. החזיקו את העכבר ביד אחת והשתמשו ביד השנייה כדי לעסות בעדינות את אזור הגחון מלמעלה למטה.
    4. השתמש בצינור 1.5 מ"ל או פיפטה כדי לאסוף את השתן ישירות, או אם הדגימה טיפה, לאסוף אותו מיריעת פלסטיק. השתמש בכפפות, סדינים וטיפים טריים עבור כל דוגמה.
      הערה: אם זה לא עובד, השתמש בכוס סטרילית כדי לבודד את העכבר, ולאחר מכן אסוף את השתן מהכוס לאחר שהעכבר משתין.
    5. החזירו את העכבר לכלוב. הוצא עכבר נוסף וחזור על שלבים 1.1.3-1.1.4.
      הערה: נקו תמיד את יריעת הפלסטיק ואת הכוס עם 70% אתנול לאחר איסוף הדגימה עבור כל עכבר. לפחות חמישה עכברים לקבוצה נחוצים למובהקות סטטיסטית. דגימות שתן ניתן לאחסן בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס עד לשימוש עד 12 חודשים.
  2. כימות החלבונים בשיטת ברדפורד24.
    1. אפשרו לדגימות שתן, לתקן אלבומין ולמגיב ברדפורד להגיע לטמפרטורת החדר (RT) על ידי השארתם מחוץ למקפיא למשך 10-20 דקות.
      הערה: מגיב ברדפורד ותקן אלבומין כלולים בערכה הזמינה מסחרית (ראה טבלת חומרים). הריכוז ההתחלתי של תקן אלבומין הוא 2 מ"ג/מ"ל. דילולים סדרתיים (1:2 שש פעמים) חייבים להיעשות עם מים.
    2. הוסיפו את מגיב ברדפורד לצלחת של 96 בארות (200 μL/well), ללא דילול.
    3. פיפטה 5 μL של דגימת שתן לא מדולל לכל באר ולהשתמש בקצה כדי פיפטה למעלה ולמטה מספר פעמים כדי לערבב כראוי.
    4. הוסף תקנים (400, 200, 100, 50, 25, 12.5 mg/dL) בכפילויות. השאירו כמה בארות כריקים.
      הערה: הוספת דוגמאות ותקנים צריכה להיעשות במהירות.
    5. תן לזה לעמוד במשך 5-10 דקות ב- RT.
    6. קרא את הלוחית בגודל 595 ננומטר בקורא צלחות בהתאם לפרוטוקול היצרן (ראה טבלת חומרים).

2. בידוד של תאי הכליה

  1. המתת העכבר באמצעות CO2 (קצב זרימה: 30%-70% נפח/דקה, כדי להשיג חוסר הכרה או מוות) בתא ואחריו נקע צוואר הרחם. המשך עם דיסקציה כדי לאסוף את שתי הכליות. מניחים כליה וחצי במדיום C10 קר כקרח. שים את חצי הכליה השנייה ב- OCT (שלב 3.1.1).
    הערה: C10 מיוצר עם RPMI 1640 בתוספת 10% סרום בקר עוברי, 1 mM של נתרן פירובט, 1% של 100x חומצות אמינו לא חיוניות MEM, 10 mM של HEPES, 55 μM של 2-mercaptoethanol, ו 100 U/mL של פניצילין-סטרפטומיצין (ראה טבלת חומרים).
  2. חותכים את הכליות לגודל דגנים (1-2 מ"מ3 חתיכות) ומתעכלים ב-5 מ"ל של מאגר עיכול המכיל 1 מ"ג/מ"ל של קולגן ו-0.2 מ"ג/מ"ל של DNase I (ראו טבלת חומרים) במדיום RPMI 1640 המכיל 10 mmol /L של HEPES למשך שעה אחת עם רעידות עדינות מתמשכות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.
    הערה: יש להוסיף חיץ עיכול של 1 מ"ל בצינור סטרילי של 2 מ"ל ולהשתמש במספריים סטריליים כדי לקצוץ את הכליה.
  3. הוסיפו 10 מ"ל של PBS קר כקרח המכיל 10 מ"מ של חומצה אתילנדיאמינטטראציטית (EDTA) ודגרה במשך 10 דקות על קרח. ואז מערבלים את ההשעיה פעמיים.
  4. סנן את מתלה התא דרך מסננת 100 μM ושטוף עם 10 מ"ל של HBSS מלא.
    הערה: HBSS-full מכיל 5 mM של EDTA, 0.1% BSA ו-10 mM של HEPES.
  5. צנטריפוגה ב 350 x גרם במשך 10 דקות ב RT.
  6. הכן פתרון 30%, 37% ו-70% סטוק איזוטוני פרקול (SIP).
    הערה: ערבבו נפח חלק אחד של 10x PBS ונפח של 9 חלקים של Percoll להכנת SIP (ראו טבלת חומרים); השתמש ב-HBSS-full כדי לדלל את SIP ל-30%, 37% ו-70% SIP.
  7. יש לתלות תאים ב-5 מ"ל של 30% SIP ולטעון 37% מ-5 מ"ל (למעלה) ו-70% מ-5 מ"ל (למטה), מה שהופך את SIP לשיפוע, לאט לאט עם פיפטה פאסטר.
  8. צנטריפוגה עם Up9 down0 (או בלם 0) ב-1000 x גרם למשך 30 דקות ב-RT.
  9. לאסוף לויקוציטים מן הממשק 37%-70% ולחדש אותם ב 5 מ"ל של C10.
  10. צנטריפוגה ב 350 x גרם במשך 10 דקות ב 4 מעלות צלזיוס.
  11. השהה את גלולת התא ב-3 מ"ל של מאגר FACS. התאים מוכנים לצביעת FACS.
    הערה: מאגר FACS מכיל PBS אחד ואלבומין בסרום בקר (BSA) של 0.1%.
  12. צנטריפוגה ב 350 x גרם במשך 5 דקות ב 4 מעלות צלזיוס ולהשליך את supernatant (SN), משאיר כ 50 μL.
    הערה: כדי להסיר את הסופרנטנט, יש לשפוך בזהירות או לפטם את התמיסה הרחק מהמוצק או להשתמש בוואקום חצי-אוטומטי כדי לשאוף את הסופרנטנט.
  13. הוסף 50 μL של בלוק FcR (ראה טבלת חומרים) לכל שפופרת (מדולל מראש 1/50 ב 1x PBS); מערבבים ודוגרים על קרח בחושך במשך 10 דקות.
  14. יש להוסיף 2 מ"ל של מאגר FACS לשטיפה.
  15. צנטריפוגה ב 350 x גרם במשך 5 דקות ב 4 מעלות צלזיוס ולהשליך SN, משאיר כ 50 μL.
  16. הוסיפו 20 μL של הצבע הפלואורסצנטי המתאים (דיללו 1/100 עם 1x PBS, ראו טבלת חומרים) ותנו לו לעמוד במשך 15-30 דקות על קרח.
  17. הוסף 50 μL של תערובת נוגדנים15 לכל צינור: CD138-BV711 (1/200 ב-PBS אחד) ו-CD45-AF700 (1/200 ב-PBS אחד) (ראה טבלת חומרים).
  18. דגרו על קרח בחושך במשך 15-30 דקות והוסיפו 3 מ"ל של חיץ FACS.
  19. צנטריפוגה ב 350 x גרם במשך 5 דקות ב 4 °C ו ואקום SN, משאיר כ 50 μL. השעיה ב 200 μL של 1x PBS. זה עכשיו מוכן להיות מנותח על ידי ציטומטריה זרימה.

3. מכתים אימונופלואורסצנטיים

  1. בצע את איסוף הדגימות.
    1. הטמע את חצי הכליה בקריומולד הפלסטי הקטן עם תרכובת טמפרטורת החיתוך האופטימלית (OCT) (ראו טבלת חומרים).
    2. הוסיפו קרח יבש לקופסת קצף פוליסטירן (ראו טבלת חומרים), והניחו בזהירות את הקריומולד על גבי הקרח היבש. ודא כי cryomolds ממוקמים שטוח.
      הערה: לוקח 3-4 דקות עד שתרכובת OCT מתמצקת והופכת ללבנה.
    3. מוציאים את הקריומולד ועוטפים אותו בנייר אלומיניום. יש לאחסן בטמפרטורה של -80°C עד לשימוש נוסף.
      הערה: ניתן לאחסן אותו ב-80°C- למשך שנה אחת לפחות.
  2. בצע חיתוך ותיקון של המדגם.
    1. חותכים את הדגימות למקטעים של 4 מיקרומטר, ממתינים לפחות 2-3 שעות לייבוש, ואז מתקנים עם אצטון קר (ב-4 מעלות צלזיוס) למשך 10 דקות.
      הערה: היזהר בעת שימוש באצטון, הדורש מכסה מנוע כימי מיוחד.
    2. לאחר תיקון המגלשות, יש לייבש באוויר למשך 0.5-1 שעות ולאחסן אותן לזמן קצר ב-20°C-, או למשך זמן רב ב-80°C-.
  3. להכתים את הדגימות.
    1. תקן את השקופיות באצטון קר במשך 5-10 דקות.
    2. אפשרו למקטעים להתחמם ל-RT. השתמשו בעט PAP (ראו טבלת חומרים) מסביב למקטע ותנו לו להתייבש.
      הערה: ניתן להשתמש גם באמייל הציפורן. שלב זה מונע מדילול נוגדנים לצוף על כל המגלשה.
    3. הניחו את השקופיות ב-1x Tris-buffered saline (TBS) בצנצנת קופלין (ראו טבלת חומרים) למשך 20 דקות, הניחו את הצנצנת על השייקר ונערו בעדינות.
    4. מוזגים 1x TBS וממלאים את הצנצנת ב-1x TBS, 5% BSA ו-0.1% Tween 20. לדגור במשך 20 דקות על השייקר, לנער בעדינות.
    5. הוציאו את המגלשות ונגבו את תחתית השקופיות לייבוש. במידת הצורך, נערו את המגלשות לייבוש. הוסף 100 μL של נוגדנים מצומדים25 C3-FITC (1/100) ו- IgG2a-PE (1/100) לסעיף (ראה טבלת חומרים). דגירה ב- RT בתא לחות למשך שעה אחת.
    6. יש לשטוף את הקטע 3 פעמים ב-1x TBS, 5% BSA ו-0.1% Tween 20 למשך 10 דקות על השייקר.
    7. יש לייבש את המגלשות ולהרכיב את הקטע עם מגיב אנטי-פאדי (ראו טבלת חומרים) ולאחר מכן עם כיסוי כיסוי.
    8. אחסן את השקופיות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס עד לצפייה מתחת למיקרוסקופ (למשל, מיקרוסקופ קונפוקלי או מיקרוסקופ מערכת הדמיה). כימות תמונות באמצעות תוכנה והפחת אותות רקע בעת השוואת עוצמת הפלואורסצנטיות בין אזורים.
    9. לניתוח תמונות באמצעות תוכנת ImageJ (ראה טבלת חומרים), התווה את האזור הרצוי.
    10. הגדר פרמטרים סטנדרטיים על ידי לחיצה על נתח, ולאחר מכן הגדר מדידות ומדידת שטח כדי לקבל את התוצאות.
    11. העבר את הנתונים המתקבלים מחלונות המדידה לגיליון אלקטרוני.
      הערה: ניתן לבחור שטח קטן מהתמונה כרקע; זה לא צריך להיות שום פלואורסצנציה.
    12. לאחר שתסיים, לחץ על נתח כדי למדוד את האזור ולהעביר נתונים שוב לגיליון האלקטרוני הקודם.
    13. חזור על שלבים 3.3.11-3.3.12 עבור מספר אזורים.
    14. חישוב הפלואורסצנציה הממוצעת כפלואורסצנציה של תא מתוקן (CCF) = צפיפות משולבת - (אזור תא נבחר x פלואורסצנטיות רקע ממוצעת).
    15. חשב עבור כל אזור ונתח נתונים באמצעות תוכנת הגרפים והסטטיסטיקה (ראה טבלת חומרים).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

הפרוטוקול משתמש במספר שיטות כדי להעריך עכברי MRL/lpr עבור זאבת נפריטיס. ראשית, מתואר הליך לחקר רמות פרוטאינוריה מוגברות עקב תפקוד לקוי של הכליות לאורך זמן. כפי שמוצג באיור 1, נקבות עכברים טופלו בנטילת שתן פומית של 200 μL של מי מלח עם מאגרי פוספט (1x PBS) כקבוצת הביקורת ולקטובצילוס ראוטרי פרוביוטי כקבוצת הטיפול, בריכוז של 109 cfu/mL, פעמיים בשבוע. הטיפול החל בגיל 3 שבועות והסתיים בגיל 15 שבועות. קבוצת העכברים שטופלה ב-L. reuteri הייתה בעלת התקדמות פרוטאינוריה אגרסיבית יותר מאשר בקבוצת הביקורת.

Figure 1
איור 1: זיהוי רמות חלבון בשתן של עכברי MRL/lpr לאורך זמן. n = 5 עכברים לקבוצה. הסטטיסטיקה בוצעה באמצעות מבחן רגרסיה ליניארית פשוטה. *P < 0.05, **P < 0.01. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

איור 2 מציג את ניתוח ה-FACS של לויקוציטים בכליות המבודדות. העכברים טופלו עם ונקומיצין (2 גרם לליטר) או ונקומיצין בתוספת E. coli dsDNA (80 מיקרוגרם) בניסוי זה. Vancomycin ניתנה יחד עם מי השתייה במהלך פרק הזמן שצוין. גאווה אוראלית של דנ"א חיידקי ניתנה לעכברים שטופלו בוונקומיצין פעם בשבוע במשך ארבעה שבועות רצופים בגיל 4, 5, 6 ו-7 שבועות. E. coli dsDNA היה צפוי לגרום לחדירה כלייתית של תאי פלזמה המובילה לפגיעה בתפקוד הכליות, אך לא נמצא הבדל משמעותי.

Figure 2
איור 2: ניתוח של תאי פלזמה בלויקוציטים מבודדים בכליות. (A) אסטרטגיית גידור רציפה: סך תאים, תאים בודדים, תאים חיים, תאי CD45+ ולבסוף תאי CD138+. (B) אחוז תאי הפלזמה לאחר טיפול בוואן (Vancomycin) או van + DNA (Vancomycin + E. coli dsDNA) במשך 3 שבועות (n ≥ 5 עכברים לקבוצה). לא נצפתה מובהקות סטטיסטית ('ns'). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

איור 3 מראה צביעה אימונופלואורסצנטית של משלים C3 ו-IgG2a על מקטעי כליות MRL/lpr של נשים. בניסוי זה הושוותה ההשפעה של גורמים סביבתיים לגבי תצהיר הכליות של C3 ו- IgG2a. עכברים פנימיים גודלו במתקן החיות במשך כמה דורות, והם הושוו לעכברים שנרכשו לאחרונה מספק. הניתוח האימונוהיסטוכימי לא הראה הבדל בין מתקנים שונים.

Figure 3
איור 3: זיהוי של משלים C3 ו-IgG2a במקטעי כליות באמצעות צביעה אימונופלואורסצנטית. (A) תמונות מייצגות של מקטעי כליות המוכתמים באנטי-C3-FITC (ירוק) ואנטי-IgG2a-PE (אדום). (B) השוואה של פלואורסצנטיות תאים מתוקנת (CCF) בין שתי הקבוצות (n ≥ 5 עכברים לקבוצה). סרגל קנה מידה = 100 μM. לא נצפתה מובהקות סטטיסטית ('ns'). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

LN הוא גורם מוביל לתמותה בחולי SLE, והגורמים המחמירים את המחלה עדיין אינם ברורים. היישום של פרוטוקול זה הוא לאפיין את תפקוד הכליות באמצעות שיטות מרובות, כולל מדידה של פרוטאינוריה, ניתוח FACS של לויקוציטים בכליות מבודדות, והכתמה אימונופלואורסצנטית של מקטעי כליות קפואים.

נקודה חשובה אחת שיש לקחת בחשבון בעת איסוף שתן היא כי אחד צריך להיות עקבי עם השעה של היום ואת המיקום של איסוף שתן. עכברים הם בעלי חיים ליליים, ולכן הדגימות המדויקות ביותר נאספות בשעות אחר הצהריים המאוחרות לפני שהעכברים מתחילים להיות פעילים. סיבה נוספת לבחירה הפעם היא שעכברי MRL/lpr נוטים לשתות הרבה מים בלילה, מה שמוביל לשתן מדולל. לכן, איסוף בזמן הלא נכון עלול להגביר את ריכוז השתן ו/או את השתנות הנפח. חשוב גם לאסוף כמה שיותר שתן כדי לקבל תוצאות מדויקות.

מבחן ברדפורד נותן לנו הערכה של כמות החלבון הקיימת. זה לא ספציפי עבור כל חלבוני סמן SLE אבל טוב מספיק כדי לתת מושג על התקדמות המחלה26. בנוסף, שיטה זו היא חסכונית בהשוואה לאחרים. יש לציין כי מבחן ברדפורד רגיש לזמן; לכן, זה חייב להסתיים בתוך חצי שעה. דגימות נוטות להיות בעלות ערכים מוגברים או תוצאות שווא גבוהות אם אחת מהן ממתינה זמן רב מדי. יתרון נוסף בהשוואה לרצועות הריאגנטים המסחריות לבדיקת שתן הוא שהיא נותנת מספרים מדויקים ולא טווח בתוך דגימת השתן. רצועות ניקוד יכולות לתת תוצאות מעורפלות, במיוחד בטווח הגבוה יותר 9,10,24.

עבור בידוד של לויקוציטים בכליות, צעד המפתח הראשון הוא לבצע את דיסקציה מהר ככל האפשר. הכדאיות של תאי הכליה משפיעה מאוד על ההצלחה של ניתוח FACS עוקב. כאשר הכליות מעובדות, כל שלב הוא רגיש לזמן ולטמפרטורה. יש לציין כי ריכוזי DNase I ו- collagenase וטמפרטורה חשובים ליעילות מקסימלית, שכן הם מבטלים את הדנ"א ומאפשרים התפוררות של האיבר, בהתאמה27. שלב המפתח השני הוא בידוד תאים, המחולק לשני תהליכים חשובים. הראשון הוא באמצעות מסננת המאפשרת הסרת פסולת רקמות; התהליך השני בו מעורב פרקול הוא השלב המכריע ביותר ודורש מיקוד וסבלנות. כאשר מבצעים את שיפוע הצפיפות עם Percoll, חשוב לשמור על ממשקים ברורים בין ריכוזים שונים של SIP. מומלץ להשתמש בפיפטה פסטר מכיוון שניתן לשלוט בשטף ובלחץ באופן ידני. ניתן לבנות שלבים נוספים בצורה טובה יותר עם חלוקה איטית של תמיסת SIP או אפילו טיפה אחר טיפה. לאחר קביעת שלבים, הצינור צריך להיות מטופל בעדינות; אחרת, השלבים יתערבבו מיד, ודגימות יאבדו, שכן אי אפשר להפריד את השלבים שוב. בנוסף, חשוב צנטריפוגה של הצינור ללא הפסקה כי שבירה יכול להיות אגרסיבי מדי, המוביל לאובדן של שלבים נפרדים. לאחר מכן הלויקוציטים מתאוששים מאינטרפאזה בין 30% ל-37% SIP. ניתחנו אוכלוסיית תאים אחת בדוגמה זו, תאי פלזמה (CD45+ ו-CD138+). עם זאת, טכניקה זו אינה מוגבלת לתאי B; זה יכול לשמש עבור סוגי תאים אחרים מכתים תוך תאיים28.

השיטה השלישית היא כלי רב עוצמה להדמיית לוקליזציות תוך תאיות של תצהירי חלבון נתון. ברגע שהרקמות קבועות באצטון, חשוב לבצע שטיפה נאותה, כך שהנוגדנים יתחברו רק למטרה. לאחר מכן, חסימה באמצעות BSA מפחיתה קשירה לא ספציפית ותוצאות חיוביות שגויות. אימונופלואורסצנציה ישירה מומלצת בדרך כלל, שכן היא מהירה יותר מאימונופלואורסצנציה עקיפה עם נוגדן משני, וזה גוזל זמן, במיוחד בהתחשב בשלבי הכביסה והדגירה הנוספים. עם זאת, אימונופלואורסצנציה ישירה מגבילה את הגמישות של בחירת נוגדנים בהשוואה לאימונופלואורסצנציה עקיפה29. לכן, שניהם יכולים להיות שיטות בעלות ערך בהתאם למטרה. יתר על כן, יש לציין כי גורמי דילול הם המפתח בעת צביעה עבור IHC. אם הדילול לא נעשה היטב, רקע מוגבר (לא מספיק דילול נוגדנים) או צביעה חלשה (הרחבה רבה מדי) יופיעו על תמונות המיקרוסקופיה. חשוב להתחיל עם דילולים סדרתיים של הנוגדן כדי לייעל את ריכוז הנוגדנים ליחס מטרה-רקע טוב יותר. צעד נוסף שיש לקחת בחשבון הוא כמות זמן הדגירה עם הנוגדנים. ככל שהנוגדן נמצא במגע עם הדגימה זמן רב יותר, כך ניתן ליצור קשירה לא ספציפית יותר.

המגבלות של השיטות הנוכחיות הן כדלקמן. פרמטרים קליניים מסוימים עבור LN, כגון יחס אלבומין/קריאטינין, אינם ניתנים לגילוי בשיטות אלה. בנוסף, דגימות מסוימות עשויות להיות מסיסות חומצה ירודה המובילה לקריאה בריכוז גבוה מעל העקומה הסטנדרטית. זה דורש דילול נוסף של דגימות או תוספת של חומרים פעילי שטח כדי לזרז את הצבע30. יתר על כן, פרוטוקול זה עשוי שלא להתאים אם תאים רבים נדרשים לאחר בידוד לויקוציטים בכליות. פרוטוקול בידוד תאי הכליה הנוכחי כולל מספר שלבי שטיפה, עיכול ובידוד כדי למקסם את ההסרה של תאים אחרים, כך שלמרות שטוהר התאים גבוה בסוף, מספר התאים בדרך כלל נמוך. יתר על כן, זהו הליך ארוך, כך שניתן לפגוע בכדאיות התא. בדיקות מוכנות לשימוש אחרות מתאימות יותר לשימוש קליני; עם זאת, השיטות הנוכחיות עשויות לספק תוצאות מדויקות עם תקציב קטן יותר למעבדות מחקר.

לסיכום, שלוש טכניקות יעילות ומדויקות שונות מוצגות בפרוטוקול זה כדי לאפיין את התקדמות LN. שילוב של שיטת ברדפורד לרמת הפרוטאינוריה, ניתוח FACS לחדירת כליות של לויקוציטים, וניתוח IHC לתצהיר הכליות של IgG2a ו- C3, תמונה ברורה של תפקוד לקוי של הכליות אצל נקבות עכברי MRL/lpr כמודל של LN אנושי נקבעת בהצלחה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים מצהירים כי אין ניגוד עניינים.

Acknowledgments

אנו מודים למתקן הליבה של ציטומטריה של זרימה, למעבדה היסטופתולוגית, למרכז ההדמיה של פרלין במכון הפוליטכני של וירג'יניה ולאוניברסיטת המדינה על התמיכה הטכנית. עבודה זו נתמכת על ידי מענקים שונים של NIH ומענקים פנימיים.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10x Tris-Buffered Saline (TBS) Thermo Fisher Scientific J60764.K2
2-mercaptoethanol Thermo Fisher Scientific 21985-023
Anti-Human/Mouse C3 Cedarlane CL7632F
Anti-Mouse CD138 BV711 Biolegend 142519
Anti-Mouse CD45 AF700 Biolegend 103127
Bovine Serum Albumin Sigma-Aldrich A9418-100G
Collagenase D Sigma-Aldrich 11088882001
Confocal Microscope LSM 880 Zeiss LSM 880
Coplin jar Fisher Scientific 50-212-281
Cryomold Fisher Scientific NC9511236
Density gradient medium GE Healthcare 17-1440-02 Percoll
DEPC-Treated water Thermo Fisher Scientific AM9906
DNase I Sigma-Aldrich D4527
dsDNA-EC InvivoGen tlrl-ecdna
Ethylenediaminetetraacetic Acid Fisher Scientific S311-500 EDTA
EVOS M5000 Microscope imaging system Thermo Fisher Scientific AMF5000
FACS Fusion Cell sorter BD Biosciences FACS Fusion
Fetal Bovine Serum - Premium, Heat Inactivated R&D systems S11150H
Fisherbrand 96-Well Polystyrene Plates Fisher Scientific 12-565-501
Graphpad prism GraphPad N/A
Hank’s Balanced Salt Solution Thermo Fisher Scientific 14175-079
HEPES Thermo Fisher Scientific 15630-080
ImageJ software National Institutes of Health N/A
Lactobacillus reuteri Kandler et al. ATCC 23272
MEM non-essential amino acids Thermo Fisher Scientific 11140-050
MRL/MpJ-Fas lpr /J Mice (MRL/lpr) Jackson Lab 485
Nail enamel N/A N/A Any conventional store
O.C.T compound Tisse-Tek 4583
PAP pen Sigma-Aldrich Z377821
Peel-A-Way Disposable Embedding Molds Polysciences R-30
Penicillin-Streptomycin Thermo Fisher Scientific 15140-122
Phosphate-buffered saline (PBS) Thermo Fisher Scientific 70011069
Pierce 20x TBS Buffer Thermo Fisher Scientific 28358
Pierce Coomassie Plus (Bradford) Assay kit Thermo Fisher Scientific 23236 Albumin standard included
ProLon Gold Antifade Mountant ThermoFisher P36934
Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 BD Biosciences 553141 FcR block
RPMI 1640 Thermo Fisher Scientific 11875-093
Sodium pyruvate Thermo Fisher Scientific 11360-070
SpectraMax M5 Molecular Devices N/A SoftMax Pro 6.1 software
Sterile cell Strainers 100 µM Fisher Scientific 22363549
Tween 20 Fisher Scientific BP337-500
Vancomycin Hydrochloride Goldbio V-200-1
Zombie Aqua Biolegend 423102 fluorescent dye for flow cytometry analysis

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Tsokos, G. C. Systemic Lupus Erythematosus. New England Journal of Medicine. 365 (22), 2110-2121 (2011).
  2. Davidson, A., Aranow, C. Lupus nephritis: lessons from murine models. Nature Reviews Rheumatology. 6 (1), 13-20 (2010).
  3. Maldonado, M. A., et al. The role of environmental antigens in the spontaneous development of autoimmunity in MRL-lpr mice. Journal of Immunology. 162 (11), 6322-6330 (1999).
  4. Lech, M., Anders, H. J. The pathogenesis of lupus nephritis. Journal of the American Society of Nephrology. 24 (9), 1357-1366 (2013).
  5. Bagavant, H., Fu, S. M. Pathogenesis of kidney disease in systemic lupus erythematosus. Current Opinion in Rheumatology. 21 (5), 489-494 (2009).
  6. Li, Q. Z., et al. Identification of autoantibody clusters that best predict lupus disease activity using glomerular proteome arrays. Journal of Clinical Investigation. 115 (12), 3428-3439 (2005).
  7. Aragón, C. C., et al. Urinary biomarkers in lupus nephritis. Journal of Translational Autoimmunity. 3, 100042 (2020).
  8. Mu, Q., et al. Control of lupus nephritis by changes of gut microbiota. Microbiome. 5 (1), 73 (2017).
  9. Lu, T. -S., Yiao, S. -Y., Lim, K., Jensen, R. V., Hsiao, L. -L. Interpretation of biological and mechanical variations between the Lowry versus Bradford method for protein quantification. North American Journal of Medical Sciences. 2 (7), 325-328 (2010).
  10. Lamb, E. J., MacKenzie, F., Stevens, P. E. How should proteinuria be detected and measured. Annals of Clinical Biochemistry. 46, Pt 3 205-217 (2009).
  11. Viswanathan, G., Upadhyay, A. Assessment of proteinuria. Advances in Chronic Kidney Disease. 18 (4), 243-248 (2011).
  12. Hsieh, C., et al. Predicting outcomes of lupus nephritis with tubulointerstitial inflammation and scarring. Arthritis Care & Research. 63 (6), 865-874 (2011).
  13. Hill, G. S., Delahousse, M., Nochy, D., Mandet, C., Bariéty, J. Proteinuria and tubulointerstitial lesions in lupus nephritis. Kidney International. 60 (5), 1893-1903 (2001).
  14. Chang, A., et al. In situ B cell-mediated immune responses and tubulointerstitial inflammation in human lupus nephritis. Journal of Immunology. 186 (3), 1849-1860 (2011).
  15. Schrezenmeier, E., Jayne, D., Dörner, T. Targeting B Cells and plasma cells in glomerular diseases: translational perspectives. Journal of the American Society of Nephrology. 29 (3), 741 (2018).
  16. Fitzgibbons, P. L., et al. Principles of analytic validation of immunohistochemical assays: Guideline from the college of American pathologists pathology and laboratory quality center. Archives of Pathology & Laboratory Medicine. 138 (11), 1432-1443 (2014).
  17. Lewis, M. J., Botto, M. Complement deficiencies in humans and animals: links to autoimmunity. Autoimmunity. 39 (5), 367-378 (2006).
  18. Watanabe, H., et al. Modulation of renal disease in MRL/lpr mice genetically deficient in the alternative complement pathway factor B. Journal of Immunology. 164 (2), 786-794 (2000).
  19. Yin, Z., et al. IL-10 regulates murine lupus. Journal of Immunology. 169 (4), 2148-2155 (2002).
  20. Singh, R. R., et al. Differential contribution of IL-4 and STAT6 vs STAT4 to the development of lupus nephritis. Journal of Immunology. 170 (9), 4818-4825 (2003).
  21. van Bavel, C. C., Fenton, K. A., Rekvig, O. P., vander Vlag, J., Berden, J. H. Glomerular targets of nephritogenic autoantibodies in systemic lupus erythematosus. Arthritis & Rheumatism. 58 (7), 1892-1899 (2008).
  22. Zuniga, R., et al. Identification of IgG subclasses and C-reactive protein in lupus nephritis: the relationship between the composition of immune deposits and FCgamma receptor type IIA alleles. Arthritis & Rheumatism. 48 (2), 460-470 (2003).
  23. Wang, S., Wang, F., Wang, X., Zhang, Y., Song, L. Elevated creatinine clearance in lupus nephritis patients with normal creatinine. International Journal of Medical Sciences. 18 (6), 1449-1455 (2021).
  24. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72 (1), 248-254 (1976).
  25. Cabana-Puig, X., et al. Phenotypic drift in lupus-prone MRL/lpr Mice: potential roles of micrornas and gut microbiota. Immunohorizons. 6 (1), 36-46 (2022).
  26. Wang, S., Wang, F., Wang, X., Zhang, Y., Song, L. Elevated creatinine clearance in lupus nephritis patients with normal creatinine. International Journal of Medical Sciences. 18 (6), 1449-1455 (2021).
  27. Kienzle, N., Young, D., Zehntner, S., Bushell, G., Sculley, T. B. DNaseI treatment is a prerequisite for the amplification of cDNA from episomal-based genes. Biotechniques. 20 (4), 612-616 (1996).
  28. Park, J. G. -, et al. Immune cell composition in normal human kidneys. Scientific Reports. 10 (1), 15678 (2020).
  29. Im, K., Mareninov, S., Diaz, M. F. P., Yong, W. H. An introduction to performing immunofluorescence staining. Methods in Molecular Biology. 1897, 299-311 (2019).
  30. Okutucu, B., Dınçer, A., Habib, Ö, Zıhnıoglu, F. Comparison of five methods for determination of total plasma protein concentration. Journal of Biochemical and Biophysical Methods. 70 (5), 709-711 (2007).

Tags

אימונולוגיה וזיהום גיליון 184 SLE זאבת נפריטיס כליות חדירת כליות תאי B לא מתפקדים תצהיר חלבונים
ניתוחים של פרוטאינוריה, חדירה כלייתית של לויקוציטים ותצהיר כלייתי של חלבונים בעכברי MRL/lpr המועדים לזאבת
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Cabana-Puig, X., Luo, X. M. Analyses … More

Cabana-Puig, X., Luo, X. M. Analyses of Proteinuria, Renal Infiltration of Leukocytes, and Renal Deposition of Proteins in Lupus-prone MRL/lpr Mice. J. Vis. Exp. (184), e63506, doi:10.3791/63506 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter