Summary
Существует несколько различий между правым и левым желудочками. Однако патофизиология инфаркта правого желудочка (РВИ) не выяснена. В настоящем протоколе введен воспроизводимый метод генерации модели мыши RVI, который может обеспечить средство для объяснения механизма RVI.
Abstract
Инфаркт правого желудочка (РВИ) является распространенным проявлением в клинической практике. Тяжелая РВИ может привести к фатальной гемодинамической дисфункции и аритмии. В отличие от широко используемой мышиной модели инфаркта миокарда (ИМ), генерируемой перевязкой левой коронарной артерии, мышиная модель RVI редко используется из-за трудностей, связанных с генерацией модели. Исследования механизмов и лечения RVI-индуцированного ремоделирования и дисфункции RV требуют, чтобы животные модели имитировали патофизиологию RVI у пациентов. В этом исследовании представлена осуществимая процедура генерации модели RVI у мышей C57BL/6J. Далее эта модель была охарактеризована на основе следующего: оценка размера инфаркта через 24 ч после ИМ, оценка ремоделирования и функции сердца с помощью эхокардиографии, оценка гемодинамики RV и гистология зоны инфаркта через 4 недели после RVI. Кроме того, был выполнен слепок коронарной сосудистой системы для наблюдения за расположением коронарных артерий в RV. Эта мышиная модель RVI облегчит исследование механизмов правой сердечной недостаточности и поиск новых терапевтических целей ремоделирования RV.
Introduction
Правый желудочек (RV), долгое время считавшийся простой трубкой, соединенной с легочной артерией, был неправомерно запущен в течение многих лет1. Тем не менее, в последнее время наблюдается повышенный интерес к функции RV, поскольку она играет важную роль в гемодинамических расстройствах 2,3 и может служить независимым предиктором риска сердечно-сосудистых заболеваний 4,5,6,7. Заболевания RV включают инфаркт RV (RVI), гипертензию легочной артерии и заболевание клапанов8. В отличие от огромного интереса к гипертонии легочной артерии, RVI остается безнадзорным 7,9.
RVI, обычно сопровождающийся инфарктом нижне-задней части миокарда 10,11, вызван окклюзией правой коронарной артерии (RCA). Согласно клиническим исследованиям, тяжелая РВИ, вероятно, вызывает гемодинамические нарушения и аритмии, такие как гипотония, брадикардия и атриовентрикулярная блокада, связанные с более высокой больничной заболеваемостью и смертностью 12,13,14. Функция RV может восстанавливаться спонтанно в определенной степени даже при отсутствии реперфузии15,16. Существует несколько морфологических и функциональных различий между левым желудочком (LV) и RV17. Считается, что RV более устойчив к ишемии, чем LV8, частично из-за более обширного образования коллатерального кровообращения после RVI. Уточнение различий между инфарктом ЛЖ (ЛВИ) и РВИ и выявление основных механизмов обеспечит новые терапевтические мишени для регенерации сердца и ишемической сердечной недостаточности. Однако из-за трудностей, связанных с генерацией мышиной модели RVI, фундаментальные исследования RVI в основном ограничены.
Большая животная модель RVI была получена путем лигирования RCA у свиней18, которая проще в эксплуатации из-за видимого RCA. По сравнению с моделью крупного животного, мышиная модель имеет следующие преимущества: большая доступность в генных манипуляциях, более низкая экономическая стоимость и более короткий экспериментальный период19,20. Хотя ранее сообщалось о мышиной модели RVI, ориентированной на влияние RVI на функцию LV, подробные этапы процедуры, трудности и ключевые моменты работы, а также характеристики модели, такие как гемодинамические изменения, не были полностью введены 9,21.
В этой статье представлены подробные хирургические процедуры для создания мышиной модели RVI. Кроме того, эта модель характеризовалась эхокардиографическим измерением, инвазивной гемодинамической оценкой и гистологическим анализом. Кроме того, был выполнен коронарный сосудистый слепок для наблюдения за расположением коронарных артерий в RV. Метод, представленный в этой статье, поможет новичкам быстро понять генерацию мышиной модели RVI с приемлемой смертностью от операций и надежными подходами к оценке. Мышиная модель RVI поможет исследовать механизмы правой сердечной недостаточности и искать новые терапевтические цели ремоделирования RV.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все процедуры выполнялись в соответствии с Руководством по уходу за лабораторными животными и их использованию, опубликованным Национальными институтами здравоохранения США (публикация NIH No 85-23, пересмотренная в 1996 году) и были одобрены Комитетом по этике животных больницы Наньфан Южного медицинского университета (Гуанчжоу, Китай). Здоровые самцы мышей C57BL/6J (8-10 недель; масса тела, 25-30 г) были получены из Центра животных Южного медицинского университета. Самки мышей также могут быть использованы, но смешивание обоих полов не рекомендуется из-за потенциального влияния половых различий. После прибытия мышей размещали в 12-часовом / 12-часовом темном / светлом цикле (3-4 мыши на клетку), с пищей ad libitum и водой.
1. Подготовка к операции
- Стерилизуйте хирургические инструменты путем автоклавирования перед операцией. Отрегулируйте грелку до 37 °C.
- Обезболивают мышей внутрибрюшинной инъекцией 50 мг/кг пентобарбитала (см. Таблицу материалов) для облегчения хирургической боли. Поместите мышей в отдельные ящики для индукции анестезии. Обеспечьте глубину анестезии за счет отсутствия реакции на снятие пальцев ног.
ПРИМЕЧАНИЕ: Также рекомендуется использовать 1,5% изофлурана для ингаляционной анестезии, потому что это лучше для обезболивания. - Поместите мышей лежа на подушечку, зафиксировав их резцы швом и обездвижив их конечности скотчем. Убедитесь в глубине анестезии еще раз, проверив рефлекс.
- Удалите волосы с шеи до клифоса с помощью крема для депиляции. Продезинфицируйте хирургическую область 3 раза чередующимся антисептическим скрабом и 75% спиртом, а затем задрапируйте хирургическое поле.
- Выполните интубацию, выполнив следующие действия.
- Отрегулируйте частоту дыхания животного с помощью мини-вентилятора (см. Таблицу материалов) до 150/мин и дыхательного объема до 300 мкл.
ПРИМЕЧАНИЕ: Нет необходимости использовать режим положительного давления конечного выдоха. - Слегка вытяните язык пинцетом, поднимите нижнюю челюсть с помощью депрессора языка, чтобы обнажить голосовую щель, и выполните внутритрахеальную интубацию, вставив канюлю 22 G в голосовую щель.
- Включите мини-вентилятор и подключите трахеальную канюлю к аппарату ИВЛ. Явление придания грудной волны частоте вентилятора свидетельствует об успешной интубации. Закрепите канюлю скотчем, чтобы предотвратить скольжение во время операции.
- Отрегулируйте частоту дыхания животного с помощью мини-вентилятора (см. Таблицу материалов) до 150/мин и дыхательного объема до 300 мкл.
2. Перманентное перевязка правой коронарной артерии
- Правильно подключите электроды электрокардиографии (ЭКГ) (см. Таблицу материалов) к конечностям мыши и запишите ЭКГ.
ПРИМЕЧАНИЕ: В качестве ведущего мониторинга выбирается один из руководителей II, III или AVF; Свинец III является более уместным. - Откройте сундук.
- Сделайте разрез длиной 1 см в коже параллельно третьему правому ребру офтальмологическими ножницами. Еще раз определите третий межреберный и обеспечьте достаточное пространство в соответствии с углом грудины.
ПРИМЕЧАНИЕ: Направление разреза кожи производится от угла грудины к правой передней подмышечной линии. - Отделите и разрезайте большую грудную и грудную мышцы ножницами и микрощипцами над третьим межреберным пространством. После этого тупо отделяют межреберную мышцу локтевыми щипцами, чтобы обнажить операционное поле.
ПРИМЕЧАНИЕ: Только небольшую часть грудных мышц нужно разрезать, а затем рекомендуется тупое отделение для обнажения сердца. - Прорежьте перикард. Поднимите правое предсердие стерильным хлопком и обложите RCA стерильным 8-0 нейлоновая нить с диапазоном перевязки 3-5 мм. После лигирования RCA мониторингОВАЯ ЭКГ (свинец III) показывает повышение сегмента ST.
ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку RCA мыши невидима, ее анатомическое местоположение должно быть тщательно подтверждено. Миокард RV намного тоньше, чем у LV. Поэтому трудно уловить глубину вставленной иглы. Легко вызвать синусовую брадикардию и атриовентрикулярную блокаду, если глубина вставленной иглы слишком глубока, а диапазон перевязки слишком велик.
- Сделайте разрез длиной 1 см в коже параллельно третьему правому ребру офтальмологическими ножницами. Еще раз определите третий межреберный и обеспечьте достаточное пространство в соответствии с углом грудины.
- Удалите стерильные хлопковые и шовные мышцы и кожу стерильной нейлоновой нитью 5-0, чтобы закрыть межреберный разрез. Снова продезинфицируйте кожу 75% спиртом и однодомной мышью после операции.
ПРИМЕЧАНИЕ: Хорошо зашитая мышца важна для предотвращения аэроторакса. Стерильную дренажную трубку помещают в грудную полость до завершения закрытия грудной клетки, а затем грудную полость эвакуируют инъекционным шприцем, соединяющим дренажную трубку.
ПРИМЕЧАНИЕ: После операции мышей помещают на грелку. Анальгетики, такие как бупренорфин (0,1 мг / кг массы тела, подкожно инъекция), необходимы для уменьшения боли животных после операции. Ожидаемыми осложнениями являются синусовая брадикардия и атриовентрикулярная блокада, а смертность после операции составляет 10-20%.
3. Эхокардиографическая оценка функции RV после операции
ПРИМЕЧАНИЕ: Для эхокардиографии используйте зонд MS400D с центральной частотой 30 МГц, подключенный к системе ультразвуковой визуализации высокого разрешения (см. Таблицу материалов). Эхокардиографическое исследование проводится через 4 недели после операции.
- Обезболить мышь 3% изофлураном путем ингаляции.
- Поместите мышь в положение лежа на спине на ультразвуковой платформе для фиксации животных и ультразвуковой работы. Прикрепите его когти к электроду, чтобы получить запись ЭКГ через систему, прикрепленную к ультразвуковому аппарату.
- Контролируйте частоту сердечных сокращений с помощью ЭКГ и поддерживайте ее между 450-550 ударами / мин, регулируя концентрацию анестетика между 1,5% и 3%.
- Удалите волосы с груди мыши кремом для депиляции и нанесите ультразвуковой гель на кожу грудной клетки.
- Установите платформу в горизонтальное положение. Ориентируйте преобразователь параллельно левой ноге и получайте изображение левого желудочка по длинной оси. Поверните зонд на 90° по часовой стрелке, чтобы получить вид на короткую ось LV. Нажмите кнопку Cine Store , чтобы сохранить изображения.
ПРИМЕЧАНИЕ: Верхняя левая часть платформы наклонена в самой низкой точке. Угол поворота преобразователя по короткой оси LV сохраняется, в то время как преобразователь ориентирован на правое плечо мыши. - Двигайтесь вниз по датчику вертикально, сохраняя его положение над верхней частью живота и ниже диафрагмы мыши в режиме B. Немного отрегулируйте положение платформы, повернув ее оси x и y, пока на экране не будут четко видны RV, правое предсердие (RA), левое предсердие (LA) и LV. Сохраните апикальные четырехкамерные изображения, нажав кнопку Cine store или Frame store .
ПРИМЕЧАНИЕ: B-режим используется для отображения двухмерного (2D) вида сердца. - Нажмите M-режим; после появления индикаторной линии 2x найдите индикаторную линию на отверстии трехстворчатого клапана, чтобы получить движение трикуспидальной кольцевой плоскости. Нажмите кнопку Cine store или Frame store для сохранения данных и изображений.
ПРИМЕЧАНИЕ: M-мод означает режим движения, который показывает движение сердца или сосуда в кривой форме. - Нажмите кнопку Измерить , чтобы войти в режим измерения. Нажмите кнопку Измерения площади , чтобы перейти на RV и LV. Рассчитайте площадь RV и LV, чтобы получить отношение площади RV к LV.
- Нажмите кнопку Timeline и сделайте две базовые линии, чтобы определить диапазон движения трикуспидальной кольцевой плоскости во время систолического и диастолического периодов. Нажмите кнопку «Расстояние» и измерьте расстояние между двумя базовыми линиями, чтобы получить систолическую экскурсию трикуспидальной кольцевой плоскости (TAPSE).
- Наклоните левую сторону платформы в самой низкой точке. Держите зонд под углом 30° к горизонтальной оси вдоль правой передней подмышечной линии. Поверните оси x и Y платформы для отображения RV.
- Нажмите кнопку M-mode и найдите линию индикатора в гиперэхоической точке перегородки, чтобы получить изображение M-режима интерфейса RV. Нажмите кнопку Cine Store , чтобы сохранить изображение.
- Откройте изображение M-режима интерфейса RV, нажмите кнопку Measure для входа в режим измерения. Измерьте внутреннее расстояние RV в конце диастолы (RVIDd), фракцию выброса RV (RVEF) и укорочение фракции RV (RVFS) с помощью встроенного инструмента измерения эхокардиографической системы.
- Прекратите введение изофлурана и положите мышь на грелку на 3-5 мин, пока она не придет в сознание. После этого верните мышь в клетку с 12-часовым циклом свет/темнота.
4. Инвазивные измерения гемодинамики RV
ПРИМЕЧАНИЕ: Гемодинамика RV оценивается с помощью катетеризации правого сердца через 4 недели после RVI. Применяется катетер 1,0 F вместе с системой мониторинга.
- Обезболить мышь внутрибрюшинной инъекцией 50 мг/кг пентобарбитала натрия (см. Таблицу материалов).
- После подтверждения исчезновения рефлекса снятия педали удерживайте мышь в положении лежа на спине и обездвиживайте ее скотчем.
- Сбрить волосы на груди от грудинного угла до шиповника. Продезинфицируйте рабочую зону 75% спиртом.
- Выполните интубацию трахеи и установите параметр вентилятора животного, как описано в шагах 1.5.2-1.5.3.
- Сделайте двусторонний разрез размером 1 см на коже над мечевидным отростком и пересекните диафрагму и ребро офтальмологическими ножницами, чтобы обнажить сердце.
- Проколите свободную стенку правого желудочка иглой 32 Г. Удалите иглу и прижмите рану хлопком, чтобы остановить кровотечение.
- Вставьте кончик катетера в правый желудочек через место пункции и медленно протолкните катетер вперед. Отрегулируйте положение наконечника, чтобы получить типичную форму сигнала давления RV, отображаемую на мониторе и системе записи.
ПРИМЕЧАНИЕ: Правая яремная вена также является подходящим маршрутом для гемодинамического измерения. - После 10 мин стабилизации запишите данные RV систолического артериального давления (RVSBP), конечного диастолического давления RV (RVEDP) и RV dP / dt. Нажмите кнопку «Выбрать », чтобы выбрать сердечные циклы для расчета, а затем нажмите кнопку « Анализировать », чтобы рассчитать средние значения выбранных циклов.
- Извлеките катетер после завершения записи, а затем поместите его внутрь обычного физиологического раствора.
- Усыпить мышь внутрибрюшинной инъекцией передозировки пентобарбитала натрия (150 мг/кг), а затем принести его в жертву при вывихе шейки матки.
- Соберите сердце и большеберцовую кость для гистологического анализа.
5. Коронарная сосудистая слепок с использованием сосудистого литейного агента
- Гепаринизировать мышь внутрибрюшинной инъекцией 200 МЕ/мл гепарина натрия при 2000 МЕ/кг (см. Таблицу материалов).
- Обезболить мышь внутрибрюшинной инъекцией 50 мг/кг пентобарбитала натрия.
- Поместите животное лежа на подушечке и интубируйте для искусственной вентиляции легких, выполнив шаги 1.5.2-1.5.3.
- Откройте грудную клетку хирургическими ножницами, как описано в шаге 4.5, и обнажите сердце.
- Сделайте 3 мм выемку с офтальмологическими ножницами на правом предсердии и перфьминируйте сердце 5 мл нормального физиологического раствора через сердечную вершину с помощью инъектора.
- Блокировать кровь из аорты с помощью аортального зажима и перфузить 0,1 мл нитроглицерина (1 мг / мл) через сердечную вершину с помощью инъектора для расширения коронарной артерии.
- Приготовьте литый реагент, смешав ингредиенты в комплекте в соответствии с инструкциями производителя (см. Таблицу материалов).
ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется одновременно готовить слепой реагент и перфузию с нормальным физиологическим раствором и нитроглицерином для предотвращения микрососудистого закрытия. - Перфузируйте сердце 1 мл литого реагента через сердечную вершину и подождите 2-3 ч.
- Размывают сердце 50% гидроксидом натрия в течение 2-3 дней и удаляют мышечную ткань или соединительную ткань путем полоскания нормальным физиологическим раствором.
- Делайте снимки под фотоаппарат.
ВНИМАНИЕ: Слепой реагент вреден для глаз, кожи и дыхательных путей. Гидроксид натрия является коррозионным. Требуется ношение защитных перчаток, защитных очков и лабораторного халата. Литой реагент должен быть подготовлен в вытяжном капюшоне.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
В этом исследовании мыши были случайным образом распределены в группу RVI (n = 11) или фиктивной операции (n = 11). Коронарное слепок в 2 нормальных сердцах мышей показано на рисунке 1А. В ответ на лигирование RCA повышение сегмента ST наблюдалось в свинце III ЭКГ (рисунок 1B). Кроме того, окрашивание 2,3,5-трифенилтетразолия хлорида (ТТС) показало, что на область инфаркта приходится 45% свободной стенки RV через 24 ч после операции (рисунок 1C,D). Приведенные выше данные указывали на успешную генерацию мышиной модели RVI.
Записи 4-камерного вида вершины (рисунок 2A) и 2-камерного вида на короткой оси LV и соответствующие измерения эхокардиографии m-режима (рисунок 2B) были выполнены через 4 недели после операции для оценки ремоделирования и функции RV. По сравнению с тем, что в фиктивной группе, внутренний размер RV в конце диастолы (RVIDd) увеличился в группе RVI (рисунок 2C), и он был более чем в 2 раза в фиктивной группе (рисунок 2A). Фракция выброса RV (RVEF), укорочение фракции RV (RVFS) и систолическая экскурсия трикуспидальной кольцевой плоскости (TAPSE) были значительно меньше в группе RVI, чем в фиктивной группе (рисунок 2D-F). Соотношение площади RV/LV увеличилось примерно на 50% по отношению к фиктивной группе (рисунок 2G).
Мышей подвергали гемодинамическому измерению RV через 4 недели после операции. В группе RVI сократимость RVSBP, dp/dt max, dp/dt min и RV была значительно меньше. В то же время индексы RVEDP и τ (tau) были значительно более значимыми, чем в фиктивной группе (рисунок 3A-E).
Через четыре недели после операции мыши были принесены в жертву. Аневризма RV была видна в инфарктной области (рисунок 4A). Отношение массы сердца к массе тела (HW/BW) и отношение массы сердца к длине большеберцовой кости (HW/TL) в группе RVI были немного больше (без статистической значимости), чем в фиктивной группе (рисунок 4B, C). Окрашивание Массона22 указывало на значительный фиброз в стенке без RV, и редко фиброз возникал в перегородке в группе RVI (рисунок 4D, E). Напротив, несколько выживших кардиомиоцитов находились в области инфаркта (рисунок 4F).
Рисунок 1: Изменения электрокардиографии (ЭКГ) и размера инфаркта после перевязки правой коронарной артерии (РКА). (А) Репрезентативные изображения коронарной сосудистой повязки мыши. Шкала стержня = 4 мм. (B) Изменение ЭКГ свинца III в ответ на лигирование RCA. (C) Репрезентативные изображения окрашивания 2,3,5-трифенил тетразолия хлорида (TTC) (белый цвет указывает на область инфаркта, красный - жизнеспособную ткань). Шкала стержня = 4 мм. (D) Количественное определение размера инфаркта миокарда у мышей RVI. Данные представлены в виде среднего значения ± SEM, *P < 0,01 против. фиктивная группа, n = 6 на группу (два независимых образца t-теста). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Эхокардиографическая оценка ремоделирования и функции правого желудочка (RV) у мышей, подвергшихся лигированию RCA. (A) Репрезентативные изображения B-режима в четырехкамерном виде через 4 недели после лигирования RCA; шкала = 2 мм. (B) Типичные изображения B-режима на границе правого желудочка (вверху) и соответствующего M-режима (внизу), показывающие как LV, так и RV через 4 недели после лигирования RCA; шкала стержня = 2 мм. (C) RV внутренний размер в конце диастолы (RVIDd). (D) Укорочение фракции RV (RVFS). (E) Фракция выброса RV (RVEF). (F) Систолическая экскурсия трикуспидальной кольцевой плоскости (TAPSE). (G) Соотношение площади RV/LV. Данные представлены в виде среднего ± SEM. *P < 0,01 против. фиктивная группа, n = 6 на группу (два независимых образца t-теста). ЛЖ, левый желудочек; РВИ, инфаркт правого желудочка. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Гемодинамика правого желудочка (RV) через 4 недели после перевязки правой коронарной артерии. (A) Репрезентативные кривые давления были получены с помощью катетера давления. (B) Правожелудочковое систолическое артериальное давление (RVSBP) и правожелудочковое конечное диастолическое давление (RVEDP). (C) Максимальная и минимальная скорость повышения давления RV (dp/dt max, dp/dt min). (D) Сократимость RV. (E) Экспоненциальная постоянная времени релаксации RV (τ). *P < 0,01 против фиктивная группа, n = 6 на группу (два независимых образца t-теста). Данные представлены в виде среднего ± SEM. RVI, инфаркт правого желудочка; РВП, давление в правом желудочке. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Гистологические результаты через 4 недели после RVI. (A) Снимки всего репрезентативного сердца из фиктивной и RVI группы (красный круг указывает на стенку инфаркта; шкала = 3 мм). (B) Отношение массы сердца к массе тела (HW/BW), P = 0,0536 между RVI и фиктивной группой. (C) Отношение длины HW к длине большеберцовой кости (HW/TL), P = 0,1682 между RVI и фиктивной группой. (D) Представить изображения окрашивания гематоксилин-эозином и окрашивания Массона срезов сердца (шкала бар = 3 мм). (E) Количественные результаты фиброза миокарда. (F) Репрезентативные снимки окрашивания Массона, показывающие выживаемость кардиомиоцитов в области инфаркта (правое изображение (шкала = 100 мкм) представляет собой увеличение ткани в левой коробке (шкала = 1 мм). * P < 0,01 против фиктивной группы, n = 6 на группу (два независимых образца t-теста). Данные представлены в виде среднего ± SEM. RVI, инфаркта правого желудочка. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Сикард и его коллеги из Франции впервые сообщили о мышиной модели RVI в 2019 году, которая описала хирургический процесс и сосредоточилась на взаимодействии между LV и RV после RVI9. Однако на сегодняшний день ни в одном исследовании не сообщалось об использовании этой модели для дальнейших исследований. Более подробная процедура была бы полезна для исследователей, чтобы использовать мышиную модель RVI для исследования. В отличие от отчета Sicard et al.9, мы предоставили пошаговую информацию для генерации моделей и стратегии контроля качества и дополнительно оценили анатомическое распределение RCA, гемодинамику RV и выживаемость кардиомиоцитов в области инфаркта. Недавний отчет показал, что кардиомиоциты в области инфаркта играют важную роль в регенерации миокарда23. Функция RV у пациентов с RVI восстанавливается спонтанно в течение 3-12 месяцев, даже без реперфузии16,24. Эти результаты свидетельствуют о том, что мышиная модель RVI поможет найти потенциальные терапевтические цели для правой сердечной недостаточности или регенерации сердца. Поэтому необходимо популяризировать модель.
Из-за невидимости RCA и вариации распределения RCA младшим операторам было бы трудно генерировать модели RVI со стабильными размерами инфаркта. Для преодоления этого ограничения рекомендуется контролировать уровень и диапазон перевязки и обеспечивать достаточное повышение ST-сегмента во II или III отведении ЭКГ. Наиболее важным шагом для успешного создания мышиной модели RVI является определение анатомической структуры RCA. Как показано на фиг.1А, мышиный RCA может содержать первичную или несколько параллельных артерий; таким образом, размер инфаркта зависит от того, сколько артерий заблокировано. Поэтому интраоперационно положение РКА может быть подтверждено по анатомическим характеристикам соседних правых предсердий и видимой вены. У мышей RVI обычно проявляется инфаркт миокарда в свободной стенке RV. Тем не менее, перегородка также может быть редко вовлечена, если септальная артерия происходит из RCA, как показано на рисунке 4D. Перегородка может орошаться у мышей собственной ветвью25 септальной коронарной артерии или ветвью RCA или LCA26,27. После лигирования RCA классическое изменение ЭКГ подъема сегмента ST в отведениях ЭЭГ II или III является золотым стандартом для оценки успеха RVI.
Поскольку дилатация RV, вызванная лигированием RCA, увеличит внутриперикардиальное давление, а затем ограничит сердечное наполнение, что приведет к усугублению гемодинамического расстройства 9,10, перикард должен быть разорван во время операции. В отличие от высокой частоты сердечных разрывов у мышей с перевязкой LCA, у мышей RVI разрыва сердца не наблюдалось. Тем не менее, хирургическая смертность из-за кровотечения и атриовентрикулярной блокады может достигать 50% для начинающих, чего можно избежать, уменьшив пронзительную глубину игольчатого шва и диапазон перевязки миокарда, понизив положение перевязки и щадящие манипуляции. Опытные технические специалисты в нашей лаборатории могут завершить генерацию модели мыши RVI примерно за 30 минут с показателем успеха 80-90%, рассчитанным по доле выживаемости мышей со значительным размером инфаркта. Об успешности операции судили по мгновенному подъему СЕГМЕНТА ST в свинце II или III ЭКГ после перевязки RCA, отрицательному окрашиванию миокарда TTC через1-й 24 ч после операции и дилатации RV, измеренной эхокардиографией через 3 дня или 1 неделю после операции. Повышение ST в отведениях ЭКГ нижней стенки и эхокардиографическое расширение RV через 3 дня после операции могут быть использованы в качестве критериев включения для исследований с использованием мышиной модели RVI.
В течение 4-недельного периода наблюдения в инфарктной области мышей RVI наблюдалось довольно много выживших кардиомиоцитов, что может быть разумной основой для регенеративных исследований. Ремоделирование RV и восстановление дисфункции через 4 недели не были отмечены после RVI в этой модели, предполагая, что эта модель также возможна для фундаментальных исследований по ремоделированию и недостаточности правого сердца.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана грантами Национального фонда естественных наук Китая (82073851 до Солнца) и Национального китайского постдокторского научного фонда (2021M690074 для Линь).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride | Sigma | T8877 | For TTC staining |
| Animal Mini Ventilator | Havard | Type 845 | For artificial ventilation |
| Animal ultrasound system VEVO2100 | Visual Sonic | VEVO2100 | Measurement for Doppler flow velocity and AS plaque |
| Batson’s #17 Anatomical Corrosion Kit | Polyscience Inc | 7349 | For vasculature casting |
| buprenorphine | Isoreag | 1134630-70-8 | For reduce the pain of mice after surgery |
| C57BL/6J mice + D29A1A2:D27 | Animal Center of South Medical University | - | For the generation of mouse RVI model |
| Camera | Sangnond | For taking photograph | |
| Cold light illuminator | Olympus | ILD-2 | Light for operation |
| electrocardiograph | ADI Instrument | ADAS1000 | For recording electrocardiogram |
| hair removal cream | Reckitt Benchiser | RQ/B 33 Type 2 | Remove mouse hair |
| Heat pad- thermostatic surgical system (ALC-HTP-S1) | SHANGHAI ALCOTT BIOTECH CO | ALC-HTP-S1 | Heating |
| Hematoxylin-eosin dye | Leagene | DH0003 | Hematoxylin-eosin staining |
| Heparin sodium salt | Macklin | H837056 | For heparization |
| Isoflurane | RWD life science | R510-22 | Inhalant anaesthesia |
| Lab made spatula | Work as a laryngoscope | ||
| Lab made tracheal cannula | For intubation | ||
| Matrx VIP 3000 Isofurane Vaporizer | Midmark Corporation | VIP 3000 | Anesthetization |
| Medical nylon suture (5-0) | Ningbo Medical Needle Co. | 5-0 | For chest close |
| Microsurgical elbow tweezers | RWD life science | F11021-11 | For surgery |
| Microsurgical scissors | NAPOX | MB-54-1 | For arteriotomy |
| Millar Catheter | AD Instruments, Shanghai | 1.0F | Measurement of pressure gradient |
| MS400D ultrasonic probe | Visual Sonic | MS400D | Measurement for Doppler flow velocity and AS plaque |
| needle forceps | Visual Sonic | F31006-12 | For surgery |
| nitroglycerin | BEIJING YIMIN MEDICINE Co | For dilating coronary artery | |
| Ophthalmic scissors | RWD life science | S11022-14 | For surgery |
| Pentobarbital sodium salt | Merck | 25MG | Anesthetization |
| PowerLab Multi-Directional Physiological Recording System | AD Instruments, Shanghai | 4/35 | Pressure recording |
| Precision electronic balance | Denver Instrument | TB-114 | Weighing scale |
| Silk suture (8-0) | Ningbo Medical Needle Co. | 6-0 | coronary artery ligation |
| Small animal microsurgery equipment | Napox | MA-65 | Surgical instruments |
| tissue forceps | Visual Sonic | F-12007-10 | For surgery |
| tissue scissor | Visual Sonic | S13052-12 | Open chest for hemodynamic measurement |
| Transmission Gel | Guang Gong pai | 250ML | preparation for Echocardiography measurement |
| Vascular Clamps | Visual Sonic | R31005-06 | For blocking blood from aorta |
References
- Rallidis, L. S., Makavos, G., Nihoyannopoulos, P. Right ventricular involvement in coronary artery disease: role of echocardiography for diagnosis and prognosis. Journal of the American Society of Echocardiography: Official Publication of the American Society of Echocardiography. 27 (3), 223-229 (2014).
- Frangogiannis, N. G. Fibroblasts and the extracellular matrix in right ventricular disease. Cardiovascular Research. 113 (12), 1453-1464 (2017).
- Ondrus, T., et al. Right ventricular myocardial infarction: From pathophysiology to prognosis. Experimental & Clinical Cardiology. 18 (1), 27-30 (2013).
- Badagliacca, R., et al. Right ventricular concentric hypertrophy and clinical worsening in idiopathic pulmonary arterial hypertension. The Journal of Heart and Lung Transplantation. 35 (11), 1321-1329 (2016).
- Verhaert, D., et al. Right ventricular response to intensive medical therapy in advanced decompensated heart failure. Circulation: Heart Failure. 3 (3), 340-346 (2010).
- Chen, K., et al. RNA interactions in right ventricular dysfunction induced type II cardiorenal syndrome. Aging (Albany NY). 13 (3), 4215-4241 (2021).
- Wang, Q., et al. Induction of right ventricular failure by pulmonary artery constriction and evaluation of right ventricular function in mice. Journal of Visualized Experiments. (147), e59431 (2019).
- Harjola, V. P., et al. Contemporary management of acute right ventricular failure: A statement from the heart failure association and the working group on pulmonary circulation and right ventricular function of the European society of cardiology. European Journal of Heart Failure. 18 (3), 226-241 (2016).
- Sicard, P., et al. Right coronary artery ligation in mice: a novel method to investigate right ventricular dysfunction and biventricular interaction. American Journal of Physiology: Heart and Circulatory Physiology. 316 (3), 684-692 (2019).
- Goldstein, J. A. Pathophysiology and management of right heart ischemia. Journal of the American College of Cardiology. 40 (5), 841-853 (2002).
- Stiermaier, T., et al. Frequency and prognostic impact of right ventricular involvement in acute myocardial infarction. Heart. 0, 1-8 (2020).
- Zehender, M., et al. Right ventricular infarction as an independent predictor of prognosis after acute inferior myocardial infarction. The New England Journal of Medicine. 328 (14), 981-988 (1993).
- Brodie, B. R., et al. Comparison of late survival in patients with cardiogenic shock due to right ventricular infarction versus left ventricular pump failure following primary percutaneous coronary intervention for ST-elevation acute myocardial infarction. The American Journal of Cardiology. 99 (4), 431-435 (2007).
- Konstam, M. A., et al. Evaluation and management of right-sided heart failure: A scientific statement from the american heart association. Circulation. 137 (20), 578-622 (2018).
- Leferovich, J. M., et al. Heart regeneration in adult MRL mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (17), 9830-9835 (2001).
- Dell'Italia, L. J., et al. Hemodynamically important right ventricular infarction: Follow-up evaluation of right ventricular systolic function at rest and during exercise with radionuclide ventriculography and respiratory gas exchange. Circulation. 75 (5), 996-1003 (1987).
- Friedberg, M. K., Redington, A. N. Right versus left ventricular failure: differences, similarities, and interactions. Circulation. 129 (9), 1033-1044 (2014).
- Haraldsen, P., Lindstedt, S., Metzsch, C., Algotsson, L., Ingemansson, R. A porcine model for acute ischaemic right ventricular dysfunction. Interactive Cardiovascular and Thoracic Surgery. 18 (1), 43-48 (2014).
- Ren, L., Colafella, K. M. M., Bovée, D. M., Uijl, E., Danser, A. H. J. Targeting angiotensinogen with RNA-based therapeutics. Current Opinion in Nephrology and Hypertension. 29 (2), 180-189 (2020).
- Hacker, T. A. Animal models and cardiac extracellular matrix research. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1098, 45-58 (2018).
- Chien, T. M., et al. Double right coronary artery and its clinical implications. Cardiology in the Young. 24 (1), 5-12 (2014).
- Zhu, Y., et al. Characterizing a long-term chronic heart failure model by transcriptomic alterations and monitoring of cardiac remodeling. Aging (Albany NY). 13 (10), 13585-13614 (2021).
- Cui, M., et al. Nrf1 promotes heart regeneration and repair by regulating proteostasis and redox balance. Nature Communications. 12 (1), 5270 (2021).
- Meyer, P., et al. Effects of right ventricular ejection fraction on outcomes in chronic systolic heart failure. Circulation. 121 (2), 252-258 (2010).
- Dunmore-Buyze, P. J., et al. Three-dimensional imaging of the mouse heart and vasculature using micro-CT and whole-body perfusion of iodine or phosphotungstic acid. Contrast Media & Molecular Imaging. 9 (5), 383-390 (2014).
- Fernández, B., et al. The coronary arteries of the C57BL/6 mouse strains: Implications for comparison with mutant models. Journal of Anatomy. 212 (1), 12-18 (2008).
- Zhang, H., Faber, J. E. De-novo collateral formation following acute myocardial infarction: Dependence on CCR2+ bone marrow cells. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 87, 4-16 (2015).
