Immunology and Infection
A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Analyser av proteinuri, renal infiltrasjon av leukocytter og nyreavsetning av proteiner i lupusutsatt MRL/lpr-mus
Chapters
Summary June 8th, 2022
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Den nåværende protokollen beskriver en metode for å spore lupusprogresjon hos mus. Ytterligere to prosedyrer presenteres for å karakterisere lupus nefritt basert på celleinfiltrasjon og proteinavsetning i nyrene.
Transcript
Disse metodene kan bidra til å undersøke utviklingen av kronisk betennelse assosiert med nyrer i lupus pasienter. Vi tilbyr et pålitelig og kostnadseffektivt alternativ som kan brukes til å overvåke sykdomsforløpet i lupus. Begynn å sterilisere hetten ved å sprøyte 70% etanol og legg et sterilt plastark på overflaten.
Forbered deretter tips, 1,5 milliliter rør og en pipette for å samle ca. 20 mikroliter urin. Ta buret og spray 70% etanol før du plasserer det inne i hetten. Etterpå holder du musen med den ene hånden og bruker den andre hånden til å forsiktig massere ventralområdet fra topp til bunn.
Bruk et 1,5 milliliter rør eller pipette, samle urinen direkte. Eller hvis prøven faller samle den fra plastplaten. Sett deretter musen tilbake i buret.
Skjær de dissekerte nyrene i kornstørrelse og fordøy i fem milliliter fordøyelsesbuffer som inneholder kollagenase og DNase 1 i RPMI 1640 medium som inneholder HEPES i en time med kontinuerlig mild risting ved 37 grader Celsius. Tilsett 10 ml iskald PBS som inneholder 10 millimolar EDTA og inkuber i 10 minutter på is. Deretter vortex suspensjonen to ganger.
Senere filtrerer du cellesuspensjonen gjennom en 100 mikrometer sil og vasker med 10 ml HBSS full. Etterpå sentrifuger ved 350 ganger G i 10 minutter ved romtemperatur. Forbered en 30, 37 og 70% lager isotonisk Percoll-løsning og legg til et lag med 37% Percoll-løsning på toppen av 70%-løsningen.
Re suspendere cellene i fem milliliter av 30% lager isotonisk Percoll. Ved hjelp av en Pasteur pipette sakte laste 37% av fem milliliter topp og 70% av fem milliliter på bunnen, noe som gjør lager isotonisk Percoll gradient. Sentrifuger deretter med opp nummer ni og ned nummer null ved 1000 ganger G i 30 minutter ved romtemperatur.
Etterpå samler du leukocytter fra 37 til 70% grensesnittet og suspenderer dem i fem milliliter C 10. Igjen, sentrifuger ved 350 ganger G i 10 minutter ved fire grader Celsius. Deretter suspendere cellepelleten i tre milliliter faksbuffer og sentrifuge ved 350 ganger G i fem minutter ved fire grader Celsius.
Kast deretter supernatanten og la omtrent 50 mikroliter av totalvolumet. Tilsett 50 mikroliter FC-reseptorblokk per rør. Etter denne blandingen og inkuber på is i mørket i 10 minutter.
Senere legger du til to milliliter faksbuffer for vasking. Sentrifuger deretter ved 350 ganger G i fem minutter ved fire grader Celsius og kast supernatenten og etterlater ca. 50 mikroliter av totalvolumet. Deretter tilsettes 20 mikroliter av riktig fluorescerende fargestoff og la det stå i 15 til 30 minutter på is.
Tilsett 50 mikroliter antistoffblanding per rør som inneholder CD 138 briljant fiolett syv 11 og CD 45 Alexa Fluor 700 og rug på is i mørket i 15 til 30 minutter. Etterpå legger du til tre milliliter faksbuffer. Sentrifuge ved 350 ganger G i fem minutter ved fire grader Celsius.
Fjern supernatanten ved vakuum og etterlat ca. 50 mikroliter av totalvolumet. Senere, suspendere cellepelleten i 200 mikroliter PBS. For å samle prøven, legg den halve nyren i den lille plastkryommen med den optimale skjæretemperaturforbindelsen.
Tilsett deretter tørris i en isoporskumboks og legg kryommen forsiktig på toppen av tørrisen. Fjern deretter kryommet, pakk det inn i aluminiumsfolie og oppbevar det ved minus 80 grader Celsius til videre bruk. Fest deretter de tørre til fire mikrometerseksjonene med kald aceton i 10 minutter.
Etter å ha festet lysbildene, luft tørk i 0,5 til en time og oppbevar dem ved minus 20 grader Celsius i kort tid eller minus 80 grader Celsius i lang tid. For å flekke prøvene, fest lysbildene i kald aceton i fem til 10 minutter og la seksjonene varmes opp til romtemperatur. Etterpå, bruk en klapppenn, tegn en hydrofob sirkel rundt seksjonen og la den tørke.
Legg deretter lysbilder i TBS i Copeland-krukken i 20 minutter og rist forsiktig ved å sette krukken på shakeren. Hell deretter TBS og fyll krukken med TBS 5% BSA og 0,1% TW 20. Senere, inkuber krukken i 20 minutter ved å riste forsiktig på shakeren.
Ta deretter lysbildene ut og tørk bunnen av lysbildene. Tilsett 100 mikroliter konjugerte antistoffer C3 fit C og IgG2 APE til seksjonen og inkuber romtemperatur i et fuktet kammer i en time. Vask seksjonen tre ganger i PBS 5% BSA og 0,1% TW 20 i 10 minutter på shakeren og rist deretter skliene.
Monter seksjonen med et anti-fade reagens og deretter med en dekselslipp. Oppbevar deretter lysbildene ved fire grader Celsius til du ser under mikroskopet. For bildeanalyse ved hjelp av bildet J-programvaren, skissere ønsket region.
Etterpå angir du standardparametere ved å klikke på analyser og deretter angi målinger og måleområde for å få resultatene. Deretter overfører du dataene som er hentet fra målevinduene til et regneark. Når du er ferdig, klikker du på analyser for å måle regionen og overføre dataene igjen til forrige regneark.
Proteinnivåene i urinen hos MRL LPR-mus ble påvist over tid der de ble behandlet med fosfatbufret saltvann som kontrollgruppe og lactobacillus reuteri som behandlingsgruppe. Musgruppen behandlet med L.reuteri ved en mer aggressiv proteinuriprogresjon enn kontrollgruppen. Faksanalysen ble utført for de isolerte nyreleukocyttene for å analysere plasmacellene.
Videre ble musene behandlet med vancomycin eller vancomycin sammen med Escherichia coli dobbeltstrenget DNA. Selv om dobbeltstrenget DNA fra Escherichia coli var forventet å utløse nyreinfiltrasjonen, ble det ikke funnet noen signifikant forskjell i prosentandelen plasmaceller. Komplement C3 og IgG2a ble påvist ved immunfluorescensfarging på kvinnelige MRL IPR nyreseksjoner.
De effektive miljøfaktorene på nyreavsetning av C3 og IgG2a ble sammenlignet for det interne musebrødet i dyreanlegget og de som ble kjøpt fra en leverandør. Den immunhistokjemiske analysen viste ingen forskjell mellom de to gruppene. Det kan være utfordrende å legge til hvert lag av prosentandelen ISO 20 Percoll-løsning, og hvis de blander seg, må du starte på nytt.
Denne prosedyren hjelper med flowcytometeret og i vittereksperimenter, slik at du ikke kan studere de forskjellige nyrecelletypene av populasjoner. Denne prosedyren lar oss studere B-cellenes infiltrater i nyrene, og det er ikke mye informasjon i litteraturen.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
