Summary
CUT&RUN e suas variantes podem ser usadas para determinar a ocupação de proteínas na cromatina. Este protocolo descreve como determinar a localização da proteína na cromatina usando uliCUT&RUN unicelular.
Abstract
Determinar os locais de vinculação de uma proteína na cromatina é essencial para entender sua função e potenciais metas regulatórias. A imunoprecipitação de cromatina (ChIP) tem sido o padrão-ouro para determinar a localização da proteína por mais de 30 anos e é definida pelo uso de um anticorpo para retirar a proteína de interesse da cromatina sônica ou enzimática digerida. Mais recentemente, as técnicas de amarração de anticorpos tornaram-se populares para avaliar a localização de proteínas na cromatina devido ao seu aumento da sensibilidade. Cleavage Sob Alvos & Liberação Sob Nuclease (CUT&RUN) é o derivado em todo o genoma do Chromatin Immunocleavage (ChIC) e utiliza proteína recombinante A amarrada à nuclease microcócica (pA-MNase) para identificar a região constante do IgG do anticorpo visando uma proteína de interesse, permitindo, portanto, o decote específico do DNA flanqueando a proteína de interesse. O CUT&RUN pode ser usado para traçar modificações de histona, fatores de transcrição e outras proteínas de ligação de cromatina, como fatores de remodelação nucleossomo. É importante ressaltar que o CUT&RUN pode ser usado para avaliar a localização de proteínas eucromáticas ou heterocromáticas e modificações de histona. Por essas razões, a CUT&RUN é um método poderoso para determinar os perfis de vinculação de uma ampla gama de proteínas. Recentemente, a CUT&RUN foi otimizada para o perfil do fator de transcrição em baixas populações de células e células únicas e o protocolo otimizado tem sido chamado de cut&RUN de entrada ultra-baixa (uliCUT&RUN). Aqui, um protocolo detalhado é apresentado para o perfil de fator unicelular usando uliCUT&RUN em um formato manual de 96 poços.
Introduction
Muitas proteínas nucleares funcionam interagindo com a cromatina para promover ou prevenir atividades modeldas por DNA. Para determinar a função dessas proteínas que interagem com a cromatina, é importante identificar os locais genômicos em que essas proteínas estão ligadas. Desde o seu desenvolvimento em 1985, a Imunoprecipitação Chromatina (ChIP) tem sido o padrão-ouro para identificar onde uma proteína se liga à cromatina 1,2. A técnica tradicional de ChIP tem o seguinte fluxo de trabalho básico: as células são colhidas e cruzadas (geralmente com formaldeído), a cromatina é ensaboada (geralmente com métodos de sônica dura, necessitando de crosslinking), a proteína de interesse é imunoprecipitada usando um anticorpo que visa a proteína (ou proteína marcada) seguido por um anticorpo secundário (acoplado a garose ou contas magnéticas), crosslinking é revertido, proteína e RNA são digeridos para purificar o DNA, e este DNA enriquecido chIP é usado como modelo para análise (usando sondas radiolabeled 1,2, qPCR3, microarrays 5,6, ou sequenciamento4). Com o advento das microarrays e do sequenciamento profundo massivamente paralelo, o Chip ChIP 5,6 e o ChIP-seq4 foram mais recentemente desenvolvidos e permitem a identificação em todo o genoma da localização de proteínas na cromatina. Crosslinking ChIP tem sido uma técnica poderosa e confiável desde o seu advento com grandes avanços na resolução por ChIP-exo7 e ChIP-nexus8. Paralelamente ao desenvolvimento de protocolos chip-seq, nativos (não-crosslinking) para ChIP (N-ChIP) foram estabelecidos, que utilizam digestão nuclease (muitas vezes usando nuclease microcócica ou MNase) para fragmentar a cromatina, em oposição à sonicação realizada nas técnicas tradicionais de ChIP transligação9. No entanto, uma grande desvantagem tanto para as tecnologias de ChIP e N-ChIP de crosslinking tem sido a exigência de números de células elevados devido ao baixo rendimento de DNA após a manipulação experimental. Portanto, nos anos mais recentes, muitos esforços têm sido para otimizar as tecnologias chip para baixa entrada celular. Esses esforços resultaram no desenvolvimento de muitas tecnologias poderosas baseadas em ChIP que variam em seus requisitos de aplicabilidade e insumo 10,11,12,13,14,15,16,17,18. No entanto, faltam tecnologias baseadas em ChIP-seq unicelulares, especialmente para proteínas não histonas.
Em 2004, uma tecnologia alternativa foi desenvolvida para determinar a ocupação proteica em chromatina denominada Chromatin Endogenous Cleavage (ChEC) e Chromatin Immunocleavage (ChIC)19. Essas técnicas de locus único utilizam uma fusão de MNase para a proteína de interesse (ChEC) ou para a proteína A (ChIC) para corte direto do DNA adjacente à proteína de interesse. Nos anos mais recentes, tanto o ChEC quanto o ChIC foram otimizados para o perfil de proteína em todo o genoma em cromatina (ChEC-seq e CUT&RUN, respectivamente)20,21. Embora o ChEC-seq seja uma técnica poderosa para determinar a localização de fatores, requer o desenvolvimento de proteínas de fusão de MNase para cada alvo, enquanto o ChIC e sua variação genoma-em todo o genoma, CUT&RUN, dependem de um anticorpo direcionado para a proteína de interesse (como com chip) e proteína recombinante A-MNase, onde a Proteína A pode reconhecer a região constante de IgG do anticorpo. Como alternativa, foi desenvolvida uma proteína de fusão A/Protein G-MNase (pA/G-MNase) que pode reconhecer uma gama mais ampla de regiões constantes de anticorpos22. A CUT&RUN tornou-se rapidamente uma alternativa popular ao ChIP-seq para determinar a localização de proteínas em todo o genoma da cromatina.
A entrada ultra-baixa CUT&RUN (uliCUT&RUN), uma variação da CUT&RUN que permite o uso de entradas de células baixas e unicelulares, foi descrita em 201923. Aqui, a metodologia para um formato manual de 96 poços de aplicação unicelular é descrita. É importante notar que desde o desenvolvimento do uliCUT&RUN, duas alternativas para o perfil de histona, CUT&Tag e iACT-seq foram desenvolvidas, fornecendo perfil robusto e altamente paralelo das proteínas histonas24,25. Além disso, o scCUT&Tag foi otimizado para traçar múltiplos fatores em uma única célula (multiCUT&Tag) e para aplicação a proteínas não histonas26. Juntas, a CUT&RUN oferece uma alternativa atraente para chip-seq de baixa entrada, onde o uliCUT&RUN pode ser realizado em qualquer laboratório de biologia molecular que tenha acesso a um classificador de células e equipamentos padrão.
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Protocol
Declaração ética: Todos os estudos foram aprovados pelo Escritório de Proteção à Pesquisa da Universidade de Pittsburgh.
1. Prepare contas magnéticas
NOTA: Realize antes da triagem celular e segure no gelo até o uso.
- Pipeta 30 μL de microesferas paramagnéticas conjugadas misturam chorume por reação a um tubo fresco de microfuça de 1,5 mL e adicionam 850 μL de Buffer de Ligação, pipetando suavemente para misturar.
NOTA: Microesferas paramagnéticas conjugadas pela são contas magnéticas revestidas de lectina que permitem a ligação da membrana lipídica. - Coloque o tubo em um rack magnético e deixe que as contas magnetizem por 1-2 min. Uma vez que o supernatante tenha limpado, remova e descarte o supernatante sem perturbar as contas.
- Remova o tubo do rack magnético e lave as contas reutilizando em 1 mL de buffer de ligação.
- Repita as etapas 1.2 e 1.3.
- Magnetize as contas por 2 minutos e remova o supernatante para descartar.
- Remova o tubo do rack magnético e resuspense as contas em 30 μL de Buffer de ligação por reação.
- Segure a mistura de contas lavadas no gelo até que as células sejam classificadas.
2. Células de colheita
NOTA: Esta etapa é escrita para células aderidas e otimizada para células-tronco embrionárias murine E14. A colheita e a colheita das células dependem do tipo celular.
- Remova as células da incubadora de 37 °C e examine-as sob um microscópio para garantir a qualidade.
- Aspire a mídia da placa celular e enxágue com 5 mL de PBS 1x.
- Aspirar PBS da placa e colher as células (utilizando métodos tradicionais de colheita celular que diferem por tipo de célula). Obtenha suspensão unicelular, encanar suavemente para cima e para baixo com uma pipeta sorológica contra o prato de cultura, se necessário.
- Transfira a suspensão celular para um tubo cônico de 15 mL e gire a 200 x g por 5 min.
- Aspire fora da mídia para descartar e lavar a pelota celular com 5 mL de PBS + 1% FBS.
- Gire as células a 200 x g por 5 min, descarte o supernascedor e resuspenque a pelota celular em 5 mL de PBS + 1% FBS.
- Conte as células e transfira 1 mL de 1 x 106 células para um tubo de microfuça de 1,5 mL fresco.
- Adicione 5 μL de 7-Amino-Actinomicina D (7-AAD), inverta bem o tubo para misturar e, em seguida, aplique a amostra no classificador celular para classificar células individuais vivas em poços individuais de uma placa de 96 poços.
NOTA: O corante 7-AAD é excluído das células vivas e, portanto, pode ser usado na triagem de células vivas.
3. Classificação celular e lise celular
- Prepare uma placa de 96 poços compatível com o classificador celular com 100 μL de buffer de extração nuclear (NE) em cada poço antes da classificação celular.
- Classifique as células em placas de 96 poços seguindo as instruções do fabricante.
- Gire rapidamente a placa (600 x g para 30 s) para garantir que as células estejam no buffer dentro dos poços.
NOTA: Vale a pena testar em um experimento preliminar se as células que estão sendo usadas são de forma confiável trazidas para o fundo dos poços. - Segure as amostras no gelo por 15 minutos.
- Gire as amostras a 600 x g por 5 min a 4 °C e cuidadosamente pipeta para remover o supernaspetivo (deixando para trás 5 μL).
- Resuspenque cada amostra em 55 μL de buffer NE e adicione 30 μL das microesferas paramagnéticas pré-lavadas conjugadas (a partir do passo 1,7; em Buffer de Ligação) a cada reação.
- Incubar em temperatura ambiente por 10 minutos.
4. Amostras pré-bloco para evitar a digestão precoce por MNase
- Coloque a placa em um rack magnético de 96 poços, deixe as contas se amarrarem por um mínimo de 5 minutos e, em seguida, remova e descarte o sobrenatário.
- Adicione 100 μL de Tampão de Bloqueio às contas ligadas ao núcleo e misture com tubulação suave.
- Incubar por 5 minutos em temperatura ambiente.
5. Adição de anticorpo primário
- Coloque a placa em um rack magnético de 96 poços, deixe o supernatante limpar por um mínimo de 5 minutos e, em seguida, remova e descarte o sobrenante sem perturbar as contas.
- Remova a placa do rack magnético e resuspenque as contas em 100 μL de Wash Buffer por reação com tubulação suave.
- Coloque a placa de volta no rack magnético de 96 poços, deixe o supernatante limpar e, em seguida, remova e descarte o supernatante.
- Resuspenda as contas em 25 μL de Wash Buffer por reação com tubulação suave.
- Faça uma mistura principal de mestre de anticorpos: 25 μL de Wash Buffer + 0,5 μL de anticorpo por reação.
- Enquanto suavemente vórtice as contas ligadas aos núcleos, adicione 25 μL da mistura principal de anticorpos mestre a cada amostra que está sendo tratada com um anticorpo visando a proteína de interesse (tipicamente 1:100 diluição final). Adicione 25 μL de Wash Buffer sem anticorpos, se realizar um controle.
- Incubar por 1h à temperatura ambiente.
- Coloque as amostras em um rack magnético de 96 poços, permita que o supernatante se limpe por um mínimo de 5 minutos e, em seguida, remova e descarte o sobrenatário sem perturbar as contas.
- Remova a placa do rack magnético e lave as contas com 100 μL de Tampão de Lavagem, reutilizando por pipetação.
6. Adição de pA-MNase ou pA/G-MNase
NOTA: A proteína A tem uma alta afinidade com moléculas de IgG de determinadas espécies, como coelhos, mas não é adequada para IgGs de outras espécies, como ratos ou ratos. Alternativamente, a Proteína A/G-MNase pode ser usada. Este híbrido liga IgGs de coelho, rato e rato, evitando a necessidade de anticorpos secundários quando anticorpos primários de rato ou rato são usados.
- Coloque a placa de volta em um rack magnético de 96 poços, deixe o supernatante limpar por um mínimo de 5 minutos, e depois remova e descarte o sobrenatário sem perturbar as contas.
- Remova a placa do rack magnético e resuspenque cada amostra em 25 μL de Wash Buffer.
- Faça um mix mestre pA-MNase (25 μL de Wash Buffer + quantidade otimizada de pA-MNase por reação).
- Enquanto suavemente vórtice, adicione 25 μL da mistura mestre pA-MNase a cada amostra, incluindo as amostras de controle.
NOTA: A concentração de pA-MNase varia após a preparação, se caseira, e deve ser testada antes de ser usada em cada purificação independente. Para pA/G-MNase, devem ser utilizados 2,5 μL do estoque de 20x. - Incubar as amostras por 30 minutos em temperatura ambiente.
- Coloque a placa em um rack magnético de 96 poços, deixe o supernatante limpar por um mínimo de 5 minutos e, em seguida, remova e descarte o sobrenante sem perturbar as contas.
- Remova a placa do rack magnético e lave as contas com 100 μL de Tampão de Lavagem, reutilizando-se por tubulação suave.
7. Digestão de DNA direcionada
- Coloque a placa em um rack magnético de 96 poços, deixe o supernatante limpar por um mínimo de 5 minutos e, em seguida, remova e descarte o sobrenatário.
- Remova as amostras do rack magnético e resuspenja as contas em 50 μL de Wash Buffer por tubulação suave.
- Equilibre as amostras para 0 °C em uma mistura de gelo/água por 5 minutos.
- Remova as amostras do banho de gelo/água de 0 °C e adicione 1 μL de 100 mM CaCl2 usando uma pipeta multicanal. Misture bem (3-5 vezes) com tubos suaves usando uma pipeta multicanal de maior volume e, em seguida, devolva as amostras para 0 °C.
NOTA: Misturar bem aqui é essencial. CaCl2 é adicionado para ativar a digestão MNase do DNA flanqueando a proteína de interesse. - Inicie um temporizador de 10 minutos assim que a placa voltar ao banho de gelo/água.
- Pare a reação pipetando 50 μL de buffer 2XRSTOP+ em cada poço, na mesma ordem que o CaCl2 foi adicionado.
NOTA: Faça o buffer 2XRSTOP+ antes que a digestão de 10 minutos acabe para evitar a digestão excessiva.
8. Fracionamento da amostra
- Incubar as amostras por 20 min a 37 °C.
- Gire a placa a 16.000 x g por 5 min a 4 °C.
- Coloque a placa em um rack magnético de 96 poços, deixe o supernatante limpar por um mínimo de 5 minutos, e transfira supernantes para uma placa fresca de 96 poços. Descarte as contas.
9. Extração de DNA
- Adicione 1 μL de Sulfato de Dodecyl de Sódio (SDS) e 0,83 μL de 20 mg/mL Proteinase K a cada amostra.
ATENÇÃO: O pó SDS é prejudicial se inalado. Os usuários devem usar em espaços bem ventilados usando óculos, luvas e um respirador de grau N95, manuseando com cuidado. - Misture as amostras por tubulação suave.
- Incubar as amostras por 10 min a 70 °C.
- Volte a placa à temperatura ambiente e adicione 46,6 μL de 5 M NaCl e 90 μL de 50% PEG 4000. Misture por pipetação suave.
- Adicione 33 μL de contas de poliestireno-magnetita a cada amostra e incubar por 10 minutos à temperatura ambiente.
NOTA: Certifique-se de levar as contas de poliestireno-magnetita à temperatura ambiente (~30 min) e misturar bem antes de usar. - Coloque a placa em um rack magnético e deixe o supernatante limpar por ~5 minutos, e depois descarte cuidadosamente o sobrenante sem perturbar as contas.
- Enxágüe 2x com 150 μL de 80% de etanol sem perturbar as contas.
ATENÇÃO: O etanol é altamente inflamável e causa irritação na pele, nos olhos e no pulmão. Realize esta etapa com roupas de laboratório adequadas e em um capô ventilado. - Gire a placa brevemente a 1000 x g para 30 s. Coloque a placa de volta em um rack magnético de 96 poços e remova todos os EtOH residuais sem perturbar as contas.
- Seque as amostras por ~2-5 min.
NOTA: Não seque as contas por mais de 5 minutos. Se for diligente em remover o EtOH, 2-3 min de secagem é suficiente. - Resuspenncie as contas com 37,5 μL de 10 mM Tris-HCl (pH 8) e incubar por 5 min a temperatura ambiente.
- Coloque a placa em um rack magnético e deixe as contas se amarrarem por 5 minutos.
- Transfira 36,5 μL do supernante para uma placa de 96 poços compatível com termocicl. Descarte as contas.
NOTA: O experimento pode ser interrompido aqui armazenando amostras a -20 °C ou pode continuar com a construção da biblioteca (etapas 10-15).
10. Reparação final, fosforilação, adenilação
NOTA: Os reagentes são originados como referenciados na Tabela de Materiais. O protocolo abaixo segue um método semelhante ao kit comercial, como o kit NEBNext Ultra DNA II.
- Diluir 5 U/μL de polimerase de DNA T4 1:20 em 1x tampão de ligase de DNA T4.
- Prepare um mix mestre de reparo final/3'A: 2 μL de 10x tampão de ligase de DNA T4, 2,5 μL de 10 mM dNTPs, 1,25 μL de 10 mM ATP, 3,13 μL de 40% PEG 4000, 0,63 μL de 10 U/μL T4 PNK, 0,5 μL de polimerase de DNA T4 diluída, 0,5 μL de polimerase de DNA Taq 5U/μL, com um volume total de 13,5 μl de reação de DNA por.
NOTA: Certifique-se de levar 40% PEG 4000 à temperatura ambiente antes de pipetar. - Adicione 13,5 μL de reparação final/3'A mistura mestre a 36,5 μL de DNA.
- Misture a reação com vórtice rápido e, em seguida, um giro rápido (500 x g para 10 s).
- Incubar usando as seguintes condições de reação em um termociclador pré-resfriado com uma tampa aquecida para temperaturas >20 °C. Use as condições de reação: 12 °C para 15 min, 37 °C para 15 min, 72 °C para 20 min, mantenha em 4 °C.
11. Ligadura adaptador
NOTA: Mantenha as amostras no gelo enquanto configura a seguinte reação. Deixe que o tampão ligase chegue à temperatura ambiente antes de pipetar. Diluir o Adaptador (ver Tabela de Materiais) em uma solução de 10 mM Tris-HCl contendo 10 mM NaCl (pH 7.5). Devido ao baixo rendimento, não pré-quantifique o DNA enriquecido pela CUT&RUN. Em vez disso, gerar diluições 25 vezes do adaptador, utilizando uma concentração final do adaptador de trabalho de 0,6 μM.
- Faça uma mistura mestre de ligadura: 55 μL de tampão de ligase (2x), 5 μL de liga ligase de DNA T4 e 5 μL de Adaptador diluído, com um volume total de 65 μL por reação.
- Adicione 65 μL da mistura de ligadura mestre a 50 μL de DNA a partir da etapa 10.5.
- Misture por vórtice rápido, seguido de giro rápido (500 x g para 10 s).
- Incubar a 20 °C em um termociclador (sem tampa aquecida) por 15 min.
NOTA: Proceda imediatamente para a seguinte etapa.
12. Digestão do USUÁRIO
- Adicione 3 μL de enzima US a cada amostra, vórtice e giro (500 x g para 10 s).
- Incubar em ciclofaixa térmica a 37 °C por 15 min (tampa aquecida a 50 °C).
13. Limpeza de contas de poliestireno-magnetita após reação de ligadura
NOTA: Permitir que as contas de poliestireno-magnetita se equilibrem à temperatura ambiente (~30 min). Vórtice para homogeneizar a solução de contas antes de usar. Realize as seguintes etapas em temperatura ambiente.
- Adicione 39 μL (0,33x) de solução de contas de hidrostimo de poliestireno a cada bem que contenha DNA ligado por adaptador.
- Misture bem por pipetar e, em seguida, incubar as amostras à temperatura ambiente por 15 minutos para permitir que o DNA se ligue às contas.
- Coloque as amostras em um rack magnético de 96 poços e incubar por 5 minutos até que o sobrenatante esteja limpo.
- Mantenha a placa no rack magnético e remova cuidadosamente e descarte o sobrenatário sem perturbar as contas.
- Enxágüe as contas com 200 μL de 80% EtOH sem perturbar as contas.
- Incubar por 30 s em um rack magnético de 96 poços para permitir que a solução seja limpa.
- Remova e descarte o supernatante sem perturbar as contas.
- Repita as etapas 13.5-13.7 para um total de duas lavagens.
- Gire a placa brevemente a 500 x g para 10 s, coloque a placa de volta em um rack magnético de 96 poços e remova o EtOH residual sem perturbar as contas.
- Mantenha a placa no rack magnético e seque as amostras por 2 minutos.
NOTA: Não seque demais as contas. - Remova a placa do rack magnético e resuspenque as contas em 28,5 μL de 10 mM Tris-HCl (pH 8).
ATENÇÃO: O ácido clorídrico é muito corrosivo. Os usuários devem lidar com isso com cuidado em um capuz de fumaça química usando óculos, luvas e um jaleco. - Resuspend completamente as contas por pipetação, tomando cuidado para não produzir bolhas.
- Incubar por 5 minutos em temperatura ambiente.
- Coloque a placa em um rack magnético de 96 poços e deixe a solução limpar por 5 minutos.
- Transfira 27,5 μL de supernaspeso para uma nova placa PCR e descarte as contas.
14. Enriquecimento da biblioteca
NOTA: Os primers são diluídos com a mesma solução do adaptador. Para esta construção da biblioteca, use uma concentração final de primer de trabalho de 0,6 μM.
- Adicione 5 μL de primer indexado diluído (ver Tabela de Materiais) a cada amostra.
NOTA: Cada amostra precisa de um índice diferente para ser identificado após o sequenciamento. - Prepare um mix mestre pcr: 10 μL de 5x tampão PCR de alta fidelidade, 1,5 μL de 10 mM dNTPs, 5 μL de primer Universal diluído, 1 μL de 1 U hot start de alta fidelidade polimerase, com um volume total de mix mestre de 17,5 μL por amostra.
- Adicione 17,5 μL pf MISTURA PCR a 32,5 μL de DNA purificado adaptado a adaptador (5 μL de primer indexado está incluído neste volume).
- Misture a solução por pipetação.
- Incubar em um termociclador utilizando as seguintes condições de reação com uma velocidade máxima de 3 °C/s: 98 °C para 45 s, 98 °C para 45 s, 60 °C para 10 s, repita o segundo e terceiro passos 21 vezes, 72 °C para 1 min, mantenha em 4 °C.
NOTA: As amostras podem ser mantidas a 4 °C para armazenamento a curto prazo ou -20 °C para armazenamento a longo prazo.
15. Limpeza de contas de poliestireno-magnetita
- Adicione 60 μL (1,2x) de contas de poliestireno-magnetita a cada amostra.
- Resuspenda as contas por pipetação e incubar por 15 minutos à temperatura ambiente.
- Coloque a placa em um rack magnético por 5 minutos até que a solução esteja clara.
- Descarte o supernasce e enxágue as contas com 200 μL de 80% De SI sem perturbar as contas.
- Repita a etapa de lavagem para um total de duas lavagens de 80% etoh.
- Gire a placa a 500 x g para 10 s, coloque a placa em um rack magnético de 96 poços e deixe as contas se amarrarem por 5 minutos.
- Pipeta para remover o excesso de EtOH sem perturbar as contas e permitir que as contas sequem ao ar por 2 minutos.
NOTA: Não seque demais as contas. - Resuspenda as contas em 21 μL de água sem nuclease e incubar por 5 minutos à temperatura ambiente.
- Coloque a placa em um rack magnético e deixe a solução limpar por 5 minutos.
- Transfira 20 μL do supernatante para uma nova placa.
NOTA: O experimento pode ser interrompido aqui armazenando a amostra a -20 °C. - Quantifique as concentrações da biblioteca com um fluorômetro (ver Tabela de Materiais), usando um reagente 1x HS.
- Se a concentração permitir, execute 30 ng de amostra em gel de 1,5% de agarose com uma escada de baixo peso molecular para visualizar. Alternativamente, visualize em um Analisador de Fragmentos ou instrumento relacionado.
- Bibliotecas sequenciadas em uma plataforma de Illumina para obter ~50.000-100.000 leituras exclusivamente mapeadas.
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Representative Results
Aqui, um protocolo detalhado é apresentado para perfil de proteína unicelular em cromatina usando um formato manual de 96 poços uliCUT&RUN. Embora os resultados variem com base na proteína que está sendo perfilada (devido à abundância de proteínas e qualidade de anticorpos), tipo celular e outros fatores contribuintes, os resultados antecipados para esta técnica são discutidos aqui. A qualidade celular (aparência celular e por cento das células viáveis) e a classificação unicelular devem ser avaliadas antes ou no momento da classificação de células vivas no buffer NE. Um exemplo de colônias de células ES e classificação celular é mostrado na Figura 2A,B. Especificamente, as células de baixa qualidade não devem ser utilizadas, e se a qualidade é um problema, deve-se tomar cuidado para seguir as diretrizes para o tipo específico de célula. Além disso, a triagem celular precisa pelo instrumento de classificação celular deve ser avaliada antes da experimentação. Por exemplo, as células de teste podem ser classificadas e manchadas usando a mancha hoechst 33342 e contadas para garantir que 0 ou 1 célula seja encontrada em cada poço. Se as células únicas não forem encontradas, as condições de classificação devem ser otimizadas. Após a preparação da biblioteca, as amostras podem ser avaliadas em um gel de agarose (se a concentração permitir o carregamento de 30 ng ou mais, pois há um limite menor para visualização de DNA em um gel de agarose) ou um Analisador de Fragmentos (ou dispositivo similar, como uma Estação de Fita ou Bioanalyzer) antes de sequenciar e exemplos de resultados são mostrados na Figura 2C, D. Especificamente, a distribuição de tamanho esperado é de ~150 a ~500 bp. Em maiores quantidades celulares, a CUT&RUN realizada em grandes proteínas (como histones) terá uma distribuição de tamanho do lado direito, onde a maioria do DNA será vista ~270 bp; no entanto, este ombro normalmente não é observado em experimentos unicelulares.
Após o sequenciamento, a qualidade das leituras de sequenciamento deve ser avaliada utilizando o FASTQC. O percentual de leituras de mapeamento único deve ser determinado. Normalmente, leituras de mapeamento de 0,5%-10% são observadas em experimentos unicelulares. Essas porcentagens de mapeamento são semelhantes a outras técnicas unicelulares baseadas em DNA30. Em seguida, a distribuição de tamanho das leituras após o mapeamento deve ser determinada para garantir que o perfil seja semelhante ao pré-sequenciamento (com a sequência do adaptador não contribuindo mais para os tamanhos de leitura).
Após a avaliação da qualidade dos dados, a ocupação proteica pode ser visualizada usando vários métodos: imagens do navegador genoma de locus simples podem ser visualizadas usando navegador de genoma UCSC ou IGV (Figura 3A) e padrões de ocupação em todo o genoma em coordenadas genômicas específicas podem ser visualizados usando metaplots (Figura 3B, fundo), mapas térmicos (Figura 3B, topo) ou heatmaps 1D (Figura 3C). Para obter mais informações sobre análise de dados, consulte o estudo de Patty e Hainer27. Dados unicelulares de uma célula diploide resultarão em até quatro leituras contribuindo para cada lócus (quatro leituras se a célula estava em mitose), mas mais frequentemente uma ou duas leituras. Portanto, os dados são binários, e um fundo alto pode ser mais facilmente confundido com ocupação, em relação a experimentos de células altas. Portanto, recomenda-se realizar um experimento cut&RUN paralelo em um número de células alta (5.000 a 100.000 células), se possível, para adquirir todos os locais de ligação possíveis para a proteína de interesse. Em seguida, os dados unicelulares podem ser comparados com possíveis locais de ligação. Nos exemplos mostrados na Figura 3, os resultados ctcf ulicut&RUN de célula única são comparados com ctcf ulicut&RUN de células altas (Figura 3A) ou ChIP-seq (Figura 3B,C). Como demonstrado anteriormente, os picos uliCUT&RUN de células únicas CTCF, SOX2 e NANOG representaram em grande parte picos mais fortes dos conjuntos de dados ChIP-seq de células altas23.
Figura 1: Esquema do protocolo uliCUT&RUN. As células são colhidas e classificadas em uma placa de 96 poços contendo tampão NE. Núcleos individuais são então vinculados a microesferas paramagnéticas conjugadas pelo, e sequencialmente um anticorpo (visando a proteína de interesse) e pA-MNase ou pA/G-MNase são adicionados. O DNA adjacente à proteína é cortado via MNase, e o DNA é então purificado para uso na preparação da biblioteca. Este número foi criado com Biorender.com. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Exemplos de classificação celular e controle de qualidade das bibliotecas uliCUT&RUN. (A) Imagem de células de tronco embrionário murina (ES) de alta qualidade. Barra de escala: 200 μm. (B) Saída da classificação unicelular após adicionar 7AAD às células ES colhidas e classificar em um instrumento FACS. (C) Gel de agarose manchado de brometo de ethidium representando bibliotecas uliCUT&RUN completas. A pista 1 é uma escada de baixo peso molecular e as pistas 2-21 são exemplos de bibliotecas uliCUT&RUN individuais bem sucedidas antes do sequenciamento. (D) Gel de agarose manchado de brometo de ethidium representando bibliotecas uliCUT&RUN concluídas abaixo do ideal e ótimas. A pista 1 é uma escada de baixo peso molecular, a pista 2 é uma biblioteca sub-ideal devido à digestão ineficiente de MNase, e a pista 3 é uma biblioteca bem sucedida com digestão apropriada. (E) Distribuição do analisador de fragmentos de uma única biblioteca uliCUT&RUN de células antes do sequenciamento. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Exemplo dos resultados esperados para dados uliCUT&RUN de células ES únicas. (A) Faixa do navegador de número de celular alto (5.000 células) CTCF ou controle negativo (Sem Anticorpo, Sem Ab) uliCUT&RUN (duas faixas principais) e CTCF uliCUT&RUN de célula única. A imagem é reproduzida, com permissão, de Patty e Hainer27. (B) Mapas de calor (superior) e metaplots (inferior) de CTCF de célula única ou controle negativo (No Ab) uliCUT&RUN sobre os sites CTCF ChIP-seq publicados anteriormente (GSE11724). A imagem é reproduzida, com permissão, de Hainer et al.23. (C) mapas de calor 1D de CTCF de célula única ou controle negativo (No Ab) uliCUT&RUN sobre os sites CTCF ChIP-seq publicados anteriormente (GSE11724). A imagem é reproduzida, com permissão, de Hainer et al.23. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Tabela 1: Composição de vários buffers utilizados neste protocolo. O volume de solução de estoque necessário é listado com concentração final escrita entre parênteses. Clique aqui para baixar esta Tabela.
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Discussion
CUT&RUN é um protocolo eficaz para determinar a localização de proteínas na cromatina. Tem muitas vantagens em relação a outros protocolos, incluindo: 1) alta relação sinal-ruído, 2) protocolo rápido e 3) baixa cobertura de leitura de sequenciamento necessária, levando, assim, à redução de custos. O uso de Proteína A- ou Proteína A/G-MNase permite que o CUT&RUN seja aplicado com qualquer anticorpo disponível; portanto, tem o potencial de traçar rapidamente e facilmente muitas proteínas. No entanto, a adaptação a célula única para qualquer perfil de proteína na cromatina tem sido difícil, especialmente quando comparada à transcrição unicelular (ou seja, scRNA-seq), devido ao baixo número de cópia de DNA em relação ao RNA (duas a quatro cópias de DNA versus possíveis milhares de cópias de RNA).
No protocolo detalhado acima, várias etapas críticas devem ser consideradas. Em primeiro lugar, a classificação adequada das células depende do tipo celular (ou tecido), e deve-se tomar cuidado para uma classificação precisa. Recomenda-se testar o quão eficaz é a classificação unicelular com o instrumento antes de qualquer experimento. Em segundo lugar, a escolha eficaz de anticorpos é essencial. Antes de prosseguir para uma aplicação unicelular, recomenda-se testar o anticorpo em um experimento de número de células altas (bem como outros testes de anticorpos padrão, como confirmar a especificidade usando a mancha ocidental após o knockdown, titulação do anticorpo em experimentos CUT&RUN, etc.). Em terceiro lugar, utilizar um controle negativo, como OGG ou nenhum anticorpo primário, pois uma comparação adequada com as amostras experimentais é essencial para a interpretação da qualidade dos dados e dos resultados biológicos. Ao comparar os resultados experimentais unicelulares com um alto conjunto de dados de números de células, os experimentos de células únicas de controle negativo devem ter menos cobertura de leitura sobre os locais de ligação identificados no experimento de células altas e, em vez disso, ter uma distribuição aleatória de leituras em todo o genoma (com um viés para regiões abertas de cromatina). Em quarto lugar, deve-se tomar cuidado ao adicionar e ativar a proteína A- ou proteína A/G-MNase para não digerir sobre a cromatina: não superaquecer as amostras com as mãos, manter as amostras em uma temperatura de banho de gelo/água (0 °C) e quilatar a reação no momento apropriado. Em quinto lugar, deve-se tomar cuidado durante todo o experimento uliCUT&RUN e preparação da biblioteca, devido ao baixo material. Por exemplo, a incubação estendida no rack magnético durante a ligação de contas para garantir que o supernante tenha limpado e tomando cuidado para não perturbar as contas ao remover o supernante são essenciais para o rendimento suficiente. Em sexto lugar, dependendo das questões abordadas, o número de experimentos unicelulares que estão sendo realizados é uma consideração importante. Alguns dos experimentos unicelulares falharão (como em todos os experimentos de baixa entrada), e, portanto, o número de resultados experimentais positivos necessários para interpretação adequada deve ser considerado antes do início do experimento. O número de células a serem incluem no experimento depende da quantidade de dados experimentais exigidas pelo pesquisador e da qualidade do anticorpo. Por fim, observe que resultados equivalentes poderiam ser alcançados com volumes reduzidos de muitos aspectos deste protocolo. As etapas em que o volume foi reduzido em 50% incluem o volume de tampão de NE, tampão de lavagem, mistura de anticorpos primários (incluindo a quantidade de anticorpos primários), mistura pA-MNase (incluindo a quantidade de pA-MNase) e todas as etapas na preparação da biblioteca.
Com base na natureza complicada do perfil de fatores na cromatina, existem muitas fontes potenciais de problemas e lugares onde a solução de problemas pode se tornar necessária. Embora possa haver muitas etapas em que problemas possam surgir, três questões importantes foram observadas: 1) baixo rendimento de DNA para entrada na construção da biblioteca; 2) sinal de fundo alto em amostras experimentais e 3) baixo rendimento após a construção da biblioteca. Se não houver DNA suficiente para preparação e sequenciamento da biblioteca (ponto 1), observe os seguintes conselhos de solução de problemas: a) pode ter havido lise de membrana incompleta e, portanto, o tempo de lise com tampão NE pode ser aumentado; b) pode ter havido ligação ineficiente do núcleo às microesferas paramagnéticas conjugadas pelo e isso poderia ser remediado através da mistura adequada após a adição dessas contas; c) pode ter sido adicionado muito pouco anticorpo e, portanto, recomenda-se realizar uma titulação de anticorpos para identificar a quantidade mais eficaz; d) os tempos de incubação com o anticorpo primário ou a proteína A- ou proteína A/G-MNase são muito curtos (ou seja, não há tempo suficiente para permitir a vinculação) ou muito tempo (são amostras nativas, não cruzadas), e podem ser otimizados; e) a interação da proteína alvo com cromatina pode ser muito transitória para capturar em condições nativas e, portanto, a interligação CUT&RUN poderia ser realizada28. Embora os conjuntos de dados unicelulares produzam um fundo alto, pode haver um fundo excessivamente alto onde o sinal é difícil de interpretar a partir do fundo (ponto 2). Para esta questão, observe os seguintes conselhos: a) a etapa de bloqueio com EDTA para evitar a digestão preventiva do MNase pode ser aumentada ou otimizada; b) se houver corte excessivo, pode ser devido à muita proteína A- ou Proteína A/G-MNase, e, portanto, uma titulação de quantidades apropriadas pode ser realizada; c) a digestão excessiva por MNase pode resultar no alto plano de fundo e, portanto, a mistura adequada de cloreto de cálcio após a adição e otimização para o tempo de digestão de MNase deve ser avaliada. Finalmente, o DNA enriquecido com uliCUT&RUN eficiente pode ter sido recuperado, mas uma baixa quantidade de biblioteca pode ser recuperada (ponto 3). Para esta questão, recomenda-se: a) manuseio adequado e uso de contas de poliestireno-magnetita para garantir a purificação correta e nenhuma perda de DNA; especificamente, recomenda-se ter incubações de 15 min e um mínimo de 5 minutos para magnetizar contas para evitar perdas; b) a sub amplificação da biblioteca na fase PCR resultaria em baixo rendimento e, portanto, os ciclos apropriados devem ser determinados utilizando qPCR (conforme previamente estabelecido para atac-seqes29).
Como em todas as tecnologias, existem limitações para o uliCUT&RUN que devem ser consideradas antes de iniciar qualquer experimentação. Em primeiro lugar, esses experimentos são projetados e otimizados para condições nativas e, portanto, se uma proteína está apenas interagindo transitoriamente com a cromatina, uma abordagem transversal pode ser necessária para garantir a recuperação da interação. Em segundo lugar, como em todas as técnicas baseadas em anticorpos, a qualidade do anticorpo é importante. Deve-se tomar cuidado para garantir a qualidade e consistência do anticorpo antes de realizar quaisquer experimentos. Em terceiro lugar, o corte de fundo MNase pode ocorrer e, embora haja um sinal de fundo consistentemente menor no CUT&RUN em relação a outros experimentos, o sinal de fundo pode ser alto em experimentos unicelulares e, portanto, controles e análises apropriados devem ser realizados. Enquanto a natureza binária dos dados de perfil unicelular limita a visualização, tecnologias genômicas computacionais mais avançadas, como a redução dimensional e outras podem ser realizadas (como descrito anteriormente27). Finalmente, embora o perfil unicelular tenha sido expandido aqui para o formato de 96 poços, este é um baixo rendimento em relação a outras tecnologias unicelulares que utilizam 10xGenomics ou outros formatos.
Tecnologias de perfil baseadas em tethering, como ChEC-seq20, CUT&Tag24, CUT&RUN21 e uliCUT&RUN23, podem determinar a localização de fatores na cromatina com uma linha do tempo experimental mais rápida, menor fundo e menor custo do que as tecnologias tradicionais de criação de perfil, como chip-seq. Portanto, são tecnologias muito interessantes para aplicação a amostras preciosas, como amostras de pacientes ou amostras de desenvolvimento precoce. Além disso, a aplicação em células únicas pode fornecer estudos complementares realizados usando outros experimentos unicelulares, como scRNA-seq e scATAC-seq30. Como descrito usando essas tecnologias unicelulares mais amplamente utilizadas, novas percepções podem ser obtidas em relação a experimentos de células em massa. Espera-se que o perfil de proteína unicelular na cromatina se torne mais regularmente utilizado à medida que as tecnologias continuam a melhorar e permitir mais paraleloização.
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Disclosures
Os autores declaram não haver interesses concorrentes relacionados a este projeto.
Acknowledgments
Agradecemos aos membros do Laboratório Hainer por lerem e comentarem uma versão anterior deste manuscrito. Este projeto utilizou o NextSeq500 disponível no Núcleo de Sequenciamento de Ciências da Saúde da Universidade de Pittsburgh no UPMC Children's Hospital of Pittsburgh para sequenciamento com agradecimentos especiais ao seu diretor, William MacDonald. Esta pesquisa foi apoiada em parte pelo Centro de Computação de Pesquisa da Universidade de Pittsburgh através dos recursos de computador fornecidos. Este trabalho foi apoiado pelo Número de Subvenção dos Institutos Nacionais de Saúde R35GM133732 (para S.J.H.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL clear microfuge tubes | ThermoFisher Scientific | 90410 | |
| 1.5 mL tube magnetic rack | ThermoFisher Scientific | 12321D | |
| 1.5 mL tube-compatible cold centrifuge | Eppendorf | 5404000537 | |
| 10 cm sterile tissue culture plates | ThermoFisher Scientific | 150464 | |
| 10X T4 DNA Ligase buffer | New England Biolabs | B0202S | |
| 15 mL conical tubes | VWR | 89039-656 | |
| 1X TE buffer | ThermoFisher Scientific | 12090015 | |
| 200 µL PCR tubes | Eppendorf | 951010022 | |
| 2X quick ligase buffer | New England Biolabs | M2200 | Ligase Buffer |
| 5X KAPA HiFi buffer | Roche | 7958889001 | 5X high fidelity PCR buffer |
| 7-Amino-Actinomycin D (7-AAD) | Fisher Scientific | BDB559925 | |
| 96-well magnetic rack | ThermoFisher Scientific | 12027 or 12331D | |
| 96-well plate | VWR | 82006-636 | |
| AMPure XP beads | Beckman Coulter | A63881 | polystyrene-magnetite beads; Due to potential variability between AMPure XP bead lots, it is recommended that your AMPure bead solution be calibrated. See manufacturer’s instructions |
| Antibody to protein of interest | varies | ||
| ATP | ThermoFisher Scientific | R0441 | |
| BioMag Plus Concanavalin A beads | Polysciences | 86057-10 | ConA-conjugated paramagnetic microspheres |
| BSA | |||
| Calcium Chloride (CaCl2) | Fisher Scientific | AAJ62905AP | |
| Cell sorter | BD FACSAria II cell sorter | Requires training | |
| Cell-specific media for cell culture | Varies | ||
| Chloroform | ThermoFisher Scientific | C298-500 | Chloroform is a skin irritant and harmful if swallowed; handle in a chemical fume hood using gloves, a lab coat, and goggles |
| Computer with 64-bit processer and access to a super computing cluster | For computational analyses of resulting sequencing datasets | ||
| DNA spin columns | Epoch Life Sciences | 1920-250 | |
| dNTP set | New England Biolabs | N0446S | |
| EGTA | Sigma Aldrich | E3889 | |
| Electrophoresis equipment | varies | ||
| Ethanol | Fisher Scientific | 22032601 | 100% vol/vol ethanol is highly flammable; handle in a chemical fume hood using gloves, a lab coat, and goggles |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Fisher Scientific | BP2482100 | |
| FBS | Sigma Aldrich | F2442 | |
| Glycerol | Fisher Scientific | BP229-1 | |
| Glycogen | VWR | 97063-256 | |
| HEPES | Fisher Scientific | BP310-500 | |
| Heterologous S. cerevisiae DNA spike-in | homemade | Prepared from crosslinked, MNase-digested, and agarose gel extracted genomic DNA purified of protein/RNA and diluted to 10 ng/mL. We recommend yeast genomic DNA, but other organisms can be used if needed. | |
| Hydrochloric Acid (HCl) | Fisher Scientific | A144-212 | Hydrochloric Acid is very corrosive; handle in a chemical fume hood using gloves, a lab coat, and goggles |
| Ice Bucket | varies | ||
| Illumina Sequencing platform (e.g., NextSeq500) | Illumina | ||
| Incubator with temperature and atmosphere control | ThermoFisher Scientific | 51030284 | |
| KAPA HotStart HiFi DNA Polymerase with 5X KAPA HiFi buffer | Roche | 7958889001 | hotstart high fidelity polymerase |
| Laminar flow hood | Bakery Company | SG404 | |
| Manganese Chloride (MnCl2) | Sigma Aldrich | 244589 | |
| Micropipette set | Rainin | 30386597 | |
| Minifuge | Benchmark Scientific | C1012 | |
| NEB Adaptor | New England Biolabs | E6612AVIAL | Adaptor |
| NEB Universal primer | New England Biolabs | E6611AVIAL | Universal Primer |
| NEBNext Multiplex Oligos for Illumina kit | New England Biolabs | E7335S/L, E7500S/L, E7710S/L, E7730S/L | Indexed Primers |
| Negative control antibody | Antibodies-Online | ABIN101961 | |
| Nuclease Free water | New England Biolabs | B1500S | |
| PCR thermocycler | Eppendorf | 2231000666 | |
| Phase lock tubes | Qiagen | 129046 | |
| Phenol/Chloroform/Isoamyl Alcohol (PCI) | ThermoFisher Scientific | 15593049 | Phenol is harmful if swallowed or upon skin contact; handle in a chemical fume hood using gloves, a lab coat, and goggles |
| Phsophate buffered saline (PBS) | ThermoFisher Scientific | 10814010 | |
| Pipette aid | Drummond Scientific | # 4-000-100 | |
| Polyethylene glycol (PEG) 4000 | VWR | A16151 | |
| Potassium Chloride (KCl) | Sigma Aldrich | P3911 | |
| Potassium Hydroxide (KOH) | Fisher Scientific | P250-1 | CAUTION KOH is an eye/skin irritant as a solid and corrosive in solution. Handle in a chemical fume hood using gloves, a lab coat, and goggles |
| Protease Inhibitors | ThermoFisher Scientific | 78430 | |
| ProteinA/G-MNase | Epicypher | 15-1016 | pA/G-MNase |
| ProteinA-MNase, purified from pK19pA-MN | Addgene | 86973 | |
| Proteinase K | New England Biolabs | P8107S | |
| Qubit 1X dsDNA HS Assay Kit | ThermoFisher Scientific | Q33230 | |
| Qubit Assay tubes | ThermoFisher Scientific | Q32856 | |
| Qubit Fluorometer | ThermoFisher Scientific | Q33238 | |
| Quick Ligase with 2X Quick Ligase buffer | New England Biolabs | M2200S | |
| RNase A | New England Biolabs | T3010 | |
| Sodium Acetate (NaOAc) | ThermoFisher Scientific | BP333-500 | |
| Sodium Chloride (NaCl) | Sigma Aldrich | S5150-1L | |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | ThermoFisher Scientific | BP166-500 | SDS is poisonous if inhaled; handle with care in well ventilated spaces using gloves, eye protection, and an N95-grade respirator when handling |
| Sodium Hydroxide (NaOH) | Fisher Scientific | S318-1 | NaOH is an eye/skin irritant as a solid and corrosive in solution. Handle in a chemical fume hood using gloves, a lab coat, and goggles |
| Spermidine | Sigma Aldrich | S2626 | |
| Standard Inverted Light Microscope | Leica | 11526213 | |
| Standard lab agarose gel materials | Varies | ||
| Standard lab materials such as serological pipettes and pipette tips | Varies | ||
| T4 DNA Ligase | New England Biolabs | M0202S | |
| T4 DNA Polymerase | New England Biolabs | M0203S | |
| T4 PNK | New England Biolabs | M0201S | |
| Tabletop vortexer | Fisher Scientific | 2215414 | |
| Taq DNA Polymerase | New England Biolabs | M0273S | |
| Thermomixer | Eppendorf | 5384000020 | Alternatively, can use a waterbath |
| Tris base | Fisher Scientific | BP152-5 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | 9002-93-1 | Triton X-100 is hazardous; use a lab coat, gloves, and goggles when handling |
| Trypsin | Fisher Scientific | MT25052 | |
| Tube rotator | VWR | 10136084 | |
| USER enzyme | New England Biolabs | M5505S |
References
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