Summary
CUT&RUN ve varyantları, kromatin üzerindeki protein doluluğunu belirlemek için kullanılabilir. Bu protokol, tek hücreli uliCUT&RUN kullanarak kromatin üzerindeki protein lokalizasyonunun nasıl belirleneceğini açıklar.
Abstract
Bir proteinin kromatin üzerindeki bağlanma yerlerinin belirlenmesi, işlevini ve potansiyel düzenleyici hedeflerini anlamak için gereklidir. Kromatin İmmünopresipitasyonu (ChIP), 30 yılı aşkın bir süredir protein lokalizasyonunu belirlemek için altın standart olmuştur ve ilgilenilen proteini sonikleştirilmiş veya enzimatik olarak sindirilmiş kromatinden çıkarmak için bir antikor kullanımı ile tanımlanmıştır. Daha yakın zamanlarda, antikor bağlama teknikleri, artan duyarlılıkları nedeniyle kromatin üzerindeki protein lokalizasyonunu değerlendirmek için popüler hale gelmiştir. Nükleaz Altında Hedefler Altında Bölünme ve Salınım (CUT&RUN), Kromatin İmmünoklevajının (ChIC) genom çapında türevidir ve ilgilenilen bir proteini hedefleyen antikorun IgG sabit bölgesini tanımlamak için mikrokokal nükleaza (pA-MNase) bağlı rekombinant Protein A'yı kullanır, bu nedenle ilgilenilen proteini çevreleyen DNA'nın bölgeye özgü bölünmesini sağlar. CUT&RUN, histon modifikasyonlarını, transkripsiyon faktörlerini ve nükleozom yeniden şekillendirme faktörleri gibi diğer kromatin bağlayıcı proteinleri profillemek için kullanılabilir. Daha da önemlisi, CUT&RUN, ökromatik veya heterokromatik ilişkili proteinlerin ve histon modifikasyonlarının lokalizasyonunu değerlendirmek için kullanılabilir. Bu nedenlerden dolayı, CUT&RUN çok çeşitli proteinlerin bağlanma profillerini belirlemek için güçlü bir yöntemdir. Son zamanlarda, CUT&RUN, düşük hücre popülasyonlarında ve tek hücrelerde transkripsiyon faktörü profillemesi için optimize edilmiştir ve optimize edilmiş protokol ultra düşük girişli CUT&RUN (uliCUT&RUN) olarak adlandırılmıştır. Burada, uliCUT & RUN kullanılarak manuel 96 kuyucuklu bir biçimde tek hücreli faktör profili oluşturma için ayrıntılı bir protokol sunulmaktadır.
Introduction
Birçok nükleer protein, DNA şablonlu aktiviteleri teşvik etmek veya önlemek için kromatin ile etkileşime girerek işlev görür. Bu kromatin etkileşiminde bulunan proteinlerin işlevini belirlemek için, bu proteinlerin bağlandığı genomik yerleri tanımlamak önemlidir. 1985 yılında geliştirilmesinden bu yana, Kromatin İmmünopresipitasyonu (ChIP), bir proteinin kromatin 1,2'ye nerede bağlandığını belirlemek için altın standart olmuştur. Geleneksel ChIP tekniği aşağıdaki temel iş akışına sahiptir: hücreler toplanır ve çapraz bağlanır (genellikle formaldehit ile), kromatin kesilir (genellikle çapraz bağlama gerektiren sert sonikasyon yöntemleriyle), ilgilenilen protein, proteini (veya etiketli proteini) hedef alan bir antikor kullanılarak immünopreprepite edilir, ardından ikincil bir antikor (agaroz veya manyetik boncuklara bağlanmış), çapraz bağlama tersine çevrilir, DNA'yı saflaştırmak için protein ve RNA sindirilir ve bu ChIP ile zenginleştirilmiş DNA, analiz için şablon olarak kullanılır (radyoetiketli problar1,2, qPCR3, mikrodiziler 5,6 veya dizileme4 kullanılarak). Mikrodizilerin ortaya çıkması ve büyük ölçüde paralel derin dizilemeyle birlikte, ChIP-çip 5,6 ve ChIP-seq4 daha yakın zamanda geliştirilmiştir ve kromatin üzerindeki protein lokalizasyonunun genom çapında tanımlanmasına izin vermektedir. ChIP'yi çapraz bağlamak, ChIP-exo7 ve ChIP-nexus8 tarafından çözünürlükte büyük ilerlemelerle ortaya çıkmasından bu yana güçlü ve güvenilir bir teknik olmuştur. ChIP-seq'in geliştirilmesine paralel olarak, geleneksel çapraz bağlama ChIP tekniklerinde gerçekleştirilen sonikasyonun aksine, kromatini parçalamak için nükleaz sindirimini (genellikle mikrokokal nükleaz veya MNaz kullanarak) kullanan ChIP (N-ChIP) için doğal (çapraz bağlanmayan) protokoller kurulmuştur9. Bununla birlikte, hem çapraz bağlanma ChIP hem de N-ChIP teknolojilerinin en büyük dezavantajlarından biri, deneysel manipülasyonu takiben düşük DNA verimi nedeniyle yüksek hücre sayılarına duyulan gereksinim olmuştur. Bu nedenle, son yıllarda, ChIP teknolojilerini düşük hücre girişi için optimize etmeye yönelik birçok çaba sarf edilmiştir. Bu çabalar, uygulanabilirlikleri ve girdi gereksinimleri10,11,12,13,14,15,16,17,18 olarak değişen birçok güçlü ChIP tabanlı teknolojinin geliştirilmesine neden olmuştur. Bununla birlikte, tek hücreli ChIP-seq tabanlı teknolojiler, özellikle histon olmayan proteinler için eksiktir.
2004 yılında, Kromatin Endojen Bölünme (ChEC) ve Kromatin İmmün Kemebölünme (ChIC)19 olarak adlandırılan kromatin üzerindeki protein doluluğunu belirlemek için alternatif bir teknoloji geliştirilmiştir. Bu tek lokus teknikleri, ilgilenilen proteine bitişik DNA'nın doğrudan kesilmesi için MNaz'ın ilgilenilen proteine (ChEC) veya protein A'ya (ChIC) füzyonunu kullanır. Daha yakın yıllarda, hem ChEC hem de ChIC, kromatin (sırasıyla ChEC-seq ve CUT&RUN) üzerinde genom çapında protein profillemesi için optimize edilmiştir 20,21. ChEC-seq, faktör lokalizasyonunu belirlemek için güçlü bir teknik olsa da, her hedef için MNaz-füzyon proteinlerinin geliştirilmesini gerektirirken, ChIC ve genom çapındaki varyasyonu CUT&RUN, ilgilenilen proteine (ChIP'de olduğu gibi) ve Protein A'nın antikorun IgG sabit bölgesini tanıyabildiği rekombinant Protein A-MNaz'a yönelik bir antikora güvenir. Alternatif olarak, daha geniş bir yelpazedeki antikor sabit bölgelerini tanıyabilen bir füzyon Protein A / Protein G-MNaz (pA / G-MNaz) geliştirilmiştir22. CUT&RUN, kromatin genomu genelinde protein lokalizasyonunu belirlemek için hızla ChIP-seq'e popüler bir alternatif haline gelmiştir.
Düşük ve tek hücreli girişlerin kullanılmasını sağlayan bir CUT&RUN varyasyonu olan ultra düşük girişli CUT&RUN (ULICUT&RUN), 201923 yılında açıklanmıştır. Burada, manuel 96 delikli formatta tek hücreli bir uygulamanın metodolojisi açıklanmaktadır. uliCUT&RUN'un geliştirilmesinden bu yana, histon profillemesi için iki alternatifin, CUT&Tag ve iACT-seq'in geliştirildiğini ve histon proteinlerinin sağlam ve oldukça paralel profillenmesini sağladığını belirtmek önemlidir24,25. Ayrıca, scCUT&Tag, tek bir hücrede (multiCUT&Tag) birden fazla faktörün profilini çıkarmak ve histon olmayan proteinlere uygulama için optimize edilmiştir26. Birlikte, CUT&RUN, uliCUT&RUN'un bir hücre ayıklayıcıya ve standart ekipmana erişimi olan herhangi bir moleküler biyoloji laboratuvarında gerçekleştirilebildiği düşük girişli ChIP-seq'e çekici bir alternatif sunar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Etik beyanı: Tüm çalışmalar Pittsburgh Üniversitesi Kurumsal Biyogüvenlik Araştırma Koruma Ofisi tarafından onaylanmıştır.
1. Manyetik boncuklar hazırlayın
NOT: Hücre sıralamadan önce gerçekleştirin ve kullanana kadar buz üzerinde tutun.
- Pipet 30 μL ConA-konjuge paramanyetik mikrosferler boncuk bulamaç karışımı taze 1,5 mL mikrofuge tüpe reaksiyon başına ve karıştırmak için hafifçe pipetleme yaparak 850 μL Bağlayıcı Tampon ekleyin.
NOT: KonA konjuge paramanyetik mikrosferler, lipit membranının bağlanmasına izin veren lektin kaplı manyetik boncuklardır. - Tüpü manyetik bir rafa yerleştirin ve boncukların 1-2 dakika boyunca mıknatıslanmasına izin verin. Süpernatant temizlendikten sonra, boncukları rahatsız etmeden süpernatantı çıkarın ve atın.
- Tüpü manyetik raftan çıkarın ve 1 mL Bağlayıcı Arabelleğe geri sarılarak boncukları yıkayın.
- 1.2 ve 1.3 numaralı adımları yineleyin.
- Boncukları 2 dakika boyunca manyetize edin ve atmak için süpernatantı çıkarın.
- Tüpü manyetik raftan çıkarın ve boncukları reaksiyon başına 30 μL Bağlayıcı Tamponda yeniden askıya alın.
- Yıkanmış boncuk karışımını hücreler sıralanana kadar buz üzerinde tutun.
2. Hasat hücreleri
NOT: Bu adım yapıştırılmış hücreler için yazılmıştır ve murin E14 embriyonik kök hücreleri için optimize edilmiştir. Hücrelerin kültürlenmesi ve toplanması hücre tipine bağlıdır.
- Hücreleri 37 °C inkübatörden çıkarın ve kaliteyi sağlamak için mikroskop altında inceleyin.
- Ortamı hücre plakasından aspire edin ve 5 mL 1x PBS ile durulayın.
- PBS'yi plakadan aspire edin ve hücreleri toplayın (hücre tipine göre farklılık gösterecek geleneksel hücre toplama yöntemlerini kullanarak). Gerekirse, kültür kabına karşı serolojik bir pipetle hafifçe yukarı ve aşağı pipetleyerek, tek hücreli süspansiyon elde edin.
- Hücre süspansiyonunu 15 mL'lik bir konik tüpe aktarın ve 5 dakika boyunca 200 x g'de aşağı doğru döndürün.
- Hücre peletini atmak ve yıkamak için medyayı 5 mL PBS +% 1 FBS ile aspire edin.
- Hücreleri 5 dakika boyunca 200 x g'de döndürün, süpernatanı atın ve hücre peletini 5 mL PBS +% 1 FBS'de yeniden askıya alın.
- Hücreleri sayın ve 1 mL'lik 1 x 106 hücreyi taze bir 1,5 mL mikrofüj tüpüne aktarın.
- 5 μL 7-Amino-Aktinomisin D (7-AAD) ekleyin, karıştırmak için tüpü iyice ters çevirin ve ardından canlı tek hücreleri 96 delikli bir plakanın ayrı deliklerine ayırmak için numuneyi hücre sıralayıcısına uygulayın.
NOT: 7-AAD boya canlı hücrelerden dışlanır ve bu nedenle canlı hücre sıralamada kullanılabilir.
3. Hücre sıralama ve lizis
- Hücre sıralamadan önce her bir kuyucukta 100 μL Nükleer Ekstraksiyon (NE) Tamponu bulunan hücre ayıklayıcı uyumlu 96 delikli bir plaka hazırlayın.
- Üreticinin talimatlarını izleyerek hücreleri 96 delikli plakalara ayırın.
- Hücrelerin kuyucuklar içindeki tamponda olduğundan emin olmak için plakayı (30 s için 600 x g) hızla döndürün.
NOT: Kullanılan hücrelerin kuyucukların dibine güvenilir bir şekilde getirilip getirilmediğini bir ön deneyde test etmeye değer. - Örnekleri 15 dakika boyunca buz üzerinde tutun.
- Numuneleri 4 °C'de 5 dakika boyunca 600 x g'de döndürün ve süpernatantı çıkarmak için dikkatlice pipet çekin (5 μL'yi geride bırakarak).
- Her numuneyi 55 μL NE tamponunda yeniden askıya alın ve her reaksiyona önceden yıkanmış ConA konjuge paramanyetik mikrosferlerin 30 μL'sini (adım 1.7'den; Bağlanma Tamponunda) ekleyin.
- Oda sıcaklığında 10 dakika boyunca inkübe edin.
4. MNase ile erken sindirimi önlemek için numuneleri önceden bloke edin
- Plakayı 96 delikli manyetik bir rafa yerleştirin, boncukların en az 5 dakika boyunca bağlanmasına izin verin ve ardından süpernatanı çıkarın ve atın.
- Çekirdeğe bağlı boncuklara 100 μL Bloke Edici Tampon ekleyin ve nazik pipetleme ile karıştırın.
- Oda sıcaklığında 5 dakika kuluçkaya yatırın.
5. Primer antikor ilavesi
- Plakayı 96 delikli manyetik bir rafa yerleştirin, süpernatantın en az 5 dakika boyunca temizlemesine izin verin ve ardından boncukları rahatsız etmeden süpernatantı çıkarın ve atın.
- Plakayı manyetik raftan çıkarın ve boncukları nazik pipetleme ile reaksiyon başına 100 μL Yıkama Tamponunda yeniden askıya alın.
- Plakayı 96 delikli manyetik rafa geri yerleştirin, süpernatantın temizlenmesine izin verin ve ardından süpernatanı çıkarın ve atın.
- Boncukları, nazik pipetleme ile reaksiyon başına 25 μL Yıkama Tamponunda yeniden askıya alın.
- Birincil antikor ana karışımı yapın: reaksiyon başına 25 μL Yıkama Tamponu + 0.5 μL antikor.
- Çekirdeğe bağlı boncukları nazikçe vortekslerken, ilgilenilen proteini hedefleyen bir antikor ile muamele edilen her numuneye birincil antikor ana karışımının 25 μL'sini ekleyin (tipik olarak 1:100 son seyreltme). Kontrol yapıyorsanız, antikor içermeyen 25 μL Yıkama Tamponu ekleyin.
- Oda sıcaklığında 1 saat inkübe edin.
- Numuneleri 96 delikli manyetik bir rafa yerleştirin, süpernatantın en az 5 dakika boyunca temizlemesine izin verin ve ardından boncukları rahatsız etmeden süpernatantı çıkarın ve atın.
- Plakayı manyetik raftan çıkarın ve boncukları pipetleme ile yeniden yayınlayarak 100 μL Yıkama Tamponu ile yıkayın.
6. pA-MNase veya pA/G-MNase ilavesi
NOT: Protein A, tavşanlar gibi belirli türlerden IgG molekülleri için yüksek bir afiniteye sahiptir, ancak fareler veya sıçanlar gibi diğer türlerden IgG'ler için uygun değildir. Alternatif olarak, Protein A / G-MNaz kullanılabilir. Bu melez, tavşan, fare ve sıçan IgG'lerini bağlar ve fare veya sıçan birincil antikorları kullanıldığında ikincil antikorlara ihtiyaç duyulmasını önler.
- Plakayı 96 delikli manyetik bir rafa geri yerleştirin, süpernatantın en az 5 dakika boyunca temizlemesine izin verin ve ardından boncukları rahatsız etmeden süpernatantı çıkarın ve atın.
- Plakayı manyetik raftan çıkarın ve her numuneyi 25 μL Yıkama Tamponunda yeniden askıya alın.
- Bir pA-MNase ana karışımı yapın (25 μL Yıkama Tamponu + reaksiyon başına optimize edilmiş pA-MNaz miktarı).
- Hafifçe girdap yaparken, kontrol numuneleri de dahil olmak üzere her numuneye 25 μL pA-MNase ana karışımı ekleyin.
NOT: pA-MNaz konsantrasyonu, ev yapımı ise hazırlığa göre değişir ve her bağımsız saflaştırmada kullanımdan önce test edilmelidir. pA/G-MNaz için 20x stoğun 2,5 μL'si kullanılmalıdır. - Numuneleri oda sıcaklığında 30 dakika boyunca inkübe edin.
- Plakayı 96 delikli manyetik bir rafa yerleştirin, süpernatantın en az 5 dakika boyunca temizlemesine izin verin ve ardından boncukları rahatsız etmeden süpernatantı çıkarın ve atın.
- Plakayı manyetik raftan çıkarın ve boncukları 100 μL Yıkama Tamponu ile yıkayın, nazik pipetleme ile yeniden askıya alın.
7. Yönlendirilmiş DNA sindirimi
- Plakayı 96 delikli bir manyetik rafa yerleştirin, süpernatantın en az 5 dakika boyunca temizlemesine izin verin ve ardından süpernatanı çıkarın ve atın.
- Numuneleri manyetik raftan çıkarın ve boncukları nazik pipetleme ile 50 μL Yıkama Tamponunda yeniden askıya alın.
- Numuneleri 5 dakika boyunca bir buz/su karışımında 0 °C'ye dengeleyin.
- Numuneleri 0 °C buz/su banyosundan çıkarın ve çok kanallı pipet kullanarak 1 μL 100 mM CaCl2 ekleyin. Daha büyük hacimli çok kanallı pipet kullanarak nazik pipetleme ile iyice karıştırın (3-5 kez) ve ardından numuneleri 0 °C'ye geri döndürün.
NOT: Burada iyice karıştırmak çok önemlidir. CaCl2 , ilgilenilen proteini çevreleyen DNA'nın MNaz sindirimini aktive etmek için eklenir. - Plaka buz / su banyosuna geri döner dönmez 10 dakikalık bir zamanlayıcı başlatın.
- CaCl 2 eklendiği sıraya göre her bir kuyucuğa 50 μL 2XRSTOP+ Buffer pipetleyerek reaksiyonu durdurun.
NOT: Aşırı sindirimi önlemek için 10 dakikalık sindirim bitmeden önce 2XRSTOP+ Buffer yapın.
8. Numune fraksiyonasyonu
- Numuneleri 37 °C'de 20 dakika boyunca inkübe edin.
- Plakayı 4 ° C'de 5 dakika boyunca 16.000 x g'de döndürün.
- Plakayı 96 delikli manyetik bir rafa yerleştirin, süpernatantın en az 5 dakika boyunca temizlemesine izin verin ve süpernatantları taze bir 96 delikli plakaya aktarın. Boncukları atın.
9. DNA ekstraksiyonu
- Her numuneye 1 μL %10 Sodyum Dodesil Sülfat (SDS) ve 0.83 μL 20 mg/mL Proteinaz K ekleyin.
DİKKAT: SDS tozu solunduğunda zararlıdır. Kullanıcılar iyi havalandırılan alanlarda gözlük, eldiven ve N95 sınıfı solunum cihazı takarak dikkatli bir şekilde kullanmalıdır. - Numuneleri nazik pipetleme ile karıştırın.
- Numuneleri 70 °C'de 10 dakika boyunca inkübe edin.
- Plakayı oda sıcaklığına geri döndürün ve 46,6 μL 5 M NaCl ve 90 μL %50 PEG 4000 ekleyin. Nazik pipetleme ile karıştırın.
- Her numuneye 33 μL polistiren-manyetit boncuk ekleyin ve oda sıcaklığında 10 dakika kuluçkaya yatırın.
NOT: Polistiren-manyetit boncukları oda sıcaklığına (~ 30 dakika) getirdiğinizden ve kullanmadan önce iyice karıştırdığınızdan emin olun. - Plakayı manyetik bir rafa yerleştirin ve süpernatantın ~ 5 dakika boyunca temizlemesine izin verin ve ardından boncukları rahatsız etmeden süpernatantı dikkatlice atın.
- Boncukları rahatsız etmeden 150 μL %80 etanol ile 2x durulayın.
DİKKAT: Etanol oldukça yanıcıdır ve cilt, göz ve akciğer tahrişine neden olur. Bu adımı uygun laboratuvar kıyafetleriyle ve havalandırmalı bir başlıkta gerçekleştirin. - Plakayı 30 s için 1000 x g'de kısaca döndürün. Plakayı 96 delikli manyetik rafa geri yerleştirin ve boncukları rahatsız etmeden kalan tüm EtOH'leri çıkarın.
- Numuneleri ~ 2-5 dakika boyunca hava ile kurulayın.
NOT: Boncukları 5 dakikadan daha uzun süre kurutmayın. EtOH'yi çıkarma konusunda gayretliyse, 2-3 dakika kurutma yeterlidir. - Boncukları 37,5 μL 10 mM Tris-HCl (pH 8) ile yeniden askıya alın ve oda sıcaklığında 5 dakika kuluçkaya yatırın.
- Plakayı manyetik bir rafa yerleştirin ve boncukların 5 dakika boyunca bağlanmasına izin verin.
- Süpernatantın 36,5 μL'sini taze bir termosikler uyumlu 96 delikli plakaya aktarın. Boncukları atın.
NOT: Deney, numuneler -20 °C'de depolanarak burada durdurulabilir veya kütüphane oluşturma işlemine devam edebilir (10-15. adımlar).
10. Son onarım, fosforilasyon, adenilasyon
NOT: Reaktifler, Malzeme Tablosunda belirtildiği gibi tedarik edilir. Aşağıdaki protokol, NEBNext Ultra DNA II kiti gibi ticari kitlere benzer bir yöntem izler.
- 5 U/μL T4 DNA polimeraz 1:20'yi 1x T4 DNA ligaz tamponunda seyreltin.
- Bir son onarım/3'A ana karışım hazırlayın: 2 μL 10x T4 DNA ligaz tamponu, 2,5 μL 10 mM dNTP, 1,25 μL 10 mM ATP, 3,13 μL %40 PEG 4000, 0,63 μL 10 U/μL T4 PNK, 0,5 μL seyreltilmiş T4 DNA polimeraz, 0,5 μL 5U/μL Taq DNA polimeraz, reaksiyon başına toplam hacmi 13,5 μL.
NOT: Pipetlemeden önce oda sıcaklığına %40 PEG 4000 getirdiğinizden emin olun. - 36,5 μL DNA'ya 13,5 μL son onarım/3'A ana karışım ekleyin.
- Reaksiyonu hızlı girdap ve ardından hızlı bir spin (10 s için 500 x g) ile karıştırın.
- >20 °C sıcaklıklar için ısıtılmış kapaklı önceden soğutulmuş bir termosikler'de aşağıdaki reaksiyon koşullarını kullanarak inkübe edin. Reaksiyon koşullarını kullanın: 15 dakika için 12 °C, 15 dakika için 37 °C, 20 dakika için 72 °C, 4 °C'de tutun.
11. Adaptör ligasyonu
NOT: Aşağıdaki reaksiyonu ayarlarken numuneleri buz üzerinde tutun. Pipetlemeden önce ligaz tamponunun oda sıcaklığına gelmesine izin verin. Adaptörü (bkz. Malzeme Tablosu) 10 mM NaCl (pH 7,5) içeren 10 mM Tris-HCl'lik bir çözelti içinde seyreltin. Düşük verim nedeniyle, CUT & RUN ile zenginleştirilmiş DNA'yı önceden ölçmeyin. Bunun yerine, 0,6 μM'lik son çalışma adaptörü konsantrasyonunu kullanarak adaptörün 25 kat seyreltilmesini sağlayın.
- Bir ligasyon ana karışımı yapın: 55 μL ligaz tamponu (2x), 5 μL T4 DNA ligaz ve 5 μL seyreltilmiş Adaptör, reaksiyon başına toplam 65 μL hacim.
- Ana ligasyon karışımının 65 μL'sini, adım 10.5'ten itibaren 50 μL DNA'ya ekleyin.
- Hızlı vorteksleme ile karıştırın, ardından hızlı eğirme (10 s için 500 x g).
- 15 dakika boyunca bir termosiklerde (ısıtılmış kapak olmadan) 20 ° C'de inkübe edin.
NOT: Hemen aşağıdaki adıma geçin.
12. KULLANICI sindirimi
- Her numuneye, girdaba ve spine 3 μL USER enzimi ekleyin (10 s için 500 x g).
- Termal bisikletçide 15 dakika boyunca 37 °C'de inkübe edin (ısıtmalı kapak 50 °C'ye ayarlanmıştır).
13. Ligasyon reaksiyonunu takiben polistiren-manyetit boncuk temizliği
NOT: Polistiren-manyetit boncukların oda sıcaklığında (~30 dakika) dengelenmesine izin verin. Kullanmadan önce boncuk çözeltisini homojenize etmek için vorteks. Aşağıdaki adımları oda sıcaklığında gerçekleştirin.
- Adaptör bağlı DNA içeren her bir kuyucuğa 39 μL (0.33x) polistiren-manyetit boncuk çözeltisi ekleyin.
- Pipetleme ile iyice karıştırın ve ardından DNA'nın boncuklara bağlanmasına izin vermek için numuneleri oda sıcaklığında 15 dakika boyunca inkübe edin.
- Numuneleri 96 delikli manyetik bir rafa yerleştirin ve süpernatant temizlenene kadar 5 dakika kuluçkaya yatırın.
- Plakayı manyetik rafta tutun ve boncukları rahatsız etmeden süpernatantı dikkatlice çıkarın ve atın.
- Boncukları rahatsız etmeden 200 μL% 80 EtOH ile durulayın.
- Çözümün temizlenmesini sağlamak için 96 delikli manyetik rafta 30 s boyunca inkübe edin.
- Boncukları rahatsız etmeden süpernatantı çıkarın ve atın.
- Toplam iki yıkama için 13,5-13,7 arasındaki adımları yineleyin.
- Plakayı 10 s boyunca 500 x g'de kısaca döndürün, plakayı 96 delikli bir manyetik rafa geri yerleştirin ve boncukları rahatsız etmeden artık EtOH'yi çıkarın.
- Plakayı manyetik rafta tutun ve numuneleri 2 dakika boyunca hava ile kurulayın.
NOT: Boncukları fazla kurutmayın. - Plakayı manyetik raftan çıkarın ve boncukları 10 mM Tris-HCl'nin (pH 8) 28,5 μL'sinde yeniden askıya alın.
DİKKAT: Hidroklorik asit çok aşındırıcıdır. Kullanıcılar gözlük, eldiven ve laboratuvar önlüğü giyen kimyasal bir duman başlığında dikkatli bir şekilde kullanmalıdır. - Boncukları pipetleyerek, kabarcık üretmemeye dikkat ederek iyice askıya alın.
- Oda sıcaklığında 5 dakika kuluçkaya yatırın.
- Plakayı 96 delikli manyetik bir rafa yerleştirin ve çözeltinin 5 dakika boyunca temizlenmesine izin verin.
- 27.5 μL süpernatantı yeni bir PCR plakasına aktarın ve boncukları atın.
14. Kütüphane zenginleştirme
NOT: Astarlar, adaptörle aynı çözelti ile seyreltilir. Bu kütüphane yapısı için, 0,6 μM'lik son bir çalışma astarı konsantrasyonu kullanın.
- Her numuneye 5 μL seyreltilmiş indeksli astar ekleyin (bkz.
NOT: Her numunenin sıralamadan sonra tanımlanması için farklı bir indekse ihtiyacı vardır. - Bir PCR ana karışımı hazırlayın: 10 μL 5x yüksek doğrulukta PCR tamponu, 1,5 μL 10 mM dNTP, 5 μL seyreltilmiş Universal astar, 1 μL 1 U sıcak başlatma yüksek doğrulukta polimeraz, numune başına toplam ana karışım hacmi 17,5 μL.
- 32.5 μL saflaştırılmış adaptör bağlı DNA'ya 17.5 μL pf PCR karışımı ekleyin (bu hacme 5 μL indekslenmiş primer dahil edilmiştir).
- Pipetleme ile çözeltiyi karıştırın.
- Maksimum rampa hızı 3 °C / s olan aşağıdaki reaksiyon koşullarını kullanarak bir termosikkerde inkübe edin: 45 s için 98 °C, 45 s için 98 °C, 10 s için 60 °C, ikinci ve üçüncü adımları 21 kez, 72 °C'yi 1 dakika boyunca tekrarlayın, 4 °C'de tutun.
NOT: Numuneler kısa süreli depolama için 4 °C'de veya uzun süreli depolama için -20 °C'de tutulabilir.
15. Polistiren-manyetit boncuk temizliği
- Her numuneye 60 μL (1,2x) polistiren-manyetit boncuk ekleyin.
- Boncukları pipetleyerek, yeniden askıya alın ve oda sıcaklığında 15 dakika kuluçkaya yatırın.
- Plakayı, çözelti temizlenene kadar 5 dakika boyunca manyetik bir rafa yerleştirin.
- Süpernatantı atın ve boncukları rahatsız etmeden 200 μL% 80 EtOH ile durulayın.
- Toplam iki adet %80 EtOH yıkama için yıkama adımını tekrarlayın.
- Plakayı 10 s boyunca 500 x g'de döndürün, plakayı 96 delikli bir manyetik rafa yerleştirin ve boncukların 5 dakika boyunca bağlanmasına izin verin.
- Boncukları rahatsız etmeden fazla EtOH'yi çıkarmak ve boncukların 2 dakika boyunca hava ile kurumasını sağlamak için pipet.
NOT: Boncukları fazla kurutmayın. - Boncukları 21 μL nükleaz içermeyen suda tekrar askıya alın ve oda sıcaklığında 5 dakika kuluçkaya yatırın.
- Plakayı manyetik bir rafa yerleştirin ve çözeltinin 5 dakika boyunca temizlenmesine izin verin.
- Süpernatantın 20 μL'sini yeni bir plakaya aktarın.
NOT: Deney, numune -20 °C'de saklanarak burada durdurulabilir. - 1x HS reaktifi kullanarak kütüphane konsantrasyonlarını bir florometre ile ölçün (bkz.
- Konsantrasyon izin veriyorsa, görselleştirmek için düşük moleküler ağırlıklı bir merdivenle% 1.5 agaroz jeli üzerinde 30 ng numune çalıştırın. Alternatif olarak, bir Parça Analizörü veya ilgili cihaz üzerinde görselleştirin.
- ~ 50.000-100.000 benzersiz şekilde eşlenmiş okuma elde etmek için bir Illumina platformunda kütüphaneleri sıralayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Burada, 96 kuyucuklu manuel bir format uliCUT & RUN kullanılarak kromatin üzerinde tek hücreli protein profillemesi için ayrıntılı bir protokol sunulmaktadır. Sonuçlar, profillenen proteine (protein bolluğu ve antikor kalitesi nedeniyle), hücre tipine ve diğer katkıda bulunan faktörlere bağlı olarak değişmekle birlikte, bu teknik için beklenen sonuçlar burada tartışılmaktadır. Hücre kalitesi (hücre görünümü ve canlı hücrelerin yüzdesi) ve tek hücreli sıralama, NE tamponuna canlı hücre ayıklamasından önce veya bu sırada değerlendirilmelidir. ES hücre kolonileri ve hücre sıralama örnekleri Şekil 2A,B'de gösterilmiştir. Spesifik olarak, düşük kaliteli hücreler kullanılmamalıdır ve kalite bir sorunsa, spesifik hücre tipi için yönergeleri izlemeye özen gösterilmelidir. Ek olarak, hücre sıralama cihazı tarafından doğru hücre sıralama, deneyden önce değerlendirilmelidir. Örneğin, test hücreleri Hoechst 33342 boyası kullanılarak sıralanabilir ve boyanabilir ve her bir kuyucukta 0 veya 1 hücrenin bulunduğundan emin olmak için sayılabilir. Tek hücreler bulunamazsa, sıralama koşulları optimize edilmelidir. Kütüphane hazırlandıktan sonra, örnekler dizilemeden önce bir agaroz jeli (konsantrasyon bir agaroz jeli üzerinde DNA görselleştirme için daha düşük bir sınır olduğu için 30 ng veya daha fazla yüklemeye izin veriyorsa) veya bir Fragman Analizörü (veya bir Tapestation veya Bioanalyzer gibi benzer bir cihaz) üzerinde değerlendirilebilir ve örnek sonuçlar Şekil 2C'de gösterilmiştir. D. Özellikle, beklenen boyut dağılımı ~ 150 ila ~ 500 bp arasındadır. Daha yüksek hücre miktarlarında, büyük proteinler (histonlar gibi) üzerinde gerçekleştirilen CUT & RUN, DNA'nın çoğunluğunun ~ 270 bp görüleceği sağ taraflı bir boyut dağılımına sahip olacaktır; Bununla birlikte, bu omuz tipik olarak tek hücreli deneylerde gözlenmez.
Sıralamadan sonra, sıralama okumalarının kalitesi FASTQC kullanılarak değerlendirilmelidir. Benzersiz eşleme okumalarının yüzdesi belirlenmelidir. Tipik olarak, tek hücreli deneylerde% 0.5 -% 10 benzersiz eşleme okumaları gözlenir. Bu haritalama yüzdeleri, diğer DNA tabanlı tek hücreli tekniklerebenzerdir 30. Daha sonra, profilin ön sıralamaya benzer olduğundan emin olmak için eşlemeden sonra okumaların boyut dağılımı belirlenmelidir (bağdaştırıcı dizisi artık okuma boyutlarına katkıda bulunmaz).
Veri kalitesi değerlendirildikten sonra, protein doluluğu çeşitli yöntemler kullanılarak görselleştirilebilir: tek lokus genom tarayıcı görüntüleri UCSC genom tarayıcısı veya IGV (Şekil 3A) kullanılarak görselleştirilebilir ve belirli genomik koordinatlar üzerindeki genom çapında doluluk kalıpları metaplotlar (Şekil 3B, alt), ısı haritaları (Şekil 3B, üst) veya 1D ısı haritaları (Şekil 3C) kullanılarak görselleştirilebilir. Veri analizi hakkında daha fazla bilgi için, Patty ve Hainer27 tarafından yapılan çalışmaya bakın. Bir diploid hücreden gelen tek hücreli veriler, her lokusa katkıda bulunan dört okumaya kadar (hücre mitozdaysa dört okuma) ile sonuçlanır, ancak daha sık bir veya iki okuma. Bu nedenle, veriler ikilidir ve yüksek bir arka plan, yüksek hücre deneylerine kıyasla doluluk ile daha kolay karıştırılabilir. Bu nedenle, mümkünse, ilgilenilen protein için olası tüm bağlanma konumlarını elde etmek için yüksek hücre sayısı (5.000 ila 100.000 hücre) üzerinde paralel bir CUT&RUN deneyi yapılması önerilir. Ardından, tek hücreli veriler olası bağlama konumlarıyla karşılaştırılabilir. Şekil 3'te gösterilen örneklerde, tek hücreli CTCF uliCUT&RUN sonuçları yüksek hücreli CTCF uliCUT&RUN (Şekil 3A) veya ChIP-seq (Şekil 3B,C) ile karşılaştırılmıştır. Daha önce gösterildiği gibi, CTCF, SOX2 ve NANOG tek hücreli uliCUT & RUN zirveleri büyük ölçüde yüksek hücreli ChIP-seq veri kümelerinden daha güçlü zirveleri temsil ediyordu23.
Şekil 1: uliCUT&RUN protokolünün şeması. Hücreler toplanır ve NE tamponu içeren 96 delikli bir plakaya ayrılır. Bireysel çekirdekler daha sonra ConA-konjuge paramanyetik mikrosferlere bağlanır ve sırayla bir antikor (ilgilenilen proteini hedefleyen) ve pA-MNaz veya pA / G-MNaz eklenir. Proteine bitişik DNA MNaz yoluyla bölünür ve DNA daha sonra kütüphane hazırlığında kullanılmak üzere saflaştırılır. Bu figür Biorender.com ile yaratılmıştır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: uliCUT&RUN kütüphanelerinin hücre sıralaması ve kalite kontrolünden elde edilen örnek sonuçlar . (A) Yüksek kaliteli murin embriyonik kök (ES) hücrelerinin görüntüsü. Ölçek çubuğu: 200 μm. (B) Hasat edilen ES hücrelerine 7AAD eklendikten ve bir FACS cihazında sıralandıktan sonra tek hücreli sıralamadan elde edilen çıktı. (C) Tamamlanmış uliCUT&RUN kütüphanelerini tasvir eden Ethidium bromür lekeli agaroz jeli. Şerit 1, düşük moleküler ağırlıklı bir merdivendir ve 2-21 arası şeritler, sıralamadan önce başarılı bireysel tek hücreli uliCUT & RUN kütüphanelerinin örnekleridir. (D) Ethidium bromür lekeli agaroz jeli, optimal olmayan ve optimal tamamlanmış uliCUT & RUN kütüphanelerini tasvir eder. Şerit 1 düşük moleküler ağırlıklı bir merdivendir, şerit 2 verimsiz MNase sindirimi nedeniyle optimal olmayan bir kütüphanedir ve şerit 3 uygun sindirime sahip başarılı bir kütüphanedir. (E) Sıralamadan önce tek bir hücreli uliCUT&RUN kütüphanesinin parça analizörü dağıtımı. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Tek ES hücresi uliCUT&RUN verileri için beklenen sonuçlara örnek. (A) Yüksek hücre sayısı (5.000 hücre) CTCF veya negatif kontrol (Antikor Yok, Ab Yok) uliCUT & RUN (ilk iki parça) ve tek hücreli CTCF uliCUT & RUN tarayıcı izi. Görüntü, Patty ve Hainer27'den izin alınarak çoğaltılmıştır. (B) Daha önce yayınlanmış CTCF ChIP-seq siteleri (GSE11724) üzerinde tek hücreli CTCF veya negatif kontrol (No Ab) uliCUT & RUN'ın ısı haritaları (üstte) ve metaplotları (altta). Görüntü, Hainer ve ark.23'ün izniyle çoğaltılmıştır. (C) Daha önce yayınlanmış CTCF ChIP-seq siteleri (GSE11724) üzerinde tek hücreli CTCF veya negatif kontrol (No Ab) uliCUT & RUN'ın 1D ısı haritaları. Görüntü, Hainer ve ark.23'ün izniyle çoğaltılmıştır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Tablo 1: Bu protokolde kullanılan çeşitli tamponların bileşimi. Gerekli stok çözeltisinin hacmi, parantez içinde son konsantrasyon yazılı olarak listelenir. Bu tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
CUT&RUN, kromatin üzerindeki protein lokalizasyonunu belirlemek için etkili bir protokoldür. Diğer protokollere göre birçok avantajı vardır: 1) yüksek sinyal-gürültü oranı, 2) hızlı protokol ve 3) düşük sıralama okuma kapsamı gerekli ve böylece maliyet tasarrufuna yol açar. Protein A- veya Protein A/G-MNaz kullanımı, CUT&RUN'un mevcut herhangi bir antikor ile uygulanmasını sağlar; bu nedenle, birçok proteinin profilini hızlı ve kolay bir şekilde çıkarma potansiyeline sahiptir. Bununla birlikte, kromatin üzerindeki herhangi bir protein profillemesi için tek hücreye adaptasyon, özellikle tek hücreli transkriptomiklerle (yani, scRNA-seq) karşılaştırıldığında, RNA'ya göre DNA'nın düşük kopya sayısı nedeniyle (DNA'nın iki ila dört kopyasına karşı olası binlerce RNA kopyası) zor olmuştur.
Yukarıda detaylandırılan protokolde, birkaç kritik adım göz önünde bulundurulmalıdır. İlk olarak, hücrelerin uygun şekilde sıralanması hücre (veya doku) tipine bağlıdır ve doğru sıralama için özen gösterilmelidir. Tek hücreli sıralamanın herhangi bir deneyden önce cihazla ne kadar etkili olduğunu test etmeniz önerilir. İkincisi, etkili antikor seçimi esastır. Tek hücreli bir uygulamaya geçmeden önce, antikorun yüksek hücre sayısı deneyinde test edilmesi önerilir (ayrıca nakavttan sonra batı lekesi kullanarak özgüllüğü doğrulamak, CUT&RUN deneylerinde antikorun titrasyonunu vb. gibi diğer standart antikor testlerinin yanı sıra). Üçüncüsü, IgG gibi negatif bir kontrol kullanın veya birincil antikor kullanmayın, çünkü veri kalitesinin ve biyolojik sonuçların yorumlanması için deneysel örneklerle uygun bir karşılaştırma şarttır. Tek hücreli deneysel sonuçları yüksek hücre sayısı veri kümesiyle karşılaştırırken, negatif kontrollü tek hücreli deneyler, yüksek hücreli deneyde tanımlanan bağlanma bölgeleri üzerinde daha az okuma kapsamına sahip olmalı ve bunun yerine genom boyunca rastgele bir okuma dağılımına sahip olmalıdır (kromatinin açık bölgeleri için bir önyargı ile). Dördüncüsü, kromatini fazla sindirmemek için Protein A veya Protein A / G-MNaz eklenirken ve aktive edilirken dikkatli olunmalıdır: numuneleri ellerinizle aşırı ısıtmayın, numuneleri buz / su banyosu sıcaklığında (0 ° C) tutun ve reaksiyonu uygun zamanda şelatlayın. Beşinci olarak, düşük malzeme nedeniyle uliCUT&RUN deneyi ve kütüphane hazırlığı boyunca dikkatli olunmalıdır. Örneğin, süpernatantın temizlendiğinden emin olmak için boncuk bağlama sırasında manyetik rafta uzun süreli inkübasyon ve süpernatantı çıkarırken boncukları rahatsız etmemeye özen göstermek yeterli verim için gereklidir. Altıncısı, ele alınan sorulara bağlı olarak, gerçekleştirilen tek hücreli deneylerin sayısı önemli bir husustur. Tek hücreli deneylerin bazıları başarısız olacaktır (tüm düşük girdili deneylerde olduğu gibi) ve bu nedenle, uygun yorumlama için gereken pozitif deney sonuçlarının sayısı, deneye başlamadan önce dikkate alınmalıdır. Deneye dahil edilecek hücre sayısı, araştırmacının ihtiyaç duyduğu deneysel veri miktarına ve antikorun kalitesine bağlıdır. Son olarak, bu protokolün birçok yönünün hacminin azaltılmasıyla eşdeğer sonuçların elde edilebileceğini unutmayın. Hacmin% 50 oranında azaltıldığı adımlar arasında NE tamponunun hacmi, yıkama tamponu, birincil antikor karışımı (birincil antikor miktarı dahil), pA-MNaz karışımı (pA-MNaz miktarı dahil) ve kütüphane hazırlığındaki tüm adımlar bulunur.
Kromatin üzerindeki faktör profillemenin karmaşık doğasına dayanarak, sorun gidermenin gerekli olabileceği birçok potansiyel sorun kaynağı ve yer vardır. Sorunların ortaya çıkabileceği birçok adım olsa da, üç ana sorun gözlemlenmiştir: 1) kütüphane yapısına girdi için düşük DNA verimi; 2) deneysel örneklerde yüksek arka plan sinyali ve 3) kütüphane oluşturulduktan sonra düşük verim. Kütüphane hazırlama ve dizileme için yeterli DNA yoksa (nokta 1), aşağıdaki sorun giderme tavsiyelerine dikkat edin: a) tamamlanmamış membran lizisi olmuş olabilir ve bu nedenle NE tamponu ile lizis süresi arttırılabilir; b) Çekirdeğin ConA-konjuge paramanyetik mikrosferlere verimsiz bağlanması olabilir ve bu, bu boncukların eklenmesi üzerine uygun karıştırma yoluyla düzeltilebilir; c) Çok az antikor eklenmiş olabilir ve bu nedenle en etkili miktarı belirlemek için bir antikor titrasyonu yapılması önerilir; d) Birincil antikor veya Protein A- veya Protein A/G-MNaz ile inkübasyon süreleri ya çok kısadır (yani, bağlanmaya izin vermek için yeterli zaman yoktur) ya da çok uzundur (bunlar yerli, çapraz bağlanmamış numunelerdir) ve optimize edilebilir; e) Hedef proteinin kromatin ile etkileşimi, doğal koşullarda yakalanamayacak kadar geçici olabilir ve bu nedenle çapraz bağlama CUT&RUN gerçekleştirilebilir28. Tek hücreli veri kümeleri yüksek arka plan verirken, sinyalin arka plandan yorumlanmasının zor olduğu aşırı yüksek arka plan olabilir (nokta 2). Bu sorun için, aşağıdaki tavsiyelere dikkat edin: a) önleyici MNaz sindirimini önlemek için EDTA ile engelleme adımı arttırılabilir veya optimize edilebilir; b) Aşırı kesim varsa, bunun nedeni çok fazla Protein A- veya Protein A/G-MNaz olması olabilir ve bu nedenle uygun miktarlarda bir titrasyon yapılabilir; c) MNaz tarafından aşırı sindirim, yüksek arka plana neden olabilir ve bu nedenle MNaz sindirim süresi için ilave ve optimizasyon üzerine kalsiyum klorürün uygun şekilde karıştırılması değerlendirilmelidir. Son olarak, verimli uliCUT & RUN ile zenginleştirilmiş DNA geri kazanılmış olabilir, ancak düşük miktarda kütüphane geri kazanılabilir (nokta 3). Bu sorun için, aşağıdakiler önerilir: a) doğru saflaştırmayı ve DNA kaybı olmamasını sağlamak için polistiren-manyetit boncukların uygun şekilde kullanılması ve kullanılması; özellikle, kaybı önlemek için boncukları manyetize etmek için 15 dakikalık inkübasyonlara ve en az 5 dakikaya sahip olmanız önerilir; b) PCR aşamasında kütüphanenin yetersiz amplifikasyonu düşük verime neden olur ve bu nedenle qPCR kullanılarak uygun döngüler belirlenmelidir (daha önce ATAC-seq kütüphaneleri için kurulduğu gibi29).
Tüm teknolojilerde olduğu gibi, uliCUT&RUN için de herhangi bir denemeye başlamadan önce göz önünde bulundurulması gereken sınırlamalar vardır. İlk olarak, bu deneyler doğal koşullar için tasarlanmış ve optimize edilmiştir ve bu nedenle bir protein kromatin ile sadece geçici olarak etkileşime giriyorsa, etkileşimin iyileşmesini sağlamak için çapraz bağlama yaklaşımı gerekli olabilir. İkincisi, tüm antikor bazlı tekniklerde olduğu gibi, antikorun kalitesi önemlidir. Herhangi bir deney yapmadan önce antikorun kalitesini ve tutarlılığını sağlamak için özen gösterilmelidir. Üçüncüsü, MNase arka plan kesimi meydana gelebilir ve CUT&RUN'da diğer deneylere göre sürekli olarak daha düşük bir arka plan sinyali olsa da, arka plan sinyali tek hücreli deneylerde yüksek olabilir ve bu nedenle uygun kontroller ve analizler yapılmalıdır. Tek hücreli profil oluşturma verilerinin ikili doğası görselleştirmeyi sınırlarken, boyutsal indirgeme ve diğerleri gibi daha gelişmiş hesaplamalı genomik teknolojiler gerçekleştirilebilir (daha önce açıklandığı gibi27). Son olarak, tek hücreli profil oluşturma burada 96 kuyucuklu biçime genişletilirken, bu, 10xGenomics veya diğer formatları kullanan diğer tek hücreli teknolojilere göre düşük verimdir.
ChEC-seq 20, CUT&Tag24, CUT&RUN21 ve uliCUT&RUN23 gibi Tethering tabanlı profil oluşturma teknolojileri, ChIP-seq gibi geleneksel profil oluşturma teknolojilerinden daha hızlı bir deneysel zaman çizelgesi, daha düşük arka plan ve daha düşük maliyetle kromatin üzerindeki faktör lokalizasyonunu belirleyebilir. Bu nedenle, bunlar hasta örnekleri veya erken gelişimsel örnekler gibi değerli örneklere uygulama için çok heyecan verici teknolojilerdir. Ayrıca, tek hücrelere uygulama, scRNA-seq ve scATAC-seq30 gibi diğer tek hücreli deneyler kullanılarak yapılan tamamlayıcı çalışmalar sağlayabilir. Daha yaygın olarak kullanılan bu tek hücreli teknolojiler kullanılarak açıklandığı gibi, toplu hücre deneylerine göre yeni bilgiler elde edilebilir. Kromatin üzerindeki tek hücreli protein profillemenin, teknolojiler gelişmeye devam ettikçe ve daha fazla paralelleşmeye izin verdikçe daha düzenli olarak kullanılması beklenmektedir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar bu projeyle ilgili hiçbir rakip çıkar beyan etmemektedir.
Acknowledgments
Hainer Lab üyelerine bu makalenin önceki bir versiyonunu okudukları ve yorumladıkları için teşekkür ederiz. Bu proje, Pittsburgh Üniversitesi Sağlık Bilimleri Sıralama Çekirdeği'nde bulunan NextSeq500'ü, Pittsburgh Çocuk Hastanesi'ndeki UPMC Çocuk Hastanesi'nde, direktörü William MacDonald'a özel teşekkürlerle sıralamak için kullandı. Bu araştırma kısmen Pittsburgh Üniversitesi Araştırma Hesaplama Merkezi tarafından sağlanan bilgisayar kaynakları aracılığıyla desteklenmiştir. Bu çalışma Ulusal Sağlık Enstitüleri Hibe Numarası R35GM133732 (S.J.H.'ye) tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL clear microfuge tubes | ThermoFisher Scientific | 90410 | |
| 1.5 mL tube magnetic rack | ThermoFisher Scientific | 12321D | |
| 1.5 mL tube-compatible cold centrifuge | Eppendorf | 5404000537 | |
| 10 cm sterile tissue culture plates | ThermoFisher Scientific | 150464 | |
| 10X T4 DNA Ligase buffer | New England Biolabs | B0202S | |
| 15 mL conical tubes | VWR | 89039-656 | |
| 1X TE buffer | ThermoFisher Scientific | 12090015 | |
| 200 µL PCR tubes | Eppendorf | 951010022 | |
| 2X quick ligase buffer | New England Biolabs | M2200 | Ligase Buffer |
| 5X KAPA HiFi buffer | Roche | 7958889001 | 5X high fidelity PCR buffer |
| 7-Amino-Actinomycin D (7-AAD) | Fisher Scientific | BDB559925 | |
| 96-well magnetic rack | ThermoFisher Scientific | 12027 or 12331D | |
| 96-well plate | VWR | 82006-636 | |
| AMPure XP beads | Beckman Coulter | A63881 | polystyrene-magnetite beads; Due to potential variability between AMPure XP bead lots, it is recommended that your AMPure bead solution be calibrated. See manufacturer’s instructions |
| Antibody to protein of interest | varies | ||
| ATP | ThermoFisher Scientific | R0441 | |
| BioMag Plus Concanavalin A beads | Polysciences | 86057-10 | ConA-conjugated paramagnetic microspheres |
| BSA | |||
| Calcium Chloride (CaCl2) | Fisher Scientific | AAJ62905AP | |
| Cell sorter | BD FACSAria II cell sorter | Requires training | |
| Cell-specific media for cell culture | Varies | ||
| Chloroform | ThermoFisher Scientific | C298-500 | Chloroform is a skin irritant and harmful if swallowed; handle in a chemical fume hood using gloves, a lab coat, and goggles |
| Computer with 64-bit processer and access to a super computing cluster | For computational analyses of resulting sequencing datasets | ||
| DNA spin columns | Epoch Life Sciences | 1920-250 | |
| dNTP set | New England Biolabs | N0446S | |
| EGTA | Sigma Aldrich | E3889 | |
| Electrophoresis equipment | varies | ||
| Ethanol | Fisher Scientific | 22032601 | 100% vol/vol ethanol is highly flammable; handle in a chemical fume hood using gloves, a lab coat, and goggles |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Fisher Scientific | BP2482100 | |
| FBS | Sigma Aldrich | F2442 | |
| Glycerol | Fisher Scientific | BP229-1 | |
| Glycogen | VWR | 97063-256 | |
| HEPES | Fisher Scientific | BP310-500 | |
| Heterologous S. cerevisiae DNA spike-in | homemade | Prepared from crosslinked, MNase-digested, and agarose gel extracted genomic DNA purified of protein/RNA and diluted to 10 ng/mL. We recommend yeast genomic DNA, but other organisms can be used if needed. | |
| Hydrochloric Acid (HCl) | Fisher Scientific | A144-212 | Hydrochloric Acid is very corrosive; handle in a chemical fume hood using gloves, a lab coat, and goggles |
| Ice Bucket | varies | ||
| Illumina Sequencing platform (e.g., NextSeq500) | Illumina | ||
| Incubator with temperature and atmosphere control | ThermoFisher Scientific | 51030284 | |
| KAPA HotStart HiFi DNA Polymerase with 5X KAPA HiFi buffer | Roche | 7958889001 | hotstart high fidelity polymerase |
| Laminar flow hood | Bakery Company | SG404 | |
| Manganese Chloride (MnCl2) | Sigma Aldrich | 244589 | |
| Micropipette set | Rainin | 30386597 | |
| Minifuge | Benchmark Scientific | C1012 | |
| NEB Adaptor | New England Biolabs | E6612AVIAL | Adaptor |
| NEB Universal primer | New England Biolabs | E6611AVIAL | Universal Primer |
| NEBNext Multiplex Oligos for Illumina kit | New England Biolabs | E7335S/L, E7500S/L, E7710S/L, E7730S/L | Indexed Primers |
| Negative control antibody | Antibodies-Online | ABIN101961 | |
| Nuclease Free water | New England Biolabs | B1500S | |
| PCR thermocycler | Eppendorf | 2231000666 | |
| Phase lock tubes | Qiagen | 129046 | |
| Phenol/Chloroform/Isoamyl Alcohol (PCI) | ThermoFisher Scientific | 15593049 | Phenol is harmful if swallowed or upon skin contact; handle in a chemical fume hood using gloves, a lab coat, and goggles |
| Phsophate buffered saline (PBS) | ThermoFisher Scientific | 10814010 | |
| Pipette aid | Drummond Scientific | # 4-000-100 | |
| Polyethylene glycol (PEG) 4000 | VWR | A16151 | |
| Potassium Chloride (KCl) | Sigma Aldrich | P3911 | |
| Potassium Hydroxide (KOH) | Fisher Scientific | P250-1 | CAUTION KOH is an eye/skin irritant as a solid and corrosive in solution. Handle in a chemical fume hood using gloves, a lab coat, and goggles |
| Protease Inhibitors | ThermoFisher Scientific | 78430 | |
| ProteinA/G-MNase | Epicypher | 15-1016 | pA/G-MNase |
| ProteinA-MNase, purified from pK19pA-MN | Addgene | 86973 | |
| Proteinase K | New England Biolabs | P8107S | |
| Qubit 1X dsDNA HS Assay Kit | ThermoFisher Scientific | Q33230 | |
| Qubit Assay tubes | ThermoFisher Scientific | Q32856 | |
| Qubit Fluorometer | ThermoFisher Scientific | Q33238 | |
| Quick Ligase with 2X Quick Ligase buffer | New England Biolabs | M2200S | |
| RNase A | New England Biolabs | T3010 | |
| Sodium Acetate (NaOAc) | ThermoFisher Scientific | BP333-500 | |
| Sodium Chloride (NaCl) | Sigma Aldrich | S5150-1L | |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | ThermoFisher Scientific | BP166-500 | SDS is poisonous if inhaled; handle with care in well ventilated spaces using gloves, eye protection, and an N95-grade respirator when handling |
| Sodium Hydroxide (NaOH) | Fisher Scientific | S318-1 | NaOH is an eye/skin irritant as a solid and corrosive in solution. Handle in a chemical fume hood using gloves, a lab coat, and goggles |
| Spermidine | Sigma Aldrich | S2626 | |
| Standard Inverted Light Microscope | Leica | 11526213 | |
| Standard lab agarose gel materials | Varies | ||
| Standard lab materials such as serological pipettes and pipette tips | Varies | ||
| T4 DNA Ligase | New England Biolabs | M0202S | |
| T4 DNA Polymerase | New England Biolabs | M0203S | |
| T4 PNK | New England Biolabs | M0201S | |
| Tabletop vortexer | Fisher Scientific | 2215414 | |
| Taq DNA Polymerase | New England Biolabs | M0273S | |
| Thermomixer | Eppendorf | 5384000020 | Alternatively, can use a waterbath |
| Tris base | Fisher Scientific | BP152-5 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | 9002-93-1 | Triton X-100 is hazardous; use a lab coat, gloves, and goggles when handling |
| Trypsin | Fisher Scientific | MT25052 | |
| Tube rotator | VWR | 10136084 | |
| USER enzyme | New England Biolabs | M5505S |
References
- Gilmour, D. S., Lis, J. T. In vivo interactions of RNA polymerase II with genes of Drosophila melanogaster. Molecular and Cellular Biology. 5 (8), 2009-2018 (1985).
- Solomon, M. J., Varshavsky, A. Formaldehyde-mediated DNA-protein crosslinking: a probe for in vivo chromatin structures. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 82 (19), 6470-6474 (1985).
- Irvine, R. A., Lin, I. G., Hsieh, C. -L. DNA methylation has a local effect on transcription and histone acetylation. Molecular and Cellular Biology. 22 (19), 6689-6696 (2002).
- Albert, I., et al. Translational and rotational settings of H2A.Z nucleosomes across the Saccharomyces cerevisiae genome. Nature. 446 (7135), 572-576 (2007).
- Blat, Y., Kleckner, N. Cohesins bind to preferential sites along yeast chromosome III, with differential regulation along arms versus the centric region. Cell. 98 (2), 249-259 (1999).
- Ren, B., et al. Genome-wide location and function of DNA binding proteins. Science. 290 (5500), 2306-2309 (2000).
- Rhee, H. S., Pugh, B. F. Comprehensive genome-wide protein-DNA interactions detected at single-nucleotide resolution. Cell. 147 (6), 1408-1419 (2011).
- He, Q., Johnston, J., Zeitlinger, J. ChIP-nexus enables improved detection of in vivo transcription factor binding footprints. Nature Biotechnology. 33 (4), 395-401 (2015).
- O'Neill, L. P., Turner, B. M.
- Schmidl, C., Rendeiro, A. F., Sheffield, N. C., Bock, C. ChIPmentation: fast, robust, low-input ChIP-seq for histones and transcription factors. Nature Methods. 12 (10), 963-965 (2015).
- Cao, Z., Chen, C., He, B., Tan, K., Lu, C. A microfluidic device for epigenomic profiling using 100 cells. Nature Methods. 12 (10), 959-962 (2015).
- Shankaranarayanan, P., et al. Single-tube linear DNA amplification (LinDA) for robust ChIP-seq. Nature Methods. 8 (7), 565-567 (2011).
- Rotem, A., et al. Single-cell ChIP-seq reveals cell subpopulations defined by chromatin state. Nature Biotechnology. 33 (11), 1165-1172 (2015).
- Grosselin, K., et al. High-throughput single-cell ChIP-seq identifies heterogeneity of chromatin states in breast cancer. Nature Genetics. 51 (6), 1060-1066 (2019).
- Adli, M., Bernstein, B. E. Whole-genome chromatin profiling from limited numbers of cells using nano-ChIP-seq. Nature Protocols. 6 (10), 1656-1668 (2011).
- Zwart, W., et al. A carrier-assisted ChIP-seq method for estrogen receptor-chromatin interactions from breast cancer core needle biopsy samples. BMC Genomics. 14, 232 (2013).
- Valensisi, C., Liao, J. L., Andrus, C., Battle, S. L., Hawkins, R. D. cChIP-seq: a robust small-scale method for investigation of histone modifications. BMC Genomics. 16, 1083 (2015).
- Brind'Amour, J., et al. An ultra-low-input native ChIP-seq protocol for genome-wide profiling of rare cell populations. Nature Communications. 6, 6033 (2015).
- Schmid, M., Durussel, T., Laemmli, U. K. C. hI. C. ChlC and ChEC; genomic mapping of chromatin proteins. Molecular Cell. 16 (1), 147-157 (2004).
- Zentner, G. E., Kasinathan, S., Xin, B., Rohs, R., Henikoff, S. ChEC-seq kinetics discriminates transcription factor binding sites by DNA sequence and shape in vivo. Nature Communications. 6, 8733 (2015).
- Skene, P. J., Henikoff, S. An efficient targeted nuclease strategy for high-resolution mapping of DNA binding sites. eLife. 6, 21856 (2017).
- Meers, M. P., Bryson, T. D., Henikoff, J. G., Henikoff, S.
- Hainer, S. J., Bošković, A., McCannell, K. N., Rando, O. J., Fazzio, T. G. Profiling of pluripotency factors in single cells and early embryos. Cell. 177 (5), 1319-1329 (2019).
- Kaya-Okur, H. S., et al. CUT&Tag for efficient epigenomic profiling of small samples and single cells. Nature Communications. 10 (1), 1930 (2019).
- Carter, B., et al. Mapping histone modifications in low cell number and single cells using antibody-guided chromatin tagmentation (ACT-seq). Nature Communications. 10 (1), 3747 (2019).
- Gopalan, S., Wang, Y., Harper, N. W., Garber, M., Fazzio, T. G. Simultaneous profiling of multiple chromatin proteins in the same cells. Molecular Cell. 81 (22), 4736-4746 (2021).
- Patty, B. J., Hainer, S. J. Transcription factor chromatin profiling genome-wide using uliCUT&RUN in single cells and individual blastocysts. Nature Protocols. 16 (5), 2633-2666 (2021).
- Zheng, X. -Y., Gehring, M. Low-input chromatin profiling in Arabidopsis endosperm using CUT&RUN. Plant Reproduction. 32 (1), 63-75 (2019).
- Buenrostro, J. D., Giresi, P. G., Zaba, L. C., Chang, H. Y., Greenleaf, W. J. Transposition of native chromatin for fast and sensitive epigenomic profiling of open chromatin, DNA-binding proteins and nucleosome position. Nature Methods. 10 (12), 1213-1218 (2013).
- Buenrostro, J. D., et al. Single-cell chromatin accessibility reveals principles of regulatory variation. Nature. 523 (7561), 486-490 (2015).
