Summary
3D 오가노이드 배양물을 확립하기 위해 송곳니 장 및 간 조직으로부터 성체 줄기 세포를 수확하는 실험 방법이 기재되어 있다. 또한, 일관된 성장을 보장하고 수확, 바이오 뱅크 및 개 장 및 간 오가노이드 배양을 부활시키기위한 표준 운영 절차를 제공하기위한 실험실 기술이 논의됩니다.
Abstract
개는 염증성 질환, 대사성 질환 및 암을 포함하여 인간과 유사한 복잡한 다인자 질환을 발병합니다. 따라서 그들은 인간 의학에 대한 번역 잠재력을 가진 관련 대형 동물 모델을 대표합니다. 오가노이드는 3차원(3D), 그들의 기원 기관의 미세해부학 및 생리학을 모방하는 줄기세포로부터 유래된 자기조립 구조이다. 이러한 번역적 시험관내 모델은 약물 투과성 및 발견 응용, 독성학 평가, 및 다인자성 만성 질환의 병태생리학에 대한 기계론적 이해를 제공하기 위해 사용될 수 있다. 또한, 송곳니 오가노이드는 반려견의 삶을 향상시켜 수의학 연구의 다양한 분야에 대한 의견을 제공하고 수의학에서 개인화 된 치료 응용 프로그램을 촉진 할 수 있습니다. 소그룹의 기증자는 오가노이드 샘플의 바이오 뱅크를 만들 수 있으며, 오가노이드 세포주가 무기한으로 계대 배양 될 수 있기 때문에 지속적인 조직 수확의 필요성을 줄일 수 있습니다. 본원에서, 성체 줄기 세포로부터 유래된 장 및 간 송곳니 오가노이드의 배양에 초점을 맞추는 세 가지 프로토콜이 제시된다. 송곳니 오가노이드 분리 프로토콜은 조직을 처리하고 세포를 지지하는 매트릭스 (가용화 된 세포외 막 매트릭스)에 격리하는 방법을 설명합니다. 송곳니 오가노이드 유지 보수 프로토콜은 확장을위한 적절한 타이밍과 함께 청소 및 통과를 포함하여 오가노이드 성장 및 유지 보수를 설명합니다. Organoid Harvesting and Biobanking Protocol은 추가 분석을 위해 오가노이드를 추출, 동결 및 보존하는 방법을 설명합니다.
Introduction
설치류는 생물 의학 및 번역 연구에 가장 일반적으로 사용되는 동물 모델입니다1. 그들은 만성 다인자 질환에 대한 임상 적 관련성이 최근에 의문을 제기하고 있지만, 질병의 기본 분자 병인을 조사하는 데 매우 유용합니다2. 송곳니 모델은 설치류와 비교하여 몇 가지 장점을 나타냅니다.3,4. 개와 인간은 가축화의 다양한 기간 동안 인간의 식단 섭취로 인해 개발 된 대사체학 및 장내 미생물의 유사성을 공유합니다5,6,7. 송곳니와 인간의 위장 해부학 및 생리학 사이의 유사성은 또 다른 예입니다8.
또한, 개들은 종종 주인과 비슷한 환경과 생활 방식을 공유합니다9. 설치류에 비해 개들의 수명이 길수록 수많은 만성 질환의 자연 발달이 가능합니다10. 염증성 장 질환 또는 대사 증후군은 인간과 개 사이에 중요한 유사성을 공유하는 다인자성 만성 질환의 예이다11,12. 자연적으로 발생하는 질병을 앓고있는 개를 포함하는 송곳니 전임상 시험은 설치류 모델에서 얻은 것보다 더 신뢰할 수있는 데이터를 생성 할 수 있습니다13. 그러나, 살아있는 동물 연구의 사용을 최소화하고 3Rs(Reduce, Refine, Replace)14의 원칙을 준수하기 위해, 3D 시험관내 송곳니 오가노이드를 이용한 생체내 시험에 대한 대안이 등장하였다15.
오가노이드는 원래 장기의 생리학 및 미세 해부학을 재구성하는 자체 조립 된 3D 줄기 세포 유래 구조입니다16,17. 이 기술은 200917 년 Sato et al.에 의해 처음 기술되었으며 2D 암 세포 배양물을 사용하여 이전에 가능했던 것보다 상피 세포주에서 더 많은 번역 가능한 시험관 내 연구를 허용했습니다18,19,20. 오가노이드는 전임상 독성학21,22,23, 흡수 또는 대사 연구 24,25,26,27,28뿐만 아니라 개인화 된 의학적 접근법과 같은 많은 생물 의학 분야에서 시험관 내 모델에서 유용합니다.29,30,31 . 송곳니 장 오가노이드의 성공적인 배양은 201912 년에 처음으로 기술되었으며, 개에서 유래 한 간 오가노이드는 201532 년 Nantasanti et al.에 의해 처음보고되었습니다. 송곳니 오가노이드는 이후 송곳니 만성 장병증, 위장관 기질 종양, 대장 선암종12 및 윌슨병33,34를 조사하는 연구에 성공적으로 사용되었습니다.
성체 줄기 세포는 부검을 통해 수확 될 수 있지만, 오가노이드 기술은 항상 동물을 희생 할 필요는 없습니다. 내시경 및 복강경 생검, 또는 심지어 장기의 미세바늘 흡인물35은 상피 오가노이드 분리를 위한 성체 줄기 세포의 실행 가능한 공급원이다12. 수의학 실습에서 이러한 비 침습적 기술의 광범위한 사용은 역 번역 연구 (수의학 임상 실습에서 인간 임상 실습으로 또는 그 반대의 경우도 마찬가지)를위한 옵션을 용이하게합니다 15. 오가노이드 기술의 발전은 오가노이드 배양 및 유지 보수 방법의 표준화에 의해 보장 될 수 있습니다. 여기에 제시된 오가노이드 프로토콜은 부분적으로 201536 년 Saxena et al.의 이전에 발표 된 연구를 기반으로하며, 방법은 송곳니 장 및 간 오가노이드 배양의 특이성에 맞게 조정되었습니다. 송곳니 오가노이드 프로토콜의 전체 워크플로우는 그림 1에 묘사되어 있습니다.
송곳니 오가노이드 분리 프로토콜은 내시경, 복강경 및 외과 생검 및 부검에서 샘플을 얻는 방법을 소개합니다. 그것은 실험실로 수송하는 데 사용되는 조직 샘플과 방법론의 초기 전처리를 설명합니다. 오가노이드 분리에 필요한 재료 및 시약은 '분리 준비'섹션에 요약되어 있습니다. 조직 샘플로부터 성체 줄기세포를 분리하는 과정은 추가로 상세히 설명된다. 마지막으로, 가용화된 세포외 막 매트릭스를 사용하여 오가노이드를 돔형 구조로 도금하는 과정이 논의된다.
두 번째 프로토콜 인 Canine Organoid Maintenance Protocol은 오가노이드를 문서화하고 배양하는 방법을 설명합니다. 미디어 변경 사항 및 빈도에 대해서는 이 섹션에서 설명합니다. 또한, 3D 송곳니 오가노이드의 성공적인 유지를 보장하는 데 필수적인 세포 배양물을 통과 및 청소하는 것과 같은 실험실 절차가 설명됩니다. 적절한 통과는 프로토콜의 중요한 단계이며,이 단계의 가능한 조정 및 문제 해결은 원고에서 더 자세히 논의됩니다.
마지막 프로토콜은 파라핀 임베딩 및 RNA 보존을 위해 완전히 자란 오가노이드를 준비하는 방법을 포함하는 송곳니 오가노이드 수확 및 바이오 뱅킹 프로토콜입니다. 액체 질소 저장소에서 오가노이드 샘플을 바이오뱅킹하는 방법 또한 여기에 기재되어 있다. 마지막으로, 냉동 샘플을 해동하고 성장을 지원하는 방법이 논의됩니다.
결론적으로,이 기사는 실험실 간 프로토콜의 표준화를 통해 일관된 송곳니 오가노이드 배양 절차를 제공하는 것을 목표로합니다. 이를 통해 원고는 송곳니 오가노이드 모델에서 파생 된 데이터의 재현성을 촉진하여 번역 생물 의학 연구에서의 관련성을 높이는 것을 목표로합니다.
그림 1: 송곳니 오가노이드 프로토콜의 워크플로우. 송곳니 오가노이드 분리 프로토콜은 오가노이드 분리에 필요한 재료의 준비, 조직 샘플의 수확 (부검, 내시경, 복강경 및 외과 생검 수단을 통해) 및 세포 집단의 세포 해리 및 도금에 대한 지침을 설명합니다. 송곳니 오가노이드 유지 보수 프로토콜은 오가노이드 문화의 청소 및 통과에 대해 논의합니다. 오가노이드 수확 및 바이오뱅킹 프로토콜은 파라핀 임베딩 및 추가 오가노이드 특성화를 위한 오가노이드 샘플의 준비에 대해 논의합니다. 유기 세포 배양물을 바이오 뱅크하고 액체 질소의 저장에서 부활시키는 방법도 논의됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
Protocol
이 연구는 아이오와 주립 대학의 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC-19-337; IACUC-18-065; IACUC-19-017).
참고: 다음 섹션(단계 1-3)에서는 송곳니 오가노이드 격리 프로토콜에 대해 설명합니다.
1. 격리 준비
- 수송 튜브: 오가노이드 분리 전(일반적으로 24시간 전) 50mL 원뿔형 튜브에 0.2mL의 펜 스트렙이 풍부한 둘베코의 변형 이글 배지/영양 혼합물 F-12(Advanced DMEM/F12) 10mL를 채웁니다.
- 복강경, 절개 또는 절제 생검의 경우, 세 개의 추가 50 mL 원뿔형 튜브를 준비하십시오. 이 튜브를 10mL의 완전한 킬레이트 용액으로 채웁니다(1x CCS; 표 1 참조).
참고: 1.2 단계의 경우, 인산완충식염수(PBS) 중의 2mM N-아세틸시스테인(NAC)도 줄기세포 수확에 사용되는 전통적인 용액으로 사용할 수 있습니다. PBS에서 1x CCS 또는 NAC를 사용할 때 관찰된 차이는 없었다. 두 용액 모두 용액에서 세포를 방출하기 위해 첨가됩니다. - 튜브를 하룻밤 사이에 4°C에서 유지하고 나머지 프로토콜에 대해 튜브를 얼음 위로 운반한다.
- 5mL의 1x CCS가 있는 5개의 15mL 원심분리 튜브, 3mL의 1x CCS가 있는 15mL 원심분리 튜브 1개, 빈 15mL 원심분리 튜브(상청액 튜브) 1개, 5mL의 1x CCS 및 2mL의 태아 소 혈청(FBS)이 있는 15mL 원심분리 튜브를 준비합니다.
참고 : 위의 내용은 여러 샘플이 처리 될 경우 분리 일 전에 준비 할 수 있습니다. 자세한 내용은 그림 2의 절연 튜브 레이아웃을 참조하십시오. - 격리 당일에는 생물 안전 캐비닛에서 페트리 접시, 메스, 얼음 양동이 및 차가운 고급 DMEM / F12를 준비하십시오. 필요한 수의 24-웰 세포 배양 플레이트를 인큐베이터(37°C; 5% CO2 분위기)에 넣고 예열한다.
- 가용화된 세포외 막 매트릭스(ECM; 표 참조)를 얼음 위에 놓고 해동을 시작한다.
참고: 얼음에 잠기는 것은 빠른 해동으로부터 보호하고 응고를 방지하는 데 도움이 됩니다. 피펫 팁 박스를 냉동실에 넣어 가용화된 ECM을 도금하는 데 도움을 줄 수 있습니다. - 원심분리기를 4°C로 예냉시킨다.
- 성장 인자 "CMGF+" 또는 "오가노이드 매질"(조성에 대해서는 표 1 참조)이 있는 완전한 배지를 냉동고/냉장고에서 37°C 수조로 옮깁니다. 가능하면 직사광선 노출을 피하십시오.
그림 2: 절연 튜브 레이아웃. 조직 수확을 위한 권장 설정에는 50mL 원심분리 튜브에 10mL의 고급 DMEM/F12 및 0.2mL의 펜 스트렙이 포함됩니다. 또한, 10mL의 1x CCS로 채워진 세 개의 50mL 튜브가 수술 생검이나 부검에 필요합니다. 분리 단계를 위한 권장 튜브 레이아웃에는 CCS 세척 단계 중에 사용할 5mL의 1x CCS를 포함하는 5개의 튜브가 포함됩니다. 첫 번째 튜브는 다진 조직을 포함하는 샘플 튜브로 사용되며 나머지 튜브는 첫 번째 튜브에 첨가되는 1x CCS의 저장소로 사용됩니다. 여섯 번째 튜브에는 6-웰 플레이트로 옮길 때 샘플 튜브로부터 나머지 조직을 플러싱하기 위한 3mL의 1x CCS가 들어 있습니다. 이들 여섯 개의 튜브는 EDTA 인큐베이션 단계 전에 사용될 것이다. 5 mL의 1x CCS와 2 mL의 FBS가 있는 튜브는 EDTA 인큐베이션 후 샘플 튜브 역할을 하며, 이 튜브로부터의 상청액은 줄기 세포와 함께 나머지 분리를 위해 빈 튜브로 옮겨진다. 분리를 시작하기 전에 튜브를 4°C에 보관하십시오. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
2. 조직 수확
- 장 내시경 및 복강경 생검 (직경 2.8 mm)은 대형 생검 포셉을 사용하여 획득 할 수 있습니다. 장 부위 당 적어도 여덟 개의 내시경 샘플을 수확하십시오.
- 샘플을 수송 튜브에 직접 수집하여 얼음 위에 놓습니다.
- 외과 생검 및 부검의 경우, 0.5cm x 0.5cm 크기의 조직 조각을 수확하여 첫 번째 1x CCS 튜브에 놓습니다.
참고 : 장 생검의 경우 남아있는 장 함량을 제거하고 메스로 점막층을 긁어 융모를 제거하십시오. 샘플이 풍부하다면, 추가적인 생검을 RNA 저장 시약 (1 mL) 또는 파라핀 포매를 함유하는 냉동 온도에서 수집하여 오가노이드와 그 기원 조직 간의 향후 비교를 위해 할 수 있습니다. TEM 분석을 위해 생검을 복용하는 경우, 융모를 긁지 말고 샘플을 방부제 (인산염 완충 식염수 (PBS) 중 3 % 파라포름 알데히드 및 3 % 글루타르 알데히드)에 저장하고 4 °C에서 보관하십시오. - 1x CCS 튜브를 ~ 30 초 동안 격렬하게 흔들어 포셉을 사용하여 샘플을 새로운 1x CCS 튜브로 옮깁니다. 이 과정을 두 번 반복하십시오.
- 마지막 1x CCS 튜브에서 이송 튜브(Advanced DMEM/F12 + Pen Strep)로 샘플을 옮기고 샘플을 실험실로 다시 가져옵니다.
참고: 이 방법으로 사전 처리된 샘플은 얼음 위에서 하룻밤 사이에 배송할 수도 있습니다(드라이아이스로 배송하지 마십시오).
3. 오가노이드 분리
주: 생물 안전 캐비닛에서 무균 기술을 사용하여 격리를 수행하십시오. 송곳니 오가노이드 분리 워크플로우에 대해서는 그림 3 을 참조하십시오.
- 조직 샘플을 수송 튜브에서 ∼30 초 동안 흔들고, 유체 표면 근처에서 천천히 피펫팅함으로써 튜브 내에 0.5 mL가 남을 때까지 과도한 상청액을 제거한다. 조직을 버리지 마십시오.
- 조직과 남아있는 상등액을 멸균 페트리 접시에 옮깁니다. 일회용 메스 (또는 멸균 된 포셉 및 가위)를 사용하여 조직을 약 5 분 동안 매쉬 일관성과 비슷한 작은 조각 (1mm2 크기)으로 자르고 다듬습니다.
- 다진 조직을 페트리 접시에서 첫 번째 CCS 튜브로 액체로 피펫팅하십시오. 2mL의 고급 DMEM/F12를 페트리 접시에 넣고 남은 조직을 씻어낸 다음 첫 번째 CCS 튜브로 옮깁니다.
- 1x CCS 튜브를 5초 동안 약 5회 소용돌이치십시오. 생검이 15 mL 튜브의 바닥에 침전되도록 (약 1 분) 허용하고 튜브에 5 mL가 남을 때까지 상층액을 제거하십시오. 1x CCS를 새 튜브에서 샘플 튜브로 옮깁니다.
- 다음 두 튜브에 대해 이전 단계를 반복합니다. 마지막 두 번의 세척에서, 튜브에 남아있는 3 mL까지 상층액을 제거하였다.
- 생검 및 1x CCS를 샘플 튜브로부터 6-웰 플레이트의 하나의 웰로 옮긴다. 그런 다음, 3 mL의 1x CCS를 샘플 튜브에 첨가하고, 부드럽게 소용돌이 치며 남아있는 조직을 수집하고, 플레이트의 동일한 웰로 옮긴다.
- 150 μL의 0.5 M EDTA를 첨가한다(웰에서 6.15 mL의 총 부피를 달성한다). 6웰 플레이트를 4°C에서 20°, 24rpm 너트 믹서/로커 위에 놓습니다. 간 샘플을 10분 동안 인큐베이션하고, 장 샘플을 움직이는 로커 상에서 1시간 동안 인큐베이션한다.
- 6웰 플레이트를 다시 생물 안전 캐비닛으로 운반하십시오. 다진 조직과 액체를 1x CCS / FBS 튜브로 옮기고 조직이 정착되도록하십시오. 상청액 (이 부분은 이제 자유 줄기 세포를 포함함) 및 조직의 상부의 약 0.2 mL를 빈 튜브로 운반하십시오.
- 샘플을 함유하는 튜브를 스핀다운한다(4°C에서 5분 동안 700 x g). 줄기 세포는 이제 다진 조직과 함께 펠릿화됩니다. 펠렛을 방해하지 않도록 상층액을 조심스럽게 제거하고 버립니다.
- 펠렛을 고급 DMEM/F12에 재현탁하고 튜브를 다시 회전시킨다(4°C에서 5분 동안 700 x g ). 상청액을 흡인하고 펠렛을 방해하지 마십시오.
- 해리된 세포 및 조직을 시딩하는 데 필요한 가용화된 ECM의 부피를 계산한다. 적절한 시딩 밀도를 달성하기 위해 24-웰 플레이트의 웰당 30μL의 가용화된 ECM을 사용하십시오.
참고: 분리 후 샘플을 24-웰 플레이트의 4 내지 6 웰에 임베드한다(즉, 샘플 내의 다진 조직의 양을 기준으로). - 가용화된 ECM의 계산된 부피를 샘플 튜브에 첨가하고 거품의 형성을 피하기 위해 천천히 위아래로 피펫을 한다. 가용화된 ECM이 돔형 구조를 형성할 수 있도록 웰의 중간에 현탁액을 시드한다.
참고: -20°C 냉동고의 피펫 팁을 사용하면 가용화 ECM을 도금하는 데 도움이 됩니다. 조직 덩어리가 P200 피펫 팁보다 큰 경우 넓은 콜드 팁을 사용하거나 차가운 P1000 팁을 잘라 도금을 돕습니다. 가능하면 가용화된 ECM으로 샘플을 얼음 위에 보관하십시오. - 플레이트를 인큐베이터 (37 °C; 5 % CO2 분위기)로 운반하고 가용화 된 ECM이 ~ 30 분 동안 응고되도록하십시오.
- ROCK 억제제와 GSK3β를 CMGF+에 혼합한다( 표 1의 농도). 이 용액 500μL(CMGF+ R/G)를 모든 웰에 첨가합니다. 플레이트를 인큐베이터(37°C; 5% CO2 분위기)에 놓는다.
그림 3: 송곳니 오가노이드 격리 워크플로우. 수확 된 조직 샘플은 페트리 접시로 옮겨지고 적절하게 다진 것입니다. 그런 다음 샘플을 1x CCS 튜브로 옮기고 세척 단계가 수행됩니다. EDTA 인큐베이션을 위해 6-웰 플레이트에서, 샘플을 1x CCS 및 FBS를 함유하는 튜브로 옮긴다. 조직이 침전 된 후, 소량의 조직을 가진 상청액은 빈 튜브로 옮겨집니다. 결과적으로 샘플이 회전하고, 상청액이 제거되고, 펠릿이 Advanced DMEM/F12에 재현탁됩니다. 튜브가 다시 회전하고 상청액이 흡인되어 버려집니다. 가용화된 ECM을 튜브에 첨가하고, 혼합하고, 샘플을 24-웰 플레이트에 플레이팅한다. 플레이트를 결과적으로 30분 동안 인큐베이션(37°C; 5% CO2 분위기)하고, 이어서 매질을 첨가한다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
참고: 다음 섹션(단계 4 및 5)에서는 송곳니 오가노이드 유지 관리 프로토콜에 대해 설명합니다. 표 2 에 따라 배지를 변경하고 가용화된 ECM의 아폽토시스, 오염, 과밀화 및 분리의 징후에 대해 매일 오가노이드를 검사한다. 배양물에 대한 조건과 실험적 효과를 정확하게 모니터링하기 위해 그림 4 에 따라 일일 노트를 작성해야 합니다. 정확하고 재현 가능한 오가노이드 배양 관련 메모를 허용하는 템플릿에 대해서는 보충 표 1 을 참조하십시오. 간 오가노이드의 경우, ROCK 억제제 및 GSK3β로 강화된 CMGF+를 사용하십시오.
그림 4: 오가노이드 크기 및 밀도 가이드. (A) 오가노이드 성장의 정확한 추적을 위한 오가노이드 크기 차트. 크기 조정 가이드에는 초소형(XS), 소형(S), 중간(M), 대형(L) 및 초대형(XL) 범주가 포함되어 있습니다. (B) 밀도 가이드는 매우 낮은 밀도 (VLD), 저밀도 (LD), 중간 밀도 (MD), 고밀도 (HD) 및 매우 높은 밀도 범주 (VHD)로 구성됩니다. (C) 오가노이드 샘플의 박테리아 및 곰팡이 오염의 대표적인 이미지. (D) 오가노이드 과밀 및 아폽토시스의 대표적인 이미지. 목표 배율은 모든 패널에 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 미디어 변경 권장 사항 | ||||||
| 월요일 | 화요일 | 수요일 | 목요일 | 금요일 | 토요일 | 일요일 |
| 500 μL | 해당 없음 | 500 μL | 해당 없음 | 750 μL | 해당 없음 | 해당 없음 |
표 2: 미디어 변경 권장 사항. 주간 미디어 변경의 권장 타임라인입니다. 배지 (장 오가노이드의 경우 500μL의 CMGF + 또는 간 오가노이드의 경우 500μL의 CMGF + R / G)를 격일로 변경하는 것이 좋습니다. 주말에 추가 시간을 설명하기 위해 금요일 오후에 750μL의 미디어가 추가되고 월요일 아침에 미디어가 새로 고쳐집니다.
4. 오가노이드 청소
참고 : 오가노이드 배양의 건강을 유지하기 위해 오가노이드 세척 또는 패시징을 정기적으로 수행해야합니다. 배양물에서 아폽토시스, 파편의 존재, 오가노이드의 과밀 또는 가용화 된 ECM의 분리가 발견 될 때마다 세척 절차를 수행하십시오. 그림 4D를 참조하십시오.
- 가용화된 ECM의 파괴를 피하기 위해 플레이트를 기울이면서 웰로부터 매체를 제거한다.
참고: 가용화된 ECM 분리가 상당한 경우, 샘플을 함유하는 가용화된 ECM의 단편이 손실되지 않도록 매체를 15 mL 튜브로 옮기는 것이 좋습니다. - 각 웰에 0.5mL의 사전 냉각된 고급 DMEM/F12를 추가하여 P1000 팁을 사용하여 반복적인 피펫팅을 통해 매트릭스 돔을 용해시킵니다(과도한 버블 생성 방지). 오가노이드 함유 용해된 매트릭스를 15 mL 원심분리 튜브로 옮긴다. 튜브를 얼음 위에 놓고 부피가 6mL보다 낮 으면 튜브를 고급 DMEM/F12로 천천히 채워 총 부피가 6mL에 이릅니다.
- 튜브(4°C에서 5분 동안 700 x g )를 회전시키고, 펠릿을 방해하지 않도록 하면서 모든 상청액을 제거하였다.
- 가용화된 ECM의 필요한 부피 (적절한 시딩 밀도를 달성하기 위해 웰 당 30 μL)를 첨가하고, 피펫 혼합에 의해 펠렛을 천천히 재현탁시킨다. 현탁액을 24-웰 플레이트의 중간에 플레이트화하여 돔을 형성하였다.
- 플레이트를 ~30분 동안 인큐베이터(37°C; 5% CO2 분위기)에 놓고, 이어서 적절한 부피의 배지를 첨가한다(표 2).
5. 오가노이드 패시징
참고: 계대배양은 전형적으로 오가노이드 세포주를 확장시키기 위해 초기 배양 후 5-7일 후에 수행된다. 오가노이드 배양은 전형적으로 1:3 비율로 확장될 수 있다. 통과를 위해 준비된 건강한 문화의 이미지는 그림 4에서 볼 수 있습니다. 오가노이드는 적어도 중간 크기이어야합니다.
- 4.1~4.3단계를 수행합니다.
- 튜브에 0.5 mL를 남기고 있는 상청액을 제거한다. 펠릿을 방해하지 않도록하십시오.
- 트립신-유사 프로테아제 0.5 mL를 첨가하고( 물질의 표 참조), 피펫으로 흡인하여 적절하게 혼합하고, 37°C 수조에서 인큐베이션한다(장내 오가노이드를 8분 동안 또는 간 오가노이드를 10분 동안 인큐베이션). 인큐베이션의 하프 타임 포인트에서 튜브를 여러 번 플릭싱하여 용액을 계속 혼합한다.
- 샘플이 들어있는 튜브를 다시 생물 안전 캐비닛으로 옮기고 미리 냉각된 고급 DMEM/F12 6mL를 천천히 첨가하여 트립신과 같은 프로테아제를 비활성화하고 세포의 해리를 중지합니다.
- 튜브(4°C에서 5분 동안 700 x g )를 회전시키고 상청액을 제거하였다. 펠릿을 방해하지 않도록하십시오.
- 4.4단계를 수행합니다. 및 4.5.
참고: 다음 섹션(단계 6-9)에서는 오가노이드 수확 및 바이오뱅킹 프로토콜에 대해 설명합니다. 오가노이드 배양물은 이전 계대 동안 제거된 조직이 없어야 한다. 배양은 또한 건강하고, 적어도 크기가 크고, 중간 내지 고밀도여야 한다. 다운스트림 응용 프로그램에 사용할 준비가 된 건강한 문화의 이미지는 그림 4에서 볼 수 있습니다. 최적이 아닌 오가노이드 배양물을 보존하고 수확하면서 하류로 이동하면 특성화 결과와 바이오 뱅크의 생존 가능성에 부정적인 영향을 줄 수 있습니다. 그림 5에서 권장되는 24웰 플레이트 레이아웃을 검토합니다.
그림 5: 권장 24웰 플레이트 레이아웃. 오가노이드 배양의 확장 후 기본 특성화를위한 24 웰 플레이트의 권장 레이아웃. 파라핀-여섯 웰(중간 내지 고밀도의 중간 내지 큰 오가노이드)의 포매는 전형적으로 조직학 블록에서 고농도의 오가노이드를 허용할 것이다. 오가노이드의 네 웰은 하류 적용을 위해 RNA 저장 시약과 함께 하나의 cryovial에 풀링될 수 있다. 열네 개의 웰은 오가노이드 샘플을 바이오 뱅킹하는 데 사용되며 최대 일곱 개의 냉동 보존 된 바이알에 대한 재료를 제공합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
6. 오가노이드의 고정
- 우물에서 매체를 제거하고 가용화 된 ECM 돔을 방해하지 않도록하십시오.
- 고정제로서 작용하는 500 μL의 포르말린-아세트산-알콜 용액을 첨가한다(FAA; 표 1의 조성물).
- 실온에서 오가노이드를 보관하십시오. 24시간 후, FAA를 흡인하고 웰을 70% 에탄올로 채운다. 빠른 증발을 피하기 위해 플레이트를 실험실 유연한 필름 테이프 ( 재료 표 참조)로 감싸십시오. 오가노이드는 이제 파라핀 임베딩을 할 준비가되었습니다. 파라핀-오가노이드 배양의 포매는 전통적인 금속 기재 주형에서 수행된다.
7. RNA 보존
- 웰에서 매체를 제거하고 가용화된 ECM 돔을 방해하지 않도록 하십시오.
- 웰당 0.5mL의 사전 냉각된 고급 DMEM/F12를 사용하여 위아래로 반복적으로 피펫팅하여 가용화된 ECM 돔을 용해시킵니다(과도한 거품 생성 방지). 오가노이드를 15 mL 원심분리 튜브로 옮긴다. 튜브를 얼음 위에 놓고 부피가 6mL보다 낮으면 튜브를 고급 DMEM/F12로 천천히 채워 총 부피의 6mL에 도달합니다.
- 튜브(4°C에서 5분 동안 700 x g )를 회전시키고 모든 상청액을 제거하였다. 펠릿을 방해하지 않도록하십시오.
- 100 μL의 PBS를 샘플 튜브에 첨가하고, 온화한 피펫팅에 의해 펠렛을 재현탁시켰다. 샘플 튜브의 내용물을 냉동 튜브로 옮깁니다.
- 900 μL의 RNA 저장 시약 ( 물질 표 참조)을 샘플 튜브에 첨가하고 혼합하여 나머지 오가노이드를 수집하십시오. 이들 잔류 오가노이드를 동결로 옮기고 이를 -80°C에서 저장한다(전형적으로 하나의 동결로 풀링된 네 개의 웰은 qPCR 및 RNA 시퀀싱을 포함하는 다운스트림 적용에 충분할 것이다).
참고: 하나의 cryovial은 일반적으로 총 4,000ng의 RNA (분광광도계 분석을 통해 측정됨)를 생성합니다.
8. 오가노이드 바이오뱅킹
참고 : 바이오 뱅킹은 일반적으로 통과 후 3-4 일 후에 발생합니다. 아폽토시스의 징후는이 방법을 수행하기 위해 배양물에 존재해서는 안됩니다. 동결에 적합한 크기와 밀도를 참조하려면 그림 4 를 참조하십시오. 바이오뱅크 중간에서 초대형 오가노이드까지 중간 내지 매우 높은 밀도. 오가노이드 세포주가 특히 드물거나 더 이상의 생존력이 보장되지 않는 경우 비상 동결 단계를 따를 수 있다. 정상적인 오가노이드 바이오뱅킹에 대해 동일한 단계를 따르십시오(단계 8.1 내지 8.4). 비상 동결은 작고 밀도가 낮은 문화권에서 수행됩니다. 성장하는 오가노이드의 많은 우물을 8.1 내지 8.4 단계에 따라 하나의 냉동 상태로 풀링한다. 배양물을 확장하기 위해 충분한 수의 오가노이드가 살아 있어야한다는 것을 명심하십시오 (비상 동결은 오염 또는 기타 예기치 않은 발생을 통해 가능한 문화 손실로부터 보호하기위한 백업 절차 일뿐입니다).
- 7.1~7.3단계를 수행합니다.
- 냉동 배지 1 mL당 냉동 배지( 표 1의 조성물)를 샘플 튜브에 첨가하고, 상하로 피펫팅하여 펠렛을 부드럽게 재현탁시킨다.
- 용액 1 mL를 하나의 냉동 (두 웰 / 냉동 비율)으로 옮기고 얼음 위에 cryovial을 보관하십시오.
- 냉동 생물을 얼음에서 냉동 용기 (정기적으로 이소프로판올로 저수지를 다시 채우기)로 옮기고 즉시 -80 °C로 옮깁니다. 샘플을 액체 질소(-196°C)로 옮겨 24시간 후 장기간 보관합니다.
참고 : 알코올이없는 세포 냉동 용기는 전통적인 용기 대신 사용할 수도 있습니다. 샘플이 -80°C에서 장기 액체 질소 저장소로 운반하는 동안 해동되지 않는지 확인하십시오. 반복적인 해동은 세포 배양물의 생존력을 감소시킨다.
9. 액체 질소 저장에서 부흥
참고 : 오가노이드 라인을 해동하기로 선택할 때, 부활 된 오가노이드의 하위 집합은 가능한 한 빨리 바이오 뱅크에서 적어도 하나 (바람직하게는 더 많은) 냉동 상태로 재냉동되고 교체되어야합니다.
- 가용화된 ECM을 얼음 위에 올려 놓고 천천히 해동하고, 인큐베이터(37°C; 5% CO2 분위기)에 24 웰 플레이트를 넣고, 15mL 튜브 및 Advanced DMEM/F12와 같은 필요한 시약을 준비합니다.
- 오가노이드 샘플을 함유하는 동결을 액체 질소 저장소로부터 회수하고, 즉시 2분 동안 열조(37°C)로 옮긴다.
- 동결의 내용물을 생물안전 캐비닛의 15 mL 원심분리 튜브로 옮긴다. 미리 냉각된 고급 DMEM/F12를 천천히 첨가하여 총 부피가 6mL에 이릅니다.
- 튜브를 회전시킨다(4°C에서 5분 동안 700 x g ). 상층액을 제거하고 펠렛을 방해하지 않도록하십시오.
- 180 μL (웰 당 30 μL)의 가용화된 ECM을 펠렛에 첨가하고, 이 현탁액을 예열된 24-웰 플레이트에 플레이트화한다. 하나의 cryovial은 24 웰 플레이트의 여섯 웰에 도금 될 수 있습니다.
- 24웰 플레이트를 인큐베이터(37°C, 5% CO2 분위기)에 ~30분 동안 놓고 CMGF+ R/G를 추가합니다(장내 오가노이드의 경우 24~48시간 내에 CMGF+로 전환).
참고: 샘플이 도금되어 24웰 플레이트에서 성장할 때, 생존력을 높이기 위해 통과 전에 적어도 2일 동안 회수할 수 있어야 합니다.
Representative Results
송곳니 오가노이드 프로토콜은 전형적으로 24-웰 플레이트의 웰 당 ~50,000 내지 ∼150,000개의 장 또는 간 세포를 생성한다. 대표적인 오가노이드는 도 6에서 볼 수 있다.
그림 6 : 송곳니 오가노이드의 대표적인 이미지. 이 프로토콜을 사용하여 분리된 오가노이드의 이미지가 묘사된다. (A, B) 십이지장으로부터 유래된 장 오가노이드 (10x 및 5x 객관적 배율로 취함). 오래된 싹이 트인 오가노이드와 더 어린 구상체의 존재에 유의하십시오. (C,D) 제주눔의 하부로부터의 송곳니 엔테로이드 (10x 및 20x 객관적 배율로 취함). (E, F) 장막 엔테로이드 (20x 및 5x 대물 배율로 촬영) 및 (G, H) 콜로노이드 (10x 대물 배율로 촬영). (I) 20x 객관적 배율로 촬영한 간 오가노이드의 대표적인 이미지. 대부분의 오가노이드는 싹트는 형태입니다. 더 어린 간 구상체도 그림에서 볼 수 있습니다. (J) 덕트형 구조를 형성하는 희귀한 간조직 오가노이드를 보여주는 대표적인 이미지(10x 대물 배율로 촬영). 스케일 바(500 μm)는 각 이미지의 좌측 상단 모서리에 존재한다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
이 프로토콜을 사용하여 유도된 엔테로이드 및 콜로노이드는 이전에 Chandra et al. 201912에 의해 특성화되었다. 송곳니 장 오가노이드는 장 상피의 규칙적인 세포 집단으로 구성됩니다. 계내 혼성화에서 RNA를 사용하여, 줄기 세포 바이오마커 (류신-풍부 G 단백질 결합 수용체 5 - LGR5 및 SRY-Box 전사 인자 9 - SOX9를 포함하는 반복), 파네스 세포 바이오마커 (에프린 타입-B 수용체 2 - EPHB2), 흡수성 상피 세포 마커 (알칼리성 포스파타제 - ALP) 및 장내분비 마커 (뉴로제닌-3 - 뉴로게닌-G3)12의 발현 확인되었다. 알시안 블루 염색은 고블릿 세포의 존재를 확인하기 위해 파라핀 포매된 슬라이드에서 수행되었다. 추가적으로, 오가노이드의 대사 활성을 확인하기 위해 광학 대사 영상화 (OMI) 또는 낭포성 섬유증 막횡단 전도도 조절기 (CFTR) 팽윤 분석과 같은 기능적 검정이 수행되었다. 염증성 장 질환, 위장관 간질 종양(GIST), 또는 결장직장 선암종으로 진단된 개로부터의 송곳니 오가노이드도 또한 이 프로토콜12를 사용하여 분리하였다.
줄기 세포 분리 후, 간 송곳니 오가노이드는 구상체 확장으로 수명주기를 시작하고 ~ 7 일 후에 오가노이드를 분화시키고 분화시킵니다. 이 프로토콜에 따라 분리 및 배양된 송곳니 간 구상체는 그들의 성장을 정량화하고 계대에 이상적인 시간을 결정하기 위해 측정되었다. 건강한 성인 개들의 복강경 간 생검으로부터 유래된 구상체(n=7)는 배양의 첫 7일 동안 측정되었다. 대표적인 이미지를 촬영하고, 배양 전반에 걸쳐 구상체의 종방향 (a) 및 대각선 (b) 반경 (n=845)을 측정하였다. 구상체의 부피(V), 표면적(P), 2D 타원 영역(A), 및 원주(C)를 계산하였다. 실험의 계산 및 결과는 도 7에 요약되어 있다. 2D 타원 영역 및 둘레를 사용하여 광 현미경을 사용하여 오가노이드 배양물의 건강을 평가하였다. 이러한 가치는 문화 유지 관리 결정을위한 지침이 될 수 있습니다.
간단히 말해서, 구상체는 부피, 표면적, 2D 타원 영역 및 둘레에서 빠르게 확장되었습니다. 일곱 비글의 측정 데이터는 다음과 같은 계산을 위해 평균화되었습니다. 거래량은 2일째부터 3일째까지 479%(±6%)나 증가했다. 동시에 스페로이드 표면적과 2D 타원 면적은 각각 211 % (±208 %)와 209 % (±198 %)만큼 증가했습니다. 2D 타원 둘레가 2일째에서 3일로 73%(±57%)나 증가했습니다. 2-7 일간의 간 오가노이드의 전체 부피의 증가는 365 배 이상이었고, 표면적과 2D 타원 면적은 49 배 증가했으며, 2D 타원 둘레는 6 배 증가했습니다.
다음에, 2개의 성인 송곳니 샘플로부터 유래된 구상체를 계내 혼성화 (RNA ISH) 에서 RNA를 위해 계대 후 추가로 성장시키고, 매일 (2-7일) 수집하였다. 송곳니 프로브를 설계하고(프로브 목록은 보충 표 2로 제공됨), mRNA 발현은 줄기 세포 마커 (LGR5), 담관세포에 특이적인 마커 (시토케라틴 7 - KRT-7, 및 아쿠아포린 1 - AQP1), 뿐만 아니라 간세포 마커 (포크헤드 박스 단백질 A1 - FOXA1; 및 시토크롬 P450 3A12 - CYP3A12)에 대해 평가하였다. 마커의 발현을 반정량적 방식으로 평가하였다( 도 8의 대표적인 사진). 스페로이드는 우선적으로 세포의 신호 영역/총 면적에서 1% 내지 26% 범위의 담관세포 마커 KRT-7을 발현하였다. AQP1은 오가노이드 샘플에서 발현되지 않았으며, 이는 송곳니 간 샘플에서의 그의 존재가 희박하기 때문이라고 틀림없다. 줄기세포 마커 발현(LGR5)은 0.17%~0.78% 사이였고, 간세포 마커는 FOXA1의 경우 0.05%-0.34%, CYP3A12의 경우 0.03%-0.28%로 낮은 정도로 발현되었다.
도 7: 간 스페로이드 측정. (A) 간 스페로이드 성장은 배양 2-7일째부터 매일 관찰되었다. 구상체는 2 일째에 처음 형성되었고, 마지막 구상체는 7 일째에 신진 과정을 시작했습니다. 후속 실험에서는 RNA ISH를 수행하기 위해 파라핀 포매를 위해 매일 구상체를 수확하기 위해 계대 후 두 개의 송곳니 오가노이드 라인을 사용했습니다 (2 일째 이미지는 40x에서 촬영되었고, 6 일째 이미지는 10x에서 촬영되었으며, 나머지 이미지는 20x 배율로 촬영되었습니다). (b) 간 스페로이드 클러스터가 분리 4일 후에 가용화된 ECM에 포매된 조직 덩어리에 부착된 것으로 나타났다. 구상체의 종방향 및 대각선 반경을 측정하였다(10x에서 촬영된 이미지). 패널(C)은 부피(V), 표면적(P), 2D 타원 영역(A) 및 원주(C)를 도출하기 위한 계산에 사용되는 공식을 도시한다. 이러한 계산을 위해, 송곳니 간 구상체가 이상적인 구상체라고 추정되었다. 개별 성장일에 대한 간 구상체의 부피, 표면적, 2D 타원 영역 및 2D 타원 둘레의 측정 결과가 패널 (D)에 묘사되어 있습니다. 오차 막대는 평균(SEM)의 표준 오차를 나타낸다. (e) KRT-7, LGR5, FOXA1, 및 CYP3A12의 mRNA 발현을 제2일째부터 7일째까지의 통과 후 송곳니 간 구상체의 샘플에서 측정하였다. AQP1은 이들 샘플에서 발현되지 않았다. 스케일 바(5x: 500 μm; 10x: 200 μm; 20x: 100 μm; 40x: 50 μm)가 각 이미지의 왼쪽 상단에 존재한다. 객관적인 배율이 주목되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
오가노이드는이 표준화 된 기술에 따라 패시징 과정에서 거의 분해되지 않습니다. 해리가 발생하지 않으면, 통과 시간은 최적의 세포 클러스터 붕해를 달성하기 위해 조정될 수 있다. 그러나, 트립신-유사 프로테아제에 장기간 노출되면 오가노이드의 성장에 부정적인 영향을 미칠 수 있다. 간 오가노이드는 최적의 해리 시간을 조사하고 적절한 계대 방법을 확립하기 위해 후속 실험에서 사용되었다. 간략하게, 두 마리의 건강한 개로부터의 간 오가노이드 (각각 6 웰 반복실험)를 트립신 유사 프로테아제로 12분 및 24분 동안 계대배양하였다. 샘플을 매 6분마다 교반시켰다. 해리 시점의 끝에서, 빙냉 어드밴스드 DMEM/F12 6mL를 용액에 첨가하고, 샘플을 회전시켰다(4°C에서 5분 동안 700 x g ). 상청액(희석된 트립신형 프로테아제를 사용한 어드밴스드 DMEM/F12)을 제거하고, 펠렛을 상기 기재된 바와 같이 가용화된 ECM에 매립하였다(단계 4.4-4.5). 가용화된 ECM 및 CMGF+ R/G에서 12시간 배양한 후, 두 샘플 모두에서 차이가 관찰되었다. 트립신-유사 프로테아제와 함께 12분간 인큐베이션한 결과, 오가노이드 성장을 억제하지 않았다. 그러나, 오가노이드의 성장은 24분 인큐베이션을 사용하여 부정적인 영향을 미쳤다( 도 9 참조).
그림 9 : 송곳니 간 오가노이드 통과 실험. 두 마리의 개(D_1 및 D_2)로부터 유래된 오가노이드의 대표적인 이미지는 트립신 유사 프로테아제 인큐베이션 방법을 사용하여 계대배양하여 12분 또는 24분 동안 인큐베이션하였다. 대조군 샘플을 트립신 유사 프로테아제로 10분 동안 계대시켰다. 스케일 바(μm)는 각 이미지의 왼쪽 상단에 존재하며 500μm(5x 대물 배율)를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
다음으로, 불리한 환경에서이 프로토콜에서 유래 된 개 간 오가노이드의 생존 가능성 (구조적 지원 및 영양 부족)에 대한 조사가 수행되었습니다. 이 조사는 간 오가노이드의 성공적인 성장과 생존에 필요한 오가노이드 배지 및 지하실 매트릭스의 부피를 결정하고 오가노이드 배양에 대한 그러한 조건의 영향을 확립하는 데 중점을 두었습니다. 생존성은 제한된 수의 오가노이드를 갖는 96-웰 플레이트에서 측정되었다. 두 개로부터의 오가노이드를 상기 기재된 바와 같이 계대배양하고(12 반복실험) 가용화된 ECM(10 μL 또는 15 μL)의 상이한 부피로 포매하였다. 세포를 40,000 세포/mL에 해당하는 400 세포/10 μL 웰 및 600 세포/15 μL 웰의 농도로 플레이팅하였다. 두 가지 배지 유형(CMGF+ 또는 CMGF+ R/G)이 서로 다른 볼륨(25μL, 30μL 또는 35μL)으로 첨가되었습니다. 미디어는 변경되지 않았으며 유지 보수 절차는 수행되지 않았습니다. 오가노이드의 생존 가능성을 매일 모니터링하였다. 오가노이드 사멸은 오가노이드 구조의 50% 이상의 용해로 정의되었다. 이들 조건에서 오가노이드의 생존율은 12.9 (±2.3) 일 내지 18 일 (±1.5) 일 범위였으며, 그 결과는 표 3에 요약되어 있다. 가장 오래 살아남은 두 샘플은 15μL의 가용화된 ECM과 30μL의 CMGF+ 배지에 포매된 개로부터 유래된 오가노이드였다. 두 샘플 모두 가용화된 ECM (30 μL) 및 신선한 배지 (500 μL)를 표준 24-웰 플레이트에 포매하여 18일간 박탈 후 오가노이드 확장이 여전히 가능함을 보장하였다 (도 10).
| 미디어 유형 | 평균(생존 일수) | 중앙값 | 이력서 % | 평균(생존 일수) | 중앙값 | 이력서 % | 평균(생존 일수) | 중앙값 | 이력서 % | 평균(생존 일수) | 중앙값 | 이력서 % | |
| 미디어 (μL) | 30 | 25 | 35 | 30 | |||||||||
| ECM (μL) | 10 | 10 | 10 | 15 | |||||||||
| D_1 | CMGF + R / G | 12.50 | 13 | 11.57 | 12.83 | 13 | 4.50 | 11.83 | 11.5 | 12.91 | 12.08 | 13 | 12.46 |
| CMGF+ | 17.08 | 17 | 16.26 | 18.50 | 19 | 4.89 | 18.42 | 19 | 14.54 | 17.82 | 19 | 8.99 | |
| D_2 | CMGF + R / G | 13.67 | 14 | 13.36 | 13.00 | 13 | 12.70 | 14.00 | 14.5 | 17.23 | 13.08 | 13 | 8.90 |
| CMGF+ | 15.50 | 15 | 18.56 | 17.50 | 18 | 10.48 | 17.50 | 19 | 20.89 | 17.00 | 17 | 14.41 | |
| 합계 | CMGF + R / G | 13.08 | 13 | 13.13 | 12.92 | 13 | 9.39 | 12.92 | 13 | 17.52 | 12.58 | 13 | 11.22 |
| CMGF+ | 16.29 | 16.5 | 17.69 | 18.00 | 18.5 | 8.35 | 17.96 | 19 | 17.65 | 17.43 | 17 | 11.70 | |
| 사망 = 오가노이드 질량의 50 % 이상이 생존 할 수 없습니다. | |||||||||||||
표 3: 생존가능성 실험 결과. 실험은 두 개의 오가노이드 배양의 구조적 지원 또는 영양 부족에 기초했다. 결과는 개별 개에서 가용화된 ECM 및 배지의 개별 농도의 평균, 중앙값 및 표준 편차 (CV%)를 포함한다.
그림 10 : 오가노이드 영양 및 구조적 박탈. 오가노이드를 24-웰 플레이트에서 재충전하여 박탈 후 팽창 능력을 확인하였다 (A). 리플레이팅 후 4일째와 7일째의 대표적인 이미지는 오가노이드의 팽창을 보여주며, 실행 가능한 오가노이드를 시각적으로 식별하는 능력을 확인한다(이미지는 5x 대물 배율로 촬영됨). 살아 있거나 죽은 것으로 간주되는 오가노이드의 대표적인 이미지는 (B)에서 볼 수 있다. 이미지는 5x 대물 배율로 촬영됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 8: 간 구상체 RNA in situ hybridization 대표 이미지. LGR5, KRT7, FOXA1 및 CYP3A12 마커의 대표적인 이미지를 계대 후 2-7일째부터 샘플의 60x 대물 배율로 촬영하였다. 양성 mRNA 분자는 빨간색으로 염색됩니다. AQP1은 샘플에서 발현되지 않았다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 불완전한 킬레이트 용액 (ICS) 조성 | 최종 농도 |
| 500 mL H2O | 북미 |
| 2.49 g Na2HPO4-2H2O | 4.98 밀리그램/mL |
| 2.7 그램 KH2PO4 | 5.4 밀리그램/mL |
| 나클 14 g | 28 밀리그램/mL |
| 0.3 g KCl | 0.6 밀리그램/mL |
| 자당 37.5 g | 75 밀리그램/mL |
| D-소르비톨 25 g | 50 밀리그램/mL |
| 완전한 킬레이트 용액 (CCS) 조성 | V/V % 또는 최종 농도 |
| 불완전한 킬레이트 용액 | 20% |
| 멸균 H2O | 80% |
| 증권 시세 표시기 | 520 μM |
| 펜 스트렙 | 펜: 196 U/mL; 스트렙 196 ug/mL |
| 오가노이드 배지 조성 | 최종 농도 |
| 고급 DMEM/F12 | 북미 |
| FBS | 8% |
| 글루타맥스 | 2 밀리지미터 |
| 헤페스 | 10 밀리지미터 |
| 프리모신 | 100 μg/mL |
| B27 보충 교재 | 1배 |
| N2 보충 교재 | 1배 |
| N-아세틸-L-시스테인 | 1 밀리지미터 |
| 뮤린 EGF | 50 ng/mL |
| 뮤린 노긴 | 100 ng/mL |
| 인간 R-스폰딘-1 | 500 ng/mL |
| 뮤린 Wnt-3a | 100 ng/mL |
| [Leu15]-가스트린 I 인간 | 10 nM |
| 니코틴아미드 | 10 밀리지미터 |
| A-83-01 | 500 nM |
| SB202190 (P38 억제제) | 10 μM |
| TMS (트리메토프림 설파메톡사졸) | 10 μg/mL |
| 추가 구성 요소 | 최종 농도 |
| 암석 억제제 (Y-27632) | 10 μM |
| 스테바분자 CHIR99021 (GSK3β) | 2.5 μM |
| 동결 매체 구성 | V/V 퍼센트 |
| 오가노이드 배지 및 ROCK 억제제 | 50% |
| FBS | 40% |
| 디메틸 설폭사이드 (DMSO) | 10% |
| FAA 구성 | V/V 퍼센트 |
| 에탄올 (100%) | 50% |
| 아세트산, 빙하 | 5% |
| 포름알데히드 (37%) | 10% |
| 증류수 | 35% |
표 1: 용액 및 매질의 조성. 불완전하고 완전한 킬레이트 용액, CMGF+ (오가노이드 매질), 동결 배지 및 FAA의 성분 및 농도 목록.
보충 표 1: 오가노이드 케어 템플릿. 이 템플릿은 매일 정확하고 재현 가능한 오가노이드 메모 작성을 허용합니다. 이 테이블을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 표 2: 계내 RNA 혼성화 프로브. 개과 mRNA 표적을 위해 특별히 설계된 프로브의 목록은 계내 혼성화 기술에서 RNA를 수행하는 기술의 제조자에 의해 제조자에 의해 이루어진다. 개별 마커의 중요성, 프로브의 이름, 참조 번호 및 대상 영역에 대한 정보가 나열됩니다. 이 테이블을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
Discussion
현재 송곳니 간 및 장 오가노이드의 분리 및 유지에 사용할 수있는 표준화 된 프로토콜이 부족합니다. 오가노이드 배양에 대한 표준 운영 절차를 수립하는 것은이 모델이 다른 실험실 환경에서 적용 될 수 있도록 보증됩니다. 특히, 이러한 송곳니 오가노이드 모델의 배양을 위한 표준화된 작동 프로토콜을 제공하는 것은 확장 및 유지를 위한 최적의 시점을 도출하기 위해 배양 및 패시징 동안 오가노이드의 정상적인 성장을 특성화하는 데 핵심입니다. 상기 프로토콜을 사용하여 배양된 송곳니 장내 오가노이드는 이전에 Chandra et al.12에 의해 특성화되었다.
프로토콜의 가장 중요한 단계 중 하나는 오가노이드의 통과입니다. 간 구상체의 첫 번째 통과에 대한 최적 시간은 간 스페로이드 측정에 기초하여 분리 후 7 일째로 결정되었다. 구상체의 최대 부피는 7 일째까지 달성되었으며, 동시에 구상체가 싹을 틔우기 시작하여 간 오가노이드를 형성했습니다. 단리 후 2-7일째부터 전체 오가노이드 부피의 증가는 365배 이상이었으며, 이는 최적의 통과 시간이 송곳니 장내 오가노이드 배양물보다 더 길다는 것을 시사한다. 배양 7일 후, 세척 또는 계류 없이도 간 스페로이드에서 세포 사멸의 총체적인 징후가 관찰되지 않았다(도 7). 장 및 간 오가노이드를 통과시키는 것은 절차가 세포의 손실과 변화된 생존력으로 이어질 수 있기 때문에 어려울 수 있습니다. 결과는 트립신-유사 프로테아제를 사용한 간 오가노이드의 장기간 배양(최대 12분)이 계대 배양에 부정적인 영향을 미치지 않는다는 것을 나타낸다. 오가노이드를 트립신 유사 프로테아제에서 24분 이상 인큐베이션하는 것은 오가노이드의 후속 계대배양에 해로울 수 있다.
오가노이드 통로가있는 세포 클러스터에서 차선책의 파손의 경우, 트립신과 같은 프로테아제를 사용한 장기간의 배양 대신 기계적 해리가 더 유익 할 수 있습니다. 오가노이드의 적절한 해리와 함께 문제가 발생하면 통과 수율을 향상시키기 위해 샘플의 간단한 볼텍싱이 시도 될 수 있습니다. 반면에 볼텍싱은 배양을 망치고 세포를 손상시킬 가능성이 있으므로 다른 절차가 반복적으로 실패한 경우에만 사용해야합니다. 간 오가노이드를 단일 세포로 분해하면 오가노이드의 성장 속도가 낮아지고 세포 클러스터로 분해하면 생존력을 크게 향상시킬 수 있습니다. 십분은 오가노이드 프로토콜에 대한 인큐베이션 시간으로서 선택되었다. 12분 인큐베이션 시점은 트립신 유사 프로테아제 실험에서 24분 인큐베이션에 비해 세포독성이 없는 것으로 간주되었다.
생존 가능성 실험은 송곳니 간 오가노이드가 불리한 조건 (구조적 및 영양 고갈)에서 최대 19.5 일 동안 생존 할 수 있음을 확인했습니다. 이러한 조건에서 가장 오래 살아남은 오가노이드는 CMGF+ 배지로 배양되었다. 이 관찰은 Rock 억제제 및 GSK3β로 보충되지 않은 배지에서 간 오가노이드의 느린 성장으로 인해 발생했을 수 있습니다. CMGF+ R/G를 이용한 오가노이드 문화는 더 빠르게 성장했고 자원을 더 빨리 고갈시켰을 수도 있다. 이 실험은 송곳니 오가노이드 배양을 소형화하여 높은 처리량의 시스템 변환을 달성 할 수있는 가능성을 열어줍니다. 이러한 기술은 실질적으로 감소된 비용으로 약물 발견 또는 독성학 연구를 용이하게 할 수 있는 잠재력을 보여준다.
송곳니 오가노이드 배양 유지 보수 중에 발생하는 몇 가지 일반적인 문제는 도금시 부적절한 샘플 응고, 배양 오염 및 오가노이드의 적절한 밀도와 크기를 확립하는 것입니다. 가용화된 ECM이 도금 중에 조기에 응고되면 즉시 얼음 위에 10분 동안 놓습니다. 가용화된 ECM이 돔형 구조를 형성하지 않으면, 샘플로부터 충분한 매질이 제거되지 않았을 가능성이 있다. 이 경우 돔이 형성 될 때까지 샘플을 더 가용화 된 ECM으로 희석하십시오.
곰팡이 또는 박테리아 오염이 전체 플레이트에서 발견되면 ( 그림 4 참조), 가장 좋은 해결책은 플레이트를 버리는 것입니다. 항진균제 또는 항생제로 치료할 수는 있지만 그러한 시도의 성공은 매우 낮습니다. 단일 웰이 플레이트에 오염되면, 실행 가능하고 영향을받지 않는 웰을 새 플레이트로 청소하고 (4.1 ~ 4.5 단계를 따르십시오) 면밀히 모니터링 할 수 있습니다. 샘플이 이미 비상 냉동 된 경우 샘플을 해동하면 인큐베이터가 추가 오염 위험에 노출되므로 전체 샘플을 버리는 것이 좋습니다.
건강한 오가노이드 배양은 적어도 배지 크기 및 중간 밀도 범주 또는 그 이상이어야 한다. 최적의 밀도는 오가노이드 배양 성장에 매우 중요합니다. 낮은 밀도는 오가노이드를 중간 밀도로 청소하여 수정해야합니다. 극단적 인 밀도의 상황이 발생하면 (과밀), 오가노이드는 더 많은 우물로 확장되어야합니다. 세포 아폽토시스의 총체적인 징후는 종종 오가노이드 문화의 과밀과 낮은 밀도를 동반합니다. 이러한 문제가 제 시간에 시정되지 않으면 전체 오가노이드 문화가 며칠 만에 사멸 적으로 변할 것입니다. 오가노이드가 매우 큰 크기 또는 매우 높은 밀도를 달성하는 경우, 배양물은 실험, 동결 또는 고정에 사용되어야합니다.
오가노이드 배지에는 현재 17 가지 구성 요소가 포함되어 있으므로 오가노이드 유지 및 확장에 필요한 성장 인자를 추가하는 것은 비용이 많이 들 수 있습니다. 이 문제는 조건화 된 CMGF +를 생산하기 위해 성장 인자를 합성하는 2D 세포 배양물을 성장시킴으로써 해결 될 수 있습니다. 세포 배양 L-WRN은 Wnt-3a, R-Spondin-3 및 Noggin 성장 인자37을 생산한다. 세포 콜로니는 90% DMEM/F12 및 10% FBS 배양 배지를 사용합니다. 문화가 90 %의 합류율을 달성하면 미디어는 1 주 동안 매일 수확됩니다. 수확 된 배지는 2x CMGF + (이러한 성장 인자 없음)와 혼합됩니다. 2D 배양은 비용의 일부만으로 필요한 성장 인자를 생산할 수 있지만 미디어를 생산하기위한 추가 시간과 준비가 예상되어야합니다. 조건화된 배지 배치 사이의 성장 인자의 농도는 또한 다를 수 있다37,38.
송곳니 성인 줄기 세포 유래 오가노이드 배양은 One Health Initiative39의 목표를 달성하는 데 도움이되는 독특한 생물 의학 모델입니다. 오가노이드 기술은 발달 생물학, 병리 생리학, 약물 발견 및 테스트, 독성학에서 전염병 및 재생 의학 연구에 이르기까지 많은 기본 및 생물 의학 연구 분야에서 사용될 수 있습니다40. 번역 및 역번역 연구는 송곳니 오가노이드가 적용 가능한 영역입니다15. 개는 번역 실험 환경에서 수세기 동안 사용되어 왔으며, 동반자 동물 지위는 수의학에서 가장 많이 탐구 된 종 중 하나로서의 입지를 촉진했습니다.
결론적으로,이 원고는 다양한 생물 의학 분야에서이 모델의 적용을 용이하게하기 위해 송곳니 간 및 장 오가노이드의 분리, 유지 보수, 수확 및 바이오 뱅킹을위한 표준화 된 운영 프로토콜을 제공합니다. 이 모델은 지식의 학제 간 및 학제 내 공유를 촉진하기위한 One Health Initiative의 도구로서 역 번역 연구를 촉진하는 데 독특하게 적합합니다.
Disclosures
K. Allenspach는 LifEngine Animal Health and 3D Health Solutions의 공동 설립자입니다. 그녀는 Ceva Animal Health, Bioiberica, LifeDiagnostics, Antech Diagnostics, Deerland Probiotics 및 Mars의 컨설턴트로 활동하고 있습니다. J. P. Mochel은 LifEngine Animal Health and 3D Health Solutions의 공동 설립자입니다. Mochel 박사는 Ceva Animal Health 및 Ethos Animal Health의 컨설턴트로 활동하고 있습니다. 다른 저자는 선언 할 이해 상충이 없습니다.
Acknowledgments
저자들은 아이오와 주립 대학 직원의 수의학 진단 실험실, 즉 헤일리 M. 램버트, 에밀리 라헤, 로잘린 M. 브라나만, 빅토리아 J. 그린, 제니퍼 M. 그로엘츠-아구창에게 제공된 샘플의 적시 처리에 감사를 표하고 싶습니다. 저자는 교수진 스타트업, ISU VPR 밀러 상, ISU VPR 밀러 어워드, NSF SBIR 하위 어워드에서 ISU # 1912948에 대한 지원을 인정하고자 합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chelating solution | |||
| D-Sorbitol | Fisher Chemical | BP439-500 | |
| DTT | Promega | V3151 | |
| KCl | Fisher Chemical | P217-500 | |
| KH2PO4 | Sigma | P5655-100G | |
| Na2HPO4-2H2O | Sigma | S5136-100G | |
| NaCl | Fisher Chemical | S271-500 | |
| Pen Strep | Gibco | 15140-122 | |
| Sucrose | Fisher Chemical | S5-500 | |
| Organoid media | |||
| [Leu15]-Gastrin I human | Sigma | G9145-.5MG | |
| A-83-01 | PeproTech | 9094360 | |
| Advanced DMEM/F12 | Gibco | 12634-010 | |
| B27 supplement | Gibco | 17504-044 | |
| FBS | Corning | 35-010-CV | |
| Glutamax | Gibco | 35050-061 | |
| HEPES | VWR Life Science | J848-500ML | |
| Human R-Spondin-1 | PeproTech | 120-38-500UG | |
| Murine EGF | PeproTech | 315-09-1MG | |
| Murine Noggin | PeproTech | 250-38-250UG | |
| Murine Wnt-3a | PeproTech | 315-20-10UG | |
| N2 supplement | Gibco | 17502-048 | |
| N-Acetyl-L-cysteine | Sigma | A9165-25G | |
| Nicotinamide | Sigma | N0636-100G | |
| Primocin | InvivoGen | ant-pm-1 | |
| ROCK inhibitor (Y-27632) | EMD Millipore Corp. | SCM 075 | |
| SB202190 (P38 inhibitor) | Sigma | S7067-25MG | |
| Stemolecule CHIR99021 (GSK3β) | Reprocell | 04-0004-base | |
| Trimethoprim | Sigma | T7883-5G | |
| Sulfamethoxazole | Sigma-Aldrich | S7507-10G | |
| Reagents | |||
| Acetic Acid, Glacial | Fisher Chemical | A38-500 | |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Fisher Chemicals | D128-500 | |
| EDTA, pH 8.0, 0.5 M | Invitrogen | 15575-038 | |
| Formaldehyde (37%) | Fisher Chemical | F79P-4 | |
| Glutaraldehyde solution | Sigma | G5882 | |
| Matrigel Matrix For Organoid Culture | Corning | 356255 | Extracellular Membrane Matrix |
| Paraformaldehyde, 97% | Alfa Aesar | A11313 | |
| PBS, 1X (Phosphate-Buffered Saline) | Corning | 21-040-CM | |
| PBS, 1X (Phosphate-Buffered Saline) | Corning | 21-040-CM | |
| RNAlater Soln. | Invitrogen | AM7021 | RNA Storage Reagent |
| TrypLE Express | Gibco | 12604-021 | Trypsin-like Protease |
| Other | |||
| 6 Well Cell Culture Plate | Corning | 3516 | |
| ACD Hybez II Hybridization System | ACD a biotechne brand | 321710 | |
| Centrifuge Tube, 15 mL | Corning | 430766 | |
| CoolCell LX | Corning | BCS-405MC | |
| Cryogenic Vials | Corning | 430488 | |
| Disposable Centrifuge Tube (50 mL) | Fisherbrand | 05-539-13 | |
| GyroMini Nutating mixer (Rocker) | Labnet | S0500-230V-EU | |
| Heat Bath | Lab-Line Instruments | 3000 | |
| Mr. Frosty Freezing Container | ThermoFisher Scientific | 5100-0001 | |
| NanoDrop 2000 | ThermoFisher Scientific | ND2000CLAPTOP | SpectrophotometerAnalysis |
| Panasonic incubator | Panasonic | MCO-170ML-PA | |
| Parafilm M Wrapping Film | Bemis Company Inc | PM996/EMD | Laboratory Flexible Film Tape |
| Protected Disposable Scalpels | Bard-Parker | 239844 | |
| RNAscope 2.5 HD Assay – RED | ACD a biotechne brand | 322350 | |
| RNAscope H2O2 & Protease Plus Reagents | ACD a biotechne brand | 322330 | |
| RNAscope Target Retrieval Reagents | ACD a biotechne brand | 322000 | |
| RNAscope Wash Buffer Reagents | ACD a biotechne brand | 310091 | |
| Tissue Culture Dish | Dot Scientific | 6676621 | |
| Tissue Culture Plate 24 wells | Fisherbrand | FB012929 |
References
- Hickman, D. L., Johnson, J., Vemulapalli, T. H., Crisler, J. R., Shepherd, R.
- De Jong, M., Maina, T. Of mice and humans: Are they the same? - Implications in cancer translational research. Journal of Nuclear Medicine. 51 (4), 501-504 (2010).
- Cannarozzi, G., Schneider, A., Gonnet, G. A phylogenomic study of human, dog, and mouse. PLoS Computational Biology. 3 (1), 0009-0014 (2007).
- Jacob, J. A. Researchers turn to canine clinical trials to advance cancer therapies. JAMA - Journal of the American Medical Association. 315 (15), 1550-1552 (2016).
- Ziegler, A., Gonzalez, L., Blikslager, A. Large animal models: The key to translational discovery in digestive disease research. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 2 (6), 716-724 (2016).
- Swanson, K. S., et al. Phylogenetic and gene-centric metagenomics of the canine intestinal microbiome reveals similarities with humans and mice. ISME Journal. 5 (4), 639-649 (2011).
- Coelho, L. P., et al. Similarity of the dog and human gut microbiomes in gene content and response to diet. Microbiome. 6 (1), 72 (2018).
- Nguyen, T. L. A., Vieira-Silva, S., Liston, A., Raes, J. How informative is the mouse for human gut microbiota research. DMM Disease Models and Mechanisms. 8 (1), 1-16 (2015).
- Bontempo, V. Nutrition and health of dogs and cats: Evolution of petfood. Veterinary Research Communications. 29, 45-50 (2005).
- Allenspach, K., Gaschen, F. Canine chronic enteropathies: A review. Schweizer Archiv fur Tierheilkunde. 145 (5), 209-222 (2003).
- Tribuddharatana, T., Kongpiromchean, Y., Sribhen, K., Sribhen, C. Biochemical alterations and their relationships with the metabolic syndrome components in canine obesity. Kasetsart Journal - Natural Science. 45 (4), 622-628 (2011).
- Chandra, L., et al. Derivation of adult canine intestinal organoids for translational research in gastroenterology. BMC Biology. 17 (1), 33 (2019).
- Schaefer, K., Rensing, S., Hillen, H., Burkhardt, J. E., Germann, P. G. Is Science the only driver in species selection? An internal study to evaluate compound requirements in the minipig compared to the dog in preclinical studies. Toxicologic Pathology. 44 (3), 474-479 (2016).
- MacArthur Clark, J. The 3Rs in research: A contemporary approach to replacement, reduction and refinement. British Journal of Nutrition. 120, 1-7 (2018).
- Schneider, B., et al. Model-based reverse translation between veterinary and human medicine: The one health initiative. CPT: Pharmacometrics and Systems Pharmacology. 7 (2), 65-68 (2018).
- Lehmann, R., et al. Human organoids: A new dimension in cell biology. Molecular Biology of the Cell. 30 (10), 1129-1137 (2019).
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
- Kim, J., Koo, B. K., Knoblich, J. A. Human organoids: model systems for human biology and medicine. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 21 (10), 571-584 (2020).
- Jensen, C., Teng, Y. Is it time to start transitioning from 2D to 3D cell culture. Frontiers in Molecular Biosciences. 7, 33 (2020).
- Ho, B. X., Pek, N. M. Q., Soh, B. S. Disease modeling using 3D organoids derived from human induced pluripotent stem cells. International Journal of Molecular Sciences. 19 (4), 936 (2018).
- Truskey, G. A. Human microphysiological systems and organoids as in vitro models for toxicological studies. Frontiers in Public Health. 6, 185 (2018).
- Caipa Garcia, A. L., Arlt, V. M., Phillips, D. H. Organoids for toxicology and genetic toxicology: applications with drugs and prospects for environmental carcinogenesis. Mutagenesis. , (2021).
- Augustyniak, J., et al. Organoids are promising tools for species-specific in vitro toxicological studies. Journal of Applied Toxicology. 39 (12), 1610-1622 (2019).
- Zietek, T., et al. Organoids to study intestinal nutrient transport, drug uptake and metabolism - Update to the human model and expansion of applications. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 577656 (2020).
- Zietek, T., Rath, E., Haller, D., Daniel, H. Intestinal organoids for assessing nutrient transport, sensing and incretin secretion. Scientific Reports. 5 (1), 1-10 (2015).
- Kar, S. K., et al. Organoids: a promising new in vitro platform in livestock and veterinary research. Veterinary Research. 52 (1), 1-17 (2021).
- Borcherding, D. C., et al. Sa1976 polyphenols reverse the pathologic effects of palmitic acid and high fat diet in canine enteroids. Gastroenterology. 158 (6), 486 (2020).
- Ambrosini, Y. M., et al. Recapitulation of the accessible interface of biopsy-derived canine intestinal organoids to study epithelial-luminal interactions. PLoS ONE. 15 (4), 0231423 (2020).
- Zdyrski, C., et al. Su124 homology directed repair in canine duodenal enteroids to mimic the wild-type P-glycoprotein mutation. Gastroenterology. 160 (6), 625 (2021).
- Li, Y., Tang, P., Cai, S., Peng, J., Hua, G. Organoid based personalized medicine: from bench to bedside. Cell Regeneration. 9 (1), 21 (2020).
- Kurr, L. A., Allenspach, K., Jergens, A., Mochel, J. P. Harnessing the biology of intestinal organoids to accelerate drug discovery in inflammatory bowel disease: A one health approach. The FASEB Journal. 34, 1 (2020).
- Nantasanti, S., et al. Disease modeling and gene therapy of copper storage disease in canine hepatic organoids. Stem Cell Reports. 5 (5), 895-907 (2015).
- Favier, R. P., et al. COMMD1-Deficient dogs accumulate copper in hepatocytes and provide a good model for chronic hepatitis and fibrosis. PLoS ONE. 7 (8), 42158 (2012).
- Kruitwagen, H. S., et al. Long-term survival of transplanted autologous canine liver organoids in a COMMD1-deficient dog model of metabolic liver disease. Cells. 9 (2), 410 (2020).
- Vilgelm, A. E., et al. Fine-needle aspiration-based patient-derived cancer organoids. iScience. 23 (8), 101408 (2020).
- Saxena, K., et al. Human intestinal enteroids: A new model to study human rotavirus infection, host restriction, and pathophysiology. Journal of Virology. 90 (1), 43-56 (2016).
- VanDussen, K. L., Sonnek, N. M., Stappenbeck, T. S. L-WRN conditioned medium for gastrointestinal epithelial stem cell culture shows replicable batch-to-batch activity levels across multiple research teams. Stem Cell Research. 37, 101430 (2019).
- Powell, R. H., Behnke, M. S. WRN conditioned media is sufficient for in vitro propagation of intestinal organoids from large farm and small companion animals. Biology Open. 6 (5), 698-705 (2017).
- Mackenzie, J. S., Jeggo, M. The one health approach-why is it so important. Tropical Medicine and Infectious Disease. 4 (2), 88 (2019).
- Artegiani, B., Clevers, H. Use and application of 3D-organoid technology. Human Molecular Genetics. 27 (2), 99-107 (2018).
