Summary
Experimentella metoder för att skörda vuxna stamceller från hund intestinala och levervävnader för att etablera 3D organoid kulturer beskrivs. Dessutom diskuteras laboratorieteknikerna för att säkerställa konsekvent tillväxt och tillhandahålla standardrutiner för att skörda, biobank och återuppliva hund intestinala och leverorganoida kulturer.
Abstract
Hundar utvecklar komplexa multifaktoriella sjukdomar som är analoga med människor, inklusive inflammatoriska sjukdomar, metabola sjukdomar och cancer. Därför representerar de relevanta stora djurmodeller med translationell potential för humanmedicin. Organoider är 3-dimensionella (3D), självmonterade strukturer som härrör från stamceller som efterliknar mikroanatomi och fysiologi hos deras ursprungsorgan. Dessa translationella in vitro-modeller kan användas för drug permeability och discovery applikationer, toxikologi bedömning och för att ge en mekanistisk förståelse av patofysiologi av multifaktoriella kroniska sjukdomar. Dessutom kan hundorganoider förbättra livet för följeslagare, ge input inom olika områden av veterinärforskning och underlätta personliga behandlingsapplikationer inom veterinärmedicinen. En liten grupp donatorer kan skapa en biobank av organoida prover, vilket minskar behovet av kontinuerlig vävnadsskörd, eftersom organoida cellinjer kan underkultureras på obestämd tid. Häri presenteras tre protokoll som fokuserar på kulturen av intestinala och lever hundorganoider som härrör från vuxna stamceller. Canine Organoid Isolation Protocol beskriver metoder för att bearbeta vävnad och inbäddning av cellisolat i en stödjande matris (solubilized extracellulär membranmatris). Canine Organoid Maintenance Protocol beskriver organoid tillväxt och underhåll, inklusive rengöring och passaging tillsammans med lämplig tidpunkt för expansion. Organoid harvesting and biobanking protocol beskriver sätt att extrahera, frysa och bevara organoider för vidare analys.
Introduction
Gnagare är den vanligaste djurmodellen för biomedicinsk och translationell forskning1. De är exceptionellt användbara för att undersöka grundläggande molekylär patogenes av sjukdomarna, även om deras kliniska relevans för kroniska multifaktoriella sjukdomar nyligen har ifrågasatts2. Hundmodellen uppvisar flera fördelar jämfört med gnagare3,4. Hundar och människor delar likheter i metabolomik och tarmmikrobiom som utvecklats på grund av konsumtion av mänsklig kost under olika perioder av deras domesticering5,6,7. Likheter mellan hund och mänsklig gastrointestinal anatomi och fysiologi är ett annat av exemplen8.
Dessutom delar hundar ofta liknande miljöer och livsstilar med sina ägare9. Hundens längre livslängd i jämförelse med gnagare möjliggör naturlig utveckling av många kroniska tillstånd10. Inflammatorisk tarmsjukdom eller metaboliskt syndrom är exempel på multifaktoriella kroniska sjukdomar som delar viktiga likheter mellan människor och hundar11,12. Hund prekliniska prövningar som involverar hundar med naturligt förekommande sjukdomar kan generera mer tillförlitliga data än de som erhållits från gnagaremodeller13. För att minimera användningen av levande djurforskning och följa principerna i 3R (Reduce, Refine, Replace)14 har dock alternativ till in vivo-testning med hjälp av 3D-in vitro-hundorganoider dykt upp15.
Organoider är självmonterade 3D-stamcellsbaserade strukturer som rekapitulerar fysiologin och mikroanatomin i sina ursprungliga organ16,17. Denna teknik beskrevs först av Sato et al. 200917 och möjliggjorde mer översättningsbara in vitro-studier i epitelceller än vad som tidigare var möjligt med hjälp av 2D-cancercellskulturer18,19,20. Organoider är användbara in vitro-modeller inom många biomedicinska discipliner som i preklinisk toxikologiska21,22,23, absorptions- eller metabolismstudier24,25,26,27,28, liksom i personliga medicinska metoder29,30,31 . Den framgångsrika kulturen av hund intestinala organoider har beskrivits för första gången 201912, medan leverorganoider som härrör från en hund först rapporterades av Nantasanti et al. Hundorganoider har sedan dess framgångsrikt använts i studier som undersöker hund kronisk enteropathies, gastrointestinala stromal tumörer, kolorektal adenocarcinom12 och Wilsons sjukdom33,34.
Medan vuxna stamceller kan skördas via obduktioner, kräver den organoida tekniken inte alltid att offra djuren. Endoskopiska och laparoskopiska tarmbiopsier, eller till och med fina nåla aspirationer av organ35, är en livskraftig källa till vuxna stamceller för epitelial organoid isolering12. Utbredd användning av sådana icke-invasiva tekniker i veterinärpraxis underlättar alternativ för omvänd translationell forskning (översättning av information från veterinär klinisk praxis till klinisk praxis på människa och vice versa)15. Ytterligare framsteg av organoid teknik kan säkerställas genom standardisering av organoid kultur och underhållsmetoder. Det organoida protokoll som presenteras här är delvis baserat på tidigare publicerade arbeten av Saxena et al. från 201536, och metoderna anpassades för att passa detaljer i hund intestinala och leverorganoid kultur. Det övergripande arbetsflödet för hundens organoidprotokoll visas i figur 1.
Canine Organoid Isolation Protocol introducerar metoder för att erhålla prover från endoskopisk, laparoskopisk och kirurgiska tarmbiopsier, samt obduktioner. Den beskriver den första förbehandlingen av vävnadsprover och metoder som används för transport till laboratoriet. Material och reagenser som behövs för organoid isolering sammanfattas i avsnittet "Förberedelse för isolering". Processen med vuxna stamcellsisolering från vävnadsprover beskrivs vidare i detalj. Slutligen diskuteras processen att plätera organoider i kupolliknande strukturer med hjälp av en löslubiliserad extracellulär membranmatris.
Det andra protokollet, Canine Organoid Maintenance Protocol, beskriver metoder för att dokumentera och odla organoider. Medieförändringar och deras frekvens diskuteras i det här avsnittet. Dessutom beskrivs laboratorieprocedurer som passaging och rengöring av cellkulturerna, som är nödvändiga för att säkerställa ett framgångsrikt underhåll av 3D-hundorganoider. Lämplig passaging är ett kritiskt steg i protokollet, och möjliga justeringar och felsökning av detta steg diskuteras vidare i manuskriptet.
Det sista protokollet är Canine Organoid Harvesting and Biobanking Protocol som innehåller metoder för att förbereda fullvuxna organoider för paraffininbäddning och RNA-konservering. Metoder för biobanking organoid prover i flytande kväve lagring beskrivs också här. Slutligen diskuteras sätten att tina frysta prover och stödja deras tillväxt.
Sammanfattningsvis syftar denna artikel till att tillhandahålla konsekventa hundorganoida odlingsförfaranden genom standardisering av protokoll mellan laboratorier. Manuskriptet syftar till att underlätta reproducerbarheten av data som härrör från hundorganoidmodeller för att öka deras relevans inom translationell biomedicinsk forskning.
Bild 1: Arbetsflöde för hundorganoidprotokoll. Canine Organoid Isolation Protocol beskriver beredningen av de material som behövs för organoid isolering, skörd av ett vävnadsprov (med hjälp av obduktioner, endoskopisk, laparoskopisk och kirurgiska tarmbiopsier) och vägledning om cellavsociation och plätering av cellpopulationen. Canine Organoid Maintenance Protocol diskuterar rengöring och passaging av den organoida kulturen. I protokollet för organoid skörd och biobanking diskuteras beredning av organoida prover för paraffininbäddning och ytterligare organoid karakterisering. Metoder för biobankorganoida kulturer och återuppliva dem från lagring i flytande kväve diskuteras också. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Protocol
Forskningen godkändes och utfördes i enlighet med Institutional Animal Care and Use Committee vid Iowa State University (IACUC-19-337; IACUC-18-065; IACUC-19-017).
OBS: Följande avsnitt (steg 1-3) beskriver Canine Organoid Isolation Protocol.
1. Förberedelse för isolering
- Transportrör: Innan organoid isolering (vanligtvis 24 h tidigare), fyll ett 50 ml koniskt rör med 10 ml Dulbeccos modifierade Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12 (Advanced DMEM/F12) berikad med 0,2 ml Pen Strep.
- För laparoskopiska, incisionala eller excisional tarmbiopsier, förbered ytterligare tre 50 ml koniska rör. Fyll dessa rör med 10 ml komplett kelateringslösning (1x CCS; se tabell 1).
OBS: För steg 1,2 kan 2 mM N-Acetylcystein (NAC) i Fosfatbuffrad saltlösning (PBS) också användas som en traditionell lösning som används för stamcellsskörd. Det fanns inga skillnader observerades vid användning av 1x CCS eller NAC i PBS. Båda lösningarna läggs till för att frigöra celler i lösningen. - Håll rören vid 4 °C över natten och transportera rören på is under återstoden av protokollet.
- Förbered fem 15 ml centrifugrör med 5 ml 1x CCS, ett 15 ml centrifugrör med 3 ml 1x CCS, ett tomt 15 ml centrifugrör (supernatantrör) och ett 15 ml centrifugrör med 5 ml 1x CCS och 2 ml fetalt bovinserum (FBS).
OBS: Ovanstående kan beredas före isoleringsdagen om flera prover kommer att bearbetas. För illustration, se isoleringsrörets layout i bild 2. - På isoleringsdagen förbereder du en Petri-skål, skalpell, ishink och kall Avancerad DMEM / F12 i biosäkerhetsskåpet. Placera önskat antal 24-brunnscellsodlingsplattor i inkubatorn (37 °C; 5% CO2-atmosfär ) för att förvärma.
- Placera den genomskinliga extracellulära membranmatrisen (ECM; se Materialtabellen) på is för att påbörja upptining.
OBS: Nedsänkning i is skyddar mot snabb upptining och hjälper till att undvika stelning. En låda med pipettspetsar kan placeras i frysen för att hjälpa till att plätera den solubiliserade ECM. - Prechill en centrifug till 4 °C.
- Flytta Kompletta medier med tillväxtfaktorerna CMGF+" eller "organoid media" (se tabell 1 för komposition) från frysen/kylskåpet till ett vattenbad på 37 °C. Undvik direkt ljusexponering när det är möjligt.
Bild 2: Isoleringsrörslayout. Rekommenderad inställning för vävnadsskörd inkluderar 10 ml avancerat DMEM/F12 och 0,2 ml Pen Strep i ett 50 ml centrifugrör. Dessutom krävs tre 50 ml rör fyllda med 10 ml 1x CCS för kirurgiska tarmbiopsier eller obduktioner. Rekommenderad rörlayout för isoleringssteg inkluderar fem rör som innehåller 5 ml 1x CCS som ska användas under CCS tvättsteg. Det första röret används som ett provrör som innehåller den malda vävnaden, och de återstående rören fungerar som reservoarer av 1x CCS som ska läggas till det första röret. Det sjätte röret innehåller 3 ml 1x CCS för att spola den återstående vävnaden från provröret vid överföring till en 6-brunnsplatta. Dessa sex rör kommer att användas före EDTA-inkubationssteget. Ett rör med 5 ml 1x CCS och 2 ml FBS fungerar som ett provrör efter EDTA-inkubation, och supernatant från detta rör överförs med stamceller till ett tomt rör under resten av isoleringen. Håll rören vid 4 °C innan isoleringen påbörjas. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
2. Vävnadsskörd
- Intestinala endoskopiska och laparoskopiska tarmbiopsier (diameter 2,8 mm) kan förvärvas med stora biopsi tång. Skörda minst åtta endoskopiska prover per tarmställe.
- Samla prover direkt i transportrör och placera dem på is.
- För kirurgiska tarmbiopsier och obduktioner, skörda vävnadsbitar med en storlek av 0,5 cm x 0,5 cm och placera dem i det första 1x CCS-röret.
OBS: För tarmbiopsier, ta bort eventuellt återstående tarminnehåll och skrapa slemhinnan med en skalpell för att ta bort villi. Om det finns gott om prover kan ytterligare tarmbiopsier samlas in i kryovialer som innehåller reagens för RNA-lagring (1 ml) eller paraffininbäddad för framtida jämförelse mellan organoider och deras ursprungsvävnad. När det gäller biopsier för TEM-analys ska du inte skrapa villi och förvara provet i konserveringsmedel (3 % paraformaldehyd och 3 % glutaraldehyd i fosfatbuffrad saltlösning (PBS)) och förvara vid 4 °C. - Skaka 1x CCS-röret kraftigt i ~ 30 s och överför sedan provet till ett nytt 1x CCS-rör med tång. Upprepa den här processen två gånger.
- Överför provet från det sista 1x CCS-röret till transportröret (Advanced DMEM/F12 + Pen Strep) och ta tillbaka provet till laboratoriet.
OBS: Prover som förbehandlas på detta sätt kan också skickas över natten på is (skicka inte på torris).
3. Organoid isolering
OBS: Utför isolering med aseptiska tekniker i ett biosäkerhetsskåp. Se bild 3 för arbetsflöde för isolering av hundorganoider.
- Skaka vävnadsprovet i transportröret i ~ 30 s och ta bort överdriven supernatant tills det finns 0,5 ml kvar i röret genom långsam pipettering nära vätskeytan. Var noga med att inte kasta någon vävnad.
- Överför vävnad och återstående supernatant till en steril Petriskål. Använd en engångsskallpell (eller steriliserad tång och sax), skär och hacka vävnaden i mindre bitar (storlek 1 mm2) som liknar en moskonsistens i ca 5 min.
- Pipettera den malda vävnaden med vätska från Petri-skålen till det första CCS-röret. Tillsätt 2 ml avancerat DMEM/F12 i Petri-skålen, spola den återstående vävnaden och överför till det första CCS-röret.
- Virvel 1x CCS-röret i 5 s ungefär fem gånger. Låt tarmbiopsier sätta sig till botten av 15 ml-röret (ca 1 min) och ta bort supernatanten tills det finns 5 ml kvar i röret. Överför 1x CCS från det nya röret till provröret.
- Upprepa föregående steg för de kommande två rören. På de två sista tvättarna, ta bort supernatanten ner till 3 ml kvar i röret.
- Överför tarmbiopsierna och 1x CCS från provröret till en brunn på en 6-välplatta. Tillsätt sedan 3 ml 1x CCS till provröret, snurra försiktigt för att samla in eventuell återstående vävnad och överför till samma brunn på plattan.
- Tillsätt 150 μL 0,5 M EDTA (för att uppnå en total volym på 6,15 ml i en brunn). Placera 6-brunnsplattan på en mutteringsblandare/vippare med 20°, 24 varv/vipp vid 4 °C. Inkubera leverproverna i 10 minuter och tarmproverna i 1 h på den rörliga rockern.
- Transportera 6-brunnsplattan tillbaka till biosäkerhetsskåpet. Överför malet vävnad och vätska till ett 1x CCS/ FBS-rör och låt vävnaderna sätta sig. Transportera supernatanten (denna del innehåller nu fria stamceller) och cirka 0,2 ml av den övre delen av vävnaden till det tomma röret.
- Snurra ner röret som innehåller provet (700 x g i 5 min vid 4 °C). Stamceller pelleteras nu tillsammans med den malda vävnaden. Ta bort och kassera supernatanten försiktigt för att inte störa pelleten.
- Sätt tillbaka pelleten i Advanced DMEM/F12 och snurra röret igen (700 x g i 5 min vid 4 °C). Aspirera supernatanten och stör inte pelleten.
- Beräkna volymen av löslubiliserad ECM som behövs för sådd av de dissocierade cellerna och vävnaden. Använd 30 μL solubiliserad ECM per brunn på en 24-välplatta för att uppnå korrekt såddtäthet.
OBS: Bädda in ett prov efter isolering i 4 till 6 brunnar på en 24-brunnsplatta (dvs. baserat på mängden malet vävnad i provet). - Tillsätt den beräknade volymen av lösgjord ECM i provröret och rör långsamt upp och ner för att undvika bildandet av bubblor. Frö suspensionen i mitten av brunnarna så att den solubiliserade ECM kan bilda en kupolliknande struktur.
OBS: Användning av pipettspetsar från en -20 °C frys hjälper till att plätera solubiliserad ECM. Om vävnadsbitar är större än P200-pipettspetsen, använd breda köldspetsar eller skär kalla P1000-spetsar för att hjälpa till med plätering. Förvara provet med den solubiliserade ECM på is när det är möjligt. - Transportera plattan till en inkubator (37 °C; 5% CO2-atmosfär ) och låt den solubiliserade ECM stelna i ~30 min.
- Blanda ROCK-hämmare och GSK3β i CMGF+ (koncentrationer i tabell 1). Tillsätt 500 μL av denna lösning (CMGF+ R/G) till varje brunn. Placera plattan i inkubatorn (37 °C; 5% CO2 atmosfär ).
Bild 3: Arbetsflöde för isolering av hundorganoider. Det skördade vävnadsprovet överförs till en Petriskål och males ordentligt. Provet överförs sedan till ett 1x CCS-rör och tvättsteg utförs. För EDTA-inkubation i en 6-brunnsplatta överförs provet sedan till ett rör som innehåller 1x CCS och FBS. När vävnaden har lagt sig överförs supernatanten med en liten mängd vävnad till ett tomt rör. Provet snurras följaktligen, supernatanten avlägsnas och pelleten återanvänds i Avancerad DMEM/F12. Röret snurras igen, och supernatanten är insugen och kasserad. Solubiliserad ECM tillsätts till röret, blandas, och provet pläteras i en 24-välplatta. Plattan inkuberas därför (37 °C; 5% CO2-atmosfär ) i 30 min, och media tillsätts sedan. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
OBS: Följande avsnitt (steg 4 och 5) beskriver Canine Organoid Maintenance Protocol. Byt media enligt tabell 2 och kontrollera organoiderna dagligen för tecken på apoptos, förorening, överbeläggning och avskildhet av löslig ECM. Dagliga anteckningar måste göras enligt figur 4 för att noggrant övervaka förhållanden och experimentella effekter på kulturerna. Se kompletterande tabell 1 för en mall som möjliggör korrekt och reproducerbar organoidkulturrelaterad anteckning. För leverorganoider, använd CMGF+ förstärkt med ROCK-hämmare och GSK3β.
Figur 4: Organoidstorleks- och densitetsguide. (A) Organoidstorleksdiagram för noggrann spårning av organoidtillväxt. Storleksguiden innehåller extra små (XS), små (S), medelstora (M), stora (L) och extra stora (XL) kategorier. (B) Densitetsguiden består av mycket låg densitet (VLD), låg densitet (LD), medeldensitet (MD), hög densitet (HD) och mycket hög densitetskategorier (VHD). C) Representativa bilder av bakteriell och svampförorening av det organoida provet. (D) Representativa bilder av organoid överbefolkning och apoptos. Den objektiva förstoringen anges på varje panel. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
| Rekommendation för mediebyte | ||||||
| Måndag | Tisdag | Onsdag | Torsdag | Fredag | Lördag | Söndag |
| 500 μL | Ej tillämpligt | 500 μL | Ej tillämpligt | 750 μL | Ej tillämpligt | Ej tillämpligt |
Tabell 2: Rekommendation om mediebyte. En rekommenderad tidslinje för veckovisa medieändringar. Media (500 μL CMGF+ för intestinala organoider, eller 500 μL CMGF+ R/G för leverorganoider) rekommenderas att ändras varannan dag. För att ta hänsyn till de extra timmarna på en helg läggs 750 μL media till på fredagseftermiddagar, och media uppdateras på måndagsmorgnar.
4. Organoid rengöring
OBS: Organoid rengöring eller passaging måste utföras regelbundet för att underhållet av den organoida kulturens hälsa. Utför rengöringsproceduren när apoptos i kulturen, närvaro av skräp, överbeläggning av organoiderna eller avlägsnande av löslig ECM märks. Se figur 4D.
- Ta bort mediet från brunnarna medan du lutar plattan för att undvika förstörelse av den solubiliserade ECM.
OBS: Om den solubiliserade ECM-lossningen är betydande, rekommenderas det att överföra mediet till 15 ml-röret för att undvika att förlora fragment av löslig ECM som innehåller provet. - Tillsätt 0,5 ml förskjutet avancerat DMEM/F12 till varje brunn för att lösa upp matriskupolerna genom upprepad pipettering med en P1000-spets (undvik att skapa överdrivna bubblor). Överför den organoidhaltiga upplösta matrisen till ett 15 ml centrifugrör. Håll röret på is och om volymen är lägre än 6 ml, fyll långsamt röret med Advanced DMEM/F12 för att nå en total volym på 6 ml.
- Snurra röret (700 x g i 5 min vid 4 °C) och ta bort all supernatant samtidigt som du ser till att inte störa pelleten.
- Tillsätt den erforderliga volymen av solubiliserad ECM (30 μL per brunn för att uppnå korrekt såddtäthet) och återanvänd långsamt pelleten genom pipetterblandning. Plätera fjädringen i mitten av 24-brunnsplattan för att bilda en kupol.
- Placera plattan i en inkubator (37 °C; 5% CO2-atmosfär ) i ~30 min och tillsätt sedan lämplig medievolym (tabell 2).
5. Organoid passaging
OBS: Passaging utförs vanligtvis 5-7 dagar efter den första kulturen för att expandera organoid cellinjen. Organoidkulturer kan vanligtvis utökas i ett 1:3-förhållande. Bilder av friska kulturer redo för passage kan ses i figur 4. Organoider måste vara minst medelstora.
- Utför steg 4.1 till 4.3.
- Ta bort supernatanten och lämna 0,5 ml i röret. Se till att inte störa pelleten.
- Tillsätt 0,5 ml trypsinliknande proteas (se Materialtabell), blanda ordentligt genom att aspirera med en pipett och inkubera i vattenbadet på 37 °C (inkubera tarmorganoider i 8 min eller leverorganoider i 10 minuter). Fortsätt att blanda lösningen genom att snärta röret flera gånger vid inkubationens halvtidspunkt.
- Flytta röret som innehåller provet tillbaka till ett biosäkerhetsskåp och tillsätt långsamt 6 ml förskjutet avancerat DMEM/F12 för att inaktivera trypsinliknande proteas och stoppa dissociationen av cellerna.
- Snurra röret (700 x g i 5 min vid 4 °C) och ta bort supernatanten. Se till att inte störa pelleten.
- Utför steg 4.4. och 4.5.
OBS: Följande avsnitt (steg 6-9) beskriver Organoid Harvesting and Biobanking Protocol. Organoidkulturer måste vara fria från vävnad som har tagits bort under tidigare passager. Kulturer bör också vara friska, åtminstone stora i storlek och medelstora till höga i densitet. Bilder av friska kulturer som är redo för nedströmsapplikationer kan ses i figur 4. Att flytta nedströms med bevarande och skörd av suboptimala organoidkulturer kan ha en negativ inverkan på karakteriseringsresultaten och biobankens livskraft. Granska den rekommenderade 24-brunnsplattan i bild 5.
Bild 5: Rekommenderad 24-brunnsplatta layout. Den rekommenderade layouten av 24-brunnsplattan för grundläggande karakterisering efter expansion av den organoida kulturen. Paraffin-inbäddning av sex brunnar (medelstora till stora organoider med medelhög till hög densitet) möjliggör vanligtvis en hög koncentration av organoider i ett histologiblock. Fyra brunnar av organoider kan poolas till en cryovial med RNA lagring reagens för nedströms applikationer. Fjorton brunnar används för biobankning av de organoida proverna och ger material för upp till sju kryopreserverade injektionsflaska. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
6. Fixering av organoider
- Ta bort media från brunnen och se till att inte störa den solubiliserade ECM-kupolen.
- Tillsätt 500 μL formalin-ättiksyra-alkohollösning som fungerar som fixativ (FAA; sammansättning i tabell 1).
- Förvara organoider i rumstemperatur. Efter 24 timmar, aspirera FAA och fyll brunnen med 70% etanol. Slå in plattorna med ett flexibelt filmtejp i laboratoriet (se Materialtabellen) för att undvika snabb avdunstning. Organoiderna är nu redo för paraffin-inbäddning. Paraffin-inbäddning av den organoida kulturen utförs i traditionella metallbasformar.
7. RNA-bevarande
- Ta bort media från brunnarna och se till att inte störa den solubiliserade ECM-kupolen.
- Använd 0,5 ml förskjutet avancerat DMEM/F12 per brunn för att lösa upp genomskinliga ECM-kupoler genom att upprepade gånger pipettera upp och ner (undvik att skapa överdrivna bubblor). Överför organoiderna till ett 15 ml centrifugrör. Håll röret på is och om volymen är lägre än 6 ml, fyll långsamt röret med Advanced DMEM/F12 för att nå 6 ml total volym.
- Snurra röret (700 x g i 5 min vid 4 °C) och ta bort all supernatant. Se till att inte störa pelleten.
- Tillsätt 100 μL PBS i provröret och återanvänd pelleten genom skonsam pipettering. Överför innehållet i provröret till en kryovial.
- Tillsätt 900 μL reagens för RNA-lagring (se Materialtabell) i provröret och blanda för att samla in eventuella återstående organoider. Överför dessa restorganoider till kryovialen och förvara dem vid -80 °C (vanligtvis räcker det med fyra brunnar som är poolade till en kryovial för nedströmstillämpningar, inklusive qPCR- och RNA-sekvensering).
OBS: En kryovial producerar vanligtvis totalt 4 000 ng RNA (mätt via spektrofotometeranalys).
8. Organoid biobanking
OBS: Biobanking sker vanligtvis 3-4 dagar efter passage. Tecknen på apoptos bör inte vara närvarande i kulturen för att utföra denna metod. Se figur 4 för att referera till storlek och densitet som är lämplig för frysning. Biobank medium till extra-stora organoider vid medelhög till mycket hög densitet. Ett nödstoppssteg kan följas om en organoid cellinje är särskilt sällsynt eller om ytterligare livskraft inte garanteras. Följ samma steg för normal organoid biobanking (steg 8.1 till 8.4). Nödfrysning görs med mindre och mindre täta kulturer. Poola så många brunnar av växande organoider i en cryovial enligt steg 8.1 till 8.4. Tänk på att ett tillräckligt antal organoider måste hållas vid liv i ett försök att utöka kulturen (nödfrysning är helt enkelt en backup-procedur för att skydda mot eventuell förlust av kultur via förorening eller andra oväntade händelser).
- Följ steg 7.1 till 7.3.
- Tillsätt 1 ml frysmedium per kryovial (sammansättning i tabell 1) i provröret och återanvänd pelleten försiktigt genom pipettering upp och ner.
- Överför 1 ml av lösningen till en kryovial (förhållandet mellan två brunnar/cryovial) och håll kryovialerna på is.
- Överför kryovialerna från is till en frysbehållare (fyll regelbundet på behållaren med isopropanol) och överför omedelbart till -80 °C. Flytta proverna till flytande kväve (-196 °C) för långtidslagring efter 24 timmar.
OBS: En alkoholfri cellfrysningsbehållare kan också användas istället för en traditionell. Se till att proverna inte tinar under transport från -80 °C till den långsiktiga flytande kvävelagringen. Upprepad upptining minskar cellkulturens livskraft.
9. Återupplivning från flytande kvävelagring
OBS: När du väljer att tina upp en organoidlinje måste en delmängd av de återupplivade organoiderna återfrysas och ersättas i biobanken så snabbt som möjligt med minst en (helst mer) kryovial.
- Placera solubiliserad ECM på is för att långsamt tina, sätt en 24-välplatta i inkubatorn (37 °C; 5% CO2-atmosfär ) och förbered de nödvändiga reagenserna som ett 15 ml-rör och Avancerat DMEM/F12.
- Återvinn en kryovial som innehåller ett organoidprov från flytande kvävelagring och överför den omedelbart till ett värmebad (37 °C) i 2 minuter.
- Överför innehållet i kryovialen till ett 15 ml centrifugrör i ett biosäkerhetsskåp. Tillsätt långsamt förskjutna avancerade DMEM/F12 för att nå en total volym på 6 ml.
- Snurra röret (700 x g i 5 min vid 4 °C). Ta bort supernatanten och se till att inte störa pelleten.
- Tillsätt 180 μL (30 μL per brunn) solubiliserad ECM till pelleten och plätera denna suspension i den förvärmda 24-brunnsplattan. En cryovial kan pläteras till sex brunnar av en 24-brunnsplatta.
- Placera 24-brunnsplattan i inkubatorn (37 °C; 5% CO2-atmosfär ) i ~ 30 min och tillsätt CMGF + R / G (för intestinala organoider, byt till CMGF + i 24 till 48 h).
OBS: När ett prov pläteras och växer i 24-brunnsplattan måste det vara tillåtet att återhämta sig i minst 2 dagar före passaging för att öka livskraften.
Representative Results
Hundorganoidprotokollet genererar vanligtvis ~ 50 000 till ~ 150 000 tarm- eller leverceller per brunn av en 24-brunnsplatta. Representativa organoider kan ses i figur 6.
Figur 6: Representativa bilder av hundorganoider. Bilder av organoider isolerade med hjälp av detta protokoll avbildas. (A,B) Intestinala organoider som härrör från tolvfingertarmen (tas vid 10x och 5x objektiv förstoring). Notera förekomsten av äldre budded organoider och yngre sfäroider. (C,D) Hund enteroids från den nedre delen av jejunum (tas vid 10x och 20x objektiv förstoring). (E,F) Ileal enteroids (tas vid 20x och 5x objektiv förstoring) och (G,H) kolonoider (tas vid 10x objektiv förstoring). (I) En representativ bild av leverorganoider tagna vid 20x objektiv förstoring. De flesta organoiderna är i sin spirande form. Yngre leversfäroider kan också ses på bilden. (J) Representativ bild som visar en sällsynthepatisk organoid som bildar en kanalliknande struktur (tagen vid 10x objektiv förstoring). Skalstreck (500 μm) finns i det övre vänstra hörnet av varje bild. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Enteroider och kolonoider som härletts med hjälp av detta protokoll karakteriserades tidigare av Chandra et al. Hund intestinala organoider består av en regelbunden cellulär population av tarmepitelet. Med hjälp av RNA in situ hybridisering, uttrycket av stamcellsbiomarkörer (Leucine-Rich Repeat Containing G Protein-Coupled Receptor 5 - LGR5 och SRY-Box Transcription Factor 9 - SOX9), Paneth Cell Biomarker (Ephrin typ-B receptor 2 - EPHB2), absorptiv epitelcell markörer (alkaliska fosfatas - ALP) och enteroendokrina markör (Neurogenin-3) bekräftades. Alcian Blå färgning utfördes på paraffin-inbäddade bilder för att bekräfta förekomsten av bägare celler. Dessutom utfördes funktionella analyser såsom optisk metabolisk imaging (OMI) eller cystisk fibros transmembrane konduktivitet regulator (CFTR) svullnad analys för att bekräfta den metaboliska aktiviteten hos organoiderna. Canine organoider från hundar diagnostiseras med inflammatorisk tarmsjukdom, gastrointestinala stromal tumörer (GIST) eller kolorektal adenocarcinom isolerades också med hjälp av detta protokoll12.
Efter stamcellsisolering börjar leverorganoider sin livscykel som expanderande sfäroider, och efter ~ 7 dagar förvandlas de till spirande och differentierande organoider. Canine lever sfäroider isolerade och odlade enligt detta protokoll mättes för att kvantifiera deras tillväxt och bestämma den idealiska tiden för passage. Spheroids härrör från laparoscopic lever tarmbiopsier av friska vuxna hundar (n = 7) mättes under sina första 7 dagar av kultur. Representativa bilder togs, och den längsgående (a) och diagonala (b) radien av sfäroiderna (n = 845) mättes i hela kulturen. Volymen (V), ytan (P), 2D ellipsområdet (A) och omkretsen (C) av sfäroiderna beräknades. Beräkningarna och resultaten av experimentet sammanfattas i figur 7. 2D ellips område och omkrets användes för att bedöma organoid kulturens hälsa med hjälp av ljus mikroskopi. Dessa värden kan fungera som en vägledning för beslut om kulturunderhåll.
Kortfattat expanderade sfäroider snabbt i volym, yta, 2D-ellipsområde och omkrets. Mätdata från de sju beaglesna var genomsnittliga för följande beräkningar. Volymen ökade med 479% (±6%) från dag 2 till 3. Samtidigt ökade sfäroidytan och 2D-ellipsområdet med 211% (±208%) respektive 209% (±198%). 2D ellipsomkrets ökade från dag 2 till 3 med 73% (±57%). Ökningen av den totala volymen av leverorganoider från dag 2-7 var mer än 365 gånger, ytan och 2D ellipsområdet ökade 49 gånger och 2D ellips omkrets ökade sex gånger.
Därefter odlades sfäroider från två vuxna hundprover ytterligare efter passage och samlades in varje dag (dag 2-7) för RNA in situ hybridisering (RNA ISH). Hundsonder utformades (sondlista tillhandahålls som kompletterande tabell 2), och mRNA-uttryck utvärderades för stamcellsmarkörer (LGR5), markörer som är specifika för cholangiocyter (cytokeratin 7 - KRT-7 och aquaporin 1 - AQP1), liksom hepatocytmarkörer (gaffelboxprotein A1 - FOXA1; och cytokrom P450 3A12 - CYP3A1). Brytpunkternas uttryck bedömdes på ett semikvantitativt sätt (representativa bilder i figur 8). Sfäroider uttryckte företrädesvis cholangiocytmarkören KRT-7 som sträcker sig från 1% till 26% i signalområdet/den totala cellytan. AQP1 uttrycktes inte i organoidproverna, förmodligen eftersom dess förekomst i hund leverprover är sparsam. Stamcellsmarköruttrycket (LGR5) varierade mellan 0,17% till 0,78%, medan hepatocytmarkörer uttrycktes i lägre utsträckning vid 0,05%-0,34% för FOXA1 och 0,03%-0,28% för CYP3A12.
Figur 7: Lever sfäroid mätningar. (A) Lever sfäroid tillväxt observerades varje dag av kulturer från dag 2-7. Spheroids bildades först på dag 2, och de sista sfäroiderna startade den spirande processen på dag 7. Ett efterföljande experiment använde två hundorganoidlinjer efter passage för att skörda sfäroider varje dag för paraffin-inbäddning för att utföra RNA ISH (dag 2 bilden togs vid 40x, dag 6 bild vid 10x, och resten av bilderna togs vid 20x förstoring). (B) Ett leversfäroidkluster visas fäst vid en vävnadsbit inbäddad i solubiliserad ECM 4 dagar efter isolering. Längsgående och diagonal radier av sfäroiderna mättes (bild tagen vid 10x). Panel C visar den formel som används för beräkningar för att härleda volym (V), yta (P), 2D-ellipsområde (A) och omkrets (C). För dessa beräkningar antogs det att hund lever sfäroider är idealiska sfäroider. Resultaten av mätningar av leversfäroidernas volym, yta, 2D-ellipsområde och 2D-ellipsomkrets för enskilda tillväxtdagar visas i panel (D). Felstaplar representerar standardfelet för medelvärdet (SEM). (E) mRNA uttryck av KRT-7, LGR5, FOXA1 och CYP3A12 mättes i prover av hund lever lever sfäroider efter passage av dag 2 till dag 7. AQP1 uttrycktes inte i dessa prover. En skalstång (5x: 500 μm; 10x: 200 μm; 20x: 100 μm; 40x: 50 μm) finns längst upp till vänster på varje bild. Objektiv förstoring noterat. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Organoider skulle sällan inte bryta upp under passaging processen efter denna standardiserade teknik. Om dissociation inte uppstår kan passagetiderna justeras för att uppnå optimal cellklusterupplösning. Långvarig exponering för trypsinliknande proteas kan dock påverka tillväxten av organoiderna negativt. Leverorganoider användes i ett efterföljande experiment för att undersöka den optimala dissociationstiden och upprätta en korrekt passaging-metod. Kort, lever organoider från två friska hundar (6 väl replikerar vardera) var passages med trypsin-liknande proteas för 12 min och 24 min. Proverna var 6:e minut. I slutet av dissociationstiden tillsattes 6 ml iskallt Avancerat DMEM/F12 i lösningen och proverna snurrades (700 x g i 5 minuter vid 4 °C). Supernatanten (Advanced DMEM/F12 med utspädd trypsinliknande proteas) togs bort och pelletsen var inbäddade i lösliga ECM enligt beskrivningen ovan (steg 4,4-4,5). Efter 12 h av kultur i solubilized ECM och CMGF + R/G observerades skillnader i båda proverna. En inkubation på 12 minuter med trypsinliknande proteas hämmade inte organoid tillväxt. Tillväxten av organoider påverkades dock negativt (se figur 9) med en inkubation på 24 minuter.
Figur 9: Canine hepatic organoid passage experiment. Representativa bilder av organoider som härrör från två hundar (D_1 och D_2) som används med den trypsinliknande proteasinkubationsmetoden i 12 min eller 24 min. Kontroll prover var passaged med trypsin-liknande proteas i 10 min. En skalstång (μm) finns längst upp till vänster på varje bild och representerar 500 μm (5x objektiv förstoring). Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Därefter utfördes undersökningen av överlevnadsförmågan hos hund leverorganoider som härrör från detta protokoll i en ogynnsam miljö (berövande av strukturellt stöd och näring). Undersökningen fokuserade på att fastställa volymen av organoid media och källare matris som behövs för leverorganoid framgångsrik tillväxt och överlevnad och även fastställa sådana villkor inflytande på organoid kulturen. Överlevnadsbarhet mättes i en 96-väl tallrik med ett begränsat antal organoider. Organoider från två hundar antogs enligt beskrivningen ovan och inbäddades (12 replikat) i olika volymer av lösgjord ECM (10 μL eller 15 μL). Cellerna pläterades i en koncentration av 400 celler/10 μL väl och 600 celler/15 μL väl motsvarande 40 000 celler/ml. Två medietyper (CMGF+, eller CMGF+ R/G) lades till i olika volymer (25 μL, 30 μL eller 35 μL). Media ändrades aldrig och inga underhållsprocedurer utfördes. Överlevnadsförmågan hos organoiderna övervakades varje dag. Organoid död definierades som upplösningen av mer än 50% av organoid strukturer. Överlevnaden för organoider under dessa förhållanden varierade från 12,9 (±2,3) dagar till 18 (±1,5) dagar, och resultaten sammanfattas i tabell 3. De två prover som överlevde längst var organoider som härrörde från hundar inbäddade i 15 μL av lösgjord ECM och 30 μL CMGF + media. Båda proverna var inbäddade i solubiliserad ECM (30 μL) och färska medier (500 μL) i en standard 24-brunnsplatta efter 18 dagars berövande för att säkerställa att organoidexpansion fortfarande var möjlig (figur 10).
| Medietyp | Medelvärde (överlevde dagar) | Median | CV% | Medelvärde (överlevde dagar) | Median | CV% | Medelvärde (överlevde dagar) | Median | CV% | Medelvärde (överlevde dagar) | Median | CV% | |
| Media (μL) | 30 | 25 | 35 | 30 | |||||||||
| ECM (μL) | 10 | 10 | 10 | 15 | |||||||||
| D_1 | CMGF+ R/G | 12.50 | 13 | 11.57 | 12.83 | 13 | 4.50 | 11.83 | 11.5 | 12.91 | 12.08 | 13 | 12.46 |
| CMGF+ | 17.08 | 17 | 16.26 | 18.50 | 19 | 4.89 | 18.42 | 19 | 14.54 | 17.82 | 19 | 8.99 | |
| D_2 | CMGF+ R/G | 13.67 | 14 | 13.36 | 13.00 | 13 | 12.70 | 14.00 | 14.5 | 17.23 | 13.08 | 13 | 8.90 |
| CMGF+ | 15.50 | 15 | 18.56 | 17.50 | 18 | 10.48 | 17.50 | 19 | 20.89 | 17.00 | 17 | 14.41 | |
| TOTAL | CMGF+ R/G | 13.08 | 13 | 13.13 | 12.92 | 13 | 9.39 | 12.92 | 13 | 17.52 | 12.58 | 13 | 11.22 |
| CMGF+ | 16.29 | 16.5 | 17.69 | 18.00 | 18.5 | 8.35 | 17.96 | 19 | 17.65 | 17.43 | 17 | 11.70 | |
| död= mer än 50% av organoidmassan är ogenomförbar | |||||||||||||
Tabell 3: Resultat av överlevnadsexperiment. Experimentet baserades på berövande av strukturellt stöd eller näring av två organoida kulturer. Resultaten inkluderar medelvärdet, median- och standardavvikelsen (CV%) för individuella koncentrationer av löslig ECM och media hos enskilda hundar.
Figur 10: Organoider näringsmässiga och strukturella berövande. Organoider var replated i 24-brunnsplattor för att bekräfta förmågan till expansion efter fattigdom (A). Representativa bilder från dag 4 och dag 7 efter omplätering visar expansionen av organoiderna, vilket bekräftar förmågan att identifiera livskraftiga organoider visuellt (bilder tas vid 5x objektiv förstoring). Representativa bilder av organoider som anses levande eller döda ses i (B). Bilderna tas vid 5x objektiv förstoring. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 8: Leversfäroider RNA in situ hybridisering representativa bilder. Representativa bilder av LGR5, KRT7, FOXA1 och CYP3A12 markörer togs vid 60x objektiv förstoring av prover från dag 2-7 post passage. Positiva mRNA-molekyler färgar röd. AQP1 uttrycktes inte i proverna. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
| Ofullständig kelatlösning (ICS) komposition | Slutlig koncentration |
| 500 ml H2O | NA |
| 2.49 g Na2HPO4-2H2O | 4,98 mg/ml |
| 2.7 g KH2PO4 | 5,4 mg/ml |
| 14 g NaCl | 28 mg/ml |
| 0,3 g KCl | 0,6 mg/ml |
| 37,5 g Sackaros | 75 mg/ml |
| 25 g D-Sorbitol | 50 mg/ml |
| Komplett kelateringslösning (CCS) komposition | V/V % eller slutlig koncentration |
| Ofullständig chelationslösning | 20% |
| Steril H2O | 80% |
| DTT | 520 μM |
| Penna Strep | Penna: 196 U/mL; Strep 196 ug/mL |
| Organoid media komposition | Slutlig koncentration |
| Avancerad DMEM/F12 | NA |
| FBS | 8% |
| Glutamax | 2 mM |
| HEPES | 10 mM |
| Primocin | 100 μg/mL |
| B27 tillägg | 1x |
| Tillägg till N2 | 1x |
| N-acetyty-L-cystein | 1 mM |
| Murine EGF | 50 ng/mL |
| Murine Noggin | 100 ng/mL |
| Människa R-Spondin-1 | 500 ng/mL |
| Murine Wnt-3a | 100 ng/mL |
| [Leu15]-Gastrin I människa | 10 nM |
| Nikotinamid | 10 mM |
| A-83-01 | 500 nM |
| SB202190 (P38-hämmare) | 10 μM |
| TMS (trimethoprim sulfamethoxazol) | 10 μg/ml |
| Ytterligare komponenter | Slutlig koncentration |
| ROCK-hämmare (Y-27632) | 10 μM |
| Stemolecule CHIR99021 (GSK3β) | 2.5 μM |
| Frysning av mediesammansättning | V/V procent |
| Organoida medier och ROCK-hämmare | 50% |
| FBS | 40% |
| Dimetylsulfoxid (DMSO) | 10% |
| FAA-sammansättning | V/V procent |
| Etanol (100%) | 50% |
| Ättiksyra, Glacial | 5% |
| Formaldehyd (37%) | 10% |
| Destillerat vatten | 35% |
Tabell 1: Sammansättning av lösningar och medier. En lista över komponenter och koncentrationer av ofullständiga och kompletta kelateringslösningar, CMGF+ (organoid media), frysmedia och FAA.
Tilläggstabell 1: Mall för organoid vård. Denna mall möjliggör korrekt och reproducerbar organoid anteckning för varje dag. Klicka här för att ladda ner den här tabellen.
Tilläggstabell 2: RNA in situ hybridiseringssonder. Lista över sonder speciellt utformade för hund mRNA-mål av en tillverkare av tekniken för att utföra RNA in situ hybridiseringsteknik. Information om betydelsen av enskilda markörer, namnet på en avsökning, dess referensnummer och målregion listas. Klicka här för att ladda ner den här tabellen.
Discussion
Det finns för närvarande en brist på standardiserade protokoll tillgängliga för isolering och underhåll av hund lever och intestinala organoider. Fastställande av standardrutiner för organoida kulturer är motiverat för att denna modell ska kunna tillämpas i olika laboratoriemiljöer. Specifikt, att tillhandahålla standardiserade driftsprotokoll för kulturen av dessa hundorganoid modeller är nyckeln till att karakterisera organoider normala tillväxt under kultur och passaging för att härleda optimala tidpunkter för expansion och underhåll. Hund intestinala organoider odlade med hjälp av protokollet har tidigare kännetecknats av Chandra et al.12.
Ett av de mest kritiska stegen i protokollet är passaging av organoider. Den optimala tiden för den första passagen av lever sfäroider bestämdes vara på dag 7 efter isolering baserat på lever sfäroid mätningar. Den maximala volymen av sfäroider uppnåddes dag 7, och samtidigt började sfäroider att knoppa och bildade leverorganoider. Ökningen av den totala organoidvolymen från dag 2-7 efter isolering var mer än 365 gånger, vilket tyder på att den optimala passagetiden är längre än hundens intestinala organoidkultur. Efter 7 dagar i kultur observerades inga grova tecken på cellulär apoptos i leversfäroiden, även utan rengöring eller passaging (figur 7). Passaging intestinala och leverorganoider kan vara utmanande eftersom förfarandet kan leda till förlust av celler och förändrad livskraft. Resultaten visar att långvarig inkubation av leverorganoider med trypsinliknande proteas (upp till 12 min) inte påverkar subkulturen negativt. Inkubation av organoiderna i trypsinliknande proteas längre än 24 min kan vara skadligt för den efterföljande subkulturen av organoiderna.
Vid suboptimal brott i cellklustren med organoid passagen, mekanisk dissociation i stället för långvarig inkubation med trypsin-liknande proteas kan vara mer fördelaktigt. Om problem uppstår med korrekt dissociation av organoiderna, kan kort virvel av proverna försöka förbättra passageutbytet. Å andra sidan har virvelvindar potential att förstöra en kultur och skada celler, så det bör bara användas när andra förfaranden har misslyckats upprepade gånger. Att bryta leverorganoider i enstaka celler sänker tillväxttakten hos organoiderna, samtidigt som de bryts in i kluster av celler kan avsevärt förbättra deras livskraft. Tio minuter valdes som inkubationstid för det organoida protokollet. En inkubationstid på 12 minuter bedömdes inte vara cytotoxisk jämfört med en inkubation på 24 minuter i det trypsinliknande proteasexperimentet.
Överlevnadsexperimentet bekräftade att hund leverorganoider kunde överleva i upp till 19,5 dagar under ogynnsamma förhållanden (strukturell och näringsmässig utarmning). Organoider som överlevde dessa villkor längst odlades med CMGF + media. Denna observation kan ha orsakats av långsammare tillväxt av leverorganoider i medier som inte kompletterats med Rock inhibitor och GSK3β. Organoid kulturer med CMGF + R/G växte snabbare och kan ha utarmat sina resurser snabbare. Detta experiment öppnar möjligheter att miniatyrisera hundens organoidkultur för att uppnå en hög genomströmningssystemkonvertering. En sådan teknik visar på potentialen att underlätta läkemedelsupptäckt eller toxikologiska studier till en väsentligt reducerad kostnad.
Några vanliga problem som uppstår under hundorganoid kultur underhåll är felaktig prov stelning vid plätering, kultur förorening, och fastställa rätt densitet och storlek av organoider. Om solubiliserad ECM stelnar i förtid under plätering, placera den omedelbart på is i 10 minuter. Om solubiliserad ECM inte bildar kupolliknande strukturer är det troligt att inte tillräckligt med media togs bort från provet. Om så är fallet, späd provet med en mer lösgjord ECM tills kupoler bildas.
När svamp- eller bakterieförorening finns i en hel platta (se figur 4) är den bästa lösningen att kassera plattan. Behandling med svampdödande eller antibiotiska läkemedel kan försökas, men framgången med ett sådant försök är extremt låg. Om en enda brunn är förorenad i en platta kan livskraftiga och opåverkade brunnar rengöras (följ steg 4.1 till 4.5) till en ny platta och övervakas noggrant. Om provet redan har varit Emergency Frozen, är det lämpligt att kassera hela provet, eftersom upptining av provet utsätter inkubatorn för ytterligare föroreningsrisk.
En hälsosam organoidkultur bör åtminstone vara i kategorin medelstorlek och medeldensitet eller större. Optimal densitet är avgörande för organoid kultur tillväxt. Lägre densitet måste korrigeras genom rengöring av organoiderna till medeldensitet. Om situationen med extrem densitet uppstår (överbeläggning) bör organoiderna utökas till fler brunnar. Grova tecken på cellulär apoptos åtföljer ofta både överbefolkning och låg densitet av den organoida kulturen. Om dessa frågor inte korrigeras i tid kommer hela den organoida kulturen att bli apokatisk på några dagar. Om organoider uppnår extra stor storlek eller mycket hög densitet, bör kulturen användas för ett experiment, frysning eller fixering.
Organoidmedierna innehåller för närvarande 17 komponenter, och tillägg av tillväxtfaktorer som behövs för organoid underhåll och expansion kan därför vara dyrt. Detta problem kan lösas genom att växa 2D-cellkulturer som syntetiserar tillväxtfaktorerna för att producera betingade CMGF +. Cellodling L-WRN producerar Wnt-3a, R-Spondin-3 och Noggin tillväxtfaktorer37. Cellkolonin använder 90% DMEM/F12 och 10% FBS-kulturmedier. När kulturen uppnår 90 procent sammanflöde skördas media varje dag i 1 vecka. Det skördade mediet blandas sedan med 2x CMGF+ (utan dessa tillväxtfaktorer). Medan 2D-kulturer kan producera de nödvändiga tillväxtfaktorerna till en bråkdel av kostnaden, måste den extra tiden och förberedelserna för att producera media förväntas. Koncentrationerna av tillväxtfaktorer mellan konditionerade mediepartier kan också skilja sig37,38.
Canine vuxna stamcells-härledda organoidkulturer är en unik biomedicinsk modell som kan bidra till att uppnå målen för One Health Initiative39. Den organoida tekniken kan användas inom många grundläggande och biomedicinska forskningsområden, som sträcker sig från utvecklingsbiologi, patofysiologi, läkemedelsupptäckt och testning, toxikologi till studier av infektionssjukdomar och regenerativ medicin40. Translationell och omvänd translationell forskning är båda områden där hundorganoider är tillämpliga15. Hundar har använts i århundraden i translationella experimentella miljöer, och deras följeslagare djurstatus har också underlättat deras position som en av de mest utforskade arterna inom veterinärmedicin.
Sammanfattningsvis ger detta manuskript standardiserade driftsprotokoll för isolering, underhåll, skörd och biobanking av hund lever och intestinala organoider för att underlätta tillämpningen av denna modell inom olika biomedicinska områden. Denna modell är unikt lämplig för att främja omvänd translationell forskning som ett verktyg i One Health Initiative för att främja ett interdisciplinärt och tvärvetenskapligt kunskapsutbyte.
Disclosures
K. Allenspach är en av grundarna av LifEngine Animal Health och 3D Health Solutions. Hon är konsult för Ceva Animal Health, Bioiberica, LifeDiagnostics, Antech Diagnostics, Deerland Probiotics och Mars. J. P. Mochel är en av grundarna av LifEngine Animal Health och 3D Health Solutions. Dr. Mochel fungerar som konsult för Ceva Animal Health och Ethos Animal Health. Andra författare har inga intressekonflikter att deklarera.
Acknowledgments
Författarna vill uttrycka tacksamhet till Veterinary Diagnostic Laboratory of Iowa State University anställda, nämligen Haley M. Lambert, Emily Rahe, Rosalyn M. Branaman, Victoria J. Green och Jennifer M. Groeltz-Thrush, för snabb behandling av de prover som tillhandahålls. Författarna vill bekräfta stöd från Faculty Startup, ISU VPR Miller Award, ISU VPR Miller Award och NSF SBIR-underutmärkelsen till ISU # 1912948.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chelating solution | |||
| D-Sorbitol | Fisher Chemical | BP439-500 | |
| DTT | Promega | V3151 | |
| KCl | Fisher Chemical | P217-500 | |
| KH2PO4 | Sigma | P5655-100G | |
| Na2HPO4-2H2O | Sigma | S5136-100G | |
| NaCl | Fisher Chemical | S271-500 | |
| Pen Strep | Gibco | 15140-122 | |
| Sucrose | Fisher Chemical | S5-500 | |
| Organoid media | |||
| [Leu15]-Gastrin I human | Sigma | G9145-.5MG | |
| A-83-01 | PeproTech | 9094360 | |
| Advanced DMEM/F12 | Gibco | 12634-010 | |
| B27 supplement | Gibco | 17504-044 | |
| FBS | Corning | 35-010-CV | |
| Glutamax | Gibco | 35050-061 | |
| HEPES | VWR Life Science | J848-500ML | |
| Human R-Spondin-1 | PeproTech | 120-38-500UG | |
| Murine EGF | PeproTech | 315-09-1MG | |
| Murine Noggin | PeproTech | 250-38-250UG | |
| Murine Wnt-3a | PeproTech | 315-20-10UG | |
| N2 supplement | Gibco | 17502-048 | |
| N-Acetyl-L-cysteine | Sigma | A9165-25G | |
| Nicotinamide | Sigma | N0636-100G | |
| Primocin | InvivoGen | ant-pm-1 | |
| ROCK inhibitor (Y-27632) | EMD Millipore Corp. | SCM 075 | |
| SB202190 (P38 inhibitor) | Sigma | S7067-25MG | |
| Stemolecule CHIR99021 (GSK3β) | Reprocell | 04-0004-base | |
| Trimethoprim | Sigma | T7883-5G | |
| Sulfamethoxazole | Sigma-Aldrich | S7507-10G | |
| Reagents | |||
| Acetic Acid, Glacial | Fisher Chemical | A38-500 | |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Fisher Chemicals | D128-500 | |
| EDTA, pH 8.0, 0.5 M | Invitrogen | 15575-038 | |
| Formaldehyde (37%) | Fisher Chemical | F79P-4 | |
| Glutaraldehyde solution | Sigma | G5882 | |
| Matrigel Matrix For Organoid Culture | Corning | 356255 | Extracellular Membrane Matrix |
| Paraformaldehyde, 97% | Alfa Aesar | A11313 | |
| PBS, 1X (Phosphate-Buffered Saline) | Corning | 21-040-CM | |
| PBS, 1X (Phosphate-Buffered Saline) | Corning | 21-040-CM | |
| RNAlater Soln. | Invitrogen | AM7021 | RNA Storage Reagent |
| TrypLE Express | Gibco | 12604-021 | Trypsin-like Protease |
| Other | |||
| 6 Well Cell Culture Plate | Corning | 3516 | |
| ACD Hybez II Hybridization System | ACD a biotechne brand | 321710 | |
| Centrifuge Tube, 15 mL | Corning | 430766 | |
| CoolCell LX | Corning | BCS-405MC | |
| Cryogenic Vials | Corning | 430488 | |
| Disposable Centrifuge Tube (50 mL) | Fisherbrand | 05-539-13 | |
| GyroMini Nutating mixer (Rocker) | Labnet | S0500-230V-EU | |
| Heat Bath | Lab-Line Instruments | 3000 | |
| Mr. Frosty Freezing Container | ThermoFisher Scientific | 5100-0001 | |
| NanoDrop 2000 | ThermoFisher Scientific | ND2000CLAPTOP | SpectrophotometerAnalysis |
| Panasonic incubator | Panasonic | MCO-170ML-PA | |
| Parafilm M Wrapping Film | Bemis Company Inc | PM996/EMD | Laboratory Flexible Film Tape |
| Protected Disposable Scalpels | Bard-Parker | 239844 | |
| RNAscope 2.5 HD Assay – RED | ACD a biotechne brand | 322350 | |
| RNAscope H2O2 & Protease Plus Reagents | ACD a biotechne brand | 322330 | |
| RNAscope Target Retrieval Reagents | ACD a biotechne brand | 322000 | |
| RNAscope Wash Buffer Reagents | ACD a biotechne brand | 310091 | |
| Tissue Culture Dish | Dot Scientific | 6676621 | |
| Tissue Culture Plate 24 wells | Fisherbrand | FB012929 |
References
- Hickman, D. L., Johnson, J., Vemulapalli, T. H., Crisler, J. R., Shepherd, R.
- De Jong, M., Maina, T. Of mice and humans: Are they the same? - Implications in cancer translational research. Journal of Nuclear Medicine. 51 (4), 501-504 (2010).
- Cannarozzi, G., Schneider, A., Gonnet, G. A phylogenomic study of human, dog, and mouse. PLoS Computational Biology. 3 (1), 0009-0014 (2007).
- Jacob, J. A. Researchers turn to canine clinical trials to advance cancer therapies. JAMA - Journal of the American Medical Association. 315 (15), 1550-1552 (2016).
- Ziegler, A., Gonzalez, L., Blikslager, A. Large animal models: The key to translational discovery in digestive disease research. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 2 (6), 716-724 (2016).
- Swanson, K. S., et al. Phylogenetic and gene-centric metagenomics of the canine intestinal microbiome reveals similarities with humans and mice. ISME Journal. 5 (4), 639-649 (2011).
- Coelho, L. P., et al. Similarity of the dog and human gut microbiomes in gene content and response to diet. Microbiome. 6 (1), 72 (2018).
- Nguyen, T. L. A., Vieira-Silva, S., Liston, A., Raes, J. How informative is the mouse for human gut microbiota research. DMM Disease Models and Mechanisms. 8 (1), 1-16 (2015).
- Bontempo, V. Nutrition and health of dogs and cats: Evolution of petfood. Veterinary Research Communications. 29, 45-50 (2005).
- Allenspach, K., Gaschen, F. Canine chronic enteropathies: A review. Schweizer Archiv fur Tierheilkunde. 145 (5), 209-222 (2003).
- Tribuddharatana, T., Kongpiromchean, Y., Sribhen, K., Sribhen, C. Biochemical alterations and their relationships with the metabolic syndrome components in canine obesity. Kasetsart Journal - Natural Science. 45 (4), 622-628 (2011).
- Chandra, L., et al. Derivation of adult canine intestinal organoids for translational research in gastroenterology. BMC Biology. 17 (1), 33 (2019).
- Schaefer, K., Rensing, S., Hillen, H., Burkhardt, J. E., Germann, P. G. Is Science the only driver in species selection? An internal study to evaluate compound requirements in the minipig compared to the dog in preclinical studies. Toxicologic Pathology. 44 (3), 474-479 (2016).
- MacArthur Clark, J. The 3Rs in research: A contemporary approach to replacement, reduction and refinement. British Journal of Nutrition. 120, 1-7 (2018).
- Schneider, B., et al. Model-based reverse translation between veterinary and human medicine: The one health initiative. CPT: Pharmacometrics and Systems Pharmacology. 7 (2), 65-68 (2018).
- Lehmann, R., et al. Human organoids: A new dimension in cell biology. Molecular Biology of the Cell. 30 (10), 1129-1137 (2019).
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
- Kim, J., Koo, B. K., Knoblich, J. A. Human organoids: model systems for human biology and medicine. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 21 (10), 571-584 (2020).
- Jensen, C., Teng, Y. Is it time to start transitioning from 2D to 3D cell culture. Frontiers in Molecular Biosciences. 7, 33 (2020).
- Ho, B. X., Pek, N. M. Q., Soh, B. S. Disease modeling using 3D organoids derived from human induced pluripotent stem cells. International Journal of Molecular Sciences. 19 (4), 936 (2018).
- Truskey, G. A. Human microphysiological systems and organoids as in vitro models for toxicological studies. Frontiers in Public Health. 6, 185 (2018).
- Caipa Garcia, A. L., Arlt, V. M., Phillips, D. H. Organoids for toxicology and genetic toxicology: applications with drugs and prospects for environmental carcinogenesis. Mutagenesis. , (2021).
- Augustyniak, J., et al. Organoids are promising tools for species-specific in vitro toxicological studies. Journal of Applied Toxicology. 39 (12), 1610-1622 (2019).
- Zietek, T., et al. Organoids to study intestinal nutrient transport, drug uptake and metabolism - Update to the human model and expansion of applications. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 577656 (2020).
- Zietek, T., Rath, E., Haller, D., Daniel, H. Intestinal organoids for assessing nutrient transport, sensing and incretin secretion. Scientific Reports. 5 (1), 1-10 (2015).
- Kar, S. K., et al. Organoids: a promising new in vitro platform in livestock and veterinary research. Veterinary Research. 52 (1), 1-17 (2021).
- Borcherding, D. C., et al. Sa1976 polyphenols reverse the pathologic effects of palmitic acid and high fat diet in canine enteroids. Gastroenterology. 158 (6), 486 (2020).
- Ambrosini, Y. M., et al. Recapitulation of the accessible interface of biopsy-derived canine intestinal organoids to study epithelial-luminal interactions. PLoS ONE. 15 (4), 0231423 (2020).
- Zdyrski, C., et al. Su124 homology directed repair in canine duodenal enteroids to mimic the wild-type P-glycoprotein mutation. Gastroenterology. 160 (6), 625 (2021).
- Li, Y., Tang, P., Cai, S., Peng, J., Hua, G. Organoid based personalized medicine: from bench to bedside. Cell Regeneration. 9 (1), 21 (2020).
- Kurr, L. A., Allenspach, K., Jergens, A., Mochel, J. P. Harnessing the biology of intestinal organoids to accelerate drug discovery in inflammatory bowel disease: A one health approach. The FASEB Journal. 34, 1 (2020).
- Nantasanti, S., et al. Disease modeling and gene therapy of copper storage disease in canine hepatic organoids. Stem Cell Reports. 5 (5), 895-907 (2015).
- Favier, R. P., et al. COMMD1-Deficient dogs accumulate copper in hepatocytes and provide a good model for chronic hepatitis and fibrosis. PLoS ONE. 7 (8), 42158 (2012).
- Kruitwagen, H. S., et al. Long-term survival of transplanted autologous canine liver organoids in a COMMD1-deficient dog model of metabolic liver disease. Cells. 9 (2), 410 (2020).
- Vilgelm, A. E., et al. Fine-needle aspiration-based patient-derived cancer organoids. iScience. 23 (8), 101408 (2020).
- Saxena, K., et al. Human intestinal enteroids: A new model to study human rotavirus infection, host restriction, and pathophysiology. Journal of Virology. 90 (1), 43-56 (2016).
- VanDussen, K. L., Sonnek, N. M., Stappenbeck, T. S. L-WRN conditioned medium for gastrointestinal epithelial stem cell culture shows replicable batch-to-batch activity levels across multiple research teams. Stem Cell Research. 37, 101430 (2019).
- Powell, R. H., Behnke, M. S. WRN conditioned media is sufficient for in vitro propagation of intestinal organoids from large farm and small companion animals. Biology Open. 6 (5), 698-705 (2017).
- Mackenzie, J. S., Jeggo, M. The one health approach-why is it so important. Tropical Medicine and Infectious Disease. 4 (2), 88 (2019).
- Artegiani, B., Clevers, H. Use and application of 3D-organoid technology. Human Molecular Genetics. 27 (2), 99-107 (2018).
