Summary
大分子的高分辨率冷冻电镜图谱也可以通过使用200 kV透射显微镜来实现。该协议显示了设置精确光学对准、数据采集方案和成像区域选择的最佳实践，这些对于使用200 kV TEM成功收集高分辨率数据集至关重要。
Abstract
在过去的十年中，冷冻电子显微镜（cryo-EM）已被确定为蛋白质结构测定的常规方法，在已发表的结构数据中所占的份额越来越大。TEM技术和自动化的最新进展提高了数据收集速度和采集图像的质量，同时降低了在低于3 Å分辨率下获得冷冻电镜图谱所需的专业知识水平。虽然大多数这种高分辨率结构都是使用最先进的300 kV冷冻透射电镜系统获得的，但使用200 kV冷冻透射电镜系统也可以获得高分辨率结构，特别是当配备能量滤波器时。此外，通过实时图像质量评估实现显微镜对准和数据收集的自动化降低了系统复杂性，并确保了最佳的显微镜设置，从而提高了高质量图像的产量和数据收集的整体吞吐量。该协议演示了在200 kV低温透射电子显微镜上实现的最新技术进步和自动化功能，并展示了如何收集数据以重建足以从 头 原子模型构建的3D图。我们专注于最佳实践，关键变量和常见问题，必须考虑这些问题才能实现此类高分辨率冷冻电镜数据集的常规收集。特别是详细回顾了以下基本主题：i）显微镜对准的自动化，ii）选择适合数据采集的区域，iii）用于高质量，高通量数据收集的最佳光学参数，iv）用于零损耗成像的能量滤波器调整，以及v）数据管理和质量评估。最佳实践的应用和使用能量滤波器实现的分辨率的改进将在apo-铁蛋白的例子中展示，该apo-铁蛋白酶被重建为1.6Å，而 热质嗜酸酶 体20S蛋白酶体使用配备能量滤波器和直接电子检测器的200 kV TEM重建为2.1-Å分辨率。
Introduction
蛋白质结构的测定对于了解参与关键细胞过程（如细胞代谢、信号转导或宿主-病原体相互作用）的蛋白质复合物的分子结构、功能和调控至关重要。冷冻电子显微镜（cryo-EM）已成为一种强大的技术，能够解决许多蛋白质及其复合物的3D结构，这些蛋白质及其复合物对于传统的结构技术（如X射线衍射和NMR光谱）来说太具有挑战性了。特别是，冷冻电镜已被证明是膜蛋白的首选方法，膜蛋白不能轻易结晶或制备足够数量的传统结构技术，并为重要细胞受体和离子通道的结构和功能提供了新的见解1，2，3，4，5.最近，冷冻电镜通过在分子水平上确定SARS-CoV-2感染的机制，在抗击Covid-19大流行中发挥了重要作用，阐明了Covid-19疾病的起源，并为快速开发有效的疫苗和治疗方法提供了基础6，7，8，9，10。
通常，高端300 kV透射电子显微镜（TEM）用于通过冷冻电镜单颗粒分析（SPA）对生物分子进行高分辨率结构测定，以揭示其构象和相互作用。最近，当使用配备冷场发射枪（E-CFEG），直接电子探测器和能量滤波器的300 kV透射电镜以原子分辨率（1.2 Å）11，12 重建共同基准冷冻电镜样品载脂铁蛋白时，SPA技术达到了新的前沿。在该分辨率下，可以明确地解析单个原子在结构中的位置，单个氨基酸侧链的构象以及氢键和其他相互作用，这为基于结构的药物发现新靶点和优化现有候选药物开辟了新的可能性。
中档200 kV透射电镜显微镜通常用于样品筛选和样品优化，然后使用高端透射显微镜进行最终高分辨率数据收集，特别是在较大的冷冻电镜设施中。通常，成像样品可以在3-4 Å分辨率范围内进行分辨，这足以移动到高端300 kV TEM进行最终数据收集。因此，使用200 kV TEM的数据收集通常没有进一步优化以获得尽可能高的分辨率结果。此外，许多有趣的生物学问题已经可以在这些分辨率下得到回答和发表，因为所有氨基酸侧链都已经得到解决，并且配体结合位点的占用也可以可靠地确定13。已经证明，对于14，15，16，17，18多个样品，200 kVTEM可以达到超过3 Å的分辨率。在200 kV下拍摄的图像表现出固有的更高成像粒子的对比度，与300 kV TEM图像相比，尽管高分辨率下信号衰减更多，这甚至可能有助于更准确地对准粒子。需要注意的是，重建的冷冻电镜图谱的分辨率也受到成像样品的结构灵活性和构象异质性的限制，这会影响200 kV和300 kV重建。事实上，与在更高的分辨率19下相比，使用300 kV系统获得的冷冻电站重建在3-4 Å分辨率范围内得到的分辨率要多得多。由于200 kV透射电镜不太复杂，并且适合较小的房间，因此这些显微镜代表了通过冷冻电镜测定生物大分子结构的良好，低成本的选择，同时保持了从显微镜自动加载机系统中存储的多个样品中长时间收集数据的自动化。
收集用于高分辨率结构测定的冷冻电镜数据集需要精确对准显微镜光学元件。色谱柱对准系统地从电子源向下进行，直到聚光透镜系统、物镜和带电子检测器的能量滤光片。通常不需要完整的比对序列。需要时，通过半自动程序引导用户，并在显微镜用户界面（直接对准控制面板）的整个对准过程中的上下文感知帮助窗口中对每个步骤进行适当的描述。一旦显微镜完全对准，电子光学元件保持稳定，并且至少在几个月内不需要改变对准。在开始收集每个数据集之前，只有最敏感的对齐方式（例如样本平面的平行照明、物镜散光和无彗发对齐）才需要优化。然后，可以在数据收集期间使用不同的软件包（例如EPU质量监测器，cryoSPARC Live20，Relion 21，Scipion22，WARP23或Appion24）来监测所收集数据的质量。
除了显微镜的精确对准外，高质量纯化良好的样品具有最小的构象和组成异质性也是收集高分辨率数据集和求解高分辨率结构的先决条件。有关典型协议，频繁挑战和可能的补救措施的更多详细信息，可以在专门针对此主题的其他评论中找到25，26，27。从本质上讲，在给定的冷冻电镜网格上找到具有足够薄冰以保存高分辨率信息的区域至关重要，并且单个粒子以随机方向密集分布而没有重叠。然而，典型的冷冻电镜网格具有不均匀的冰厚度，因此找到并选择用于成像的最佳区域非常重要。专用于自动收集冷冻电镜数据集（如 EPU 2、Leginon28 或 SerialEM29）的软件包中提供了用于估算网格上冰层厚度的不同方法。
快速灵敏的直接电子探测器的出现使得能够以许多部分的形式收集图像作为电影，从而能够补偿光束引起的运动，并导致图像处理和最终3D重建中使用的数据的质量和数量大幅增加30。同时，自动化和高吞吐量数据收集提供了包含数千张图像/电影的庞大数据集，这些图像/电影对数据存储和访问提出了挑战。所采用的大型冷冻电镜设施的模型为数十到数百名用户提供服务，尤其需要有组织的数据管理，在已建立的冷冻电镜管道中进行适当的跟踪和数据共享31，32。
本研究描述了一种使用200 kV Glacios TEM显微镜常规收集高分辨率冷冻电镜数据集的方案。描述了显微镜光学元件的必要对准以及用于评估冷冻电镜样品和选择高分辨率数据收集的合适区域的程序。Athena演示了收集的数据和相关元数据与样本信息的组织 - Athena是一个数据管理平台，有助于审查样本信息和收集的数据。使用小鼠apo-铁蛋白样品，可以在1.6 Å分辨率13下实现3D重建。使用所描述的方案，我们还以2.1 Å分辨率重建了 嗜酸热等离子体 的20S蛋白酶体的3D密度图。
Protocol
该协议的所有步骤均针对配备Selectris-X能量滤波器（以下简称能量滤波器）和Falcon 4探测器（以下简称直接电子探测器）的200 kV Glacios TEM系统（以下简称200 kV TEM）进行了描述。协议步骤特定于 EPU 应用程序，EPU 应用程序是每个 Glacios 系统上预安装的默认 SPA 数据收集软件。下面的协议步骤对应于 EPU 版本 2.14，使用不同的 EPU 版本时，需要进行少量修改。该协议的先决条件是：i）喷枪和色谱柱对齐良好，ii）EM校准正确，iii）EPU自动功能正确校准。
1. 将网格加载到显微镜中
注意：本实验中使用的200 kV TEM可以在盒内容纳多达12个自动网格（即，夹入特殊墨盒的传统TEM网格），该盒装入显微镜的自动进样器内，并始终保持在低于-170°C的温度下，以防止样品失透。
- 在液氮条件下将自动格栅插入自动加载机盒中。
- 将带有自动格栅的暗盒插入液氮冷却的转移胶囊中。
- 将胶囊插入显微镜，然后单击显微镜UI中的 Dock 按钮，将胶囊中的盒式磁带加载到显微镜的自动加载器中。
- 单击“ 清单 ”按钮以检查加载的盒中是否存在自动网格。
- 单击“ 加载 ”和“ 卸载 ”按钮，将自动网格插入到列中以进行TEM成像。
2. 在数据管理平台中设置项目（可选）
注意：样本信息和收集的数据可以在提供的数据管理平台中进行组织，该平台允许存储所有连接仪器的结构化数据。可以创建一个项目，可以为其定义任何工作流步骤，以有组织的方式捕获图像和元数据，以便进行查看和导出。
- 启动数据管理门户应用程序并使用用户名和密码登录。
- 在门户 UI 的左侧面板中，单击“ 添加项目 ”按钮以创建新项目，或单击下面列表中现有项目的按钮以打开项目。
- 单击“ 添加实验 ”按钮，在打开的项目中创建新实验。
- 在新实验的 “元数据 ”面板中填写描述，然后单击“ 添加工作流 ”按钮以在实验中创建新工作流（例如，单颗粒分析）。
- （可选）单击中间面板中的“ 添加步骤 ”按钮以创建自定义工作流，或向预定义的 SPA 工作流添加其他步骤（图 1 和 图 2）。
注意：这些步骤可能代表样品制备，通过生物化学技术进行样品表征，样品玻璃化，冷冻电镜网格筛选，数据收集会话和数据分析。 - （可选）在每个步骤的 “注释 ”中填写说明，其中可能包括图像和照片。
- 在工作流中创建数据集步骤，然后选择数据集类型作为 EPU。
注意：这将允许分析软件在数据采集期间自动将所有结果数据/元数据放在数据管理门户中的正确位置，并自动将数据导出到首选目的地，同时保持所有步骤和数据传输的完整记录。 - 在 “生物化学 ”步骤中填充有关样本和 EM 网格的模板，并将每个网格与一个示例相关联（请注意，一个样本可以与多个网格相关联）。
- 在 “数据集” 步骤的元数据部分中关联示例网格组合。
3. 在分析软件中设置成像预设和图像偏移校准
- 设置各种成像模式的成像参数，如 表1所示。“讨论”部分详细介绍了选择特定设置的注意事项。
- 在分析软件的 数据采集 预设中为所选放大倍率设置平行照明
注意：在2聚光透镜TEM系统上，C2透镜只有一个设置，用于在给定的SPOT尺寸（即C1透镜的预设强度）下对样品进行平行照明，例如本研究中使用的200 kV透射电镜。因此，每单位面积的电子剂量率（e-/Å2/s）只能通过更改SPOT尺寸设置并根据以下步骤重新调整C2强度（光束强度）来调整。- 移动到有支撑碳箔和薄冰或无冰的区域。
- 在TEM UI的孔径菜单中选择100μm或70μm 物镜孔 径。
- 按控制面板上的 衍射 按钮切换到衍射模式。
- 插入荧光屏并将 FluCam 模式更改为 高分辨率。
- 将中心衍射光斑移动到孔径的边缘。如果光圈边缘不可见，请增加相机长度（使用放大旋钮）。
- 小心地转动控制面板上的对 焦 旋钮，使后焦平面对焦。当光圈边缘明显锐利时，后焦平面会聚焦。
- 将FluCam的灵敏度降低到最低水平，并将中心衍射点移动到FluCam的中心。
- 使用控制面板上的 强度 旋钮最小化中心点的大小。
- 缩回TEM UI中的物镜孔径并切换回成像模式。
- 单击分析软件中的“ 获取 ”按钮，将设置保存到数据采集预设中。
- 在数据采集预设中调整电子剂量率，这是使用检测器的最佳选择：
- 移动到网格上的空白区域（例如，带有破损碳箔的网格正方形）
- 单击分析软件中的 测量剂量 按钮以测量电子剂量率。
- 更改 SPOT 大小以达到最佳剂量率。对于该协议中使用的直接电子检测器，通常使用4-5 e-/pixel/s的剂量率进行高分辨率数据采集。这通常对应于 SPOT 大小 4-6。
- 如上所述，在新的SPOT尺寸设置下检查并调整平行照明。
- 选择“分数”下的“EER”选项，以在直接电子检测器33 上使用 EER 模式。
- 单击分析软件中的“ 获取 ”按钮，将设置保存到数据采集预设中。
- 切换到 自动对焦 预设，然后按“ 获取 ”按钮以保存用于对焦的照明设置。手动将曝光时间更改为 1 秒，并将分档模式更改为 2。
- 切换到 “松环” 预设，然后按“ 获取 ”按钮以保存此预设的照明设置。手动将曝光时间更改为 1-2 秒，并将分档模式更改为 2。
- 切换到 零损耗 预设，然后 按 Get 按钮 保存此预设的照明设置。手动将曝光时间更改为 0.5 秒，并分档模式 4。
- 使用“准备”选项卡中的“图像偏移校准”任务，按照分析软件手册中所述，校准设置光学设置之间的图像偏移（补充图 1）。
表 1：使用配备能量滤波器和直接电子探测器的 200 kV 冷冻透射电镜进行高分辨率数据采集的典型成像设置。 显示用于设置自动数据收集的每个光学预设的设置（《议定书》第3节）。这些设置特定于本研究中使用的200 kV TEM显微镜和直接电子检测器。 请按此下载此表格。
4. 网格映射和选择用于数据收集的最佳冷冻电镜网格
- 选择 Atlas 选项卡，然后单击 新建会话 按钮以打开新会话。
- 填写会话名称和数据存储位置等详细信息，然后单击“ 应用 ”按钮打开新的 “筛选 ”任务窗口，该窗口显示自动加载程序清单中所有网格的列表。（可选）编辑网格的名称。
- 通过选中相应网格编号旁边的复选框来选择感兴趣的网格。
- 单击“ 开始 ”按钮以启动所有选定网格的完全自动化的地图集集合。
- 集合完成后，单击网格标签以查看获取的地图集。
注意：各个格网方块根据其相对冰层厚度进行分类，这是基于每个地图集中的相对灰度值评估。分类的网格方块以不同的配色方案进行描述，可用于指导数据采集区域的选择。使用Vitrobot Mk IV生成的网格通常会在整个网格上显示冰层厚度梯度，这可能有助于确定理想的冰层厚度以进行数据收集。最佳网格应包含尽可能少的转移冰污染，并表现出足够的不间断和无裂纹的网格正方形（图3）。可以进一步研究具有合适冰分布的网格，以评估高放大倍率下冰中颗粒的分布（即单个颗粒的密度和方向）。 - 单击顶部菜单中的 加载样品 按钮，将具有合适冰分布的选定网格插入显微镜柱中。
- 选择“ 图集 ”选项卡，右键单击图集图像中合适的网格方块，然后从下拉菜单中选择“ 将舞台移动到此处 ”选项，将舞台移动到网格正方形。
- 选择“ 自动函数 ”选项卡，将网格正方形设置为真心高度。切换到 “欧心高度 ”预设，单击所选网格正方形中间的“ 光束倾斜自动以优心 ”自动功能，然后单击“ 开始 ”按钮。
- 切换到 网格方块 预设并获取图像。通过右键单击和“将载物台移动到此处”选项，将 载物台 移动到有冰且无污染或污染最小的孔中。
- 切换到 孔/真心高度 预设并获取图像。通过右键单击和“将载物台移动到此处”选项，将 载物台移动到 感兴趣孔旁边的碳区域。
- 单击 自动对焦 自动功能，将所需散焦的值设置为 0 μm，迭代为 -2 μm。切换到 自动对焦 预设，然后单击“ 开始” 按钮。
- 再次选择“ 准备 ”选项卡，然后切换到 “孔/真心高度” 预设。在先前获取的孔图像上，选择孔内的感兴趣区域，然后通过右键单击并选择“ 将载物台移动到此处”选项将载物台移动到 此位置。
- 切换到 数据采集 预设，并将波束偏移后的等待时间设置为0.5 s，并将载物台后的等待时间设置为20 s。使用 -3 μm 和 -5 μm 之间的散焦采集图像，以提高低分辨率对比度，从而更好地可视化单个颗粒。
- 或者，根据需要重复步骤4.7-4.13以对不同孔和不同网格正方形中的颗粒进行成像，这些颗粒具有不同的冰厚度。
- 确定并选择最适合高分辨率数据收集的网格后，单击顶部菜单中的“ 加载样本 ”按钮，将所选网格加载到TEM中。
注意：或者，如果需要更多信息和/或需要此筛选过程的自动化，请执行第5节。
5. 在单颗粒分析软件中设置数据收集会话
注意：如果使用金箔网格，客观散光和昏迷对齐的细化（第6节）可能无法可靠地工作。建议加载碳箔网格或交叉光栅EM网格，并在设置数据收集之前执行这些最终对齐。
- 选择 EPU 选项卡，然后单击 会话创建 按钮以在左侧面板中创建新会话。选择“ 新建会话”选项以使用当前的光学预设，或选择 “从首选项新建” 选项以加载以前导出的会话设置。
- 填写会话名称和数据存储位置。
注意：此位置将用于将数据收集会话中的集成图像和元数据保存在具有会话名称的子文件夹中。虽然这些数据不会占用大量的存储空间，但建议将这些数据保存在DMP服务器的Falcon卸载数据存储上，因为EER相机帧始终存储在具有会话名称的目录中。 - 选择会话的 “手动 ”类型，以控制在协议中稍后为数据收集选择的网格正方形中各个孔的选择。
- 选择 “更快 ”采集模式，使用无像差图像偏移（AFIS）进行数据采集，以减少各个孔之间的载物台移动，减少整体样品漂移，并在不降低图像质量的情况下提高数据采集的吞吐量。
- 选择已保存集成映像的默认 mrc 格式。
- 指定使用的网格及其类型。该协议使用R-1.2 / 1.3 UltraAufoil用于apo-ferritin，R-2 / 1 Quantifoil网格用于20S蛋白酶体。在标本载体下选择绢剂，在绢型下选择 R1.2/1.3 或 2/1。
- 可选：单击右下角的 “雅典娜登录 ”按钮以使用 EPU 质量监视器 （EQM）。
- 在浏览器弹出窗口中输入登录详细信息，以激活会话设置概述中的 设置 部分。
- 单击设置部分中的 “选择 ”按钮，然后浏览以前创建的数据集（协议部分 2），以将其与当前数据收集相关联。打开 “启用质量监视器 ”复选框。
- 单击“ 应用 ”按钮以创建新会话。
注意：此操作将在左列菜单中打开新任务。在会话期间的任何时候，如果某些详细信息不正确，则可以返回到 会话设置 任务，更改/更新详细信息，然后再次单击“ 应用 ”以更新会话。 - 在左侧面板中选择 “方块选择” 任务以显示收集的网格图集。
- （可选）双击地图集的任何磁贴以查看更高质量的图像，从而更好地判断网格方块中的冰质量。再次双击图像以返回到网格图集。
- 识别具有以下特征的网格正方形（图4）：（i）网格正方形中的支撑箔完好无损，（ii）箔孔中的玻璃体薄冰（孔看起来比支撑碳箔更亮），（iii）网格正方形中尽可能少的结晶冰污染（黑色斑点），（iv）网格正方形和单个箔孔内的最小亮度梯度。
注意：通过选择预设和良好的网格，本研究中使用的200 kV冷冻透射电镜可以以约200-300张短片/小时的速率成像。考虑到这一点，根据需要选择尽可能多的正方形，或者稍后根据显微镜可用的时间返回正方形选择任务来添加更多正方形。作为参考，收集了3000部电影以实现载脂蛋白的1.6 Å分辨率。 - 选择网格方块以在完整地图集或高质量切片图像中收集数据
- 右键单击感兴趣的网格正方形，然后选择上下文菜单中的 “选择” 选项
- 或者，按住键盘上的 Ctrl 键 ，然后左键单击所需的网格方块
- 相反，右键单击并 取消选择 或按住 Shift 键并左键以删除方块
- 在左侧面板中选取 “孔选择” 任务，以选取所选栅格方块中的孔。
- 单击“ 自动尤心 ”按钮可自动移动到第一个选定的网格正方形，调整欧心高度并获取网格正方形图像以查找箔孔。
- 单击“ 查找孔 ”按钮以查找图像中的箔孔。
注：如果找孔效果不佳（即，图像中存在跳过的孔或大小不正确的孔），请检查在“会话设置”任务的“定量箔类型”条目中输入的值是否正确，然后再次查找孔。如果仍未正确找到孔，请单击“测量孔尺寸”按钮以手动设置孔直径和距离，然后再次查找孔。 - 单击网格栏按钮附近的 “移除孔” 按钮，以取消选择网格栏附近的孔。
- 调整 Ice滤镜 的亮度直方图（位于软件窗口的右下角）中的限制，以消除所有冰太厚的孔（使用左限制线）以及所有空孔（使用右限制线），如图 4所示。
注意：为了优化，还可以在“ 应用 ”按钮旁边的相应文本框中输入特定强度值。 - 或者，使用 “选择画笔”手动优化孔的选择：左键单击并拖动画笔以取消选择不需要的孔。按住 Ctrl 键 并左键可重新选择箔孔。按住 Shift 键并使用鼠标滚轮滚动以调整画笔大小。
- 选择一个孔来设置和测试将在整个数据收集过程中重复使用的数据采集模板：在网格方形图像中的孔上单击鼠标右键，然后选择“将舞台移动到位置”选项。
- 在左侧面板中选择 模板定义 任务。
- 选择 孔/优心 预设，然后单击“ 采集 ”按钮以获取图像。
- 单击“ 查找并居中孔 ”按钮，将图像中的孔居中。
- 将 图像偏移后的延迟 设置为 0.5 秒（默认值）和 舞台偏移后的延迟 设置为 20 秒的值。
注意：由于平行光束直径固定在本研究中使用的200 kV冷冻透射电镜系统上，并且通常对应于50μm孔径下的1.6-1.7μm，因此使用R-1.2 / 1.3网格每个孔只能获得1个图像，使用R-2 / 1或R-2 / 2网格每个孔（接近相反的边缘）可以获取2个图像。请注意，屏幕上设置的采集区域的大小与实际光束直径不符。可以使用图像比例尺来估计适当的放置距离。 - 选择“ 添加采集区域 ”按钮，然后单击图像以选择中心孔中将采集高放大倍率图像的位置。
- 选择“ 添加自动对焦区域 ”按钮，然后单击图像以选择支撑箔上的位置，该位置位于将执行图像自动对焦的中心孔旁边。
注意：用于聚焦的光束尺寸为1.6-1.7μm，应与碳上的相邻孔等距放置。 - 单击绿色采集区域，在软件窗口顶部的“ 散焦列表”中设置一系列散焦 值。首先输入最高散焦，以在以下 模板执行 任务的测试运行中增强粒子的可视化效果。
- 单击蓝色自动对焦区域，在同一区域中设置特定于自动对焦的设置：
- 选择“ 居中后 ”选项以在每个 AFIS 群集开始时自动对焦。
- 选择物 镜 选项，实现更快的自动对焦和更低的载物台漂移。
- 选择 模板执行 任务，然后单击按钮 执行。
- 观察数据采集过程的各个步骤（将孔居中，在所选区域自动对焦，在设定区域中进行图像采集），并检查最终高倍率图像中成像颗粒的质量。
- 单击高放大倍率图像窗口右下角的FFT 按钮以 检查FFT图像，并直观地评估松环是否显示多个振荡并在FFT图像中扩展到高分辨率。
- 如果模板执行成功完成，请单击“孔选择”任务中的“准备所有方块”按钮，以便根据第一个格网方块中使用的设置，在所有其他选定的格网方块中自动设置数据收集组。
6. 开始数据收集前的最终显微镜对准
注意：为了获得最佳的高分辨率结果，最灵敏的对准应该在数据采集软件中与数据采集模式完全相同的设置下完成，并且就在开始实际数据采集之前。这些对齐应在网格的薄支撑碳的位置完成，与任何网格条保持足够远的位置，并在欧心高度对齐。
- 选择 模板执行 任务，获取新图像，并通过右键单击将舞台移动到碳箔上的干净区域，然后选择菜单选项 将舞台移动到此处。
- 选择 自动功能 选项卡，将 所需散焦 设置为 0 μm ，迭代 为 -2 μm。切换到 自动对焦 预设，然后单击“ 开始 ”按钮以运行自动对焦功能。
- 放下荧光屏，然后在TEM UI中打开 直接对齐 菜单。
- 为了获得最佳效果，有经验的用户可以验证枢轴点对齐：在“直接对齐”菜单中选择nP Beam Tilt pp X任务，并使用控制面板上的多功能旋钮最大限度地重叠反弹光束。对 np Beam Tilt pp Y 任务重复上述步骤。
- 单击荧光屏相机菜单中的 EF 按钮以显示一个绿色圆圈，指示能量滤光片入口孔径，并将光束居中在绿色圆圈上。
注：在继续操作之前，请确保涡轮泵已停止;它的振动减少了可见的松环的数量，并经常导致自动功能失败。 - 返回软件窗口，然后选择菜单栏中的“ 自动功能 ”选项卡。
- 选择“ 自动恢复” 任务，切换到“ 传递环” 预设，然后按 “开始” 按钮。观察该过程以确保（i）拍摄的图像在碳上，（ii）Thon环清晰可见，以及（iii）计算的CTF拟合（虚线）很好地放置在Thon环最小值处（补充图2）。
- 选择 “自动昏迷”任务， 然后按 “开始” 按钮 。观察该过程，以确保拍摄的图像在碳上，并且Thon环清晰可见，并且计算出的配合（虚线）很好地放置在Thon环最小值处。使用鼠标滚轮放大每个 Thon 环图像（补充图 3）。
注意：如果显微镜配备了能量滤光片，则应将能量滤光片调谐作为对准序列的一部分进行，以使滤光片狭缝居中到零损耗峰值，并校正能量滤光片棱镜中的任何变形（步骤6.9-6.14）。这些对齐应在网格的空白区域完成，例如在断开的网格正方形内。 - 打开 夏尔巴 UI 并选择 能量过滤器 应用程序（补充图 4）。
- 在“设置”窗口中将相机设置为EF-Falcon，图盒4倍，曝光时间为0.2秒。
- 单击“零损耗”选项中的“中心”按钮，将零损耗能量滤波器狭缝居中。
- 单击“等色度”选项中的“调谐”按钮（补充图 4）。
- 单击“几何和色度失真”选项中的“调谐放大倍率”和“调谐失真”（补充图 5，补充图 6）
- 如果结果不在指示的规格范围内，并且在输出报告中以红色显示，请再次迭代步骤 6.11 中的对齐方式。
注意：虽然直接电子探测器增益参考可以在几个月内保持稳定，但如果空白区域的图像没有显示均匀的强度，但表现出条纹或其他明显特征，则应使用 Falcon 4参考图像管理器 获取新的增益参考。或者，计算此类图像的快速傅里叶变换 （FFT），并确保没有可见的线。 - 在软件窗口中，选择“ 准备 ”选项卡并切换到“ 数据采集” 预设。
- 将剂量设置设置为 40 e-/Å2 ，然后单击测量 剂量率 按钮。
- 进入 EPU 选项卡，选择 自动采集 任务，并可选择检查 自动零损失 功能;单击“ 开始运行 ”按钮以开始全自动数据收集。
7. 在数据收集过程中监控和优化数据质量
注意：在数据收集过程中，可以通过数据管理门户使用 EQM 监视收集的数据。EQM 动态执行运动校正和 CTF 确定，并在门户中显示结果。然后，用户能够判断单个采集的质量，查看各种质量指标的图表，过滤掉不需要的采集，并将数据导出到其最终存储中，无论是动态还是作为批处理作业。
- 导航到分析软件使用 Web 浏览器将数据放置到的数据集。
- 在数据集概览中，采集卡以图形格式显示有关运动校正和CTF确定的信息。单击单个卡片以获取更多信息。
- 启用 DataViz 面板以显示来自完整数据集的聚合图形，这些图形显示每次采集的散焦、散光和 CTF 置信度范围（补充图 7）。
- 使用面板顶部的过滤器仅选择在请求的散焦范围内、散光接近于零的数据，并且可以确定 CTF 直到指定的（目标）分辨率。设置筛选器后，按 应用 按钮以在数据集概述窗口中仅显示所选数据。
- 当大多数采集的图像都在设定的标准范围内时，让数据收集会话继续完成。如果只有极小部分采集的图像满足设定的标准，请重新配置分析软件设置，移动到样品上的另一个区域（按分析软件中的 “下一个网格方块 ”按钮），或停止数据收集。
Representative Results
数据管理门户在单个软件平台中提供来自多个实验工作流程的高效、结构化图像、数据和元数据存储。所创建项目中的每个已定义实验都包含一个工作流，其中包含客户定义的步骤，用于捕获样本信息、收集的数据和相关元数据，而无需任何约束，从而为任何可能的实验和所有用例提供最大的灵活性和可用性（图 1、 图 2）。数据管理门户还具有实验室注释功能，用于说明工作流步骤，包括具有中间结果的图像处理，这些步骤可以与项目一起关联，并提供尽可能完整的记录，以便分析和创建报告和出版物。
图 1：数据管理平台中数据和元数据的可能组织示例。 每个项目可以由多个实验组成，例如冷冻电镜或质谱（即协议步骤2.3）。每个实验可以包括多个用户定义的工作流（即协议步骤 2.5），每个工作流都包含多个可配置步骤（即协议步骤 2.7）。 请点击此处查看此图的大图。
图 2：在数据管理平台中查看打开的项目工作流。 该图显示了工作流中打开的步骤的关联元数据和注释。带有图标的左侧栏提供对数据管理平台的不同选项和菜单的快速访问。左侧面板包括已保存工作流的列表（仅显示一个已保存的工作流“Exp2_ApoF_EFTEM_Grid7”）和一个用于添加新工作流的蓝色按钮。中央面板显示打开的工作流中的各个步骤，如此处的 SPA 工作流所示。右上角的蓝色按钮可以向打开的工作流添加其他步骤。右侧面板包括用于记录的元数据或工作流的用户输入注释的空间，其中可能包括文本、表格和图像。文本有不同的格式选项。 请点击此处查看此图的大图。
使用传统的低温冷冻设备（如Vitrobot）生产的冷冻电镜网格通常会在网格表面上显示冰厚梯度。一些网格在手动处理和/或夹入自动网格环形载体后也可能损坏（弯曲）。 图 3 显示了不同网格的示例，如 Atlas 概述所示。具有厚冰或损坏的网格应排除在进一步调查之外。
图3：阿特拉斯概述中看到的不同网格的图库。 （A）具有厚冰的坏网格，（B）具有坏冰和冰污染的弯曲网格，（C）具有良好冰梯度的可接受网格，（D）具有良好薄冰和小冰梯度的典型网格。 请点击此处查看此图的大图。
选择无损伤且具有最佳冰厚度的格网正方形对于收集高分辨率数据集至关重要。即使在单个网格正方形的水平上，冰层厚度也可能有所不同，因此，从每个选定的网格正方形中仅选择具有最佳薄冰的孔非常重要。 图4 显示了一个合适的网格正方形，中间有完整的箔片和薄冰。显示的网格正方形适用于设置过滤器，以便在所有选定的网格正方形中自动选择具有薄冰的孔，因为它包含一系列不同的冰厚度以及没有冰的空孔，这对于在孔选择任务中的冰过滤器中设置适当的强度范围非常有用。
图 4：具有冰层厚度梯度的示例网格正方形，从中心的空网格正方形和网格条附近的厚冰。 冰质过滤器可用于选择具有理想冰厚度的孔内的强度范围，这些孔在网格正方形（带有绿色覆盖层的孔）中相应地选择。 请点击此处查看此图的大图。
使用来自Kikkawa组11的小鼠apo-铁蛋白（apoF）样品获得使用所述方案的基准测试结果。ApoF是一种高度α螺旋蛋白，形成非常稳定的八面体笼。高稳定性和高对称性使apoF成为高分辨率冷冻电镜成像和图像处理的最佳样品。因此，ApoF已成为评估冷冻电镜仪器11，12，13性能的标准样本。将含有15mg / mL纯化apoF样品的冷冻等分试样在冰上解冻，并通过以10，000× g 离心10分钟澄清。将上清液稀释至5mg / mL，20mM HEPES pH 7.5，150mM NaCl。将3μL稀释的样品施加到发光的R-1.2 / 1.3，300目金网格上30秒。然后将网格印迹5秒，然后冻结到由液氮冷却的液态乙烷中。使用全自动玻璃化系统在100%湿度和4°C下进行急冻。 所有电网都被夹在自动格栅中，并加载到200 kV Cryo-TEM中。以300张短片/小时的吞吐量收集了大约3000部电影。使用描述11 的方法处理数据，并进行以下修改：i）使用Relion 4-beta版本代替Relian 3.1，ii）使用先前apoF重建的2D类平均值作为参考完成自动粒子拾取，iii）初始3D模型是从先前的apoF重建低传递到15-Å分辨率下产生的。没有对此数据集进行光学分组，因为所使用的AFIS程序34 已被证明可以有效且可靠地最小化光束倾斜引起的相移，这些相移不会限制以报告的分辨率重建3D图的数据质量。贝叶斯抛光和CTF细化后的3D细化导致1.68 Å分辨率图。通过Ewald球面校正进一步提高了分辨率，从而产生了1.63 Å分辨率图。数据采集和处理参数的概述如 表2所示，最终的重构密度图如图 5所示，傅里叶壳相关（FSC）曲线如 补充图8所示。
表2：用于载脂铁蛋白3D重建的数据采集和图像处理参数。请按此下载此表格。
图 5：apo-铁蛋白的低温电镜重建 （左图）以 1.6 Å 分辨率重建的 apoF 冷冻电镜图谱的 3D 渲染。（右面板）在单个氨基酸侧链水平上重建图谱的详细视图。氨基酸侧链的密度得到了很好的解决，原子模型可以在这个图谱中明确地建立起来。 请点击此处查看此图的大图。
使用从 嗜酸锥虫中分离的原核20S蛋白酶体评估在SPA重建中使用能量过滤器的效果和益处。原核20S蛋白酶体也被用作标准的冷冻电镜样品，因为它代表了具有D7对称性的蛋白酶体复合物的稳定催化核心。通过将4.5μL纯化的 嗜酸锥虫 20S蛋白酶体样品添加到发光放电的200目R 2/1铜网格上来制备网格。样品在液态乙烷/丙烷混合物中使用全自动玻璃化系统，设置为4°C和100%湿度，印迹力为20，印迹时间为4.5 s。
使用能量滤波器的不同狭缝宽度从具有相似网格正方形的同一冷冻电镜网格中收集了三个不同的数据集：i）狭缝完全打开（未插入狭缝），ii）20 eV狭缝和iii）10 eV狭缝。网格方块是使用分析软件中的冰质过滤器选择的。数据收集和数据处理的所有其他参数保持不变。收集数据集15 h，共4000部电影，并使用Relion3.1描述的方法11 进行处理，并修改了使用拉普拉斯高斯粒子拾取算法从完整数据集中产生基于参考的粒子拾取的初始2D类平均值。选择相同数量的随机选择的粒子（102，200），并将其用于每个数据集的最终迭代和3D重建。数据处理变量如下表（表3）所述，以实现 图6 所示的最终重构EM密度图和 补充图9所示的FSC曲线。这些数据集也没有进行光学分组和Ewald球体校正。
表3：用于嗜酸锥虫20S蛋白酶体3D重建的数据收集和图像处理参数。请按此下载此表格。
表4：使用具有不同能量狭缝宽度的数据集对嗜酸锥虫20S蛋白酶体进行冷冻EM重建的分辨率和B因子的摘要。请按此下载此表格。
图 6：能量滤波对冷冻电镜图像的影响。 （A） 使用或不使用 10 eV 狭缝收集的不同散焦值的冷冻电镜图像。（B）具有分段亚基的20S蛋白酶体冷冻电镜图谱概述。（C）在20S蛋白酶体图谱上缩放视图，具有拟合的原子模型。 请点击此处查看此图的大图。
补充图1：校准图像位移任务（黄色椭圆），以在分析软件中不同的光学预设（红色椭圆）之间对齐图像偏移，使用在100x至165，000x之间的全放大倍率范围内可见的六边形冰晶体。 （顶部）在“数据采集”和“孔/真心高度”预设之间进行校准，在“孔/欧心高度”和“网格方块”预设之间进行校准，在“网格正方形”和“图集”预设之间进行校准。 请点击此处下载此文件。
补充图2：分析软件中的自动标差功能（黄色椭圆）。 （左图）采集的图像。（右图）采集图像的傅里叶传递，显示同心Thon环及其CTF拟合，如径向光束所示。 请点击此处下载此文件。
补充图3：分析软件中用于昏迷对准的Autocoma功能的用户界面（黄色椭圆）。 图像面板显示在不同光束倾斜度下获取的傅里叶传递图像及其用于计算昏迷的CTF拟合。 请点击此处下载此文件。
补充图4：能量滤波器调谐的用户界面。 能量滤波器等色度的良好调谐报告示例，所有参数（以绿色文本显示）都在规格范围内。 请点击此处下载此文件。
补充图 5：能量滤波器调谐的用户界面。 能量滤波片放大倍率失真的良好调谐报告示例，所有参数（以绿色文本显示）都在规格范围内。 请点击此处下载此文件。
补充图6：能量滤波器调谐的用户界面。 能量滤波器色度失真的良好调整示例，所有参数（以绿色文本显示）都在规格范围内。 请点击此处下载此文件。
补充图 7：EPU 质量监控器的 DataViz 面板，其中包含收集的冷冻电镜数据集中的数据质量概览。 包含来自所有收集的图像/电影的聚合数据的图形显示了所选关键质量指标的值（点图）和分布（条形图），例如CTF拟合置信度（蓝色），散焦（橙色）和散光（绿色）。通过在 DataViz 面板顶部设置参数过滤器，可以选择收集的图像/动画的子集。应用滤镜后，可以导出选定的图像/动画，以便在另一个图像处理包（如 Relion 或 CryoSpark）中进行进一步处理。 请点击此处下载此文件。
补充图8：根据Relion 4-beta报告的apoF最终重建为1.6 Å分辨率的FSC曲线。 蓝色曲线显示了来自两个相互排斥的半数据集的两个独立细化的 3D 重建的蒙版 3D 地图的 FSC。根据黄金标准FSC的0.143，从完整数据集重建的最终3D地图的分辨率对应于1.6 Å。橙色曲线显示了具有随机相位的蒙版 3D 重建的 FSC。FSC曲线的快速下降表明所使用的掩码对超过~2 Å分辨率的原始重建地图（蓝色曲线）的观测到的FSC没有贡献。 请点击此处下载此文件。
补充图9：使用能量过滤器的不同狭缝宽度重建 嗜酸锥虫 20S蛋白酶体的最终重建的FSC曲线，如Relison 3.1报道。 蓝色曲线分别显示了来自每个数据集的两个半数据集的两个独立精炼重建的蒙版 3D 地图的 FSC。黄金标准FSC为0.143，表示从各自的完整数据集重建的最终3D地图的实现分辨率（分别为2.3 Å，2.2 Å和2.1 Å分辨率）。红色曲线显示了具有随机相位的蒙版地图的 FSC。红色FSC曲线的快速下降表明所使用的掩码对原始重建地图的FSC没有影响超过~3 Å分辨率。绿色曲线显示了未蒙版 3D 地图的 FSC，这些地图受整个重建的 3D 体积中的噪声影响，因此下降速度比被遮罩的 3D 地图的 FSC 更快。 请点击此处下载此文件。
数据可用性： 冷冻EM密度图已存放在EM数据库中，加入编号为：apoferritin：EMD 14173，EMPIAR-10973。20S蛋白酶体：EMD 14467，EMPIAR-10976。
Discussion
所描述的方案假设所使用的TEM显微镜的光学元件处于良好对齐状态。对于本协议中使用的200 kV TEM，在显微镜安装或任何重大服务干预后，由经验丰富的服务工程师完成，验证和保存此类色谱柱对准。这些对齐设置可以在显微镜UI中随时调用。用户可以使用显微镜UI中的直接对准程序来重新调整关键参数。某些对齐方式（如喷枪倾斜和喷枪移位）是稳定的，不需要用户每天进行调整。建议显微镜主管每年检查和重新对准（如果需要）喷枪倾斜和移位。另一方面，某些对齐是关键的，必须在上述协议中所述的每个数据收集之前对齐（例如客观散光和无昏迷对齐）。如果分析软件中的Autocoma功能未能收敛，则应验证和调整光束倾斜枢轴点和/或旋转中心的对准，并确认C2孔径的正确对中。之后，应运行自动tigmate函数，因为客观的污名化器也用于昏迷纠正。应迭代这些对齐方式，直到自动恢复和自动功能在第一次迭代时都成功。如有必要，可以选择另一个区域（例如，支持无冰的碳箔），调整成像散焦，或增加图像采集时间以优化所采集图像中的信噪比，以及多个Thon环在所采集图像的傅里叶变换中的可见性。
现代冷冻电镜显微镜生成大量数据，这些数据通常超过每个数据集1 TB，以实现高分辨率的3D重建，特别是对于对称性低的蛋白质。冷冻电镜数据和结果通常还由正交方法的数据和结果进行补充，以充分了解每个科学项目中的结构 - 功能关系。组织收集的数据，将其传输到图像处理管道，以及在协作者之间共享由此产生的冷冻电镜重建，对冷冻电镜方法的新采用者设置其本地IT基础设施提出了额外的要求。数据管理软件（如 Athena）有助于集中存储由任何连接的仪器或注册用户操作的软件获取的数据。多个用户可以使用简单的 Web 浏览器界面访问存储的数据和元数据，这些用户可以根据其登录凭据和实验设置中的数据共享定义，在项目中具有不同的访问权限（作为所有者、协作者或查看者）。这些角色具有不同的访问权限。实验工作流程的这种数字化为协作者之间的数据和元数据共享提供了手段，而不会造成不必要的重复，并提高了所用工作流程的生产率和可追溯性。在数据管理软件中实现项目，实验和工作流程的通用和可定制结构是通用的，并允许使用互补方法将正交实验定制和集成到单个项目数据库中。
选择冷冻电镜网格上数据采集的区域对于成功采集高分辨率数据集至关重要。使用传统的低温冷冻设备（如Vitrobot（全自动玻璃化系统））生产的冷冻电镜网格通常会在网格表面上显示冰厚梯度（图4）。这可能是有益的，因为网格包含具有不同冰厚度的区域;但是，必须按照上述协议中所述确定具有理想冰层厚度以进行数据收集的区域。最佳的冷冻电镜网格应包含尽可能少的转移冰污染，并包含足够的网格正方形和完整的多孔支撑箔。不建议收集具有裂缝或断裂区域的网格正方形的数据，因为与具有完整支撑箔的网格正方形相比，电子束照明时收集的图像将受到明显更强的整体漂移的影响。过量的结晶冰会遮挡大多数箔孔和/或干扰自动对焦，因此也应避免使用这种网格方块。带有薄冰的网格正方形通常表现出大的玻璃体区域和许多明亮的箔孔，这些孔在使用Atlas预设拍摄的图像中可见。在网格条附近发生较厚的冰是可以预料的，并且在孔选择过程中排除了网格正方形的这些区域中的箔孔，因此不加批判。网格正方形中存在几个空洞可能意味着周围孔中的玻璃冰非常薄，可能含有损坏的颗粒或根本没有颗粒。通常，明智的做法是在网格上选择具有不同冰层厚度的网格正方形进行初始筛选和评估，以了解哪些区域具有高分辨率数据收集的最佳条件，并表现出理想的颗粒密度和方向分布。对于本研究中使用的apof和20S蛋白酶体样品，可观测冰最薄的区域包含对这些样品进行高分辨率成像的最佳条件。
当使用数据采集软件自动选择所有选定网格方块中的孔时，建议在每个网格方块中的代表性孔上执行模板执行任务，以检查并确保没有选择过厚或过薄或意外的非玻璃体方块进行数据收集。在数据采集过程中，可以使用EQM监控所采集图像的关键质量指标，例如图像漂移和CTF拟合。然后，可以通过跳过产生低质量图像的区域来优化数据收集。但是，具有高分辨率CTF拟合的图像仍然可以包含具有几个首选方向的粒子或在太薄的冰层中变性的粒子的图像。从收集的图像中实时拾取颗粒和2D分类将提供有关成像颗粒中结构数据质量的额外信息，并揭示冰中完整颗粒的首选方向或（部分）变性颗粒的不一致结构。因此，计算类平均数有助于进一步细化数据收集的适当区域，如其他软件包23，28所示。
用于数据采集的成像设置的选择，如放大倍率、电子剂量率和散焦范围，取决于几个标准，如靶标分辨率、蛋白质大小、样品浓度、所需的显微镜通量等。对于这些实验中使用的直接电子探测器相机，通过选择适当的SPOT尺寸和强度来保持平行照明，在4-5 e-/ pix / s的范围内选择电子剂量率。如 表1所示，可以在孔/欧心高度预设中使用不同的SPOT尺寸，以确保图像中有足够的信噪比，以便在数据收集期间对孔进行居中。选择放大倍率应使像素尺寸至少比冷冻电镜重建的目标分辨率小2-3倍。然而，使用更高的放大倍率（即较小的像素尺寸），在图像中捕获较小的视野，并且每个图像的颗粒较少，这最终导致更长的数据收集时间，以收集具有足够颗粒的图像以重建高分辨率的3D地图。对于apoF样品，我们使用0.43 Å的像素大小，因为我们有足够的样品浓度来容纳图像中的高密度颗粒，并将重建的分辨率定为低于2 Å。对于20S蛋白酶体样本，我们使用0.68 Å的像素大小来覆盖采集图像中的更大视场。通常，对于200 kV透射电镜显微镜，在0.8至2.0μm的散焦范围内采集冷冻电镜图像。然而，通过使用能量滤波器改善对比度和信噪比，数据采集可以更接近焦点，从而更好地保留采集图像中的高分辨率信息，因为像差更小，CTF包络函数的衰减也相应降低。我们也没有使用客观光圈，因为光圈可能会引入额外的图像像差，而通过使用能量滤光片已经充分增强了图像对比度。对于apoF和20S蛋白酶体样品，我们使用0.5μm，0.7μm和0.9μm的散焦设置。对于较小的蛋白质（<200 kDa），我们使用-0.5 μm，-0.7 μm和-0.9 μm的散焦设置来提高颗粒的对比度，并促进在3D重建的3D细化步骤中更容易拾取颗粒和初始粗对准，从而获得~2.5 Å分辨率的3D图（未发表的结果）。
我们已经证明，使用能量滤波器成像可以改善高端300 kV透射显微镜11上收集的冷冻电镜图像的信噪比（SNR）。事实上，当电子通过样品时，会发生两种主要类型的相互作用：i）弹性散射电子保持其能量，并通过相差机制干扰非散射入射光束来促进图像形成ii）不弹性散射电子在样品中损失一些能量，并且主要导致图像中的噪声。因此，通过使用窄能量狭缝过滤非弹性散射电子，其能量低于入射光束和弹性散射电子，可以显着提高SNR。然而，使用足够稳定的能量滤波器（如Selectris或Selectris-X）至关重要，以便能够在很长（12小时以上）自动数据采集高分辨率cryoEM数据集时使用非常窄（10 eV或更小）的狭缝。
在与300 kV透射电镜显微镜相同的条件下，使用200 kV TEM显微镜采集的Cryo-EM图像由于CTF包络函数衰减更快，因此在高分辨率（特别是<4 Å）下表现出较小的SNR。因此，当使用200 kVTEM时，需要更多数量的颗粒（因此收集的图像数量更多）才能达到一定的分辨率。此外，在200 kV图像35中，景深（2-3 Å分辨率范围内的10-25 nm）也小约20%，这意味着冰层中的较少颗粒（通常为20-50 nm厚）将完全聚焦并建设性地促进计算3D重建的所有高分辨率特征，除非在3D重建过程的后期阶段独立地为每个粒子精确散焦值。对于较大的颗粒（例如二十面体病毒粒子或其它大分子组件），在高分辨率下，颗粒尺寸可能超过景深，并且由于标准3D重建算法36中Ewald球体的平面近似而引入相位误差。这些错误可以通过已经在常见的冷冻电镜图像处理包37，28，39中实现的高级算法来优化。由于Ewald球体在200 kV数据中的曲率大于300 kV数据，因此当使用200 kVTEM时，需要在相对较低的分辨率下和/或相对较小的大分子组件下进行Ewald球体校正。另一方面，200 kV图像在薄冰（20-50nm）中表现出更高的颗粒对比度，比200-300 keV电子平均自由程（220-280nm）薄得多。较高的对比度有助于提高单个颗粒的正确全局排列，特别是对于结构尚不清楚的弱散射较小蛋白质，并且3D参考模型尚未建立。
在这里，我们在20S蛋白酶体的例子中证明了，当使用200 kV TEM显微镜时，使用能量滤光片可以同样提高图像对比度和质量。使用相同数量的粒子，使用20 eV狭缝收集的数据被重建为2.26 Å分辨率，与使用完全打开的能量狭缝收集的数据相比，该能量狭缝仅重建为2.34 Å分辨率。使用重建分辨率为2.14 Å的10 eV狭缝收集的数据实现了最佳重建。这些结果与理论预测一致，即滤波非弹性散射电子会增加收集图像中的SNR，并有助于从给定数量的粒子进行冷冻EM重建的更高分辨率，如 表4所示。从这些数据集中计算出的B因子进一步证实了这些结果，这些B因子表明能量过滤数据集中的图像质量更高。
因此，我们可以得出结论，虽然300 kV TEM显微镜在冷冻电镜重建中提供了最高的通量和尽可能高的分辨率，但200 kV TEM显微镜也为高分辨率冷冻电镜重建提供了高质量的数据集。我们在这里表明，通过使用配备能量滤波器和直接电子探测器的200 kV TEM，可以进一步提高采集图像的质量，从而改善整体结构时间。所提出的实验方案描述了如何使用这种设置常规获得高分辨率冷冻电镜数据的所有必要步骤，并揭示了大分子3D结构的精细结构细节，这对于理解结构生物学和基于结构的药物设计中的关键结构 - 功能关系至关重要。
Disclosures
Sagar Khavnekar报告没有利益冲突。其他作者是赛默飞世尔科技（MSD-EM）部门的员工。
Acknowledgments
没有。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AutoGrid rings | Thermo Fisher Scientific | 1036173 | Package of 100x AutoGrid rings for the standard EM grids. |
| C-Clip | Thermo Fisher Scientific | 1036171 | Package of 100 clips that secure the standard EM grids inside the AutoGrid rings. |
| Data Management Platform | Thermo Fisher Scientific | 1160939 | Part of the Glacios base configuraiton; includes Athena Software |
| EPU Quality Monitor | Thermo Fisher Scientific | 1179770 | |
| EPU Software | Thermo Fisher Scientific | 1025080 | Part of the Glacios base configuration |
| Ethane 3.5 | Westfalen | A06010110 | Ethane gas used for making liquid ethane (puritiy at least N35, i.e. 99.95% vol) |
| Falcon 4 200kV | Thermo Fisher Scientific | 1166936 | Direct electron detector |
| Glacios | Thermo Fisher Scientific | 1149551 | 200 kV TEM |
| GloQube Plus Glow Discharge System for TEM Grids and surface modification | Quorum | N/A | also available via Thermo Fisher Scientific (PN 1160602) |
| QuantiFoil grids | Quantifoil | N/A | R-2/1, 300 mesh; carbon foil grid |
| Relion | MRC Laboratory of Molecular Biology | N/A | open source software: https://relion.readthedocs.io/en/release-3.1/ |
| Selectris with Falcon 4 for 200 kV |
Thermo Fisher Scientific | 1191753 | Energy filter |
| Selectris X with Falcon 4 for 200 kV |
Thermo Fisher Scientific | 1191755 | Energy filter |
| UltrAuFoil grids | Quantifoil | N/A | R-1.2/1.2, 300 mesh; gold foil grids |
| Vitrobot Mk. IV | Thermo Fisher Scientific | 1086439 | Automated vitrification system |
| Whatman 595 filter paper | Thermo Fisher Scientific | AA00420S |
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