Summary
胚胎中特定细胞的破坏是研究参与细胞命运的细胞相互作用的有力工具。本方案描述了用于在褐藻裂殖质的早期胚胎中激光消融靶细胞 的技术。
Abstract
在 裂殖质中，胚胎发育为称为层或叶片的单层细胞片。每个胚胎细胞都易于观察，很容易与其邻居区分开来，并且可以单独靶向。几十年来，激光消融一直用于研究胚胎发育。在这里，为褐藻狭 长链球菌的早期胚胎开发了细胞特异性激光消融方案。所介绍的工作包括：（1） 糖精 胚胎的制备，描述关键参数，包括培养条件，（2）激光消融设置，以及（3）使用延时显微镜监测受照射胚胎的后续生长。此外，还提供了有关将胚胎从成像平台运输回实验室的最佳条件的详细信息，这可能会对随后的胚胎发育产生深远的影响。属于海带目藻的藻类显示出类似于 糖精的 胚胎发生模式，因此该方案可以很容易地转移到该分类群中的其他物种。
Introduction
激光消融已经使用了几十年来研究胚胎发育。用激光束照射胚胎细胞可以监测胚胎发生过程中细胞系的再生电位和修饰，并研究靶向消融对细胞分裂和细胞命运的影响。激光消融方法中使用的模式生物通常是动物，如昆虫1，2，线虫3，4，脊椎动物5，6，偶尔植物7，8。此外，1994年和1998年在褐藻 墨角上 使用了激光微消融方法，以证明细胞壁在早期胚胎9，10的光极化中的作用。
褐藻属于星云藻类，在16亿年前在真核生物树的根部分化。因此，它们在系统发育上独立于其他多细胞生物，例如动物和植物11。糖精属於海带目，通常被称为海带，它们是地球上最大的生物之一，大小超过30米。 13.其养殖主要在亚洲，最近在欧洲，需要在孵化场准备胚胎，然后在公海释放幼鱼。像所有海带一样，它具有一个双相生命周期，由微观配子体阶段组成，在此期间，单倍体配子体生长并产生配子用于受精，以及二倍体宏观孢子体阶段，其中大型平面叶片从附着在海底或岩石上的固定物发展而来。孢子体在成熟时释放单倍体孢子，从而完成生命周期14，15，16。
裂头孢子虫 呈现出一些有趣的形态特征17.它的胚胎发育成单层平面片15，18，19，然后获得多层结构，与不同组织类型的出现相吻合。此外，海带是仅有的褐藻类群之一，其胚胎仍然附着在母体配子体组织上（去角膜动物和孢子囊藻也这样做15）。该特征提供了研究母体组织在这一发育过程中的作用的机会，并将褐藻中的母体控制机制与动物和植物中的母体控制机制进行比较。
本文介绍了早期海带胚胎中激光消融的第一个完整的方案。该协议涉及UV ns脉冲技术，导致单个胚胎细胞的特定破坏，以研究它们在胚胎发生过程中各自的作用。该程序为研究海带胚胎发生过程中的细胞相互作用和细胞命运提供了一种可靠的方法。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. 配子体甘草的产生
- 从野外收集乳突鱼的成熟孢子植物，如前所述20，21。确保选定的孢子植物没有附生植物（在叶片表面上可见的小生物）或内部寄生虫（在叶片的漂白区域或斑点中发现）。
- 使用手术刀，将刀片中心最暗的部分（可育孢子产生组织22）切成1-5个正方形（1cm²），避免任何漂白的斑点（如果存在）。
- 用手术刀背面和一些吸水纸轻轻清洁切割的碎片，以去除任何剩余的附生植物。
- 将清洁后的碎片放入装有无菌天然海水（见 材料表）的玻璃盘中45分钟，以释放先前发布的报告22后的孢子。
- 取下刀片片，通过40μm细胞过滤器过滤海水，以清除碎屑或不需要的生物体。
- 将滤液中的孢子稀释至塑料培养皿22中的20-40 sor / mL浓度。
- 将孢子溶液置于具有最佳培养条件（13°C，24μE.m-2.s-1，光周期16：8 L：D）的培养柜中（参见材料表）。
- 让孢子萌发并发育成配子体。
注意：孢子在柜中2天后可见，配子体细胞的第一次细胞分裂通常发生在随后的48小时内。 - 5天后用微滤的天然海水替换生长培养基，其中富含0.5x Provasoli溶液（NSW1 / 2）（参见 材料表）。
注意：为了避免重复这些步骤，可以选择特定的雄性和雌性配子体并无性繁殖数月。在上述相同培养条件下（4 μE.m-2.s-1，波长至少为580nm）23（步骤1.7）23下生长时，配子体保持营养。
2. 卵子发生的破碎和诱导
- 用细胞刮刀收获配子体。
- 使用小塑料杵，将收集的配子体在1.5 mL管中粉碎成4-5个细胞块。
- 用1 mL NSW1 / 2填充管（步骤1.9）。
- 将2.5μL粉碎的配子体溶液加入富含1x Provasoli溶液（NSW）的3mL天然海水中，并将其置于培养皿中。
注意：建议使用 25 mm 的玻璃底培养皿，以便于操作。 - 将准备好的菜肴放入培养柜中，并在13°C下以24μE.m-2.s-1（暗光，光周期16：8 L：D）的白光诱导配子发生。
注意：第一个配子体（雌性卵形和雄性弓形）可以在5天后观察到。雄性是超支化的，有小细胞，雌性由较大的细胞组成，形成长丝15，22。第一个卵子在大约10天后被观察到，受精卵的第一次分裂通常发生在接下来的2天内。 - 观察第一个鸡蛋六天后，将培养皿转移到较亮的白光条件下：50μE.m-2.s-1，光周期16：8 L：D，仍保持在13°C。
3. 图像采集，用于选择胚胎进行消融并监测随后的生长
- 对整个培养皿进行成像，以（重新）定位在消融步骤中选择的胚胎（无需将培养皿返回到眼部显微镜），并监测所选胚胎的后续发育。
注意：使用倒置激光扫描共聚焦显微镜（参见 材料表）进行成像（图1），并在步骤5中描述了激光消融。 - 将培养皿放在舞台上，并用视觉标记定向（例如，用永久标记画一条线）。
- 使用10x/0.45物镜聚焦于胚胎。记录培养皿的四个基点的位置。
- 开始磁贴扫描。以低分辨率采集整个培养皿的透射/荧光图像：256 x 256像素，双向扫描时像素停留时间为1.54 μs，使用561 nm激光以1.2%透射率为0.6x的数字变焦。
注意：对于225块瓷砖，整个2.5厘米培养皿的扫描时间约为6分钟（图2）。在这里，561 nm激光器用于透射和荧光成像。在共聚焦光电倍增管（PMT）上收集580-720 nm之间的荧光信号，并在透射PMT上收集透射光。561nm激光也可以在此步骤中监测叶绿素，但这是不必要的，因为它只有助于正确区分信号噪声和生物体。 - 保存图块扫描图像，并在图像采集软件（参见 材料表）窗口中保持打开状态。
- 改变目标，不要取下培养皿。
注意：40x/1.2水物镜被移动到载物台的一侧，以便可以将浸入介质（水）添加到物镜中，而无需将培养皿从其初始位置移开。 - 浏览先前获取的瓷砖扫描图像以选择合适的胚胎。一旦在此图像上鉴定出胚胎，将载物台移动到胚胎的确切位置，并以高分辨率获得该胚胎的透射/荧光图像。
注：高分辨率设置：512 x 512 像素、0.130 μm/像素、0.208 μs 像素停留时间（单向扫描）和 2 倍数字变焦（使用 561 nm 激光，透射率为 0.9%）。 - 注释每个候选激光消融胚胎的切片扫描图像（图2B），然后继续进行激光消融步骤。
4. 激光校准
- 校准激光器，并在“点击&射击模式”下将图像采集软件与激光驱动软件以及脉冲355 nm激光器同步。
注：此步骤对于确保激光驱动器软件中的鼠标光标位置（参见 材料表）与采集软件实时图像中的位置完美同步至关重要。 - 打开激光驱动软件包，在图像采集软件包中单击 Live 。
- 通过单击激光驱动程序软件包中的 “开始采集”来 同步两个软件包。实时图像现在也记录在紫外激光驱动器软件中。
- 通过单击“选择AOI”按钮并单击紫外激光驱动程序软件包中的图像边缘（右侧，左侧，顶部和底部）来定义感兴趣区域（ AOI ）。
注：完成此校准步骤后，采集软件包中的像素大小、图像格式和放大设置必须保持不变。 - 选择培养皿上的空白区域，并将载物台的水平降低到样品焦平面下方20μm，以聚焦在玻璃底部。
- 通过单击开始校准并选择手动校准来设置烧蚀激光器和成像激光轨迹。
- 选择足够高的激光功率，以便在实时图像的中心看到一个黑点，对应于玻璃盖玻片上的孔（所有百叶窗必须打开）。
- 用鼠标光标单击此中央黑点，然后单击软件建议的 另外18个点 以完成对齐过程。
- 在同一盖玻片上的“单击>射击模式”中检查校准。
注：激光校准取决于成像参数。校准激光后，确保成像参数（即 512 x 512 像素、0.130 μm/像素、单向扫描和 2 倍数字变焦时的 0.208 μs 像素停留时间）未发生更改。
5. 激光烧蚀
- 选择感兴趣的胚胎。在图像采集软件中开始延时录制。
- 使用40x/1.2 W物镜以高分辨率（即512 x 512像素，0.130μm/像素，单向扫描1.54μs像素停留时间）采集透射/荧光图像，并使用561 nm激光以0.9%透射率进行2倍数字变焦）。以最大速度获取延时录制。
- 缩小延时拍摄开始时的区域。放大自动操作系统。
- 使用激光驱动软件的“咔哒声”功能对胚胎中感兴趣的细胞施加破坏性照射。使用以下参数：45%激光透射率（相当于最大40 μW）和1 ms脉冲持续时间（步骤4）。
注：建议在激光拍摄期间进行视频录制。 - 在688nm下，监测细胞质中自发荧光叶绿体的射出。
- 如果单元格内容保留在单元格中，请再次使用“单击&触发”功能来增加单元格中违规的大小。重复此步骤，将拍摄次数保持在最低限度，直到大部分细胞内容被释放。
- 在胚胎稳定后停止延时记录（即，不能检测到进一步的细胞内运动（约1-5分钟）。
- 如有必要，请更新切片扫描图像上的批注。
6. 监测受辐照胚胎的生长
注意：监视在几天内进行。
- 通过监测激光消融后发育的胚胎数量并确定存活率，并将其与死亡胚胎进行比较。
注意：由于各种原因，一些胚胎在消融后立即死亡。高而快速的死亡率通常是在实验或随后的运输过程中激光参数不合适或更高/更长时间暴露于应力的迹象。 - 通过每天测量激光注射胚胎的长度并将其与完整胚胎进行比较来确定生长延迟。
注意：激光照射生物的生长速度通常比未经治疗的生物体慢。然而，一些（不适当的）激光设置可以抑制生长超过一周，之后生长恢复。 - 通过监测与消融细胞相邻的细胞的反应来找出相邻的损伤。在某些情况下，突发后减压可能导致邻近细胞破裂。
- 检查微生物污染。监测培养基中微藻和细菌的生长。如果培养皿中存在异常水平的微生物，则将其丢弃并重复步骤2或步骤3中的方案。
注意：激光消融后，受损 的乳突乳突鱼 胚胎已经受到高度压力，额外的外部压力会导致死亡率增加。细菌或病毒爆发是可能的，因为治疗过的胚胎不能在轴轭条件下生长。 - 通过研究表型并了解在目标区域发育中的作用，检查注射生物的全球发育。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
生长 裂 头孢子体，诱导配子发生产生受精卵和胚胎。在配子发生诱导后12天，胚胎接受了激光消融。在这里，实验旨在评估特定细胞在 乳突乳酸链球菌 胚胎整体发育中的作用。靶向最顶端的细胞，最基底细胞和正中细胞。在瓷砖扫描后，整个培养皿（图2A），一个感兴趣的胚胎，被确定为适合激光射击的候选者（图2B）。选择该胚胎的特定细胞，靶向，并用脉冲紫外激光束照射，激光功率最大为40μW（相当于此处所用设备最大功率的45%），持续1毫秒（电影 1）。细胞释放其内容物（叶绿体和细胞质）。有趣的是，相邻细胞通过扩展到细胞间空间来响应受照射细胞的破裂。记录照射胚胎的位置，以便在10天内进行后续监测（图3）。大多数辐照胚胎继续发育，但显示出生长改变（胚胎形状）。在将特定功能归因于每个受照射细胞控制整体发育机制之前，需要对形态变化进行详细分析。
相比之下，使用其他激光参数测试的胚胎（例如，在60%-80%激光功率的拍摄持续时间内为33毫秒; 电影 2）很快显示出严重压力的迹象，如细胞漂白，褪色或形状变化（四舍五入）。几乎所有以这种方式拍摄的胚胎在实验后五天内死亡（图4）。
图1：激光消融显微镜设置的照片，请点击此处查看此图的大图。
图2：整个培养皿的带注释的瓷砖 扫描（A）用于激光烧蚀的整个培养皿的瓷砖扫描。透射PMT用于获得明场扫描。一旦找到感兴趣的胚胎，用户在瓷砖扫描中单击胚胎的位置，软件将阶段直接定位在胚胎上。（B）然后可以专门注释瓷砖扫描，以便在后续步骤中定位胚胎，以跟踪和监测胚胎。在这里，图像显示了附着在培养皿底部的胚胎，可以使用561nm激光轻松定位。 请点击此处查看此图的大图。
图3：照射后生长的 乳酸链球菌 胚胎的时间序列。 这在电影1中有所体现。激光消融胚胎最顶端的细胞没有漂白胚胎的相邻细胞。它们继续生长和分裂，几天后形成一个正常的胚胎。消融后2-9天每24小时拍摄一次图像。比例尺为 50 μm，所有照片都相同。D2-D9 对应于第 2 天到第 9 天。 请点击此处查看此图的大图。
图4：使用次优参数进行激光消融后 乳酸链球菌 胚胎死亡的时间序列。 过度暴露于激光照射很容易导致目标胚胎以及邻近胚胎的死亡率更高。显示了电影2中拍摄的胚胎的时间序列，每张照片上方显示消融后的时间（消融后3-6天）。比例尺为30μm，适用于每张照片。 请点击此处查看此图的大图。
电影1：激光消融裂解裂 裂裂杆菌8细胞胚胎的最顶端细胞。 首先调整焦点在一束 糖 孢子植物（在不同的领域，先宽，然后窄）中选择的胚胎上。然后使用45%的激光功率拍摄胚胎的最顶端细胞1 ms。顶端细胞迅速破裂并释放其内容物。相邻的细胞从爆裂细胞的膨胀中解放出来，填补了空白空间。5分钟后，细胞及其内容物停止移动并达到平衡状态。电影已加速 4 倍（从每 632 毫秒 1 张图像加速到 6 fps）。胚胎发育的后续工作如图 3所示。 请按此下载此影片。
电影2：由次优激光设置引起的突发细胞附近的细胞显着漂白。 使用60%-80%的激光功率1 ms或45%的激光功率10 ms导致相邻细胞显着漂白并且存活率大大降低。用于激光的设置不应导致相邻细胞的漂白或部分损坏。通过降低激光脉冲的功率和/或持续时间，并瞄准离相邻细胞最远的点，可以获得最佳结果。在这里，拍摄裂 头孢子虫 的4细胞胚胎的最顶端细胞（80%激光功率，1 ms）（侧视图/俯视图）。下部和侧向细胞的过度漂白很容易观察到。胚胎的后续发育如图 4所示。 请按此下载此影片。
补充图1：整个协议的流程示意图。请按此下载此档案。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
局部细胞激光消融允许以高精度进行时间和空间消融。然而，其效率可能会受到靶细胞不可及性的阻碍;例如，所有细胞都是三维胚胎。该协议是在藻类 裂殖质的胚胎上开发的，该胚胎发育出单层层，其中所有细胞都可以很容易地用激光束单独区分和破坏。
激光功率和波长
NIR fs脉冲激光通常用于动物的发育研究24，25。然而，在糖精等褐藻的情况下 ， 激光无法在不燃烧整个胚胎的情况下爆破细胞。该反应可能与叶绿体光收获器的高活性有关。
使用ns脉冲紫外激光进行消融，测试了两种方法：（1）在短时间内使用高功率脉冲或（2）在较长时间内使用较低的激光曝光。激光传递的能量，激光功率和脉冲持续时间的组合，会影响传递到受照射电池的能量。传递的能量也可以通过反射和衍射影响周围的细胞。因此，选择了给出可重复结果的两个参数中的最低设置，以减少任何不必要的附带影响。激光功率在25-40 μ W.cm-2之间，脉冲为1 ms似乎是最佳的。使用这些参数，紫外激光的效果包含在非常局部的水平上，周围细胞中没有可见的漂白，但效率足以导致目标细胞爆裂。这些参数被反复应用，对胚胎没有任何直接的致命影响。较长的脉冲时间或更高的激光功率导致周围细胞漂白甚至胚胎死亡，而较低的值不足以破坏细胞壁。
藻类物质和培养条件
虽然允许在亚细胞水平上进行精确射击，但该技术要求实验者解决四个关键因素，以便对结果进行可靠的解释。在激光消融实验之前和之后都必须考虑这些要点。
要解决的第一个因素是胚胎种群密度。负面拥挤影响 裂头孢沙门氏菌26的发育速度。低密度提供了（1）更好的脉冲可重复性，因为激光路径中存在其他胚胎会降低其功率，以及（2）更容易监测激光射出的胚胎，其生长速度略慢于完整胚胎;后者迅速覆盖了射出的胚胎。该协议的第二个关键因素是进行实验的温度。激光束本身加热样品，但房间的温度和显微镜的局部环境增加了样品所经历的整体温度条件，接近18-22°C。 在这里，显微镜的房间没有冷藏，因为该设备主要用于耐受环境温度的动物细胞。幸运的是， 糖精 胚胎能够承受22°C的温度（比13°C的最佳培养温度高9°C）长达4小时。然而，帮助维持低环境温度的设备，例如充分的通风或冷却板支架，可以帮助减轻对藻类胚胎的生存和发育产生不利影响的风险。此外，配子体在红光下缓慢地预适应至16°C可以帮助胚胎在消融过程中承受温度峰值。第三，除了温度升高外，胚胎在实验期间还被剥夺了合适的光源。此外，叶绿体可能被561nm激光部分漂白。在561 nm激光器上使用尽可能低的功率有助于减少这种影响。第四，运输也是一个需要考虑的关键因素，因为并非所有实验室都有激光烧蚀设备。应避免温度峰值和外部运动或冲击，以防止藻类物质移位、丢失或死亡。只要有可能，运输箱就需要冷藏，抗振（例如，减震泡沫），并配备灯。满足这些要求的几种运输箱在商业上是可用的。
即使所有这些因素都得到尽可能的控制，仍然可能发生微弱但潜在的重大环境压力。在分析和解释胚胎对激光消融的反应时，必须考虑这种可能性。
除了在整个实验过程中必须保持稳定的环境条件外，在整个监测步骤中跟踪受辐照的生物体也是一个挑战。随着时间的推移，不同胚胎的生长会改变原始景观。除非可以专用于监测实验的自动显微镜，否则在激光消融后跟踪胚胎很容易变得耗时并产生大量数据。强烈建议在初始激光消融脉冲期间进行视频记录，以跟踪胚胎对脉冲的即时反应。这种对脉冲冲击的快速监测非常重要，因为在某些情况下，当脉冲靶向细胞的中间时，会导致靶细胞迅速破裂，很可能是由于细胞内部和介质（海水）之间的渗透压差异。当泄漏速度过快时，相邻的细胞也会破裂。在目标细胞的最远端区域射击被证明是缓冲任何相邻细胞上的突发效应的有效方法。避免剧烈爆裂的另一种有效方法是用蔗糖27增加培养基的渗透压。然而，渗透压的差异对于消除目标细胞的内容物是必要的。因此，需要保持足够的渗透压电位。在少数情况下，叶绿体和其他化合物阻碍了激光消融产生的开口，这导致细胞从激光射击中恢复，几天后生长恢复。旨在疏通开口的额外脉冲被证明足以防止阻塞。
局限性
必须在激光功率（激光功率应足够高以使细胞清空其内容物）和邻近细胞的存活之间进行权衡，后者在藻类胚胎中对热应激和光漂白特别敏感。因此，激光射击后对细胞的密切监测是控制这一步骤并确保目标细胞死亡的关键。否则，对靶向细胞对邻近细胞命运的解释，以及胚胎的后续发育，可能会产生误导。
用针刺穿细胞似乎是一种替代方案，其中藻类细胞不会经历任何热或光应激。然而，这种方法将具有挑战性，因为褐藻胚胎细胞浸泡在海水中生长，并且不与任何固体表面接触。即使在标准显微注射系统中使用显微操作器将胚胎与固体玻璃表面保持接触时，厚而有弹性的细胞壁也能抵抗针头穿透。
总之，该协议描述了激光消融和监测褐藻胚胎的完整实验程序和设置以及成功实验的关键步骤（补充图 1）。这种独特的方法是研究褐藻早期胚胎中细胞相互作用和细胞命运的有前途的方法。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
S.B.的博士资助由布列塔尼大区（ARED拨款编号COH20020）和索邦大学资助。I.T.is 博士学位由布列塔尼大区（ARED拨款编号COH18020）和挪威NMBU大学资助。该项目已通过通产省跨学科项目获得CNRS的财政支持。MRic是法国国家研究机构（ANR-10-INBS-04）支持的国家基础设施法国生物成像的成员。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 25 mm glass bottom petri dish | NEST | 801001 | |
| Autoclaved sea water | - | Collected offshore near the Astan buoy (48°44.934 N 003°57.702 W) close to Roscoff, France, at a depth of 20 m. | |
| Cell scraper | MED 2 | 83.3951 | |
| Cell strainer 40 µm | Corning / Falcon | 352340 | |
| Culture cabinets | Snijders Scientific Plant Growth Cabinet ECD01 | Any other brand is suitable provided that the light intensity, the photoperiod and the temperature can be controlled. | |
| LSM 880 Zeiss confocal microscope | Carl Zeiss microscopy, Jena, Germany | Ablation and imaging were performed using a 40x/1.2 water objective | |
| Pellet pestles | Sigma Aldrich | Z359947 | Blue polypropylene (autoclavable) |
| Provasoli supplement | - | Recipe is available here: http://www.sb-roscoff.fr/sites/www.sb-roscoff.fr/files/documents/station-biologique-roscoff-preparation-du-provasoli-2040.pdf | |
| Pulsed 355 laser (UGA-42 Caliburn 355/25) | Rapp OptoElectronic, Wedel, Germany | ||
| Scalpel | Paramount | PDSS 11 | |
| SysCon software | Rapp OptoElectronic, Wedel, Germany | Laser-driver software | |
| ZEN software | Carl Zeiss microscopy, Jena, Germany | Imaging software, used together with the SysCon software; Black 2.3 version |
References
- Montell, D. J., Keshishian, H., Spradling, A. C. Laser ablation studies of the role of the Drosophila oocyte nucleus in pattern formation. Science. 254 (5029), New York, N.Y. 290-293 (1991).
- Shivakumar, P. C., Lenne, P. F. Laser ablation to probe the epithelial mechanics in drosophila. Methods In Molecular Biology. 1478, 241-251 (2016).
- Bargmann, C. I., Avery, L. Laser killing of cells in Caenorhabditis elegans. Modern Biological Analysis of an Organism. 48, 225-250 (1995).
- Fouad, A. D., Liu, A., Du, A., Bhirgoo, P. D., Fang-Yen, C. Thermal laser ablation with tunable lesion size reveals multiple origins of seizure-like convulsions in Caenorhabditis elegans. Scientific Reports. 11 (1), 5084 (2021).
- Johnson, C. S., Holzemer, N. F., Wingert, R. A. Laser ablation of the zebrafish pronephros to study renal epithelial regeneration. Journal of Visualized Experiments. (54), e2845 (2011).
- Mondia, J. P., Adams, D. S., Orendorff, R. D., Levin, M., Omenetto, F. G. Patterned femtosecond-laser ablation of Xenopus laevis melanocytes for studies of cell migration, wound repair, and developmental processes. Biomedical Optics Express. 2 (8), 2383-2391 (2011).
- Reinhardt, D., Frenz, M., Mandel, T., Kuhlemeier, C. Microsurgical and laser ablation analysis of leaf positioning and dorsoventral patterning in tomato. Development. 132 (1), 15-26 (2005).
- Berg, C., Hage, W., Weisbeek, P., Scheres, B. Laser ablation in Arabidopsis roots: a tool to study cell-to-cell communication. Cellular integration of signalling pathways in plant development. Proceedings of the NATO Advanced Study Institute. , https://eurekamag.com/research/003/488/003488317.php 237-250 (1998).
- Berger, F., Taylor, A., Brownlee, C. Cell fate determination by the cell wall in early fucus development. Science. 263 (5152), New York, N.Y. 1421-1423 (1994).
- Bouget, F. Y., Berger, F., Brownlee, C. Position dependent control of cell fate in the Fucus embryo: role of intercellular communication. Development. 125 (11), 1999-2008 (1998).
- Bringloe, T., et al. Phylogeny and evolution of the brown algae. Critical Reviews in Plant Sciences. 39 (4), 281-321 (2020).
- Saifullah, S., Olsen, Y., Surilayani, D., Handå, A. Carbohydrate of the brown seaweed, saccharina latissima: a review. Joint proceedings of the 2nd and the 3rd International Conference on Food Security Innovation (ICFSI 2018-2019). , 180-182 (2021).
- Zhang, X., Thomsen, M. Techno-economic and environmental assessment of novel biorefinery designs for sequential extraction of high-value biomolecules from brown macroalgae Laminaria digitata, Fucus vesiculosus, and Saccharina latissima. Algal Research. 60, 102499 (2021).
- Kanda, T. On the gametophytes of some japanese species of laminariales. Scientific papers of the Institute of Algological Research, Faculty of Science. 1 (2), Hokkaido Imperial University. 221-260 (1936).
- Fritsch, F. E. The structure and reproduction of the algae. Volume 2. , Cambridge University Press. Cambridge. (1945).
- Bartsch, I., et al. The genus Laminaria sensu lato : recent insights and developments. European Journal of Phycology. 43 (1), 1-86 (2008).
- Theodorou, I., Charrier, B. Chapter 2: Brown algae: ectocarpus and saccharina as experimental models for developmental biology. Handbook of Marine Model Organisms in Experimental Biology - Established and Emerging. Boutet, A., Schierwater, B. , Francis & Taylor Group, CRC Press. ISBN 9780367444471 485 (2021).
- Drew, G. H. The reproduction and early development of laminaria digitata and laminaria saccharina. Annals of Botany. 24 (1), 177-189 (1910).
- Yendo, K. The development of costaria, undaria, and laminaria. Annals of Botany. 25 (99), 691-715 (1911).
- Forbord, S., Steinhovden, K., Rød, K., Handå, A., Skjermo, J. Cultivation protocol for Saccharina latissima. Protocols for Macroalgae Research. Charrier, B., Wichard, T., Reddy, C. R. K. , CRC Press, Francis & Taylor Group. ISBN-10: 14986427. ISBN-13: 978-1498796422 37-59 (2018).
- Bartsch, I. Derivation of clonal stock cultures and hybridization of kelps. Protocols for Macroalgae Research. Charrier, B., Wichard, T., Reddy, C. R. K. , CRC Press, Francis & Taylor Group. ISBN-10: 149879627. ISBN-13: 978-1498796422 61-78 (2018).
- Theodorou, I., Opsahl-Sorteberg, H. -G., Charrier, B. Preparation of zygotes and embryos of the kelp saccharina latissima for cell biology approaches. Bio-protocol. 101, 4132 (2021).
- Lüning, K., Dring, M. J. Reproduction induced by blue light in female gametophytes of Laminaria saccharina. Planta. 104 (3), 252-256 (1972).
- de Medeiros, G., et al. Cell and tissue manipulation with ultrashort infrared laser pulses in light-sheet microscopy. Scientific Reports. 10 (1), 1942 (2020).
- Liang, X., Michael, M., Gomez, G. A. Measurement of mechanical tension at cell-cell junctions using two-photon laser ablation. Bio-protocol. 6 (24), 2068 (2016).
- Ebbing, A., Pierik, R., Bouma, T., Kromkamp, J. C., Timmermans, K. How light and biomass density influence the reproduction of delayed Saccharina latissima gametophytes (Phaeophyceae). Journal of Phycology. 56 (3), 709-718 (2020).
- Rabillé, H., Billoud, B., Tesson, B., Le Panse, S., Rolland, É, Charrier, B. The brown algal mode of tip growth: Keeping stress under control. PLoS Biology. 17 (1), 2005258 (2019).
