Summary
A destruição de células específicas no embrião é uma ferramenta poderosa para estudar as interações celulares envolvidas no destino celular. O presente protocolo descreve técnicas para a ablação a laser de células-alvo no embrião inicial da alga marrom Saccharina latissima.
Abstract
Em Saccharina latissima, o embrião desenvolve-se como uma folha celular monocamada chamada lamina ou a lâmina. Cada célula embrionária é fácil de observar, prontamente distinguível de seus vizinhos, e pode ser alvo individual. Por décadas, a ablação a laser tem sido usada para estudar o desenvolvimento de embriões. Aqui, um protocolo para ablação a laser específica para células foi desenvolvido para embriões iniciais da alga marrom S. latissima. O trabalho apresentado inclui: (1) a preparação de embriões de Sacarina , com descrição dos parâmetros críticos, incluindo condições culturais, (2) as configurações de ablação a laser e (3) o monitoramento do crescimento subsequente do embrião irradiado utilizando microscopia de lapso de tempo. Além disso, são fornecidos detalhes sobre as condições ideais para o transporte dos embriões da plataforma de imagem de volta ao laboratório, o que pode afetar profundamente o desenvolvimento subsequente de embriões. Algas pertencentes à ordem Laminariales exibem padrões de embriogênese semelhantes à Sacarina; este protocolo pode, assim, ser facilmente transferido para outras espécies neste taxon.
Introduction
A ablação a laser tem sido usada há décadas para estudar o desenvolvimento de embriões. Irradiar células embrionárias com um raio laser torna possível monitorar o potencial regenerativo e a modificação da linhagem celular durante a embriogênese e investigar o impacto da ablação direcionada na divisão celular e no destino celular. Os organismos modelo utilizados em métodos de ablação a laser são tipicamente animais, como insetos 1,2, nematoides 3,4, vertebrados 5,6 e, ocasionalmente, plantas 7,8. Além disso, uma abordagem de micro-ablação a laser foi usada na alga marrom Fucus em 1994 e 1998 para demonstrar o papel da parede celular na fotopolarização do embrião inicial 9,10.
Algas marrons pertencem ao grupo Stramenopiles, divergiram na raiz da árvore eucariótica há 1,6 bilhões de anos. Como resultado, são filogeneticamente independentes de outros organismos multicelulares, como animais e plantas11. Saccharina latissima pertence à ordem Laminariales, mais comumente conhecida como algas, e estão entre os maiores organismos da Terra, atingindo tamanhos de mais de 30 m. Saccharina sp. é uma grande alga marinha usada para muitas aplicações, como alimentos e ração, e seus polissacarídeos são extraídos para uso nas indústrias agrícola, farmacológica e cosmética em todo o mundo12, 13 anos. Seu cultivo, principalmente na Ásia e mais recentemente na Europa, requer a preparação de embriões em incubatórios antes de liberar jovens em mar aberto. Como todas as algas, ela tem um ciclo de vida bifásico composto por uma fase gametofitica microscópica, durante a qual um gametofito de haploide cresce e produz gametas para fertilização, e uma fase esporofítica macroscópica diploide, onde uma grande lâmina planar se desenvolve a partir de seu protetor de retenção ligado ao fundo do mar ou rochas. O sporófito libera esporos haploides na maturidade, completando assim o ciclo de vida 14,15,16.
S. latissima apresenta algumas características morfológicas interessantes17. Seu embrião desenvolve-se como uma folha de planar monocamadas 15,18,19 antes de adquirir uma estrutura multicamadas coincidindo com o surgimento de diferentes tipos de tecidos. Além disso, laminariales é um dos únicos taxas de algas marrons cujos embriões permanecem ligados ao seu tecido gametofistico materno (Desmarestiales e Sporochnales também15). Essa característica oferece a oportunidade de estudar o papel do tecido materno nesse processo de desenvolvimento e comparar mecanismos de controle materno em algas marrons com os de animais e plantas.
Este artigo apresenta o primeiro protocolo completo para ablação a laser em um embrião de algas primitiva. Este protocolo envolvendo a técnica UV ns-pulsed resulta na destruição específica de células embrionárias individuais para estudar seus respectivos papéis durante a embriogênese. O procedimento oferece uma abordagem confiável para investigar interações celulares e destino celular durante a embriogênese em Laminariales.
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Protocol
1. Produção de Gametofitos de Saccharina latissima
- Coletar esporofitos maduros de S. latissima da natureza como descrito anteriormente20,21. Certifique-se de que os esporofitas selecionados são desprovidos de epífitas (pequenos organismos visíveis na superfície da lâmina) ou parasitas internos (encontrados nas áreas branqueadas ou manchas na lâmina).
- Usando um bisturi, corte a parte mais escura no centro da lâmina (tecido fértil produtor de esporos22) em 1-5 pedaços quadrados (1 cm²), evitando quaisquer manchas branqueadas, se presentes.
- Remova todas as epífitas restantes limpando suavemente os pedaços cortados com a parte de trás de um bisturi e algum papel absorvente.
- Coloque as peças limpas em um prato de vidro recheado com água do mar natural estéril (ver Tabela de Materiais) por 45 minutos para liberar esporos após o relatório publicado anteriormente22.
- Remova os pedaços da lâmina e filtre a água do mar através de um filtro de células de 40 μm para remover detritos ou organismos indesejados.
- Diluir os esporos no filtrado a uma concentração de 20-40 esporos/mL em placas de Petri de plástico22.
- Coloque a solução de esporos em um armário de cultura (ver Tabela de Materiais) configurado com as condições de cultura ideais (13 °C, 24 μE.m-2.s-1, fotoperíodo 16:8 L:D).
- Permita que os esporos germinem e se desenvolvam em gametofitas.
NOTA: A germinação do esporo é visível após 2 dias no gabinete, e a primeira divisão celular das células gametofísticas geralmente ocorre dentro das seguintes 48 horas. - Substitua o meio de crescimento após 5 dias por água do mar natural microfilmada enriquecida com uma solução 0,5x Provasoli (NSW1/2) (ver Tabela de Materiais).
NOTA: Para evitar repetir essas etapas, gametofitas específicas masculinas e femininas podem ser selecionadas e propagadas vegetativamente por vários meses. Os gametofittes permanecem vegetativos quando cultivados sob a luz vermelha (4 μE.m-2.s-1 com um comprimento de onda de pelo menos 580 nm)23 nas mesmas condições de cultura descritas acima (passo 1.7).
2. Fragmentação e indução da oogênese
- Colher gametofittes com um raspador de células.
- Usando um pequeno pilão plástico, esmague os gametofittes coletados em um tubo de 1,5 mL em pedaços de 4-5 células.
- Encha o tubo com 1 mL NSW1/2 (etapa 1.9).
- Adicione 2,5 μL da solução gametofito esmagada em 3 mL de água do mar natural enriquecida com solução 1xoli Provas (NSW) e coloque-as em uma placa de Petri.
NOTA: Recomenda-se uma placa de Petri com fundo de vidro de 25 mm para facilitar o manuseio. - Coloque os pratos preparados em um armário de cultura e induza gametogênese a 13 °C sob luz branca com uma intensidade de 24 μE.m-2.s-1 (luz fraca, fotoperóuodo 16:8 L:D).
NOTA: A primeira gametangia (oogonia feminina e arquegônia masculina) pode ser observada após 5 dias. O macho é hiper-ramificado com pequenas células, e a fêmea é composta de células maiores formando filamentos longos15,22. Os primeiros ovos são observados ~10 dias depois, e a primeira divisão de zigotos geralmente ocorre nos próximos 2 dias. - Seis dias após observar os primeiros ovos, transfira os pratos para condições mais brilhantes de luz branca: 50 μE.m-2.s-1, fotoperíodo 16:8 L:D, ainda a 13 °C.
3. Aquisição de imagens para seleção de embriões para ablação e monitoramento do crescimento subsequente
- Imagem toda a placa de Petri para (re)localizar os embriões selecionados durante a etapa de ablação (não há necessidade de retornar a placa ao microscópio ocular) e monitorar o desenvolvimento subsequente dos embriões selecionados.
NOTA: Use um microscópio confocal de escaneamento a laser invertido (ver Tabela de Materiais) para imagem (Figura 1), e a ablação a laser é descrita na etapa 5. - Coloque a placa de Petri no palco e oriente-a com uma marca visual (por exemplo, desenhe uma linha com um marcador permanente).
- Use o objetivo 10x/0.45 para focar em um embrião. Regissua a posição dos quatro pontos cardeais da placa de Petri.
- Inicie a varredura de ladrilhos. Adquira imagens transmitidas/fluorescentes de toda a placa de Petri em baixa resolução: 256 x 256 pixels, um tempo de 1,54 μs com digitalização bidirecional e um zoom digital de 0,6x usando um laser de 561 nm a 1,2% de transmissão.
NOTA: O tempo de varredura para uma placa petri inteira de 2,5 cm é de ~6 min para 225 telhas (Figura 2). Aqui, o laser de 561 nm foi usado para transmissão e fluorescência. O sinal de fluorescência foi coletado entre 580-720 nm nos fotomultipliers confocal (PMT) e a luz transmitida foi coletada no PMT transmitido. O laser de 561 nm também pode monitorar clorofila nesta etapa, mas é desnecessário porque só ajuda a distinguir o ruído do sinal e os organismos corretamente. - Salve a imagem de varredura de ladrilhos e mantenha-a aberta na janela do software de aquisição de imagens (ver Tabela de Materiais).
- Mude o objetivo, não remova a placa de Petri.
NOTA: O objetivo da água 40x/1.2 foi movido para o lado do palco para que o meio de imersão (água) pudesse ser adicionado ao objetivo sem mover a placa de Petri de sua posição inicial. - Navegue pela imagem de varredura de ladrilhos adquirida anteriormente para selecionar o embrião apropriado. Uma vez identificado um embrião nesta imagem, mova o palco para a posição exata do embrião e adquira imagens transmitidas/fluorescentes desse embrião em alta resolução.
NOTA: Configurações de alta resolução: 512 x 512 pixels, 0,130 μm/pixel, 0,208 μs pixel com digitalização monodirecional e zoom digital de 2x usando um laser de 561 nm a 0,9% de transmissão. - Anote a imagem de varredura de ladrilhos para cada candidato a ablação a laser (Figura 2B) e prossiga para o passo de ablação a laser.
4. Calibração a laser
- Calibrar o laser e sincronizar o software de aquisição de imagens com o software laser-driver no "Modo Clique & Fogo" e um laser pulsado de 355 nm.
NOTA: Esta etapa é crucial para garantir a perfeita sincronização entre a posição do cursor do mouse no software laser-driver (ver Tabela de Materiais) com a posição na imagem ao vivo do software de aquisição. - Abra o pacote de software de driver a laser e clique em Live no pacote de software de aquisição de imagens.
- Sincronize ambos os pacotes de software clicando na aquisição do Start no pacote de software laser-driver. A imagem ao vivo agora também é registrada no software UV laser-driver.
- Defina uma área de interesse (AOI) clicando no botão Escolher AOI e clicando nas bordas da imagem (direita, esquerda, superior e inferior) no pacote de software UV laser-driver.
NOTA: Após esta etapa de calibração, as configurações para tamanho de pixel, formato de imagem e zoom no pacote de software de aquisição devem permanecer constantes. - Selecione uma área vazia no prato e baixe o nível do palco para 20 μm abaixo do plano focal da amostra para se concentrar no fundo do vidro.
- Defina as trajetórias de laser de ablação e imagem a laser clicando em Iniciar a calibração e escolha calibração manual.
- Selecione um poder laser alto o suficiente para ver um ponto negro no centro da imagem ao vivo correspondente ao orifício na tampa de vidro (todas as persianas devem estar abertas).
- Clique neste ponto preto central com o cursor do mouse e clique em 18 pontos adicionais propostos pelo software para concluir o procedimento de alinhamento.
- Verifique a calibração no "Modo Clique & Fogo" no mesmo deslizamento de tampas.
NOTA: A calibração do laser depende dos parâmetros de imagem. Uma vez calibrado o laser, certifique-se de que os parâmetros de imagem (ou seja, 512 x 512 pixels, 0,130 μm/pixel, 0,208 μs pixel com digitalização monodirecional e zoom digital 2x) não foram alterados.
5. Ablação a laser
- Selecione um embrião de interesse. Inicie uma gravação de lapso de tempo no software de aquisição de imagens.
- Adquira imagens de transmissão/fluorescência com um objetivo de 40x/1,2 W em alta resolução (ou seja, 512 x 512 pixels, 0,130 μm/pixel, 1,54 μs pixel com digitalização monodirecional e zoom digital de 2x usando um laser de 561 nm a 0,9% de transmissão). Adquira a gravação de lapso de tempo na velocidade máxima.
- Desaceção para fora da área no início da gravação de lapso de tempo. Aproxime-se da AOI.
- Use a função "Click & Fire" do software laser-driver para aplicar a irradiação prejudicial na célula de interesse no embrião. Utilize os seguintes parâmetros: transmissão a laser de 45% (correspondente a um máximo de 40 μW) e 1 ms de duração do tempo de pulso (etapa 4).
NOTA: Recomenda-se a gravação de vídeo durante o disparo a laser. - Abaixo de 688 nm, monitore a ejeção de cloroplastos autofluorescentes do citoplasma.
- Se o conteúdo da célula permanecer na célula, use a função "Clique & Fogo" mais uma vez para aumentar o tamanho da brecha na célula. Repito, mantendo o número de fotos ao mínimo até que a maioria dos conteúdos do celular tenham sido liberados.
- Pare a gravação do lapso de tempo após a estabilização do embrião (ou seja, nenhum movimento intracelular adicional pode ser detectado (~1-5 min).
- Atualize a anotação na imagem de varredura de ladrilhos, se necessário.
6. Monitorando o crescimento de embriões irradiados
NOTA: O monitoramento é realizado ao longo de vários dias.
- Determine a taxa de sobrevivência monitorando o número de embriões que se desenvolvem após a ablação a laser e compare-os com aqueles que morrem.
NOTA: Alguns embriões morrem imediatamente após a ablação por várias razões. Uma alta e rápida taxa de mortalidade é geralmente um sinal de parâmetros de laser inadequados ou maior/maior exposição ao estresse durante o experimento ou transporte subsequente. - Determine o atraso de crescimento medindo o comprimento dos embriões a laser todos os dias e comparando-o com embriões intactos.
NOTA: A taxa de crescimento de organismos a laser é geralmente mais lenta do que a de organismos não tratados. No entanto, algumas configurações (inadequadas) de laser podem inibir o crescimento por mais de uma semana, com o crescimento retomando depois disso. - Descubra o dano adjacente monitorando a reação das células adjacentes às células abladas. Em alguns casos, a despressurização pós-explosão pode causar o estouro de células vizinhas.
- Verifique se há contaminações de micróbios. Monitore o crescimento de microalgas e bactérias no meio. Se um nível incomum de micróbios estiver presente no prato, então descarte-o e repita o protocolo da etapa 2 ou passo 3.
NOTA: Após a ablação a laser, embriões de S. latissima danificados já estão altamente estressados, e estresse externo adicional pode causar aumento da mortalidade. Surtos bacterianos ou virais são possíveis porque os embriões tratados não podem crescer em condições axeônicas. - Verifique o desenvolvimento global dos organismos de tiro, estudando o fenótipo e entendendo o papel no desenvolvimento da região alvo.
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Representative Results
Gametofitas de S. latissima foram cultivadas , e gametogênese foi induzida a produzir zigotes e embriões. Doze dias após a indução da gametogênese, os embriões foram submetidos à ablação a laser. Aqui, o experimento teve como objetivo avaliar o papel de células específicas no desenvolvimento global de embriões de S. latissima . A célula mais apical, a célula mais basal, e as células medianas foram alvo. Após a varredura de telhas, toda a placa de Petri (Figura 2A), um embrião de interesse, foi identificada como candidata adequada para tiro a laser (Figura 2B). Uma célula específica deste embrião foi escolhida, alvo e tiro com um raio laser UV pulsado com um máximo de 40 μW de potência laser (correspondente a 45% da potência máxima para o equipamento usado aqui) para 1 ms (Filme 1). A célula liberou seu conteúdo (cloroplastos e citoplasma). Curiosamente, as células adjacentes responderam ao estouro da célula irradiada expandindo-se para o espaço intercelular. A posição dos embriões irradiados foi registrada para monitoramento subsequente ao longo de 10 dias (Figura 3). A maioria dos embriões irradiados continuou a se desenvolver, mas mostrou alteração de crescimento (forma de embrião). Uma análise detalhada das alterações morfológicas precisa ser realizada antes que uma função específica possa ser atribuída a cada célula irradiada no controle do mecanismo de desenvolvimento global.
Em contraste, os embriões testados com outros parâmetros de laser (por exemplo, 33 ms para a duração de tiro de 60%-80% de potência laser; Filme 2) rapidamente mostrou sinais de estresse severo, como branqueamento celular, desbotamento ou mudanças de forma (arredondamento). Quase todos os embriões baleados dessa forma morreram dentro de cinco dias após o experimento (Figura 4).
Figura 1: Fotografia da configuração do microscópio de ablação a laser. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Escaneamento de ladrilhos anotados de uma placa de Petri inteira. (A) Tomografia de toda a placa de Petri usada para ablação a laser. O PMT de transmissão foi usado para obter uma varredura brightfield. Uma vez localizado um embrião de interesse, o usuário clica na posição do embrião na varredura de ladrilhos, e o software posiciona o palco diretamente sobre o embrião. (B) A varredura de ladrilhos pode então ser anotada especificamente para localizar o embrião nas etapas subsequentes, para rastrear e monitorar o embrião. Aqui, a imagem mostra um embrião preso ao fundo da placa de Petri, que pode ser facilmente localizado usando o laser de 561 nm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Série temporal do embrião S. latissima em crescimento após a irradiação. Isso é mostrado no Filme 1. A ablação a laser da célula mais apical do embrião não branqueou as células adjacentes do embrião. Eles continuaram a crescer e se dividir, formando um embrião normal após alguns dias. As imagens foram tiradas a cada 24h, 2-9 dias após ablação. A barra de escala é de 50 μm e é a mesma para todas as fotos. D2-D9 corresponde ao dia 2 ao dia 9. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Série temporal de morte embrionária de S. latissima após ablação a laser usando parâmetros subótimos. A superexposição à irradiação a laser pode facilmente levar a taxas de morte mais altas do embrião alvo e também dos vizinhos. Uma série temporal do embrião filmado no Filme 2 é mostrada, com o tempo após ablação indicado acima de cada foto (3-6 dias após a ablação). A barra de escala é de 30 μm e se aplica a cada foto. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Filme 1: Ablação a laser da célula mais apical de um embrião de 8 células de S. latissima. O foco foi primeiro ajustado no embrião selecionado entre um buquê de espófitos de Sacarina (em diferentes campos, primeiro largo, depois estreito). A célula mais apical do embrião foi então filmada usando 45% de potência laser para 1 ms. A célula apical rapidamente estourou e liberou seu conteúdo. As células adjacentes, libertadas do turgor da célula estourada, encheram o espaço vazio. Depois de 5 minutos, a célula e seu conteúdo pararam de se mover e atingiram um estado de equilíbrio. O filme foi acelerado 4 vezes (de 1 imagem por 632 ms para 6 fps). O acompanhamento do desenvolvimento de embriões é mostrado na Figura 3. Clique aqui para baixar este Filme.
Filme 2: Branqueamento significativo de células adjacentes a uma célula de explosão causada por configurações de laser subótimo. O uso de uma potência laser de 60%-80% para 1 ms ou uma potência laser de 45% para 10 ms resultou em branqueamento significativo de células adjacentes e uma taxa de sobrevivência muito menor. As configurações utilizadas para o laser não devem causar branqueamento ou danos parciais às células adjacentes. Os melhores resultados foram obtidos reduzindo a potência e/ou duração do pulso laser, e mirando o ponto mais distante das células adjacentes. Aqui, a célula mais apical de um embrião de 4 células de S. latissima éfilmada (80% de potência laser, 1 ms) (vista lateral/superior). O overbleaching das células inferiores e laterais é facilmente observável. O desenvolvimento subsequente do embrião é mostrado na Figura 4. Clique aqui para baixar este Filme.
Figura suplementar 1: Fluxograma de esquema de todo o protocolo. Clique aqui para baixar este Arquivo.
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Discussion
A ablação a laser celular local permite a ablação temporal e espacial com um alto nível de precisão. No entanto, sua eficiência pode ser dificultada pela não acessibilidade das células-alvo; por exemplo, todas as células são de um embrião tridimensional. Este protocolo foi desenvolvido no embrião da alga Saccharina latissima, que desenvolve uma lâmina monocamada na qual todas as células podem ser facilmente distinguidas e destruídas individualmente com um raio laser.
Poder laser e comprimento de onda
O laser com pulso de NIR é comumente usado em estudos de desenvolvimento em animais24,25. No entanto, no caso de algas marrons como Saccharina, o laser não poderia estourar a célula sem queimar todo o embrião. Esta reação pode estar relacionada com a alta atividade das colheitadeiras de luz de cloroplasto.
Usando o laser UV com pulso ns para ablação, duas abordagens foram testadas: (1) usando um pulso de alta potência durante um curto período de tempo ou (2) usando uma menor exposição a laser por um período mais longo de tempo. A energia fornecida pelo laser, uma combinação de energia laser e duração do pulso, impacta a energia entregue à célula irradiada. A energia entregue também pode afetar as células circundantes por reflexão e difração. Portanto, as configurações mais baixas dos dois parâmetros que deram resultados reprodutíveis foram selecionadas para reduzir quaisquer efeitos colaterais indesejados. A potência laser entre 25-40 μ W.cm-2 com pulso de 1 ms parecia ser ótima. Usando esses parâmetros, o efeito do laser UV foi contido em um nível muito local, sem branqueamento visível nas células circundantes, mas eficiente o suficiente para causar a explosão da célula alvo. Esses parâmetros foram repetidamente aplicados sem qualquer efeito letal direto sobre os embriões. Tempos de pulso mais longos ou maior poder laser causaram branqueamento das células circundantes ou até mesmo morte do embrião, enquanto valores inferiores foram insuficientes para quebrar a parede celular.
Condições materiais e culturais algas
Embora permita um tiro preciso no nível subcelular, esta técnica requer que o experimentador aborde quatro fatores críticos para permitir uma interpretação confiável dos resultados. Esses pontos devem ser considerados antes e depois do experimento de ablação a laser.
O primeiro fator a ser abordado é a densidade populacional de embriões. A aglomeração negativa impacta a taxa de desenvolvimento de S. latissima26. As baixas densidades proporcionam (1) melhor repetibilidade de pulso porque a presença de outros embriões no caminho do laser pode diminuir sua potência, e (2) o monitoramento mais fácil dos embriões atingidos pelo laser, que crescem ligeiramente mais lentos do que embriões intactos; este último rapidamente cobrindo os embriões de tiro. O segundo fator crítico deste protocolo é a temperatura em que o experimento é realizado. O raio laser em si aquece a amostra, mas a temperatura da sala e do ambiente local do microscópio adicionam às condições gerais de temperatura experimentadas pela amostra, perto de 18-22 °C. Aqui, o quarto do microscópio não foi refrigerado porque este equipamento é usado principalmente para células animais que toleram temperaturas ambientais. Felizmente, os embriões de Sacarina foram capazes de suportar temperaturas de 22 °C (9 °C acima da temperatura ideal de cultura de 13 °C) por até 4 h. No entanto, dispositivos para ajudar a manter uma baixa temperatura ambiente, como ventilação adequada ou porta-placas de resfriamento, podem ajudar a mitigar o risco de efeitos adversos sobre a sobrevivência e o desenvolvimento dos embriões alga. Além disso, a lenta pré-aclimatação de gametofittes a 16 °C sob luz vermelha pode ajudar os embriões a suportar picos de temperatura durante o processo de ablação. Em terceiro lugar, além do aumento da temperatura, os embriões são privados de uma fonte de luz adequada durante a duração do experimento. Além disso, os cloroplastos podem ser parcialmente branqueados pelo laser de 561 nm. Usar a menor potência possível no laser de 561 nm ajuda a reduzir esse efeito. Em quarto lugar, o transporte também é um fator crítico a ser levado em conta porque os equipamentos de ablação a laser não estão disponíveis em todos os laboratórios. Picos de temperatura e movimentos externos ou choques devem ser evitados para evitar o desalojamento, perda ou morte do material agal. Sempre que possível, as caixas de transporte precisam ser refrigeradas, resistentes a vibrações (por exemplo, espuma absorvente de choque) e equipadas com luzes. Várias caixas de transporte que atendam a esses requisitos estão disponíveis comercialmente.
Mesmo que todos esses fatores sejam controlados o máximo possível, o estresse ambiental fraco, mas potencialmente significativo, ainda pode ocorrer. Essa possibilidade deve ser considerada na análise e interpretação da resposta do embrião à ablação a laser.
Além das condições ambientais que devem ser mantidas estáveis durante todo o experimento, acompanhar os organismos irradiados durante toda a etapa de monitoramento também é um desafio. O crescimento dos diferentes embriões muda a paisagem original ao longo do tempo. A menos que um microscópio automatizado possa ser dedicado ao monitoramento do experimento, seguir o embrião após a ablação a laser pode facilmente se tornar demorado e gerar grandes quantidades de dados. Gravações de vídeo durante o pulso de ablação do laser inicial são altamente recomendadas para rastrear a reação imediata do embrião ao pulso. Esse rápido monitoramento do impacto do pulso é de importância significativa, pois em alguns casos, o pulso, quando direcionado para o meio da célula, fez com que a célula alvo estourasse rapidamente, provavelmente devido à diferença de osmolaridade entre o interior da célula e o meio (água do mar). Quando o vazamento foi muito rápido, as células vizinhas também estouraram. Atirar na região mais distal da célula alvo provou ser uma maneira eficiente de tamponar o efeito de explosão em qualquer célula adjacente. Outra maneira eficiente de evitar explosões violentas é aumentar a osmolaridade do meio com sacarose27. No entanto, a diferença na osmolaridade é necessária para eliminar o conteúdo da célula alvo. Assim, é necessário manter o potencial de osmolaridade suficiente. Em alguns casos, cloroplastos e outros compostos obstruíram a abertura feita pela ablação a laser, o que resultou em células se recuperando do tiro a laser, com o crescimento retomando após alguns dias. Pulsos adicionais direcionados para desentupir a abertura mostraram-se suficientes para evitar obstrução.
Limitações
Uma troca deve ser batida entre a potência laser, que deve ser alta o suficiente para fazer as células esvaziarem seu conteúdo, e a sobrevivência das células vizinhas, que em embriões de algas são particularmente sensíveis ao estresse térmico e fotobleaching. Portanto, o monitoramento próximo das células após o tiro a laser é a chave para controlar esta etapa e garantir que as células-alvo estejam mortas. Caso contrário, a interpretação das células-alvo sobre o destino das células vizinhas e, portanto, o desenvolvimento subsequente do embrião, pode ser enganosa.
Células de punção com uma agulha podem parecer uma alternativa na qual as células algas não experimentariam qualquer estresse térmico ou leve. No entanto, essa abordagem seria desafiadora porque as células embriões algas marrons crescem imersas na água do mar e não têm contato com nenhuma superfície sólida. A parede celular espessa e elástica resiste à penetração da agulha mesmo mantendo o embrião em contato com uma superfície de vidro sólida usando um micromanipulador em um sistema padrão de microinjeção.
Em resumo, este protocolo descreve o procedimento experimental completo e as configurações para a ablação a laser e o monitoramento de embriões algas marrons e as etapas críticas para um experimento bem-sucedido (Figura Suplementar 1). Esta abordagem única é um método promissor para estudar interações celulares e destino celular nos primeiros embriões de algas marrons.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
A bolsa de doutorado da S.B. é financiada pela Region Bretagne (Número de Subvenção ARED COH20020) e pela Sorbonne Université. I.T.is bolsa de doutorado é financiada pela Região Bretagne (Número de Subvenção ARED COH18020) e pela Universidade Norvegiana NMBU. Este projeto recebeu apoio financeiro do CNRS por meio dos programas interdisciplinares do MITI. MRic é membro da infraestrutura nacional France-BioImaging apoiada pela Agência Nacional de Pesquisa francesa (ANR-10-INBS-04).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 25 mm glass bottom petri dish | NEST | 801001 | |
| Autoclaved sea water | - | Collected offshore near the Astan buoy (48°44.934 N 003°57.702 W) close to Roscoff, France, at a depth of 20 m. | |
| Cell scraper | MED 2 | 83.3951 | |
| Cell strainer 40 µm | Corning / Falcon | 352340 | |
| Culture cabinets | Snijders Scientific Plant Growth Cabinet ECD01 | Any other brand is suitable provided that the light intensity, the photoperiod and the temperature can be controlled. | |
| LSM 880 Zeiss confocal microscope | Carl Zeiss microscopy, Jena, Germany | Ablation and imaging were performed using a 40x/1.2 water objective | |
| Pellet pestles | Sigma Aldrich | Z359947 | Blue polypropylene (autoclavable) |
| Provasoli supplement | - | Recipe is available here: http://www.sb-roscoff.fr/sites/www.sb-roscoff.fr/files/documents/station-biologique-roscoff-preparation-du-provasoli-2040.pdf | |
| Pulsed 355 laser (UGA-42 Caliburn 355/25) | Rapp OptoElectronic, Wedel, Germany | ||
| Scalpel | Paramount | PDSS 11 | |
| SysCon software | Rapp OptoElectronic, Wedel, Germany | Laser-driver software | |
| ZEN software | Carl Zeiss microscopy, Jena, Germany | Imaging software, used together with the SysCon software; Black 2.3 version |
References
- Montell, D. J., Keshishian, H., Spradling, A. C. Laser ablation studies of the role of the Drosophila oocyte nucleus in pattern formation. Science. 254 (5029), New York, N.Y. 290-293 (1991).
- Shivakumar, P. C., Lenne, P. F. Laser ablation to probe the epithelial mechanics in drosophila. Methods In Molecular Biology. 1478, 241-251 (2016).
- Bargmann, C. I., Avery, L. Laser killing of cells in Caenorhabditis elegans. Modern Biological Analysis of an Organism. 48, 225-250 (1995).
- Fouad, A. D., Liu, A., Du, A., Bhirgoo, P. D., Fang-Yen, C. Thermal laser ablation with tunable lesion size reveals multiple origins of seizure-like convulsions in Caenorhabditis elegans. Scientific Reports. 11 (1), 5084 (2021).
- Johnson, C. S., Holzemer, N. F., Wingert, R. A. Laser ablation of the zebrafish pronephros to study renal epithelial regeneration. Journal of Visualized Experiments. (54), e2845 (2011).
- Mondia, J. P., Adams, D. S., Orendorff, R. D., Levin, M., Omenetto, F. G. Patterned femtosecond-laser ablation of Xenopus laevis melanocytes for studies of cell migration, wound repair, and developmental processes. Biomedical Optics Express. 2 (8), 2383-2391 (2011).
- Reinhardt, D., Frenz, M., Mandel, T., Kuhlemeier, C. Microsurgical and laser ablation analysis of leaf positioning and dorsoventral patterning in tomato. Development. 132 (1), 15-26 (2005).
- Berg, C., Hage, W., Weisbeek, P., Scheres, B. Laser ablation in Arabidopsis roots: a tool to study cell-to-cell communication. Cellular integration of signalling pathways in plant development. Proceedings of the NATO Advanced Study Institute. , https://eurekamag.com/research/003/488/003488317.php 237-250 (1998).
- Berger, F., Taylor, A., Brownlee, C. Cell fate determination by the cell wall in early fucus development. Science. 263 (5152), New York, N.Y. 1421-1423 (1994).
- Bouget, F. Y., Berger, F., Brownlee, C. Position dependent control of cell fate in the Fucus embryo: role of intercellular communication. Development. 125 (11), 1999-2008 (1998).
- Bringloe, T., et al. Phylogeny and evolution of the brown algae. Critical Reviews in Plant Sciences. 39 (4), 281-321 (2020).
- Saifullah, S., Olsen, Y., Surilayani, D., Handå, A. Carbohydrate of the brown seaweed, saccharina latissima: a review. Joint proceedings of the 2nd and the 3rd International Conference on Food Security Innovation (ICFSI 2018-2019). , 180-182 (2021).
- Zhang, X., Thomsen, M. Techno-economic and environmental assessment of novel biorefinery designs for sequential extraction of high-value biomolecules from brown macroalgae Laminaria digitata, Fucus vesiculosus, and Saccharina latissima. Algal Research. 60, 102499 (2021).
- Kanda, T. On the gametophytes of some japanese species of laminariales. Scientific papers of the Institute of Algological Research, Faculty of Science. 1 (2), Hokkaido Imperial University. 221-260 (1936).
- Fritsch, F. E. The structure and reproduction of the algae. Volume 2. , Cambridge University Press. Cambridge. (1945).
- Bartsch, I., et al. The genus Laminaria sensu lato : recent insights and developments. European Journal of Phycology. 43 (1), 1-86 (2008).
- Theodorou, I., Charrier, B. Chapter 2: Brown algae: ectocarpus and saccharina as experimental models for developmental biology. Handbook of Marine Model Organisms in Experimental Biology - Established and Emerging. Boutet, A., Schierwater, B. , Francis & Taylor Group, CRC Press. ISBN 9780367444471 485 (2021).
- Drew, G. H. The reproduction and early development of laminaria digitata and laminaria saccharina. Annals of Botany. 24 (1), 177-189 (1910).
- Yendo, K. The development of costaria, undaria, and laminaria. Annals of Botany. 25 (99), 691-715 (1911).
- Forbord, S., Steinhovden, K., Rød, K., Handå, A., Skjermo, J. Cultivation protocol for Saccharina latissima. Protocols for Macroalgae Research. Charrier, B., Wichard, T., Reddy, C. R. K. , CRC Press, Francis & Taylor Group. ISBN-10: 14986427. ISBN-13: 978-1498796422 37-59 (2018).
- Bartsch, I. Derivation of clonal stock cultures and hybridization of kelps. Protocols for Macroalgae Research. Charrier, B., Wichard, T., Reddy, C. R. K. , CRC Press, Francis & Taylor Group. ISBN-10: 149879627. ISBN-13: 978-1498796422 61-78 (2018).
- Theodorou, I., Opsahl-Sorteberg, H. -G., Charrier, B. Preparation of zygotes and embryos of the kelp saccharina latissima for cell biology approaches. Bio-protocol. 101, 4132 (2021).
- Lüning, K., Dring, M. J. Reproduction induced by blue light in female gametophytes of Laminaria saccharina. Planta. 104 (3), 252-256 (1972).
- de Medeiros, G., et al. Cell and tissue manipulation with ultrashort infrared laser pulses in light-sheet microscopy. Scientific Reports. 10 (1), 1942 (2020).
- Liang, X., Michael, M., Gomez, G. A. Measurement of mechanical tension at cell-cell junctions using two-photon laser ablation. Bio-protocol. 6 (24), 2068 (2016).
- Ebbing, A., Pierik, R., Bouma, T., Kromkamp, J. C., Timmermans, K. How light and biomass density influence the reproduction of delayed Saccharina latissima gametophytes (Phaeophyceae). Journal of Phycology. 56 (3), 709-718 (2020).
- Rabillé, H., Billoud, B., Tesson, B., Le Panse, S., Rolland, É, Charrier, B. The brown algal mode of tip growth: Keeping stress under control. PLoS Biology. 17 (1), 2005258 (2019).
