Summary
Ødelæggelsen af specifikke celler i embryoet er et kraftfuldt værktøj til at studere cellulære interaktioner involveret i celle skæbne. Den nuværende protokol beskriver teknikker til laserablation af målrettede celler i det tidlige embryo af den brune alge Saccharina latissima.
Abstract
I Saccharina latissima udvikler embryoet sig som et enlags celleark kaldet lamina eller bladet. Hver embryocelle er let at observere, let at skelne fra sine naboer og kan målrettes individuelt. I årtier er laserablation blevet brugt til at studere embryoudvikling. Her blev der udviklet en protokol for cellespecifik laserablation til tidlige embryoner af den brune alge S. latissima. Det præsenterede arbejde omfatter: (1) fremstilling af Saccharina-embryoner med en beskrivelse af de kritiske parametre, herunder kulturbetingelser, (2) laserablationsindstillingerne og (3) overvågning af den efterfølgende vækst af det bestrålede embryo ved hjælp af timelapse-mikroskopi. Derudover gives detaljer om de optimale betingelser for transport af embryonerne fra billeddannelsesplatformen tilbage til laboratoriet, hvilket kan påvirke den efterfølgende embryoudvikling dybt. Alger, der tilhører ordenen Laminariales, viser embryogenesemønstre svarende til Saccharina; denne protokol kan således let overføres til andre arter i denne taxon.
Introduction
Laserablation er blevet brugt i årtier til at studere embryoudvikling. Bestråling af embryoceller med en laserstråle gør det muligt at overvåge det regenerative potentiale og modifikationen af celleslægten under embryogenese og undersøge virkningen af målrettet ablation på celledeling og celleskæbne. De modelorganismer, der anvendes i laserablationsmetoder, er typisk dyr, såsom insekter 1,2, nematoder 3,4, hvirveldyr 5,6 og lejlighedsvis planter 7,8. Derudover blev en lasermikroablationsmetode anvendt på den brune alge Fucus i 1994 og 1998 for at demonstrere cellevæggens rolle i fotopolariseringen af det tidlige embryo 9,10.
Brune alger tilhører gruppen Stramenopiles, divergerede ved roden af det eukaryote træ for 1,6 milliarder år siden. Som følge heraf er de fylogenetisk uafhængige af andre flercellede organismer, såsom dyr og planter11. Saccharina latissima tilhører ordren Laminariales, mere almindeligt kendt som kelps, og de er blandt de største organismer på jorden og når størrelser på over 30 m. Saccharina sp. er en stor tang, der anvendes til mange anvendelser såsom mad og foder, og dets polysaccharider ekstraheres til brug i landbrugs-, farmakologiske og kosmetiske industrier over hele verden12, 13. Dens dyrkning, hovedsagelig i Asien og for nylig i Europa, kræver forberedelse af embryoner i rugerier, inden unge frigives i det åbne hav. Som alle tang har den en bifasisk livscyklus sammensat af en mikroskopisk gametofytisk fase, hvor en haploid gametofyt vokser og producerer gameter til befrugtning og en diploid makroskopisk sporofytisk fase, hvor et stort plant blad udvikler sig fra sin holdfast fastgjort til havbunden eller klipperne. Sporofytten frigiver haploide sporer ved modenhed og fuldender derved livscyklussen 14,15,16.
S. latissima præsenterer nogle interessante morfologiske træk17. Dets embryo udvikler sig som et enkeltlags planark 15,18,19, før det erhverver en flerlagsstruktur, der falder sammen med fremkomsten af forskellige vævstyper. Derudover er Laminariales en af de eneste taxa af brune alger, hvis embryoner forbliver bundet til deres moderlige gametofytiske væv (Desmarestiales og Sporochnales gør også15). Denne funktion giver mulighed for at studere moderens vævs rolle i denne udviklingsproces og sammenligne moderlige kontrolmekanismer i brune alger med dem hos dyr og planter.
Denne artikel præsenterer den første komplette protokol for laserablation i et tidligt kelpembryo. Denne protokol, der involverer UV ns-pulserende teknik, resulterer i specifik destruktion af individuelle embryoceller for at studere deres respektive roller under embryogenese. Proceduren tilbyder en pålidelig tilgang til undersøgelse af celleinteraktioner og celle skæbne under embryogenese i Laminariales.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Produktion af Saccharina latissima gametofytter
- Saml modne sporofytter af S. latissima fra naturen som tidligere beskrevet20,21. Sørg for, at de valgte sporofytter er blottet for epifytter (små organismer synlige på bladets overflade) eller interne parasitter (findes i de blegede områder eller pletter på bladet).
- Brug en skalpel til at skære den mørkeste del i midten af bladet (frugtbart sporeproducerende væv22) i 1-5 firkantede stykker (1 cm²), undgå blegede pletter, hvis de er til stede.
- Fjern eventuelle resterende epifytter ved forsigtigt at rengøre de afskårne stykker med bagsiden af en skalpel og noget absorberende papir.
- Anbring de rensede stykker i en glasskål fyldt med sterilt naturligt havvand (se Materialetabel) i 45 minutter for at frigive sporer efter tidligere offentliggjort rapport22.
- Fjern bladstykkerne, og filtrer havvandet gennem en 40 μm cellesi for at fjerne snavs eller uønskede organismer.
- Fortynd sporerne i filtratet til en koncentration på 20-40 sporer/ml i petriskåleaf plast 22.
- Sporeopløsningen anbringes i et kulturskab (se Materialetabel), der er konfigureret med de optimale kulturforhold (13 °C, 24 μE.m-2.s-1, fotoperiode 16:8 L:D).
- Lad sporerne spire og udvikle sig til gametofytter.
BEMÆRK: Sporespiring er synlig efter 2 dage i kabinettet, og den første celledeling af de gametofytiske celler forekommer normalt inden for følgende 48 timer. - Vækstmediet udskiftes efter 5 dage med mikrofiltreret naturligt havvand beriget med en 0,5x Provasoli-opløsning (NSW1/2) (se materialetabel).
BEMÆRK: For at undgå at gentage disse trin kan specifikke mandlige og kvindelige gametofytter vælges og vegetativt formeres i flere måneder. Gametofytterne forbliver vegetative, når de dyrkes under rødt lys (4 μE.m-2.s-1 med en bølgelængde på mindst 580 nm)23 under de samme dyrkningsbetingelser som beskrevet ovenfor (trin 1.7).
2. Fragmentering og induktion af oogenese
- Høst gametofytter med en celleskraber.
- Brug en lille plastpestle til at knuse de opsamlede gametofytter i et 1,5 ml rør i 4-5-cellede stykker.
- Røret fyldes med 1 ml NSW1/2 (trin 1.9).
- Der tilsættes 2,5 μL knust gametofytopløsning i 3 ml naturligt havvand beriget med 1x Provasoli-opløsning (NSW), og de anbringes i en petriskål.
BEMÆRK: Et 25 mm, glasbundet petriskål anbefales for lettere håndtering. - Anbring de tilberedte retter i et kulturskab, og der fremkaldes gametogenese ved 13 °C under hvidt lys med en intensitet på 24 μE.m-2.s-1 (svagt lys, fotoperiode 16:8 L:D).
BEMÆRK: Den første gametangia (kvindelig oogonia og mandlig archegonia) kan observeres efter 5 dage. Hannen er hyperforgrenet med små celler, og hunnen består af større celler, der danner lange filamenter 15,22. De første æg observeres ~ 10 dage senere, og den første opdeling af zygoter forekommer normalt inden for de følgende 2 dage. - Seks dage efter at have observeret de første æg, overføres opvasken til lysere hvide lysforhold: 50 μE.m-2.s-1, fotoperiode 16:8 L:D, stadig ved 13 °C.
3. Billedoptagelse til udvælgelse af embryoner til ablation og overvågning af efterfølgende vækst
- Forestil dig hele petriskålen for at (gen)lokalisere de embryoner, der er valgt under ablationstrinnet (ingen grund til at returnere skålen til det okulære mikroskop) og overvåge den efterfølgende udvikling af de valgte embryoner.
BEMÆRK: Brug et omvendt laserscanningskonfokalmikroskop (se Materialetabel) til billeddannelse (figur 1), og laserablationen er beskrevet i trin 5. - Placer petriskålen på scenen og orienteret den med et visuelt mærke (tegn f.eks. en linje med en permanent markør).
- Brug målet 10x/0,45 til at fokusere på et embryo. Registrer placeringen af de fire kardinalpunkter i Petriskålen.
- Start feltscanningen. Indskaf transmitterede/fluorescerende billeder af hele petriskålen ved lav opløsning: 256 x 256 pixels, en pixel opholdstid på 1,54 μs med tovejsscanning og en digital zoom på 0,6x ved hjælp af en 561 nm laser ved 1,2% transmission.
BEMÆRK: Scanningstiden for en hel petriskål på 2,5 cm er ~6 min for 225 fliser (figur 2). Her blev 561 nm laseren brugt til transmission og fluorescensbilleddannelse. Fluorescenssignalet blev indsamlet mellem 580-720 nm på de konfokale fotomultipliers (PMT), og det transmitterede lys blev opsamlet på den transmitterede PMT. 561 nm laseren kan også overvåge klorofyl på dette trin, men det er unødvendigt, fordi det kun hjælper med at skelne signalstøj og organismer korrekt. - Gem flisescanningsbilledet, og hold det åbent i vinduet til billedoptagelsessoftware (se Materialetabel).
- Skift målet, fjern ikke petriskålen.
BEMÆRK: 40x/1.2 vandmålet blev flyttet til siden af scenen, så nedsænkningsmediet (vand) kunne føjes til målet uden at flytte petriskålen fra sin oprindelige position. - Naviger gennem det tidligere erhvervede flisescanningsbillede for at vælge det relevante embryo. Når et embryon er blevet identificeret på dette billede, skal du flytte scenen til embryonets nøjagtige position og få transmitterede / fluorescerende billeder af dette embryo i høj opløsning.
BEMÆRK: Indstillinger i høj opløsning: 512 x 512 pixels, 0,130 μm/pixel, 0,208 μs pixel opholdstid med mono-retningsscanning og 2x digital zoom ved hjælp af en 561 nm laser ved 0,9% transmission. - Anmærk flisescanningsbilledet for hver embryokandidat til laserablation (figur 2B), og fortsæt til laserablationstrinnet.
4. Laser kalibrering
- Kalibrer laseren, og synkroniser billedoptagelsessoftwaren med laserdriversoftwaren i "Click &Fire-tilstand" og en pulserende 355 nm laser.
BEMÆRK: Dette trin er afgørende for at sikre perfekt synkronisering mellem musemarkørens position i laserdriversoftwaren (se Materialetabel) med placeringen i livebilledet af anskaffelsessoftwaren. - Åbn laserdriversoftwarepakken, og klik på Live i billedoptagelsessoftwarepakken.
- Synkroniser begge softwarepakker ved at klikke på Start anskaffelse i laserdriversoftwarepakken. Live-billedet er nu også optaget i UV-laserdriversoftwaren.
- Definer et interesseområde (AOI) ved at klikke på knappen Vælg AOI og klikke på kanterne af billedet (højre, venstre, øverst og nederst) i UV-laserdriversoftwarepakken.
BEMÆRK: Efter dette kalibreringstrin skal indstillingerne for pixelstørrelse, billedformat og zoom i anskaffelsessoftwarepakken forblive konstante. - Vælg et tomt område på fadet, og sænk trinniveauet til 20 μm under prøvebrændingsplanet for at fokusere på glasbunden.
- Indstil ablationslaser- og billedlaserbanerne ved at klikke på Start kalibrering , og vælg Manuel kalibrering.
- Vælg en lasereffekt, der er høj nok til at se en sort prik i midten af det levende billede svarende til hullet i glasdækslet (alle skodder skal være åbne).
- Klik på denne centrale sorte prik med musemarkøren, og klik på 18 yderligere prikker foreslået af softwaren for at fuldføre justeringsproceduren.
- Kontroller kalibreringen i "Klik & Brand-tilstand" på samme dækslip.
BEMÆRK: Laserkalibrering afhænger af billedparametrene. Når laseren er kalibreret, skal du sikre dig, at billedparametrene (dvs. 512 x 512 pixels, 0,130 μm/pixel, 0,208 μs pixel opholdstid med mono-retningsscanning og 2x digital zoom) ikke er ændret.
5. Laserablation
- Vælg et embryo af interesse. Start en timelapse-optagelse i billedoptagelsessoftwaren.
- Indskaf transmitterede/fluorescensbilleder med et mål på 40x/1,2 W ved høj opløsning (dvs. 512 x 512 pixels, 0,130 μm/pixel, 1,54 μs pixel opholdstid med monovejsscanning og 2x digital zoom ved hjælp af en 561 nm laser ved 0,9 % transmission). Få timelapse-optagelsen med maksimal hastighed.
- Zoom ud af området i begyndelsen af timelapse-optagelsen. Zoom ind på AOI.
- Brug laserdriversoftwarens "Click &fire"-funktion til at anvende den skadelige bestråling på cellen af interesse i embryoet. Brug følgende parametre: 45 % lasertransmission (svarende til maksimalt 40 μW) og 1 ms pulstidsvarighed (trin 4).
BEMÆRK: Videooptagelse under laseroptagelse anbefales. - Under 688 nm skal du overvåge udstødningen af autofluorescerende kloroplaster fra cytoplasmaet.
- Hvis celleindholdet forbliver i cellen, skal du bruge funktionen "Klik og ild" igen for at øge størrelsen på bruddet i cellen. Gentag, og hold antallet af billeder på et minimum, indtil det meste af celleindholdet er frigivet.
- Stop timelapse-optagelsen, efter at embryoet er stabiliseret (dvs. der kan ikke påvises yderligere intracellulær bevægelse (~ 1-5 min).
- Opdater anmærkningen på flisescanningsbilledet, hvis det er nødvendigt.
6. Overvågning af væksten af bestrålede embryoner
BEMÆRK: Overvågningen foregår over flere dage.
- Bestem overlevelsesraten ved at overvåge antallet af embryoner, der udvikler sig efter laserablation, og sammenlign dem med dem, der dør.
BEMÆRK: Nogle embryoner dør umiddelbart efter ablation af forskellige årsager. En høj og hurtig dødelighed er normalt et tegn på uhensigtsmæssige laserparametre eller højere/længere eksponering for stress under forsøget eller efterfølgende transport. - Bestem vækstforsinkelsen ved at måle længden af de laserskudte embryoner hver dag og sammenligne den med intakte embryoner.
BEMÆRK: Vækstraten for laserskudte organismer er generelt langsommere end for ubehandlede organismer. Imidlertid kan nogle (upassende) laserindstillinger hæmme væksten i mere end en uge, hvor væksten genoptages efter det. - Find ud af den tilstødende skade ved at overvåge reaktionen af celler ved siden af de ablerede celler. I nogle tilfælde kan trykaflastning efter burst få naboceller til at briste.
- Kontroller for mikrobeforureninger. Overvåg væksten af mikroalger og bakterier i mediet. Hvis der er et usædvanligt niveau af mikrober i skålen, skal du kassere det og gentage protokollen fra trin 2 eller trin 3.
BEMÆRK: Efter laserablation er beskadigede S. latissima-embryoner allerede stærkt stressede, og yderligere ekstern stress kan forårsage øget dødelighed. Bakterielle eller virale udbrud er mulige, fordi de behandlede embryoner ikke kan vokse under akseniske forhold. - Kontroller den globale udvikling af de skudte organismer ved at studere fænotypen og forstå rollen i udviklingen af den målrettede region.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Gametofytter af S. latissima blev dyrket, og gametogenese blev induceret til at producere zygoter og embryoner. Tolv dage efter induktionen af gametogenese gennemgik embryonerne laserablation. Her havde eksperimentet til formål at vurdere specifikke cellers rolle i den samlede udvikling af S. latissima-embryoner . Den mest apikale celle, den mest basale celle og mediancellerne blev målrettet. Efter flisescanning blev hele petriskålen (figur 2A), et embryo af interesse, identificeret som en egnet kandidat til laserskydning (figur 2B). En specifik celle i dette embryo blev valgt, målrettet og skudt med en pulserende UV-laserstråle med maksimalt 40 μW lasereffekt (svarende til 45% af den maksimale effekt for det udstyr, der anvendes her) i 1 ms (film 1). Cellen frigav sit indhold (kloroplaster og cytoplasma). Interessant nok reagerede tilstødende celler på sprængningen af den bestrålede celle ved at ekspandere ind i det intercellulære rum. De bestrålede embryoners position blev registreret med henblik på efterfølgende overvågning over 10 dage (figur 3). De fleste af de bestrålede embryoner fortsatte med at udvikle sig, men viste vækstændring (embryoform). Det er nødvendigt at foretage en detaljeret analyse af de morfologiske ændringer, før hver bestrålet celle kan tillægges en specifik funktion til styring af den samlede udviklingsmekanisme.
I modsætning hertil testes embryoner med andre laserparametre (f.eks. 33 ms i optagevarigheden på 60% -80% lasereffekt; Film 2) viste hurtigt tegn på alvorlig stress såsom celleblegning, fading eller formændringer (afrunding). Næsten alle embryoner skudt på denne måde døde inden for fem dage efter eksperimentet (figur 4).
Figur 1: Foto af opsætningen af laserablationsmikroskopet. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Kommenteret flisescanning af et helt petriskål. (A) Flisescanning af hele petriskålen, der anvendes til laserablation. Transmissionen PMT blev brugt til at opnå en brightfield-scanning. Når et embryon af interesse er fundet, klikker brugeren på embryoets position i flisescanningen, og softwaren placerer scenen direkte over embryoet. (B) Flisescanningen kan derefter kommenteres specifikt for at lokalisere embryoet i de efterfølgende trin, for at spore og overvåge embryoet. Her viser billedet et embryo fastgjort til bunden af petriskålen, som let kan lokaliseres ved hjælp af 561 nm laseren. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Tidsserie for det voksende S. latissima embryo efter bestråling. Dette vises i film 1. Laserablation af embryonets mest apikale celle blegede ikke de tilstødende celler i embryoet. De fortsatte med at vokse og opdele og dannede et normalt embryo efter et par dage. Billeder blev taget hver 24 timer, 2-9 dage efter ablation. Skalabjælken er 50 μm og er den samme for alle fotos. D2-D9 svarer til dag-2 til dag-9. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Tidsserie af S. latissima embryodød efter laserablation ved hjælp af suboptimale parametre. Overeksponering for laserbestråling kan let føre til højere dødelighed for målembryoet og også de nærliggende. En tidsserie af embryoet skudt i film 2 vises, med tiden efter ablation angivet over hvert foto (3-6 dage efter ablation). Skalabjælken er 30 μm og gælder for hvert foto. Klik her for at se en større version af denne figur.
Film 1: Laserablation af den mest apikale celle i et 8-cellet embryo af S. latissima. Fokus blev først justeret på embryoet valgt blandt en buket Saccharina sporofytter (på forskellige felter, først brede, derefter smalle). Den mest apikale celle i embryoet blev derefter skudt ved hjælp af 45% laserkraft i 1 ms. Den apikale celle bristede hurtigt og frigav sit indhold. De tilstødende celler, befriet fra burstcellens turgor, fyldte det tomme rum. Efter 5 minutter er cellen og dens indhold stoppet med at bevæge sig og har nået en ligevægtstilstand. Filmen er blevet accelereret 4 gange (fra 1 billede pr. 632 ms til 6 fps). Opfølgningen af embryoudviklingen er vist i figur 3. Klik her for at downloade denne film.
Film 2: Betydelig blegning af celler ved siden af en burstcelle forårsaget af suboptimale laserindstillinger. Brug af en lasereffekt på 60% -80% for 1 ms eller en lasereffekt på 45% for 10 ms resulterede i betydelig blegning af tilstødende celler og en meget lavere overlevelsesrate. De indstillinger, der bruges til laseren, bør ikke forårsage blegning eller delvis skade på tilstødende celler. De bedste resultater blev opnået ved at reducere effekten og / eller varigheden af laserpulsen og målrette det punkt, der er længst væk fra de tilstødende celler. Herskydes den mest apikale celle i et 4-cellet embryo af S. latissima (80% laserkraft, 1 ms) (lateral / top view). Overblødning af de nedre og laterale celler er let observerbar. Den efterfølgende udvikling af embryoet er vist i figur 4. Klik her for at downloade denne film.
Supplerende figur 1: Skematisk rutediagram for hele protokollen. Klik her for at downloade denne fil.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Lokal cellulær laserablation giver mulighed for tidsmæssig og rumlig ablation med et højt præcisionsniveau. Dets effektivitet kan imidlertid hæmmes af målcellernes manglende tilgængelighed; for eksempel er alle cellerne af et tredimensionelt embryo. Denne protokol blev udviklet på embryoet af algen Saccharina latissima, som udvikler en enlags lamina, hvor alle celler let kan skelnes og ødelægges individuelt med en laserstråle.
Laserkraft og bølgelængde
NIR fs-pulserende laser er almindeligt anvendt i udviklingsundersøgelser på dyr 24,25. Men i tilfælde af brune alger som Saccharina kunne laseren ikke sprænge cellen uden at brænde hele embryoet. Denne reaktion kan være relateret til den høje aktivitet af chloroplastlyshøstere.
Ved hjælp af den ns-pulserende UV-laser til ablation blev to tilgange testet: (1) ved hjælp af en høj effektpuls over en kort periode eller (2) ved hjælp af en lavere lasereksponering over en længere periode. Den energi, der leveres af laseren, en kombination af lasereffekt og pulsvarighed, påvirker den energi, der leveres til den bestrålede celle. Den leverede energi kan også påvirke de omgivende celler ved refleksion og diffraktion. Derfor blev de laveste indstillinger af de to parametre, der gav reproducerbare resultater, valgt for at reducere eventuelle uønskede sikkerhedseffekter. Lasereffekt mellem 25-40 μ W.cm-2 med en puls på 1 ms syntes at være optimal. Ved hjælp af disse parametre blev effekten af UV-laseren indeholdt på et meget lokalt niveau uden synlig blegning i de omgivende celler, men effektiv nok til at få målcellen til at briste. Disse parametre blev gentagne gange anvendt uden nogen direkte dødelig virkning på embryonerne. Længere pulstider eller højere lasereffekt forårsagede blegning af de omgivende celler eller endda død af embryoet, mens lavere værdier var utilstrækkelige til at bryde cellevæggen.
Algemateriale og kulturforhold
Selvom det giver mulighed for præcis skydning på subcellulært niveau, kræver denne teknik, at eksperimentatoren adresserer fire kritiske faktorer for at muliggøre pålidelig fortolkning af resultaterne. Disse punkter skal overvejes både før og efter laserablationseksperimentet.
Den første faktor, der skal tages fat på, er embryopopulationstæthed. Negativ trængsel påvirker udviklingshastigheden for S. latissima26. Lave tætheder giver (1) bedre puls repeterbarhed, fordi tilstedeværelsen af andre embryoner i laservejen kan reducere dens effekt og (2) lettere overvågning af embryoner skudt af laseren, som vokser lidt langsommere end intakte embryoner; sidstnævnte dækker hurtigt de skudte embryoner. Den anden kritiske faktor i denne protokol er den temperatur, hvor eksperimentet udføres. Selve laserstrålen opvarmer prøven, men temperaturen i rummet og mikroskopets lokale miljø øger de samlede temperaturforhold, som prøven oplever, tæt på 18-22 °C. Her blev mikroskopets rum ikke nedkølet, fordi dette udstyr hovedsageligt bruges til dyreceller, der tåler omgivelsestemperaturer. Heldigvis var Saccharina-embryoner i stand til at modstå temperaturer på 22 °C (9 °C højere end den optimale dyrkningstemperatur på 13 °C) i op til 4 timer. Anordninger, der hjælper med at opretholde en lav omgivelsestemperatur, såsom tilstrækkelig ventilation eller en kølepladeholder, kan dog bidrage til at mindske risikoen for negative virkninger på algeembryoernes overlevelse og udvikling. Desuden kan langsom forakklimatisering af gametofytter til 16 ° C under rødt lys hjælpe embryonerne med at modstå temperaturspidser under ablationsprocessen. For det tredje fratages embryonerne ud over temperaturstigningen en passende lyskilde i løbet af eksperimentet. Desuden kan kloroplasterne delvist bleges af 561 nm laseren. Brug af den lavest mulige effekt på 561 nm laseren hjælper med at reducere denne effekt. For det fjerde er transport også en kritisk faktor at tage højde for, fordi laserablationsudstyr ikke er tilgængeligt i alle laboratorier. Temperaturspidser og eksterne bevægelser eller stød bør undgås for at forhindre algematerialets løsrivelse, tab eller død. Når det er muligt, skal transportkasserne være nedkølede, vibrationsbestandige (f.eks. stødabsorberende skum) og udstyret med lys. Flere transportkasser, der opfylder disse krav, er tilgængelige kommercielt.
Selvom alle disse faktorer kontrolleres så meget som muligt, kan der stadig forekomme svag, men potentielt betydelig miljøbelastning. Denne mulighed skal overvejes ved analyse og fortolkning af embryoresponset på laserablation.
Ud over de miljøforhold, der skal holdes stabile under hele forsøget, er det også en udfordring at holde styr på de bestrålede organismer i hele overvågningstrinnet. Væksten af de forskellige embryoner ændrer det oprindelige landskab over tid. Medmindre et automatiseret mikroskop kan dedikeres til overvågning af eksperimentet, kan det let blive tidskrævende at følge embryoet efter laserablation og generere store mængder data. Videooptagelser under den indledende laserablationsimpuls anbefales stærkt til at spore embryoets umiddelbare reaktion på pulsen. Denne hurtige overvågning af pulspåvirkningen er af stor betydning, fordi pulsen i nogle tilfælde, når den målrettes mod midten af cellen, fik målcellen til at briste hurtigt, sandsynligvis på grund af forskellen i osmolaritet mellem det indre af cellen og mediet (havvand). Når lækagen var for hurtig, bristede nabocellerne også. Skydning i det mest distale område af den målrettede celle viste sig at være en effektiv måde at buffere burst-effekten på alle tilstødende celler. En anden effektiv måde at undgå voldsomme udbrud på er at øge osmolariteten af mediet med saccharose27. Forskellen i osmolaritet er imidlertid nødvendig for at eliminere den målrettede celles indhold. Det er således nødvendigt at opretholde et tilstrækkeligt osmolaritetspotentiale. I nogle få tilfælde blokerede kloroplaster og andre forbindelser åbningen foretaget af laserablationen, hvilket resulterede i, at celler kom sig efter laserskuddet, hvor væksten genoptog efter et par dage. Yderligere impulser rettet mod afstopning af åbningen viste sig at være tilstrækkelige til at forhindre obstruktion.
Begrænsninger
Der skal foretages en afvejning mellem laserkraft, som skal være høj nok til at få cellerne til at tømme deres indhold, og overlevelsen af nabocellerne, som i algeembryoner er særligt følsomme over for varmestress og fotoblegning. Derfor er tæt overvågning af cellerne efter laserskuddet nøglen til at kontrollere dette trin og sikre, at målcellerne er døde. Ellers kan fortolkningen af de målrettede celler på nabocellernes skæbne og dermed den efterfølgende udvikling af embryoet være vildledende.
Punktering af celler med en nål kan synes at være et alternativ, hvor algecellerne ikke ville opleve nogen varme- eller lysbelastning. Denne tilgang ville imidlertid være udfordrende, fordi brune algeembryoceller vokser nedsænket i havvand og ikke har nogen kontakt med nogen fast overflade. Den tykke og elastiske cellevæg modstår nåleindtrængning, selv når embryoet holdes i kontakt med en fast glasoverflade ved hjælp af en mikromanipulator i et standard mikroinjektionssystem.
Sammenfattende beskriver denne protokol den komplette eksperimentelle procedure og indstillinger for laserablation og overvågning af brune algeembryoner og de kritiske trin for et vellykket eksperiment (supplerende figur 1). Denne unikke tilgang er en lovende metode til at studere celleinteraktioner og celle skæbne i de tidlige embryoner af brune alger.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
S.B.'s ph.d.-stipendium er finansieret af Region Bretagne (ARED-bevillingsnummer COH20020) og Sorbonne Université. I.T.is ph.d.-stipendium er finansieret af Region Bretagne (ARED-tilskudsnummer COH18020) og Norvegian NMBU University. Dette projekt har modtaget økonomisk støtte fra CNRS gennem MITI tværfaglige programmer. MRic er medlem af den nationale infrastruktur France-BioImaging støttet af det franske nationale forskningsagentur (ANR-10-INBS-04).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 25 mm glass bottom petri dish | NEST | 801001 | |
| Autoclaved sea water | - | Collected offshore near the Astan buoy (48°44.934 N 003°57.702 W) close to Roscoff, France, at a depth of 20 m. | |
| Cell scraper | MED 2 | 83.3951 | |
| Cell strainer 40 µm | Corning / Falcon | 352340 | |
| Culture cabinets | Snijders Scientific Plant Growth Cabinet ECD01 | Any other brand is suitable provided that the light intensity, the photoperiod and the temperature can be controlled. | |
| LSM 880 Zeiss confocal microscope | Carl Zeiss microscopy, Jena, Germany | Ablation and imaging were performed using a 40x/1.2 water objective | |
| Pellet pestles | Sigma Aldrich | Z359947 | Blue polypropylene (autoclavable) |
| Provasoli supplement | - | Recipe is available here: http://www.sb-roscoff.fr/sites/www.sb-roscoff.fr/files/documents/station-biologique-roscoff-preparation-du-provasoli-2040.pdf | |
| Pulsed 355 laser (UGA-42 Caliburn 355/25) | Rapp OptoElectronic, Wedel, Germany | ||
| Scalpel | Paramount | PDSS 11 | |
| SysCon software | Rapp OptoElectronic, Wedel, Germany | Laser-driver software | |
| ZEN software | Carl Zeiss microscopy, Jena, Germany | Imaging software, used together with the SysCon software; Black 2.3 version |
References
- Montell, D. J., Keshishian, H., Spradling, A. C. Laser ablation studies of the role of the Drosophila oocyte nucleus in pattern formation. Science. 254 (5029), New York, N.Y. 290-293 (1991).
- Shivakumar, P. C., Lenne, P. F. Laser ablation to probe the epithelial mechanics in drosophila. Methods In Molecular Biology. 1478, 241-251 (2016).
- Bargmann, C. I., Avery, L. Laser killing of cells in Caenorhabditis elegans. Modern Biological Analysis of an Organism. 48, 225-250 (1995).
- Fouad, A. D., Liu, A., Du, A., Bhirgoo, P. D., Fang-Yen, C. Thermal laser ablation with tunable lesion size reveals multiple origins of seizure-like convulsions in Caenorhabditis elegans. Scientific Reports. 11 (1), 5084 (2021).
- Johnson, C. S., Holzemer, N. F., Wingert, R. A. Laser ablation of the zebrafish pronephros to study renal epithelial regeneration. Journal of Visualized Experiments. (54), e2845 (2011).
- Mondia, J. P., Adams, D. S., Orendorff, R. D., Levin, M., Omenetto, F. G. Patterned femtosecond-laser ablation of Xenopus laevis melanocytes for studies of cell migration, wound repair, and developmental processes. Biomedical Optics Express. 2 (8), 2383-2391 (2011).
- Reinhardt, D., Frenz, M., Mandel, T., Kuhlemeier, C. Microsurgical and laser ablation analysis of leaf positioning and dorsoventral patterning in tomato. Development. 132 (1), 15-26 (2005).
- Berg, C., Hage, W., Weisbeek, P., Scheres, B. Laser ablation in Arabidopsis roots: a tool to study cell-to-cell communication. Cellular integration of signalling pathways in plant development. Proceedings of the NATO Advanced Study Institute. , https://eurekamag.com/research/003/488/003488317.php 237-250 (1998).
- Berger, F., Taylor, A., Brownlee, C. Cell fate determination by the cell wall in early fucus development. Science. 263 (5152), New York, N.Y. 1421-1423 (1994).
- Bouget, F. Y., Berger, F., Brownlee, C. Position dependent control of cell fate in the Fucus embryo: role of intercellular communication. Development. 125 (11), 1999-2008 (1998).
- Bringloe, T., et al. Phylogeny and evolution of the brown algae. Critical Reviews in Plant Sciences. 39 (4), 281-321 (2020).
- Saifullah, S., Olsen, Y., Surilayani, D., Handå, A. Carbohydrate of the brown seaweed, saccharina latissima: a review. Joint proceedings of the 2nd and the 3rd International Conference on Food Security Innovation (ICFSI 2018-2019). , 180-182 (2021).
- Zhang, X., Thomsen, M. Techno-economic and environmental assessment of novel biorefinery designs for sequential extraction of high-value biomolecules from brown macroalgae Laminaria digitata, Fucus vesiculosus, and Saccharina latissima. Algal Research. 60, 102499 (2021).
- Kanda, T. On the gametophytes of some japanese species of laminariales. Scientific papers of the Institute of Algological Research, Faculty of Science. 1 (2), Hokkaido Imperial University. 221-260 (1936).
- Fritsch, F. E. The structure and reproduction of the algae. Volume 2. , Cambridge University Press. Cambridge. (1945).
- Bartsch, I., et al. The genus Laminaria sensu lato : recent insights and developments. European Journal of Phycology. 43 (1), 1-86 (2008).
- Theodorou, I., Charrier, B. Chapter 2: Brown algae: ectocarpus and saccharina as experimental models for developmental biology. Handbook of Marine Model Organisms in Experimental Biology - Established and Emerging. Boutet, A., Schierwater, B. , Francis & Taylor Group, CRC Press. ISBN 9780367444471 485 (2021).
- Drew, G. H. The reproduction and early development of laminaria digitata and laminaria saccharina. Annals of Botany. 24 (1), 177-189 (1910).
- Yendo, K. The development of costaria, undaria, and laminaria. Annals of Botany. 25 (99), 691-715 (1911).
- Forbord, S., Steinhovden, K., Rød, K., Handå, A., Skjermo, J. Cultivation protocol for Saccharina latissima. Protocols for Macroalgae Research. Charrier, B., Wichard, T., Reddy, C. R. K. , CRC Press, Francis & Taylor Group. ISBN-10: 14986427. ISBN-13: 978-1498796422 37-59 (2018).
- Bartsch, I. Derivation of clonal stock cultures and hybridization of kelps. Protocols for Macroalgae Research. Charrier, B., Wichard, T., Reddy, C. R. K. , CRC Press, Francis & Taylor Group. ISBN-10: 149879627. ISBN-13: 978-1498796422 61-78 (2018).
- Theodorou, I., Opsahl-Sorteberg, H. -G., Charrier, B. Preparation of zygotes and embryos of the kelp saccharina latissima for cell biology approaches. Bio-protocol. 101, 4132 (2021).
- Lüning, K., Dring, M. J. Reproduction induced by blue light in female gametophytes of Laminaria saccharina. Planta. 104 (3), 252-256 (1972).
- de Medeiros, G., et al. Cell and tissue manipulation with ultrashort infrared laser pulses in light-sheet microscopy. Scientific Reports. 10 (1), 1942 (2020).
- Liang, X., Michael, M., Gomez, G. A. Measurement of mechanical tension at cell-cell junctions using two-photon laser ablation. Bio-protocol. 6 (24), 2068 (2016).
- Ebbing, A., Pierik, R., Bouma, T., Kromkamp, J. C., Timmermans, K. How light and biomass density influence the reproduction of delayed Saccharina latissima gametophytes (Phaeophyceae). Journal of Phycology. 56 (3), 709-718 (2020).
- Rabillé, H., Billoud, B., Tesson, B., Le Panse, S., Rolland, É, Charrier, B. The brown algal mode of tip growth: Keeping stress under control. PLoS Biology. 17 (1), 2005258 (2019).
