Summary
我们描述了一种实时检测和捕获侵袭性细胞亚群的方法。实验设计使用实时细胞分析,通过监测细胞电阻抗的变化。可以捕获复杂组织中的浸润性癌症,免疫,内皮或基质细胞,并且可以评估共培养物的影响。
Abstract
癌细胞的侵袭和转移扩散是癌症死亡的主要原因。早期开发的用于测量癌细胞群侵袭潜力的测定通常产生单一终点测量,不区分具有不同侵袭潜力的癌细胞亚群。此外,肿瘤微环境由不同的常驻基质和免疫细胞组成,这些细胞改变和参与癌细胞的侵袭行为。侵入组织在免疫细胞亚群中也起作用,在组织重塑和血管生成期间抵御微生物或从薄壁和内皮细胞中消除患病细胞。实时细胞分析(RTCA)利用阻抗生物传感器来监测细胞侵袭是超越侵袭终点测量的重要一步:这提供了随时间推移的连续测量,因此可以揭示终点测定中丢失的侵袭率的差异。使用目前的RTCA技术,我们通过添加另一个可以包含基质和/或免疫细胞的腔室来扩展双室阵列,并允许随着时间的推移测量在共培养基质或免疫细胞分泌因子的影响下的侵袭速率。除此之外,独特的设计允许随时分离腔室并分离最具侵入性的癌细胞,或存在于测试的肿瘤分离物的异质混合物中的其他细胞亚群。这些最具侵袭性的癌细胞和其他细胞亚群推动恶性进展为转移性疾病,其分子特征对于深入的机理研究,用于检测它们的诊断探针的开发以及脆弱性的评估非常重要。因此,小分子或大分子药物的纳入可用于测试靶向癌症和/或基质细胞亚群的疗法的潜力,目的是抑制(例如,癌细胞)或增强(例如,免疫细胞)侵袭行为。
Introduction
细胞侵袭是一个重要的过程,它允许细胞根据基质细胞提供的环境线索穿过基底膜屏障。它是免疫反应、伤口愈合、组织修复和恶性肿瘤发展的几个阶段的关键步骤,这些肿瘤可以从局部病变进展为浸润性和转移性癌症1。早期开发的用于测量细胞群侵入潜力的测定通常产生单个终点测量或需要对侵入性细胞进行预标记2。现在开发了微电子学和微流体技术的集成,以使用微电极上活细胞的电阻抗来检测细胞生物学的不同方面,例如活力,运动和附着力3,4。阻抗测量允许对细胞状态进行无标记、无创和定量评估3.在这里,我们描述了一个基于Abassi等人开发的实时蜂窝分析(RTCA)系统设计的三腔阵列。三腔阵列允许评估共培养细胞的细胞侵袭和侵袭细胞的恢复,以进行额外的分析或扩增。
在细胞分析仪系统中,细胞通过包被到多孔膜上的细胞外基质侵入,并到达位于屏障另一侧的叉指电极阵列。随着侵入细胞继续附着并占据该电极阵列,电阻抗平行变化。目前的系统包括一个细胞侵袭和迁移(CIM)16孔板,带有两个腔室。RTCA-DP(双用途)(以下称为双用途电池分析仪)仪器包含用于阻抗测量的传感器和用于分析和处理阻抗数据的集成软件。基线阻抗值取决于孔中介质的离子强度,并且随着细胞附着在电极上而变化。阻抗的变化取决于细胞的数量,它们的形态以及细胞附着在电极上的程度。在添加细胞之前用培养基测量孔被认为是背景信号。在电池附着并扩散到电极上达到平衡后,从阻抗测量中减去背景。电极上称为细胞指数(CI)的电极状态的无单位参数计算如下:CI =(平衡后的阻抗 -无电池时的阻抗)/标称阻抗值6。当比较不同细胞系的迁移速率时,Delta CI可用于比较细胞状态,而不管前几次测量中表示的附着差异如何。
新设计的三腔室阵列建立在现有设计的基础上,并使用包含电极的双用途细胞分析仪系统的顶部腔室。改进的中腔室和底部腔室经过调整,可将组件安装到双用途单元分析仪中,以便使用集成软件进行阻抗测量和分析。与现有的双室CIM板(以下称为细胞分析仪板)相比,新设计提供的两个主要进步是:i)恢复能力,然后分析存在于异质细胞混合物中的侵入性细胞亚群,以及ii)评估共培养基质或免疫细胞分泌因子对细胞侵袭的影响的选项(图1)。
该技术可用于研究具有不同侵入能力的细胞亚群。这包括(a)侵入周围组织或血液和淋巴管或在远处器官的转移接种部位外渗的侵袭癌细胞,(b)来自免疫系统的细胞侵入组织以处理病原体或患病细胞,(c)内皮细胞在组织重组或伤口愈合期间侵入组织以形成新血管, 以及来自肿瘤微环境的(d)基质细胞,它们与癌细胞一起支持和入侵。该方法允许包含可以调节细胞运动和侵袭的基质串扰。这里显示的可行性研究使用这种专注于癌细胞侵袭和与基质相互作用的修饰阵列作为模型系统,包括内皮侵袭以响应来自癌细胞的差异信号。可以推断出这种方法来分离癌细胞和其他细胞类型,例如免疫细胞,成纤维细胞或内皮细胞的亚群。我们测试了侵入性和非侵入性已建立的乳腺癌细胞系作为原理证明。我们还使用来自患者来源的异种移植物(PDX)侵袭的细胞来响应来自人类骨髓的免疫细胞,以显示未来在临床诊断环境中使用的可行性。PDX是植入免疫功能低下或人源化小鼠模型中的患者肿瘤组织,以允许研究原始患者的生长,进展和治疗方案7,8。
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Protocol
该研究被乔治城大学机构审查委员会审查并认为是“豁免”(IRB # 2002-022)。新鲜收获的骨髓组织是从废弃的健康人类骨髓收集过滤器中收集的,这些过滤器已被去识别化。
1. 新的腔室设计(图2)
- 打开新的双室细胞分析仪板。将带有电极的顶部腔室放在一边。
- 使用铣床,剃掉细胞分析仪板的U形底孔的2毫米。
- 使用紫外线固化粘合剂将孔径为0.2μm的2 cm x 7 cm聚醚砜(PES)膜连接到刨孔的底部。等待30分钟的腌制时间,以确保胶水完全固化和惰性。
- 使用铣床,沿侧面切出两个纵向狭缝(1.5 mm x 5.6 mm),以卡入新制造的第三腔室的脊中。
- 使用铣床,创建第三个聚碳酸酯室,复制细胞分析仪板的整体尺寸;72 毫米 x 18 毫米(材料表)。
- 创建深 4.8 mm、直径 4.75 mm 的孔,以复制细胞分析仪板的 16 孔设计。这允许每孔90μL体积。
- 在侧面,创建两个三角形脊,以便腔室锁定在步骤1.4中创建的原始狭缝中。三角形的水平部分为1.5 mm,垂直为1.4 mm,斜边为2.052 mm。
- 在直径为50.8 mm,高度为1.397 mm的短边上创建一个旋钮,以适合原始板的凹口(图2,中间)。
- 对每个孔使用0.9毫米厚的橡胶垫圈,以提供密封配合。
2. 细胞培养(MDA-MB-231、DCIS、DCIS-Δ4、J2-成纤维细胞)
- 用1x磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤贴壁细胞培养物(约70%汇合)。
- 加入0.05%胰蛋白酶- EDTA溶液以去除细胞。
- 用含有血清的细胞培养基中和胰蛋白酶溶液,并使用细胞悬浮液的等分试样计数细胞。
注:具体的细胞培养基可在 表1中找到。
3. 患者源性异种移植物解离
- 使用无菌手术刀将新鲜的肿瘤块(1 cm2)切成细糊状。
- 放入 50 mL 锥形管中,加入 20 mL DMEM F12 培养基,并补充 3 mg/mL 胰蛋白酶和 2 mg/mL 胶原酶。
- 在37°C的热振荡器(150 RPM)中孵育20分钟。
- 将管以500× g 旋转5分钟;除去上清液。
- 加入20μLDMEM F12 + 2%FBS洗涤细胞;以300× g 旋转5分钟并除去上清液。再重复洗涤两次。
- 重悬于1 mL PDX培养基(表1)中以计数细胞。
4. 骨髓细胞提取
- 用 25 mL 1x PBS 冲洗骨髓 (BM) 收集过滤器。
注意:在这项研究中,PBS被添加到医院使用的BM收集过滤器中,以收集过滤器中剩余的BM。 - 将冲洗的BM缓慢加入具有25 mL密度梯度介质的50 mL锥形管中,注意保持层尽可能分离。
- 在18°C下以800 x g 旋转20分钟
- 离心后虹吸掉顶层(脂肪/血浆),并将具有BM细胞的密度梯度培养基上方的5 mL白色层转移到15 mL锥形管中。
注意:或者,将5 mL移液器浸入顶层,直到它接触到中间层(BM),然后非常缓慢地移出中间层,而无需移动移液器。 - 在15 mL锥形管中填充1x PBS(约10 mL),并以300 x g旋转 15分钟。
- 除去上清液;剩下的白色颗粒是BM。
- 如果在沉淀中观察到红细胞,则加入5mL红细胞裂解溶液(材料表),并使其在室温(RT)下静置5分钟。以300× g 旋转5分钟并除去上清液。
- 加入10mL1x PBS洗涤细胞,以300× g 旋转5分钟并除去上清液。重复红细胞裂解(步骤4.7),直到沉淀变白。
5. 细胞接种和组装
- 将所有三个无菌室放在组织培养罩中。
- 找到下腔室短边的旋钮。调整下腔室的方向,使旋钮面向实验者。
- 将90μL培养基中的30,000-50,000个细胞加入下腔室的每个孔中。避免形成气泡。这些是基质细胞,它们将提供分泌因子,但不会被顶部腔室的电极检测到。
- 在两个下腔室孔中使用5%胎牛血清补充培养基作为细胞运动的积极对照。使用0%血清补充培养基作为阴性对照。
- 让带有细胞的下腔室在罩中静置10-15分钟以沉降。
注意:如果细胞粘附或在悬浮液中生长,建议使用此步骤。 - 将下腔室旋转90°,并将中间腔室放在顶部,以便下腔室上的旋钮滑入中间腔室的凹口。
注:下腔室上的旋钮和中间腔室上的蓝点位于组件的两端。 - 垂直向下推,直到从组件的每个长边都能听到咔嗒声。
- 向中间腔室的所有孔中加入160μL无血清培养基。
- 确保在填充孔后可以看到圆顶形的半月板;否则,根据移液器校准调整最终体积。避免形成气泡。
- 将电极朝下放在中间腔室的顶部腔室中,确保将中间和顶部腔室上的蓝点对齐。
- 垂直向下推,直到从组件的每个长边都能听到咔嗒声。
- 向顶部腔室中加入25-50μL无血清培养基。
- 将组件安装在组织培养箱中的双用途细胞分析仪上,等待30分钟,然后再测量背景。
注意:这个时间对于平衡阵列是必要的,可用于制备要添加到顶部腔室的细胞系。 - 测量背景(见第6节)并将组件放回组织培养罩中。
- 在100μL无血清培养基中加入30,000-50,000个细胞到顶部腔室的每个孔中。这些是电极在成功通过膜迁移后将检测到的细胞。
注意:为了达到最大反应,建议在进行测定之前在无血清或低血清培养基中培养细胞6-18小时。 - 让组件在引擎盖中放置30分钟,然后安装在用于阻抗测量的双用途电池分析仪上。
6. 背景和阻抗测量
- 将阵列放入两用细胞分析仪仪器的底座中。
- 打开细胞分析仪软件,然后选择要使用的底座。
- 单击“ 消息 ”选项卡,确保其显示 “连接确定” ,以确保阵列放置在底座中,并且电极与传感器对齐良好。
- 单击“ 实验注释 ”选项卡,并尽可能多地填写有关实验的信息。
- 单击 布局 选项卡,然后填写数组布局的描述。
- 单击“ 计划 ”选项卡,然后从“步骤”菜单中添加两 个步骤 ;一个背景步骤(一次扫描)和一个测试步骤,100次扫描 - 每15分钟一次扫描,总计25小时。
- 将阵列放入两用细胞分析仪培养箱中30分钟后,单击“ 播放 ”按钮开始后台测量。将弹出一个窗口,要求选择用于保存数据的文件夹。
- 背景测量完成后,从底座上取下阵列并将其放回细胞培养罩中。
- 如步骤5.13所述将细胞加入顶部腔室,并将组件保持在组织培养罩中30分钟以使细胞沉降。
- 将数组放回双用途单元分析器中,然后检查“ 消息 ”选项卡中的“ 连接正常” 消息。
- 单击“ 播放 ”按钮开始阻抗测量。
- 单击“ 绘图 ”选项卡以监视信号的进度。
- 如果在 25 小时之前到达端点,请单击执行下拉菜单中的中止步骤。
- 若要导出数据,请右键单击图形,选择“以列表格式 复制” ,然后将数据粘贴到电子表格中。
注意:数据可以导出为单元格索引或增量单元格索引。还可以选择图形和/或布局信息进行导出。
7. 分离和细胞收集
- 在双用途细胞分析仪上实时监测迁移速率,以确定停止兴趣点(6-18小时)。
注意:停止点取决于细胞的侵袭率以及何时获得来自阴性对照的明显侵袭信号。 - 完成后,从两用细胞分析仪上卸下组件并将其放入组织培养罩中。
- 准备适当数量的1.5mL微量离心管,以从感兴趣的孔中收集细胞。
- 将组件放在10厘米的培养皿中,以便在腔室分离时容纳液体。
- 将中间腔室长边上的柔性卡扣端向内推,直到听到咔嗒声。
- 拆卸顶部腔室并将其倒置成新的10厘米盘。
- 使用带有13毫米刀片的细胞提升器从具有相同实验条件(即细胞类型,药物治疗等)的所有孔中收集细胞。
注意:将设置设计为每个实验条件至少有两个孔,以实现阴性对照的统计显着变化。 - 将刀片冲洗或浸入1x磷酸盐缓冲盐水中,以将细胞收集在1.5mL微量离心管中。
- 以500× g 旋转细胞5分钟。
- 繁殖收集的细胞(见第8节)或进行终点分析,如单细胞RNA-seq。
注意:对于本体RNA-seq,请使用低细胞数RNA提取试剂盒。
8.3D细胞繁殖和检索
注意:由于收集的细胞数量很少,因此使用细胞外基质(ECM)以3D方式接种细胞以增强活力。也就是说,在这一点上,2D培养也是一种选择,特别是如果使用的细胞来自已建立的细胞系。
- 在4°C下解冻基底膜基质的等分试样过夜。将基底膜基质保持在冰上,直到准备使用。
- 向收集的活细胞沉淀中加入25μL冷基底膜基质,并轻轻上下移液以混合。避免形成气泡。
- 将细胞 - 基底膜基质混合物加入小组织培养孔的底部(即,在96孔板中),形成圆顶。尽量不要触摸井壁。在37°C下孵育20分钟,然后轻轻地滴加100μL培养基。
- 为了检索细胞,吸出培养基并向每个孔中加入100μL分散酶。
- 在室温下孵育10分钟,偶尔上下移液。
- 将细胞和溶解的基底膜基质转移到1.5mL微量离心管中。加入1mL 1x PBS,以300× g 旋转5分钟,并除去上清液。重复洗涤一次。
- 吸出上清液。拆分沉淀中的细胞或执行终点分析。
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Representative Results
使用新设计的三腔阵列,在存在或不存在基质细胞(如成纤维细胞)的情况下测试细胞的侵袭。当辐照的瑞士3T3成纤维细胞(J2菌株)接种在底部腔室中时,MDA-MB-231细胞侵袭增强,允许两个细胞系之间的因子交换。有趣的是,当3T3-J2细胞数量增加一倍时,MDA-MB-231入侵增加(图3A)。另一方面,MCFDCIS细胞侵入性克隆(DCIS-Δ4)9 的侵袭率似乎受到与3T3-J2细胞串扰的抑制(图3B)。该数据显示了三腔阵列的有用应用,以测量基质(在这种情况下为成纤维细胞)对细胞侵袭的不同影响。
接下来,为了监测内皮细胞运动和侵袭性的变化,以响应来自侵袭性(MDA-MB-231)10,11 或非侵袭性(DCIS)12 癌细胞的信号,使用代表血管壁内皮细胞的人脐静脉内皮细胞(HUVECs)。HUVECs对MDA-MB-231细胞分泌的因子的反应更具侵入性,这与DCIS细胞分泌的因子不同(图4)。这与侵袭性肿瘤招募内皮细胞用于血管形成并随后扩散到循环中的能力一致。
上述数据证明了细胞分析仪系统监测细胞系不同侵袭率的能力;当入侵开始时,进展和高原。这允许用户选择感兴趣的时间点,例如,在入侵的第一个2-3小时之后,捕获启动入侵的先驱细胞,并且与随后通过集体入侵入侵的追随者细胞不同。
虽然上述数据证明了在共培养环境中使用三腔阵列观察侵袭的可靠原理,但我们想测试该阵列在临床和诊断环境中的潜在可用性。为此,监测了患者来源的异种移植物(PDX)8 与来自人类骨髓样品的免疫细胞共培养的细胞悬浮液的侵袭。将总人骨髓免疫细胞(BM)接种到底部腔室中,有或没有血清。PDX细胞从顶部腔室侵袭增加,以响应共培养的BM免疫细胞(图5)。有趣的是,BM细胞底部腔室中存在2%的血清对于PDX侵袭至关重要。
图1:细胞侵袭监测和细胞收集系统的工作流程。 (A)将基质细胞添加到安装在中间室的底部室中,该室用作细胞屏障,仅可渗透可溶性因子。(B)带有阻抗生物传感器的顶部腔室接收要监测的细胞系。记录实时入侵,直到达到用户定义的细胞收集时间点。(C)拆卸的顶部腔室倒置,使用细胞提升器收获细胞。 请点击此处查看此图的大图。
图 2:阵列腔室和修改的图像。 (A) 用于构建阵列的三个腔室。对装有电极的顶部腔室没有进行任何修改。(B)从中间的腔室井中,剃掉了2毫米的高度,并在开口底部附着一层膜;在每侧添加纵向狭缝(1.5 mm x 5.6 mm)。(C) 下腔室(72 mm x 18 mm)为复制16孔设计而制造;孔深4.8毫米,直径4.75毫米,沿侧面添加三角形脊(1.5毫米水平x垂直1.4毫米)以卡入中室狭缝。 请点击此处查看此图的大图。
图3:共培养的成纤维细胞对癌细胞侵袭的影响。(A)MDA-MB-231细胞侵袭的实时细胞分析,单独或与3T3-J2成纤维细胞共培养(底室)。将3T3-J2成纤维细胞以每孔30,000或60,000个细胞接种。(B)DCIS-Δ4细胞侵袭的实时细胞分析,单独或与3T3-J2成纤维细胞共培养(底室)。实心圆表示均值;细虚线表示标准差。请点击此处查看此图的大图。
图4:癌细胞对内皮细胞侵袭的影响。 单独与侵入性MDA-MB-231细胞(底部室)或非侵入性DCIS细胞(底部室)共培养的HUVEC侵袭的实时细胞分析。实心圆表示均值;细虚线表示标准差。增量像元指数归一化为阻抗时 = 1 h. 请点击此处查看此图的放大版本。
图5:与骨髓免疫细胞共培养的患者来源的异种移植物(PDX)的细胞侵袭。 从PDX(上腔室)分解的单细胞与人骨髓细胞(底部腔室)共培养,并在存在或不存在血清的情况下监测其侵袭。实心圆表示均值;细虚线表示标准差。在时间 = 1 小时和 36 分钟时归一化为阻抗的 Delta 像元指数 。请点击此处查看此图的放大版本。
媒体 | 成分 | 浓度/比例 |
MDA-MD-231 介质 | 断续器 | |
胎牛血清 | 10% | |
J2 成纤维细胞培养基 | 断续器 | |
胎牛血清 | 10% | |
DCIS 媒体 | 双层 F12 | |
马血清 | 5% | |
表皮生长因子 | 20纳克/毫升 | |
胰岛素 | 10微克/毫升 | |
氢化可的松 | 0.5微克/毫升 | |
霍乱毒素 | 100纳克/毫升 | |
PDX 介质 | 双层 F12 | |
胎牛血清 | 2% | |
赫皮斯 | 1 米 | |
胰岛素转铁蛋白硒乙醇胺(ITS) | 10微克/毫升 | |
氢化可的松 | 0.5微克/毫升 | |
牛血清白蛋白 | 1毫克/毫升 |
表1:细胞培养基组成。 下表列出了MDA-MD-231培养基,J2成纤维细胞培养基,DCIS培养基和PDX培养基的组成。
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Discussion
我们修改了双腔室阵列的设计,以包括第三个腔室,用于在基质细胞存在的情况下实时监测细胞侵袭。我们已经观察到共培养成纤维细胞对侵袭性和非侵袭性癌细胞的不同影响,这表明该阵列可用于区分对共培养基质细胞产生的因子反应不同的癌细胞亚群。该阵列还用于监测内皮细胞侵入基质组织,这是血管在存在具有不同侵袭潜力的癌细胞的情况下向血管生成刺激萌发的关键步骤。这些实验表明,该阵列可用于癌细胞或其他细胞分离。
建议优化要添加到每个腔室的细胞数量。根据我们的经验和制造商的建议,30,000-50,000个细胞是最佳的。由于可以在该阵列中共培养两种细胞类型,其中一种可能是基质细胞的原代培养物,因此建议监测不同培养基对用于维持活力的细胞的影响。我们发现,待监测细胞的饥饿减少了重复之间的变异。如果无血清生长条件对细胞有害,则可以使用低血清和较短的饥饿时间。添加低血清量(1%-2%)对于底室中基质细胞(原代细胞)的存活至关重要,但请确保包括适当的控制条件以进行数据解释(即,2%血清有和没有基质细胞)。如果侵袭率低,则每个实验条件下的更多孔可以增加为下游分析收集的活细胞数量。在分析患者活检时,在细胞分析仪板上进行测试之前,组织分解成单细胞至关重要。优化崩解条件以维持细胞活力是进行侵袭分析之前的重要步骤。还可以研究侵袭的其他方面,例如对药物治疗的敏感性或细胞外基底基质(ECM)成分对侵袭率的影响。ECM是微环境的重要组成部分,并且据报道在细胞侵袭期间起主要作用13。一些已发表的研究已经使用ECM在添加侵入细胞之前涂覆顶部腔室以监测它们与各种ECM组分的相互作用14,15。三腔阵列是研究侵袭细胞和基质细胞之间共培养相互作用的有用工具。虽然所提出的设计保证了没有任何基质细胞的侵袭细胞特异性细胞收集,但如果细胞之间的串扰需要不同细胞类型的物理相互作用,这种设置可能不是最佳的。此外,在悬浮液中生长的非贴壁细胞可能不会在这里提出的方法(报废)中收集,但是另一种方法,其中可以收集包含非贴壁细胞的拆卸室中的培养基以收获非贴壁细胞。
虽然该阵列可用于监测基质成分存在下细胞侵袭的多个研究领域,但在这里我们专注于癌细胞侵袭以及这种方法如何发现异质生物样品中存在的恶性癌细胞亚群。这里使用的三腔阵列的新容量提供了一种功能测定,可以从含有更多和更少侵袭性癌细胞的异质癌细胞混合物中分离出侵袭性亚群。分析侵袭性和与结果相关的癌细胞亚群对于适当的机理研究和分子见解至关重要,这些见解无法通过分析混合细胞群获得或偏倚。基质细胞的共培养室提供了在进展为侵袭性疾病期间肿瘤微环境中的细胞 - 细胞串扰的见解。
作为应用于组织样品的一步,例如,来自患者的肿瘤活检,我们使用从患者来源的肿瘤异种移植物(PDX)中分离出的癌细胞,并测试人类骨髓细胞对肿瘤细胞侵袭的影响。我们能够收集PDX中存在的侵入细胞进行下游分析,即RNA-seq。PDXs测定是分析从患者处获得的肿瘤活检中癌细胞异质混合物中存在的细胞亚群的第一步。最终目标是使用这种肿瘤活检并分离癌细胞亚群,这些癌细胞侵入并因此由于其转移扩散的可能性而导致不良结果。识别分子特征并测试这些侵入性亚群对药物治疗的敏感性是未来的应用。
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Disclosures
乔治城大学申请了与本手稿中描述的一些方法相关的专利。G.M.S,A.W,L.D和M.P在此申请中被指定为发明人,并声明为潜在的利益冲突。
Acknowledgments
我们要感谢犹他大学亨斯迈癌症研究所的Alana Welms博士为我们提供患者来源的异种移植物(HCI-010)。这项工作得到了NIH拨款R01CA205632,R21CA226542的支持,部分得到了安捷伦科技公司的资助。
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
0.05% Trypsin-EDTA | Thermofisher | 25300-054 | |
Adhesive | Norland Optical Adhesive | NOA63 | |
Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A9418 | |
Cell lifter | Sarstedt | 83.1832 | |
Cholera Toxin from Vibrio cholerae | Thermofisher | 12585-014 | |
CIM-plate | Agilent | 5665817001 | Cell analyzer plate |
Collagenase from Clostridium histolyticum | Sigma | C0130 | |
Dispase | StemCell | 7913 | |
DMEM | Thermofisher | 11995-065 | |
DMEM-F12 | Thermofisher | 11875-093 | |
Fetal Bovine Serum (FBS), Heat Inactivated | Omega Scientific | FB-12 | |
HEPES | Thermofisher | 15630106 | |
Horse serum (HS) | Gibco | 16050-122 | |
Human EGF | Peprotech | AF-100-15 | |
Human umbilical Vein endothelail cells (HUVEC) | LONZA (RRID:CVCL_2959) | C-2517A | |
HUVEC media | LONZA | CC-3162 | |
Hydrocortisone | Sigma | H4001 | |
Insulin Transferrin Selenium Ethanolamine (ITSX) (100x) | Thermofisher | 51500056 | |
Insulin, Human Recombinant, Zinc Solution | Sigma | C8052 | |
J2 Fibroblasts | Stemcell (RRID:CVCL_W667) | 100-0353 | |
LymphoPrep | Stemcell | 7851 | Density gradient medium for the isolation of mononuclear cells |
Matrigel | Corning | 354230 | Basement membrane matrix |
MCFDCIS.com cells ( DCIS) | RRID:CVCL_5552 | ||
MDA-MB-231 cells | RRID:CVCL_0062 | ||
Milling machine | Bridgeport Series 1 Vertical | ||
Phosphate-buffered saline (1x) | Thermofisher | 10010049 | |
Polyethersulfone (PES) membrane | Sterlitech | PCTF029030 | |
RBC lysis solution | Stemcell | 7800 | |
RNeasy Micro Kit | Qiagen | 74004 | |
RTCA DP analyzer | Agilent | 3X16 | Dual purpose cell analyzer |
Trypsin | Sigma | T4799 |
References
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