Summary
تدمير خلايا معينة في الجنين هو أداة قوية لدراسة التفاعلات الخلوية المشاركة في مصير الخلية. يصف هذا البروتوكول تقنيات الاستئصال بالليزر للخلايا المستهدفة في الجنين المبكر للطحالب البنية Saccharina latissima.
Abstract
في Saccharina latissima، يتطور الجنين كورقة خلية أحادية الطبقات تسمى الصفيحة أو الشفرة. من السهل ملاحظة كل خلية جنينية ، ويمكن تمييزها بسهولة عن جيرانها ، ويمكن استهدافها بشكل فردي. لعقود من الزمان ، تم استخدام الاستئصال بالليزر لدراسة تطور الجنين. هنا ، تم تطوير بروتوكول للاستئصال بالليزر الخاص بالخلايا للأجنة المبكرة للطحالب البنية S. latissima. يتضمن العمل المعروض: (1) إعداد أجنة السكرينا ، مع وصف للمعلمات الحرجة ، بما في ذلك ظروف الزرع ، (2) إعدادات الاستئصال بالليزر ، و (3) مراقبة النمو اللاحق للجنين المشعع باستخدام المجهر بفاصل زمني. بالإضافة إلى ذلك ، يتم توفير تفاصيل حول الظروف المثلى لنقل الأجنة من منصة التصوير إلى المختبر ، والتي يمكن أن تؤثر بشكل عميق على تطور الجنين اللاحق. الطحالب التي تنتمي إلى رتبة Laminariales تعرض أنماط تكوين جنيني مشابهة ل Saccharina ؛ وبالتالي يمكن نقل هذا البروتوكول بسهولة إلى أنواع أخرى في هذا التصنيف.
Introduction
تم استخدام الاستئصال بالليزر لعقود لدراسة تطور الجنين. إن تشعيع خلايا الجنين بشعاع ليزر يجعل من الممكن مراقبة إمكانات التجدد وتعديل سلالة الخلية أثناء تكوين الجنين والتحقيق في تأثير الاستئصال المستهدف على انقسام الخلايا ومصير الخلية. الكائنات الحية النموذجية المستخدمة في طرق الاستئصال بالليزر هي عادة ، مثل الحشرات 1,2 ، والديدان الخيطية3,4 ، والفقاريات5,6 ، وأحيانا النباتات 7,8. بالإضافة إلى ذلك ، تم استخدام نهج الاستئصال الدقيق بالليزر على الطحالب البنية Fucus في عامي 1994 و 1998 لإثبات دور جدار الخلية في الاستقطاب الضوئي للجنين المبكر 9,10.
تنتمي الطحالب البنية إلى مجموعة Stramenopiles ، التي تباعدت في جذر شجرة حقيقية النواة منذ 1.6 مليار سنة. ونتيجة لذلك ، فهي مستقلة من الناحية الفيلولوجية عن الكائنات الحية متعددة الخلايا الأخرى ، مثل الحيوانات والنباتات11. ينتمي Saccharina latissima إلى رتبة Laminariales ، والمعروفة أكثر باسم عشب البحر ، وهي من بين أكبر الكائنات الحية على وجه الأرض ، حيث تصل أحجامها إلى أكثر من 30 مترا. Saccharina sp. هي أعشاب بحرية كبيرة تستخدم للعديد من التطبيقات مثل الأغذية والأعلاف ، ويتم استخراج السكريات المتعددة لاستخدامها في الصناعات الزراعية والدوائية والتجميلية في جميع أنحاء العالم12 ، 13. وتتطلب زراعته، وخاصة في آسيا ومؤخرا في أوروبا، إعداد الأجنة في المفرخات قبل إطلاق الأحداث في البحر المفتوح. مثل جميع عشب البحر ، لديها دورة حياة ثنائية الطور تتكون من مرحلة أمشاج مجهرية ، تنمو خلالها أمشاج فردية وتنتج أمشاج للإخصاب ، ومرحلة بوغية مجهرية ثنائية الصبغيات ، حيث تتطور شفرة مستوية كبيرة من ثباتها المرتبط بقاع البحر أو الصخور. يطلق البوغي جراثيم فردية عند النضج ، وبالتالي يكمل دورة الحياة 14،15،16.
يقدم S. latissima بعض الميزات المورفولوجية المثيرة للاهتمام17. يتطور جنينها كورقة مستوية أحادية الطبقات15،18،19 قبل الحصول على بنية متعددة الطبقات تتزامن مع ظهور أنواع مختلفة من الأنسجة. بالإضافة إلى ذلك ، Laminariales هي واحدة من الأصناف الوحيدة من الطحالب البنية التي تظل أجنتها مرتبطة بأنسجتها الأمومية (Desmarestiales و Sporochnales تفعل15 أيضا). توفر هذه الميزة الفرصة لدراسة دور أنسجة الأمهات في هذه العملية التنموية ومقارنة آليات مراقبة الأم في الطحالب البنية مع تلك الموجودة في الحيوانات والنباتات.
تقدم هذه المقالة أول بروتوكول كامل للاستئصال بالليزر في جنين عشب البحر المبكر. ينتج عن هذا البروتوكول الذي يتضمن تقنية نبضات الأشعة فوق البنفسجية NS تدميرا محددا لخلايا الجنين الفردية لدراسة أدوار كل منها أثناء تكوين الجنين. يوفر هذا الإجراء نهجا موثوقا به للتحقيق في تفاعلات الخلايا ومصير الخلايا أثناء التكوين الجنيني في Laminariales.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. إنتاج Saccharina latissima gametophytes
- جمع النباتات البوغية الناضجة من S. latissima من البرية كما هو موضح سابقا20,21. تأكد من أن النباتات البوغية المختارة خالية من النباتات النباتية (الكائنات الحية الصغيرة المرئية على سطح الشفرة) أو الطفيليات الداخلية (الموجودة في المناطق المبيضة أو البقع على الشفرة).
- باستخدام مشرط ، قم بقطع الجزء الأكثر قتامة في وسط الشفرة (الأنسجة المنتجة للبوغ الخصيب22) إلى 1-5 قطع مربعة (1 سم مربع) ، وتجنب أي بقع مبيضة ، إن وجدت.
- قم بإزالة أي نباتات متبقية عن طريق تنظيف القطع المقطوعة بلطف باستخدام الجزء الخلفي من مشرط وبعض الورق الماص.
- ضع القطع النظيفة في طبق زجاجي مملوء بمياه البحر الطبيعية المعقمة (انظر جدول المواد) لمدة 45 دقيقة لإطلاق الجراثيم بعد التقرير22 المنشور سابقا.
- قم بإزالة قطع الشفرة وتصفية مياه البحر من خلال مصفاة خلايا 40 ميكرومتر لإزالة الحطام أو الكائنات الحية غير المرغوب فيها.
- تمييع الجراثيم في الترشيح إلى تركيز 20-40 جراثيم / مل في أطباق بتري البلاستيكية22.
- ضع محلول البوغ في خزانة استزراع (انظر جدول المواد) تم تكوينها مع ظروف الاستزراع المثلى (13 درجة مئوية ، 24 μE.m-2.s-1 ، الفترة الضوئية 16: 8 L: D).
- اسمح للجراثيم أن تنبت وتتطور إلى نباتات مشيمة.
ملاحظة: إنبات بوغ مرئي بعد 2 أيام في الخزانة ، وعادة ما يحدث الانقسام الخلوي الأول للخلايا الأمشاج خلال 48 ساعة التالية. - استبدل وسط النمو بعد 5 أيام بمياه البحر الطبيعية المصفاة الدقيقة المخصبة بمحلول بروفاسولي 0.5x (NSW1/2) (انظر جدول المواد).
ملاحظة: لتجنب تكرار هذه الخطوات، يمكن اختيار نباتات أمشاج محددة من الذكور والإناث ونشرها نباتيا لعدة أشهر. وتظل النباتات المشيمية نباتية عندما تنمو تحت الضوء الأحمر (4 μE.m-2.s-1 بطول موجي لا يقل عن 580 نانومتر)23 في نفس ظروف الاستزراع الموصوفة أعلاه (الخطوة 1.7).
2. تجزئة وتحريض تكوين البويضات
- حصاد النباتات المشيمية مع مكشطة الخلية.
- باستخدام مدقة بلاستيكية صغيرة ، سحق النباتات المشيمة التي تم جمعها في أنبوب 1.5 مل إلى قطع 4-5 خلايا.
- املأ الأنبوب ب 1 مل NSW1/2 (الخطوة 1.9).
- أضف 2.5 ميكرولتر من محلول الأمشاج المسحوق إلى 3 مل من مياه البحر الطبيعية المخصبة بمحلول بروفاسولي 1x (نيو ساوث ويلز) وضعها في طبق بتري.
ملاحظة: يوصى باستخدام طبق بتري ذو قاع زجاجي مقاس 25 مم لتسهيل التعامل معه. - ضع الأطباق المعدة في خزانة الثقافة وحث تكوين الأمشاج عند 13 درجة مئوية تحت الضوء الأبيض بكثافة 24 μE.m-2.s-1 (الضوء الخافت ، الفترة الضوئية 16: 8 L: D).
ملاحظة: يمكن ملاحظة أول gametangia (oogonia الإناث و archegonia الذكور) بعد 5 أيام. الذكر متفرع بشكل مفرط مع خلايا صغيرة ، وتتكون الأنثى من خلايا أكبر تشكل خيوط طويلة15,22. لوحظت البويضات الأولى ~ 10 أيام في وقت لاحق ، وعادة ما يحدث الانقسام الأول من الزيجوت في غضون يومين التاليين. - بعد ستة أيام من مراقبة البيض الأول ، انقل الأطباق إلى ظروف إضاءة بيضاء أكثر إشراقا: 50 μE.m-2.s-1 ، الفترة الضوئية 16: 8 L: D ، لا تزال عند 13 درجة مئوية.
3. الحصول على صورة لاختيار الأجنة للاستئصال ومراقبة النمو اللاحق
- قم بتصوير طبق بتري بأكمله (إعادة) تحديد موقع الأجنة المختارة أثناء خطوة الاستئصال (لا حاجة لإعادة الطبق إلى مجهر العين) ومراقبة التطور اللاحق للأجنة المختارة.
ملاحظة: استخدم المجهر البؤري المقلوب الموسع بالليزر (انظر جدول المواد) للتصوير (الشكل 1)، ويتم وصف الاستئصال بالليزر في الخطوة 5. - ضع طبق بتري على المسرح ووجهه بعلامة مرئية (على سبيل المثال ، ارسم خطا بعلامة دائمة).
- استخدم هدف 10x/0.45 للتركيز على الجنين. سجل موضع النقاط الأساسية الأربع لطبق بيتري.
- ابدأ فحص البلاط. احصل على صور مرسلة / فلورسنت لطبق بتري بأكمله بدقة منخفضة: 256 × 256 بكسل ، ووقت بقاء بكسل يبلغ 1.54 ميكروثانية مع المسح الضوئي ثنائي الاتجاه ، وتكبير رقمي بمعدل 0.6x باستخدام ليزر 561 نانومتر عند إرسال 1.2٪.
ملاحظة: وقت المسح الضوئي لطبق بتري كامل بحجم 2.5 سم هو ~ 6 دقائق ل 225 بلاطة (الشكل 2). هنا ، تم استخدام ليزر 561 نانومتر للانتقال والتصوير الفلوري. تم جمع إشارة التألق بين 580-720 نانومتر على المضاعفات الضوئية البؤرية (PMT) وتم جمع الضوء المرسل على PMT المرسل. يمكن لليزر 561 نانومتر أيضا مراقبة الكلوروفيل في هذه الخطوة ، لكنه غير ضروري لأنه يساعد فقط على التمييز بين ضوضاء الإشارة والكائنات الحية بشكل صحيح. - احفظ صورة المسح الضوئي للتجانب واجعلها مفتوحة في نافذة برنامج الحصول على الصور (انظر جدول المواد).
- تغيير الهدف ، لا تقم بإزالة طبق بيتري.
ملاحظة: تم نقل الهدف المائي 40x/1.2 إلى جانب المرحلة بحيث يمكن إضافة وسط الغمر (الماء) إلى الهدف دون تحريك طبق بتري من موضعه الأولي. - انتقل عبر صورة مسح البلاط التي تم الحصول عليها مسبقا لتحديد الجنين المناسب. بمجرد تحديد الجنين على هذه الصورة ، انقل المرحلة إلى الموضع الدقيق للجنين واحصل على صور منقولة / فلورسنت لهذا الجنين بدقة عالية.
ملاحظة: إعدادات عالية الدقة: 512 × 512 بكسل، 0.130 ميكرومتر/بكسل، 0.208 ميكروثانية بكسل وقت الإقامة مع المسح الضوئي أحادي الاتجاه والتكبير/التصغير الرقمي 2x باستخدام ليزر 561 نانومتر عند إرسال 0.9٪. - قم بالتعليق على صورة مسح البلاط لكل جنين مرشح للاستئصال بالليزر (الشكل 2B) وانتقل إلى خطوة الاستئصال بالليزر.
4. معايرة الليزر
- قم بمعايرة الليزر ومزامنة برنامج الحصول على الصور مع برنامج تشغيل الليزر في "وضع Click & Fire" وليزر نبضي 355 نانومتر.
ملاحظة: هذه الخطوة ضرورية لضمان التزامن المثالي بين موضع مؤشر الماوس في برنامج تشغيل الليزر (انظر جدول المواد) مع الموضع في الصورة الحية لبرنامج الاقتناء. - افتح حزمة برامج تشغيل الليزر وانقر على Live في حزمة برامج الحصول على الصور.
- قم بمزامنة حزمتي البرامج بالنقر فوق بدء الاستحواذ في حزمة برامج تشغيل الليزر. يتم تسجيل الصورة الحية الآن أيضا في برنامج تشغيل الليزر فوق البنفسجي.
- حدد مجال الاهتمام (AOI) من خلال النقر على زر اختيار AOI والنقر على حواف الصورة (اليمين واليسار والأعلى والأسفل) في حزمة برامج تشغيل ليزر الأشعة فوق البنفسجية.
ملاحظة: بعد خطوة المعايرة هذه، يجب أن تظل إعدادات حجم البكسل وتنسيق الصورة والتكبير/التصغير في حزمة برامج الاكتساب ثابتة. - حدد منطقة فارغة على الطبق واخفض مستوى المرحلة إلى 20 ميكرومتر أسفل المستوى البؤري للعينة للتركيز على القاع الزجاجي.
- اضبط مسارات ليزر الاستئصال والتصوير بالليزر بالنقر فوق بدء المعايرة واختر المعايرة اليدوية.
- حدد طاقة ليزر عالية بما يكفي لرؤية نقطة سوداء في وسط الصورة الحية المقابلة للثقب الموجود في الغطاء الزجاجي (يجب أن تكون جميع المصاريع مفتوحة).
- انقر فوق هذه النقطة السوداء المركزية باستخدام مؤشر الماوس وانقر فوق 18 نقطة إضافية اقترحها البرنامج لإكمال إجراء المحاذاة.
- تحقق من المعايرة في "وضع Click & Fire" على نفس الغطاء.
ملاحظة: تعتمد معايرة الليزر على معلمات التصوير. بمجرد معايرة الليزر ، تأكد من أن معلمات التصوير (أي 512 × 512 بكسل ، 0.130 ميكرومتر / بكسل ، 0.208 ميكروثانية بكسل وقت الإقامة مع المسح الضوئي أحادي الاتجاه والتكبير الرقمي 2x) لم تتغير.
5. الاستئصال بالليزر
- اختر جنينا مثيرا للاهتمام. ابدأ التسجيل بفاصل زمني في برنامج الحصول على الصور.
- احصل على صور مرسلة / فلورية بهدف 40x / 1.2 W بدقة عالية (أي 512 × 512 بكسل ، 0.130 ميكرومتر / بكسل ، 1.54 ميكروثانية بكسل وقت الإقامة مع المسح الضوئي أحادي الاتجاه والتكبير الرقمي 2x باستخدام ليزر 561 نانومتر عند إرسال 0.9٪). احصل على تسجيل الفاصل الزمني بأقصى سرعة.
- قم بالتصغير من المنطقة في بداية تسجيل الفاصل الزمني. قم بتكبير الهيئة العربية للتصنيع.
- استخدم وظيفة "Click & Fire" لبرنامج تشغيل الليزر لتطبيق التشعيع الضار على الخلية ذات الأهمية في الجنين. استخدم المعلمات التالية: 45٪ من الإرسال بالليزر (المقابلة لحد أقصى 40 ميكروواط) ومدة النبض 1 مللي ثانية (الخطوة 4).
ملاحظة: يوصى بتسجيل الفيديو أثناء التصوير بالليزر. - تحت 688 نانومتر ، راقب طرد البلاستيدات الخضراء ذاتية الفلورسنت من السيتوبلازم.
- إذا بقيت محتويات الخلية في الخلية، فاستخدم وظيفة "Click & Fire" مرة أخرى لزيادة حجم الخرق في الخلية. كرر ذلك، مع الحفاظ على عدد اللقطات عند الحد الأدنى حتى يتم تحرير معظم محتويات الخلية.
- أوقف تسجيل الفاصل الزمني بعد استقرار الجنين (أي أنه لا يمكن اكتشاف أي حركة أخرى داخل الخلايا (~ 1-5 دقائق).
- قم بتحديث التعليق التوضيحي على صورة المسح الضوئي للتجانب، إذا لزم الأمر.
6. مراقبة نمو الأجنة المشععة
ملاحظة: تتم المراقبة على مدار عدة أيام.
- تحديد معدل البقاء على قيد الحياة من خلال مراقبة عدد الأجنة التي تتطور بعد الاستئصال بالليزر ومقارنتها بتلك التي تموت.
ملاحظة: تموت بعض الأجنة مباشرة بعد الاستئصال لأسباب مختلفة. عادة ما يكون معدل الوفيات المرتفع والسريع علامة على معلمات الليزر غير المناسبة أو التعرض الأعلى / الطويل للإجهاد أثناء التجربة أو النقل اللاحق. - تحديد تأخر النمو عن طريق قياس طول الأجنة التي يتم تصويرها بالليزر كل يوم ومقارنتها بالأجنة السليمة.
ملاحظة: معدل نمو الكائنات الحية التي يتم تصويرها بالليزر أبطأ عموما من معدل نمو الكائنات الحية غير المعالجة. ومع ذلك ، يمكن لبعض إعدادات الليزر (غير المناسبة) أن تمنع النمو لأكثر من أسبوع ، مع استئناف النمو بعد ذلك. - تعرف على الضرر المجاور من خلال مراقبة تفاعل الخلايا المجاورة للخلايا التي تم إزالتها. في بعض الحالات، قد يؤدي انخفاض الضغط بعد الانفجار إلى انفجار الخلايا المجاورة.
- تحقق من وجود تلوث الميكروبات. مراقبة نمو الطحالب الدقيقة والبكتيريا في الوسط. إذا كان هناك مستوى غير عادي من الميكروبات موجودة في الطبق ، فقم بالتخلص منه وكرر البروتوكول من الخطوة 2 أو الخطوة 3.
ملاحظة: بعد الاستئصال بالليزر ، تكون أجنة S. latissima التالفة مجهدة للغاية بالفعل ، ويمكن أن يتسبب الإجهاد الخارجي الإضافي في زيادة معدل الوفيات. من الممكن حدوث فاشيات بكتيرية أو فيروسية لأن الأجنة المعالجة لا يمكن أن تنمو في ظروف محورية. - التحقق من التطور العالمي للكائنات الملقحة من خلال دراسة النمط الظاهري وفهم الدور في تطوير المنطقة المستهدفة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
نمت النباتات المشيمية من S. latissima ، وتم تحفيز تكوين الأمشاج لإنتاج الزيجوت والأجنة. بعد اثني عشر يوما من تحريض تكوين الأمشاج ، خضعت الأجنة للاستئصال بالليزر. هنا ، تهدف التجربة إلى تقييم دور خلايا محددة في التطور الشامل لأجنة S. latissima. تم استهداف الخلية الأكثر قمية ، والخلايا القاعدية الأكثر ، والخلايا المتوسطة. بعد مسح البلاط ، تم تحديد طبق بتري بأكمله (الشكل 2 أ) ، وهو جنين مثير للاهتمام ، كمرشح مناسب للتصوير بالليزر (الشكل 2 ب). تم اختيار خلية معينة من هذا الجنين واستهدافها وتصويرها باستخدام شعاع ليزر نابض بالأشعة فوق البنفسجية بحد أقصى 40 ميكروواط من طاقة الليزر (المقابلة ل 45٪ من الطاقة القصوى للمعدات المستخدمة هنا) لمدة 1 مللي ثانية (الفيلم 1). أطلقت الخلية محتوياتها (البلاستيدات الخضراء والسيتوبلازم). ومن المثير للاهتمام أن الخلايا المجاورة استجابت لانفجار الخلية المشععة عن طريق التوسع في الفضاء بين الخلايا. وسجل موضع الأجنة المشععة للرصد اللاحق على مدى 10 أيام (الشكل 3). استمرت معظم الأجنة المشععة في التطور ولكنها أظهرت تغييرا في النمو (شكل الجنين). يجب إجراء تحليل مفصل للتغيرات المورفولوجية قبل أن تعزى وظيفة محددة إلى كل خلية مشععة في التحكم في آلية النمو الشاملة.
في المقابل ، تم اختبار الأجنة باستخدام معلمات ليزر أخرى (على سبيل المثال ، 33 مللي ثانية لمدة التصوير من 60٪ -80٪ من طاقة الليزر. الفيلم 2) سرعان ما أظهر علامات الإجهاد الشديد مثل تبييض الخلايا أو تلاشيها أو تغيرات الشكل (التقريب). ماتت جميع الأجنة تقريبا التي تم إطلاق النار عليها بهذه الطريقة في غضون خمسة أيام بعد التجربة (الشكل 4).
الشكل 1: صورة فوتوغرافية لإعداد مجهر الاستئصال بالليزر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 2: مسح البلاط المشروح لطبق بتري كامل. (أ) مسح البلاط لطبق بتري بأكمله المستخدم في الاستئصال بالليزر. تم استخدام PMT الإرسال للحصول على مسح برايتفيلد. بمجرد تحديد موقع الجنين محل الاهتمام ، ينقر المستخدم على موضع الجنين في فحص البلاط ، ويضع البرنامج المرحلة مباشرة فوق الجنين. (ب) يمكن بعد ذلك شرح مسح البلاط على وجه التحديد لتحديد موقع الجنين في الخطوات اللاحقة ، لتتبع الجنين ومراقبته. هنا ، تظهر الصورة جنينا متصلا بالجزء السفلي من طبق بتري ، والذي يمكن تحديد موقعه بسهولة باستخدام ليزر 561 نانومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: السلسلة الزمنية لجنين S. latissima المتنامي بعد التشعيع. يظهر هذا في الفيلم 1. لم يقم الاستئصال بالليزر للخلية الأكثر قمية في الجنين بتبييض الخلايا المجاورة للجنين. استمروا في النمو والانقسام ، وشكلوا جنينا طبيعيا بعد بضعة أيام. تم التقاط الصور كل 24 ساعة ، بعد 2-9 أيام من الاستئصال. شريط المقياس هو 50 ميكرومتر وهو نفسه لجميع الصور. D2-D9 يتوافق مع اليوم-2 إلى اليوم-9. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: السلسلة الزمنية لموت جنين S. latissima بعد الاستئصال بالليزر باستخدام معلمات دون المستوى الأمثل. يمكن أن يؤدي التعرض المفرط لتشعيع الليزر بسهولة إلى ارتفاع معدلات وفاة الجنين المستهدف وكذلك الأجنة المجاورة. يتم عرض سلسلة زمنية من لقطة الجنين في الفيلم 2 ، مع الإشارة إلى الوقت بعد الاستئصال فوق كل صورة (3-6 أيام بعد الاستئصال). شريط المقياس هو 30 ميكرومتر وينطبق على كل صورة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الفيلم 1: الاستئصال بالليزر للخلية الأكثر قمية لجنين 8 خلايا من S. latissima. تم تعديل التركيز أولا على الجنين المختار من بين باقة من النباتات البوغية Saccharina (في مجالات مختلفة ، أولا واسعة ، ثم ضيقة). ثم تم إطلاق النار على الخلية الأكثر قمية من الجنين باستخدام 45٪ من طاقة الليزر لمدة 1 مللي ثانية. انفجرت الخلية القمية بسرعة وأطلقت محتوياتها. الخلايا المجاورة ، التي تحررت من تورغور الخلية المنفجرة ، ملأت المساحة الفارغة. بعد 5 دقائق ، توقفت الخلية ومحتوياتها عن الحركة ووصلت إلى حالة من التوازن. تم تسريع الفيلم 4 مرات (من 1 صورة لكل 632 مللي ثانية إلى 6 إطارات في الثانية). ويبين الشكل 3 متابعة تطور الجنين. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الفيلم.
الفيلم 2: تبييض كبير للخلايا المجاورة لخلية انفجار ناتجة عن إعدادات ليزر دون المستوى الأمثل. أدى استخدام قوة ليزر تبلغ 60٪ -80٪ لمدة 1 مللي ثانية أو قوة ليزر بنسبة 45٪ ل 10 مللي ثانية إلى تبييض كبير للخلايا المجاورة ومعدل بقاء أقل بكثير. يجب ألا تتسبب الإعدادات المستخدمة في الليزر في تبييض أو تلف جزئي للخلايا المجاورة. تم الحصول على أفضل النتائج عن طريق تقليل قوة و / أو مدة نبضة الليزر ، واستهداف النقطة البعيدة عن الخلايا المجاورة. هنا ، يتمإطلاق النار على الخلية الأكثر قمية لجنين 4 خلايا من S. latissima (80٪ من طاقة الليزر ، 1 مللي ثانية) (عرض جانبي / علوي). يمكن ملاحظة الإفراط في تبييض الخلايا السفلية والجانبية بسهولة. يظهر التطور اللاحق للجنين في الشكل 4. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الفيلم.
الشكل التكميلي 1: مخطط انسيابي تخطيطي للبروتوكول بأكمله. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الملف.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
يسمح الاستئصال بالليزر الخلوي المحلي بالاستئصال الزماني والمكاني بمستوى عال من الدقة. ومع ذلك ، يمكن أن تعرقل كفاءتها عدم إمكانية الوصول إلى الخلايا المستهدفة ؛ على سبيل المثال ، جميع الخلايا هي من جنين ثلاثي الأبعاد. تم تطوير هذا البروتوكول على جنين الطحالب Saccharina latissima، التي تطور صفيحة أحادية الطبقة حيث يمكن تمييز جميع الخلايا بسهولة وتدميرها بشكل فردي باستخدام شعاع الليزر.
قوة الليزر والطول الموجي
يستخدم ليزر NIR fs-pulsed بشكل شائع في الدراسات التنموية على الحيوانات24,25. ومع ذلك ، في حالة الطحالب البنية مثل السكرينا ، لا يمكن لليزر تفجير الخلية دون حرق الجنين بأكمله. قد يكون هذا التفاعل مرتبطا بالنشاط العالي لحصادات ضوء البلاستيدات الخضراء.
باستخدام ليزر الأشعة فوق البنفسجية النبضي NS للاستئصال ، تم اختبار نهجين: (1) باستخدام نبضة عالية الطاقة خلال فترة زمنية قصيرة أو (2) باستخدام تعرض أقل لليزر على مدى فترة زمنية أطول. تؤثر الطاقة التي يوفرها الليزر ، وهي مزيج من طاقة الليزر ومدة النبض ، على الطاقة التي يتم توصيلها إلى الخلية المشععة. يمكن أن تؤثر الطاقة التي يتم تسليمها أيضا على الخلايا المحيطة عن طريق الانعكاس والحيود. لذلك ، تم اختيار أدنى إعدادات المعلمتين اللتين أعطيتا نتائج قابلة للتكرار لتقليل أي آثار جانبية غير مرغوب فيها. يبدو أن قوة الليزر بين 25-40 ميكرومتر W.cm-2 مع نبضة 1 مللي ثانية هي الأمثل. باستخدام هذه المعلمات ، تم احتواء تأثير ليزر الأشعة فوق البنفسجية على مستوى محلي للغاية مع عدم وجود تبييض مرئي في الخلايا المحيطة ولكنه فعال بما يكفي للتسبب في انفجار الخلية المستهدفة. تم تطبيق هذه المعلمات مرارا وتكرارا دون أي تأثير قاتل مباشر على الأجنة. تسببت أوقات النبض الأطول أو طاقة الليزر الأعلى في تبييض الخلايا المحيطة أو حتى موت الجنين ، في حين أن القيم المنخفضة لم تكن كافية لكسر جدار الخلية.
ظروف المواد والاستزراع الطحالب
على الرغم من السماح بالتصوير الدقيق على المستوى دون الخلوي ، إلا أن هذه التقنية تتطلب من المجرب معالجة أربعة عوامل حاسمة للسماح بتفسير موثوق للنتائج. يجب النظر في هذه النقاط قبل وبعد تجربة الاستئصال بالليزر.
العامل الأول الذي يجب معالجته هو الكثافة السكانية للأجنة. يؤثر الازدحام السلبي على معدل تطور S. latissima26. توفر الكثافات المنخفضة (1) قابلية أفضل لتكرار النبض لأن وجود أجنة أخرى في مسار الليزر يمكن أن يقلل من قوته ، و (2) مراقبة أسهل للأجنة التي يتم تصويرها بواسطة الليزر ، والتي تنمو أبطأ قليلا من الأجنة السليمة ؛ هذا الأخير يغطي بسرعة الأجنة النارية. العامل الحاسم الثاني لهذا البروتوكول هو درجة الحرارة التي يتم فيها إجراء التجربة. يقوم شعاع الليزر نفسه بتسخين العينة ، لكن درجة حرارة الغرفة والبيئة المحلية للمجهر تضيف إلى ظروف درجة الحرارة الإجمالية التي تمر بها العينة ، بالقرب من 18-22 درجة مئوية. هنا ، لم يتم تبريد غرفة المجهر لأن هذه المعدات تستخدم بشكل أساسي للخلايا الحيوانية التي تتحمل درجات الحرارة المحيطة. لحسن الحظ ، تمكنت أجنة Saccharina من تحمل درجات حرارة 22 درجة مئوية (9 درجات مئوية أعلى من درجة حرارة الثقافة المثلى البالغة 13 درجة مئوية) لمدة تصل إلى 4 ساعات. ومع ذلك، يمكن أن تساعد الأجهزة التي تساعد في الحفاظ على درجة حرارة محيطة منخفضة، مثل التهوية الكافية أو حامل لوحة التبريد، في التخفيف من مخاطر الآثار الضارة على بقاء أجنة الطحالب وتطورها. علاوة على ذلك ، يمكن أن يساعد التأقلم البطيء قبل التأقلم مع النباتات المشيمية إلى 16 درجة مئوية تحت الضوء الأحمر الأجنة على تحمل ارتفاع درجات الحرارة أثناء عملية الاستئصال. ثالثا ، بالإضافة إلى الزيادة في درجة الحرارة ، يتم حرمان الأجنة من مصدر ضوء مناسب طوال مدة التجربة. علاوة على ذلك ، قد يتم تبييض البلاستيدات الخضراء جزئيا بواسطة ليزر 561 نانومتر. يساعد استخدام أقل طاقة ممكنة على ليزر 561 نانومتر على تقليل هذا التأثير. رابعا ، يعد النقل أيضا عاملا حاسما يجب مراعاته لأن معدات الاستئصال بالليزر غير متوفرة في جميع المختبرات. يجب تجنب ارتفاع درجات الحرارة والحركات أو الصدمات الخارجية لمنع إزاحة مادة الطحالب أو فقدانها أو موتها. كلما كان ذلك ممكنا ، يجب أن تكون صناديق النقل مبردة ومقاومة للاهتزاز (على سبيل المثال ، رغوة ممتصة للصدمات) ، ومجهزة بالأضواء. تتوفر العديد من صناديق النقل التي تلبي هذه المتطلبات تجاريا.
حتى لو تم التحكم في جميع هذه العوامل قدر الإمكان ، فقد يستمر حدوث إجهاد بيئي ضعيف ولكن يحتمل أن يكون كبيرا. يجب النظر في هذا الاحتمال عند تحليل وتفسير استجابة الجنين للاستئصال بالليزر.
بالإضافة إلى الظروف البيئية التي يجب أن تبقى مستقرة طوال التجربة ، فإن تتبع الكائنات الحية المشععة طوال خطوة الرصد يمثل تحديا أيضا. نمو الأجنة المختلفة يغير المشهد الأصلي مع مرور الوقت. ما لم يكن من الممكن تخصيص مجهر آلي لمراقبة التجربة ، فإن متابعة الجنين بعد الاستئصال بالليزر يمكن أن تصبح بسهولة مستهلكة للوقت وتولد كميات كبيرة من البيانات. يوصى بشدة بتسجيلات الفيديو أثناء نبضة الاستئصال الأولي بالليزر لتتبع رد فعل الجنين الفوري على النبض. هذا الرصد السريع لتأثير النبض له أهمية كبيرة لأنه في بعض الحالات ، يتسبب النبض ، عند استهدافه في منتصف الخلية ، في انفجار الخلية المستهدفة بسرعة ، على الأرجح بسبب اختلاف الأسمولية بين الجزء الداخلي من الخلية والوسط (مياه البحر). عندما كان التسرب سريعا جدا ، انفجرت الخلايا المجاورة أيضا. أثبت إطلاق النار على المنطقة الأكثر بعدا من الخلية المستهدفة أنه وسيلة فعالة لتخزين تأثير الانفجار على أي خلايا مجاورة. طريقة أخرى فعالة لتجنب رشقات نارية عنيفة هي زيادة الأسمولية للوسط مع السكروز27. ومع ذلك ، فإن الفرق في الأسمولية ضروري للقضاء على محتويات الخلية المستهدفة. وبالتالي ، فإن الحفاظ على إمكانات الأسمولية الكافية مطلوب. في حالات قليلة ، أعاقت البلاستيدات الخضراء والمركبات الأخرى الفتحة التي أحدثها الاستئصال بالليزر ، مما أدى إلى تعافي الخلايا من لقاح الليزر ، مع استئناف النمو بعد بضعة أيام. أثبتت النبضات الإضافية الموجهة إلى فتح الفتحة أنها كافية لمنع الانسداد.
القيود
يجب إجراء مقايضة بين طاقة الليزر ، والتي يجب أن تكون عالية بما يكفي لجعل الخلايا تفرغ محتوياتها ، وبقاء الخلايا المجاورة ، والتي تكون في أجنة الطحالب حساسة بشكل خاص للإجهاد الحراري والتبييض الضوئي. لذلك ، فإن المراقبة الدقيقة للخلايا بعد إطلاق الليزر هي المفتاح للتحكم في هذه الخطوة وضمان موت الخلايا المستهدفة. خلاف ذلك ، فإن تفسير الخلايا المستهدفة على مصير الخلايا المجاورة ، وبالتالي التطور اللاحق للجنين ، يمكن أن يكون مضللا.
قد يبدو ثقب الخلايا بإبرة بديلا لا تتعرض فيه خلايا الطحالب لأي حرارة أو إجهاد خفيف. ومع ذلك ، فإن هذا النهج سيكون صعبا لأن خلايا جنين الطحالب البنية تنمو مغمورة في مياه البحر وليس لها أي اتصال مع أي سطح صلب. يقاوم جدار الخلية السميك والمرن اختراق الإبرة حتى عند الحفاظ على الجنين على اتصال بسطح زجاجي صلب باستخدام مناور دقيق في نظام حقن مجهري قياسي.
باختصار ، يصف هذا البروتوكول الإجراء التجريبي الكامل والإعدادات لاستئصال ومراقبة أجنة الطحالب البنية بالليزر والخطوات الحاسمة لتجربة ناجحة (الشكل التكميلي 1). هذا النهج الفريد هو طريقة واعدة لدراسة تفاعلات الخلايا ومصير الخلايا في الأجنة المبكرة للطحالب البنية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.
Acknowledgments
يتم تمويل منحة الدكتوراه من S.B. من قبل Region Bretagne (رقم منحة ARED COH20020) وجامعة السوربون. يتم تمويل منحة الدكتوراه I.T.is من قبل Region Bretagne (رقم منحة ARED COH18020) وجامعة NMBU النرويجية. وقد تلقى هذا المشروع دعما ماليا من المركز الوطني للبحث العلمي من خلال برامج MITI المتعددة التخصصات. MRic هي عضو في البنية التحتية الوطنية France-BioImaging التي تدعمها الوكالة الوطنية الفرنسية للبحوث (ANR-10-INBS-04).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 25 mm glass bottom petri dish | NEST | 801001 | |
| Autoclaved sea water | - | Collected offshore near the Astan buoy (48°44.934 N 003°57.702 W) close to Roscoff, France, at a depth of 20 m. | |
| Cell scraper | MED 2 | 83.3951 | |
| Cell strainer 40 µm | Corning / Falcon | 352340 | |
| Culture cabinets | Snijders Scientific Plant Growth Cabinet ECD01 | Any other brand is suitable provided that the light intensity, the photoperiod and the temperature can be controlled. | |
| LSM 880 Zeiss confocal microscope | Carl Zeiss microscopy, Jena, Germany | Ablation and imaging were performed using a 40x/1.2 water objective | |
| Pellet pestles | Sigma Aldrich | Z359947 | Blue polypropylene (autoclavable) |
| Provasoli supplement | - | Recipe is available here: http://www.sb-roscoff.fr/sites/www.sb-roscoff.fr/files/documents/station-biologique-roscoff-preparation-du-provasoli-2040.pdf | |
| Pulsed 355 laser (UGA-42 Caliburn 355/25) | Rapp OptoElectronic, Wedel, Germany | ||
| Scalpel | Paramount | PDSS 11 | |
| SysCon software | Rapp OptoElectronic, Wedel, Germany | Laser-driver software | |
| ZEN software | Carl Zeiss microscopy, Jena, Germany | Imaging software, used together with the SysCon software; Black 2.3 version |
References
- Montell, D. J., Keshishian, H., Spradling, A. C. Laser ablation studies of the role of the Drosophila oocyte nucleus in pattern formation. Science. 254 (5029), New York, N.Y. 290-293 (1991).
- Shivakumar, P. C., Lenne, P. F. Laser ablation to probe the epithelial mechanics in drosophila. Methods In Molecular Biology. 1478, 241-251 (2016).
- Bargmann, C. I., Avery, L. Laser killing of cells in Caenorhabditis elegans. Modern Biological Analysis of an Organism. 48, 225-250 (1995).
- Fouad, A. D., Liu, A., Du, A., Bhirgoo, P. D., Fang-Yen, C. Thermal laser ablation with tunable lesion size reveals multiple origins of seizure-like convulsions in Caenorhabditis elegans. Scientific Reports. 11 (1), 5084 (2021).
- Johnson, C. S., Holzemer, N. F., Wingert, R. A. Laser ablation of the zebrafish pronephros to study renal epithelial regeneration. Journal of Visualized Experiments. (54), e2845 (2011).
- Mondia, J. P., Adams, D. S., Orendorff, R. D., Levin, M., Omenetto, F. G. Patterned femtosecond-laser ablation of Xenopus laevis melanocytes for studies of cell migration, wound repair, and developmental processes. Biomedical Optics Express. 2 (8), 2383-2391 (2011).
- Reinhardt, D., Frenz, M., Mandel, T., Kuhlemeier, C. Microsurgical and laser ablation analysis of leaf positioning and dorsoventral patterning in tomato. Development. 132 (1), 15-26 (2005).
- Berg, C., Hage, W., Weisbeek, P., Scheres, B. Laser ablation in Arabidopsis roots: a tool to study cell-to-cell communication. Cellular integration of signalling pathways in plant development. Proceedings of the NATO Advanced Study Institute. , https://eurekamag.com/research/003/488/003488317.php 237-250 (1998).
- Berger, F., Taylor, A., Brownlee, C. Cell fate determination by the cell wall in early fucus development. Science. 263 (5152), New York, N.Y. 1421-1423 (1994).
- Bouget, F. Y., Berger, F., Brownlee, C. Position dependent control of cell fate in the Fucus embryo: role of intercellular communication. Development. 125 (11), 1999-2008 (1998).
- Bringloe, T., et al. Phylogeny and evolution of the brown algae. Critical Reviews in Plant Sciences. 39 (4), 281-321 (2020).
- Saifullah, S., Olsen, Y., Surilayani, D., Handå, A. Carbohydrate of the brown seaweed, saccharina latissima: a review. Joint proceedings of the 2nd and the 3rd International Conference on Food Security Innovation (ICFSI 2018-2019). , 180-182 (2021).
- Zhang, X., Thomsen, M. Techno-economic and environmental assessment of novel biorefinery designs for sequential extraction of high-value biomolecules from brown macroalgae Laminaria digitata, Fucus vesiculosus, and Saccharina latissima. Algal Research. 60, 102499 (2021).
- Kanda, T. On the gametophytes of some japanese species of laminariales. Scientific papers of the Institute of Algological Research, Faculty of Science. 1 (2), Hokkaido Imperial University. 221-260 (1936).
- Fritsch, F. E. The structure and reproduction of the algae. Volume 2. , Cambridge University Press. Cambridge. (1945).
- Bartsch, I., et al. The genus Laminaria sensu lato : recent insights and developments. European Journal of Phycology. 43 (1), 1-86 (2008).
- Theodorou, I., Charrier, B. Chapter 2: Brown algae: ectocarpus and saccharina as experimental models for developmental biology. Handbook of Marine Model Organisms in Experimental Biology - Established and Emerging. Boutet, A., Schierwater, B. , Francis & Taylor Group, CRC Press. ISBN 9780367444471 485 (2021).
- Drew, G. H. The reproduction and early development of laminaria digitata and laminaria saccharina. Annals of Botany. 24 (1), 177-189 (1910).
- Yendo, K. The development of costaria, undaria, and laminaria. Annals of Botany. 25 (99), 691-715 (1911).
- Forbord, S., Steinhovden, K., Rød, K., Handå, A., Skjermo, J. Cultivation protocol for Saccharina latissima. Protocols for Macroalgae Research. Charrier, B., Wichard, T., Reddy, C. R. K. , CRC Press, Francis & Taylor Group. ISBN-10: 14986427. ISBN-13: 978-1498796422 37-59 (2018).
- Bartsch, I. Derivation of clonal stock cultures and hybridization of kelps. Protocols for Macroalgae Research. Charrier, B., Wichard, T., Reddy, C. R. K. , CRC Press, Francis & Taylor Group. ISBN-10: 149879627. ISBN-13: 978-1498796422 61-78 (2018).
- Theodorou, I., Opsahl-Sorteberg, H. -G., Charrier, B. Preparation of zygotes and embryos of the kelp saccharina latissima for cell biology approaches. Bio-protocol. 101, 4132 (2021).
- Lüning, K., Dring, M. J. Reproduction induced by blue light in female gametophytes of Laminaria saccharina. Planta. 104 (3), 252-256 (1972).
- de Medeiros, G., et al. Cell and tissue manipulation with ultrashort infrared laser pulses in light-sheet microscopy. Scientific Reports. 10 (1), 1942 (2020).
- Liang, X., Michael, M., Gomez, G. A. Measurement of mechanical tension at cell-cell junctions using two-photon laser ablation. Bio-protocol. 6 (24), 2068 (2016).
- Ebbing, A., Pierik, R., Bouma, T., Kromkamp, J. C., Timmermans, K. How light and biomass density influence the reproduction of delayed Saccharina latissima gametophytes (Phaeophyceae). Journal of Phycology. 56 (3), 709-718 (2020).
- Rabillé, H., Billoud, B., Tesson, B., Le Panse, S., Rolland, É, Charrier, B. The brown algal mode of tip growth: Keeping stress under control. PLoS Biology. 17 (1), 2005258 (2019).
