Summary
CUT&RUN och dess varianter kan användas för att bestämma proteinbeläggning på kromatin. Detta protokoll beskriver hur man bestämmer proteinlokalisering på kromatin med hjälp av encelliga uliCUT &RUN.
Abstract
Att bestämma bindningsplatserna för ett protein på kromatin är avgörande för att förstå dess funktion och potentiella regleringsmål. Kromatin immunoprecipitation (ChIP) har varit guldstandarden för att bestämma proteinlokalisering i över 30 år och definieras av användningen av en antikropp för att dra ut proteinet av intresse från sonicated eller enzymatiskt smält kromatin. På senare tid har antikroppsdelningstekniker blivit populära för att bedöma proteinlokalisering på kromatin på grund av deras ökade känslighet. Klyvning under targets & release under nukleas (CUT &RUN) är det genomomfattande derivatet av kromatinimmunavage (ChIC) och använder rekombinant protein A bunden till mikrokocknukleas (pA-MNas) för att identifiera IgG-konstantregionen för antikroppen som riktar sig mot ett protein av intresse, vilket möjliggör platsspecifik klyvning av DNA som flankerar proteinet av intresse. CUT & RUN kan användas för att profilera histonmodifieringar, transkriptionsfaktorer och andra kromatinbindande proteiner såsom nukleosommodelleringsfaktorer. Viktigt är att CUT &RUN kan användas för att bedöma lokaliseringen av antingen eukromatiska eller heterokromatiskt associerade proteiner och histonmodifieringar. Av dessa skäl är CUT &RUN en kraftfull metod för att bestämma bindningsprofilerna för ett brett spektrum av proteiner. Nyligen har CUT&RUN optimerats för transkriptionsfaktorprofilering i låga populationer av celler och enskilda celler och det optimerade protokollet har kallats ultralåg input CUT&RUN (uliCUT&RUN). Här presenteras ett detaljerat protokoll för encellsfaktorprofilering med uliCUT&RUN i ett manuellt 96-brunnsformat.
Introduction
Många nukleära proteiner fungerar genom att interagera med kromatin för att främja eller förhindra DNA-mallade aktiviteter. För att bestämma funktionen hos dessa kromatin-interagerande proteiner är det viktigt att identifiera de genomiska platserna vid vilka dessa proteiner är bundna. Sedan dess utveckling 1985 har kromatinimmunutfällning (ChIP) varit guldstandarden för att identifiera var ett protein binder till kromatin 1,2. Den traditionella ChIP-tekniken har följande grundläggande arbetsflöde: celler skördas och tvärlänkas (vanligtvis med formaldehyd), kromatin skjuvas (vanligtvis med hårda ultraljudsbehandlingsmetoder, vilket kräver tvärbindning), proteinet av intresse är immunutfällt med hjälp av en antikropp som riktar sig mot proteinet (eller märkt protein) följt av en sekundär antikropp (kopplad till agaros eller magnetiska pärlor), tvärbindning vänds, protein och RNA smälts för att rena DNA, och detta ChIP-berikade DNA används som mall för analys (med hjälp av radioaktivt märkta sonder 1,2, qPCR3, mikroarrays 5,6 eller sekvensering4). Med tillkomsten av mikroarrayer och massivt parallell djupsekvensering har ChIP-chip 5,6 och ChIP-seq4 nyligen utvecklats och möjliggör genomomfattande identifiering av proteinlokalisering på kromatin. Tvärbindning ChIP har varit en kraftfull och pålitlig teknik sedan dess tillkomst med stora framsteg i upplösning av ChIP-exo7 och ChIP-nexus8. Parallellt med utvecklingen av ChIP-seq, native (non-crosslinking) protokoll för ChIP (N-ChIP) har upprättats, som använder nukleas matsmältning (ofta med hjälp av mikrokocknukleas eller MNase) för att fragmentera kromatinet, i motsats till ultraljudsbehandling utförs i traditionella tvärbindning ChIP tekniker9. En stor nackdel med både tvärbindning av ChIP- och N-ChIP-teknik har dock varit kravet på höga celltal på grund av lågt DNA-utbyte efter experimentell manipulation. Därför har många ansträngningar under senare år varit för att optimera ChIP-teknik för låg cellinmatning. Dessa ansträngningar har resulterat i utvecklingen av många kraftfulla ChIP-baserade tekniker som varierar i tillämplighet och ingångskrav 10,11,12,13,14,15,16,17,18. Emellertid har encellig ChIP-seq-baserad teknik saknats, särskilt för icke-histonproteiner.
År 2004 utvecklades en alternativ teknik för att bestämma proteinbeläggningen på kromatin benämnt kromatin endogen klyvning (ChEC) och kromatinimmunskläckning (ChIC)19. Dessa single-locus-tekniker använder en fusion av MNase till antingen proteinet av intresse (ChEC) eller till protein A (ChIC) för direkt skärning av DNA intill proteinet av intresse. På senare år har både ChEC och ChIC optimerats för genomomfattande proteinprofilering på kromatin (ChEC-seq respektive CUT&RUN)20,21. Medan ChEC-seq är en kraftfull teknik för att bestämma faktorlokalisering, kräver det att man utvecklar MNase-fusionsproteiner för varje mål, medan ChIC och dess genomomfattande variation, CUT & RUN, förlitar sig på en antikropp riktad mot proteinet av intresse (som med ChIP) och rekombinant protein A-MNase, där proteinet A kan känna igen IgG-konstantområdet i antikroppen. Som ett alternativ har ett fusionsprotein A/protein G-MNas (pA/G-MNase) utvecklats som kan känna igen ett bredare spektrum av antikroppskonstanta regioner22. CUT&RUN har snabbt blivit ett populärt alternativ till ChIP-seq för att bestämma proteinlokalisering på kromatingenomet.
Ultralåg ingång CUT&RUN (uliCUT&RUN), en variant av CUT&RUN som möjliggör användning av låg- och encellsingångar, beskrevs 201923. Här beskrivs metoden för en manuell 96-brunnsformat encellsapplikation. Det är viktigt att notera att sedan utvecklingen av uliCUT&RUN har två alternativ för histonprofilering, CUT&Tag och iACT-seq utvecklats, vilket ger robust och mycket parallell profilering av histonproteiner24,25. Dessutom har scCUT&Tag optimerats för profilering av flera faktorer i en enda cell (multiCUT&Tag) och för applicering på icke-histonproteiner26. Tillsammans erbjuder CUT&RUN ett attraktivt alternativ till ChIP-seq med låg ingång där uliCUT&RUN kan utföras i alla molekylärbiologiska laboratorier som har tillgång till en cellsorterare och standardutrustning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Etiskt uttalande: Alla studier godkändes av Institutional Biosafety Office of Research Protections vid University of Pittsburgh.
1. Förbered magnetiska pärlor
OBS: Utför före cellsortering och håll isen tills den används.
- Pipett 30 μL ConA-konjugerad paramagnetisk mikrosfär pärlslamblandning per reaktion på ett nytt 1,5 ml mikrofugerör och tillsätt 850 μL bindningsbuffert, pipettering försiktigt för att blanda.
OBS: KonA-konjugerade paramagnetiska mikrosfärer är lektinbelagda magnetiska pärlor som tillåter lipidmembranbindning. - Placera röret på ett magnetställ och låt pärlorna magnetisera i 1-2 min. När supernatanten har rensat, ta bort och kassera supernatanten utan att störa pärlorna.
- Ta bort röret från magnetstället och tvätta pärlorna genom att återanvända 1 ml bindningsbuffert.
- Upprepa steg 1.2 och 1.3.
- Magnetisera pärlorna i 2 minuter och ta bort supernatanten för att kassera.
- Ta bort röret från magnetstället och återsuspendera pärlorna i 30 μL bindningsbuffert per reaktion.
- Håll den tvättade pärlblandningen på is tills cellerna är sorterade.
2. Skörda celler
OBS: Detta steg är skrivet för vidhäftade celler och optimerat för murina E14 embryonala stamceller. Odling och skörd av cellerna beror på celltypen.
- Ta bort cellerna från 37 °C-inkubatorn och undersök dem under mikroskop för att säkerställa kvaliteten.
- Aspirera mediet från cellplattan och skölj med 5 ml 1x PBS.
- Aspirera PBS från plattan och skörda cellerna (med traditionella cellskördsmetoder som kommer att skilja sig åt beroende på celltyp). Få encellig suspension genom att försiktigt pipettera upp och ner med en serologisk pipett mot odlingsskålen, om det behövs.
- Överför cellsuspensionen till ett koniskt rör på 15 ml och snurra ner vid 200 x g i 5 min.
- Aspirera av media för att kassera och tvätta cellpelleten med 5 ml PBS + 1% FBS.
- Snurra ner cellerna vid 200 x g i 5 minuter, kassera supernatanten och resuspendera cellpelleten i 5 ml PBS + 1% FBS.
- Räkna cellerna och överför 1 ml 1 x 106 celler till ett nytt 1,5 ml mikrofugerör.
- Tillsätt 5 μL 7-amino-aktinomycin D (7-AAD), invertera röret väl för att blanda och applicera sedan provet på cellsorteraren för att sortera levande enskilda celler i enskilda brunnar på en 96-brunnsplatta.
OBS: 7-AAD-färgämne utesluts från levande celler och kan därför användas vid sortering av levande celler.
3. Cellsortering och lys
- Förbered en cellsorterarkompatibel 96-brunnsplatta med 100 μL nuclear extraction (NE) buffert i varje brunn före cellsortering.
- Sortera cellerna i 96-brunnsplattor enligt tillverkarens instruktioner.
- Snurra snabbt plattan (600 x g i 30 s) för att säkerställa att cellerna finns i bufferten i brunnarna.
OBS: Det är värt att testa i ett preliminärt experiment om cellerna som används på ett tillförlitligt sätt bringas till botten av brunnarna. - Håll proverna på is i 15 min.
- Snurra ner proverna vid 600 x g i 5 minuter vid 4 ° C och pipettera försiktigt för att ta bort supernatanten (lämnar efter sig 5 μL).
- Resuspendera varje prov i 55 μL NE-buffert och tillsätt 30 μL av de förtvättade ConA-konjugerade paramagnetiska mikrosfärerna (från steg 1.7; i Binding Buffer) till varje reaktion.
- Inkubera vid rumstemperatur i 10 min.
4. Förblockeringsprover för att förhindra tidig matsmältning av MNase
- Placera plattan på ett 96-brunns magnetställ, låt pärlorna binda i minst 5 minuter och ta sedan bort och kassera supernatanten.
- Tillsätt 100 μL blockeringsbuffert till de kärnbundna pärlorna och blanda med mild pipettering.
- Inkubera i 5 min vid rumstemperatur.
5. Tillsats av primär antikropp
- Placera plattan på ett 96-brunns magnetställ, låt supernatanten rensa i minst 5 minuter och ta sedan bort och kasta supernatanten utan att störa pärlorna.
- Ta bort plattan från magnetstället och återsuspendera pärlorna i 100 μL tvättbuffert per reaktion med skonsam pipettering.
- Placera plattan tillbaka på 96-brunnsmagnetstället, låt supernatanten rensa och ta sedan bort och kassera supernatanten.
- Resuspend pärlorna i 25 μL tvättbuffert per reaktion med skonsam pipettering.
- Gör en primär antikroppsmästarblandning: 25 μL tvättbuffert + 0,5 μL antikropp per reaktion.
- Medan du försiktigt virvlar de kärnbundna pärlorna, tillsätt 25 μL av den primära antikroppsmästarblandningen till varje prov som behandlas med en antikropp som riktar sig mot proteinet av intresse (vanligtvis 1: 100 slutlig utspädning). Tillsätt 25 μL tvättbuffert utan antikropp om du utför en kontroll.
- Inkubera i 1 timme vid rumstemperatur.
- Placera proverna på ett 96-brunns magnetställ, låt supernatanten rensa i minst 5 minuter och ta sedan bort och kassera supernatanten utan att störa pärlorna.
- Ta bort plattan från magnetstället och tvätta pärlorna med 100 μL tvättbuffert, återanvänd genom pipettering.
6. Tillsats av pA-MNase eller pA/G-MNase
OBS: Protein A har en hög affinitet för IgG-molekyler från vissa arter som kaniner men är inte lämpligt för IgGs från andra arter som möss eller råttor. Alternativt kan protein A/G-MNase användas. Denna hybrid binder kanin, mus och råtta IgGs, vilket undviker behovet av sekundära antikroppar när mus eller råtta primära antikroppar används.
- Placera tillbaka plattan på ett 96-brunns magnetställ, låt supernatanten rensa i minst 5 minuter och ta sedan bort och kasta supernatanten utan att störa pärlorna.
- Ta bort plattan från magnetstället och återsuspendera varje prov i 25 μL tvättbuffert.
- Gör en pA-MNase-mastermix (25 μL tvättbuffert + optimerad mängd pA-MNase per reaktion).
- Medan du försiktigt virvlar, tillsätt 25 μL av pA-MNas-masterblandningen till varje prov, inklusive kontrollproverna.
OBS: Koncentrationen av pA-MNas varierar beroende på beredning, om den är hemlagad, och bör testas före användning vid varje oberoende rening. För pA/G-MNase ska 2,5 μL av 20x-beståndet användas. - Inkubera proverna i 30 minuter vid rumstemperatur.
- Placera plattan på ett 96-brunns magnetställ, låt supernatanten rensa i minst 5 minuter och ta sedan bort och kasta supernatanten utan att störa pärlorna.
- Ta bort plattan från magnetstället och tvätta pärlorna med 100 μL tvättbuffert, som återanvänds genom skonsam pipettering.
7. Riktad DNA-matsmältning
- Placera plattan på ett 96-brunns magnetställ, låt supernatanten rensa i minst 5 minuter och ta sedan bort och kassera supernatanten.
- Ta bort proverna från magnetstället och återsuspendera pärlorna i 50 μL tvättbuffert genom skonsam pipettering.
- Balansera proverna till 0 °C i en is/vattenblandning i 5 min.
- Ta bort proverna från is-/vattenbadet på 0 °C och tillsätt 1 μL caCl2 med en flerkanalig pipett. Blanda väl (3-5 gånger) med skonsam pipettering med en flerkanalig pipett med större volym och sätt sedan tillbaka proverna till 0 °C.
OBS: Att blanda väl här är viktigt. CaCl2 tillsätts för att aktivera MNase-matsmältningen av DNA som flankerar proteinet av intresse. - Starta en 10 min timer så snart plattan är tillbaka i is/vattenbadet.
- Stoppa reaktionen genom att pipettera 50 μL 2XRSTOP+ Buffer i varje brunn, i samma ordning som CaCl2 tillsattes.
OBS: Gör 2XRSTOP + Buffer innan 10 minuters matsmältning är över för att förhindra över matsmältning.
8. Provfraktionering
- Inkubera proverna i 20 minuter vid 37 °C.
- Snurra plattan vid 16 000 x g i 5 min vid 4 °C.
- Placera plattan på ett 96-brunns magnetställ, låt supernatanten rensa i minst 5 minuter och överför supernatanter till en ny 96-brunnsplatta. Kassera pärlorna.
9. DNA-extraktion
- Tillsätt 1 μL 10% natriumdodecylsulfat (SDS) och 0,83 μL 20 mg/ml proteinas K till varje prov.
VARNING: SDS-pulver är skadligt vid inandning. Användare bör använda i välventilerade utrymmen med skyddsglasögon, handskar och en N95-klass andningsskydd, hantera med försiktighet. - Blanda proverna med skonsam pipettering.
- Inkubera proverna i 10 minuter vid 70 °C.
- Sätt tillbaka plattan till rumstemperatur och tillsätt 46,6 μL 5 M NaCl och 90 μL 50% PEG 4000. Blanda med mild pipettering.
- Tillsätt 33 μL polystyrenmagnetitpärlor till varje prov och inkubera i 10 min vid rumstemperatur.
OBS: Var noga med att föra polystyrenmagnetit pärlor till rumstemperatur (~ 30 min) och blanda väl innan du använder. - Placera plattan på ett magnetställ och låt supernatanten rensa i ~ 5 minuter och kasta sedan försiktigt supernatanten utan att störa pärlorna.
- Skölj 2x med 150 μL 80% etanol utan att störa pärlorna.
VARNING: Etanol är mycket brandfarligt och orsakar hud-, ögon- och lungirritation. Utför detta steg med lämpliga laboratoriekläder och i en ventilerad huva. - Snurra plattan kort vid 1000 x g i 30 s. Placera tillbaka plattan på ett 96-brunns magnetställ och ta bort all kvarvarande EtOH utan att störa pärlorna.
- Lufttorka proverna i ~2-5 min.
OBS: Torka inte pärlorna längre än 5 min. Om du är noga med att ta bort EtOH är 2-3 minuters torkning tillräcklig. - Resuspendera pärlorna med 37,5 μL av 10 mM Tris-HCl (pH 8) och inkubera i 5 min vid rumstemperatur.
- Placera plattan på ett magnetställ och låt pärlorna binda i 5 min.
- Överför 36,5 μL av supernatanten till en färsk termocykelkompatibel 96-brunnsplatta. Kassera pärlorna.
OBS: Experimentet kan stoppas här genom att lagra prover vid -20 ° C eller kan fortsätta med biblioteksbyggnaden (steg 10-15).
10. Slutreparation, fosforylering, adenylering
OBS: Reagenserna är anskaffade som det hänvisas till i materialförteckningen. Nedanstående protokoll följer en liknande metod som det kommersiella kitet som NEBNext Ultra DNA II kit.
- Späd 5 U/μL T4 DNA-polymeras 1:20 i 1x T4 DNA-ligasbuffert.
- Förbered en slutreparation/3'A masterblandning: 2 μL 10x T4 DNA-ligasbuffert, 2,5 μL 10 mM dNTP, 1,25 μL 10 mM ATP, 3,13 μL 40% PEG 4000, 0,63 μL 10 U/μL T4 PNK, 0,5 μL utspätt T4 DNA-polymeras, 0,5 μL 5U/μL Taq DNA-polymeras, med en total volym på 13,5 μL per reaktion.
OBS: Var noga med att ta 40% PEG 4000 till rumstemperatur innan du pipetterar. - Tillsätt 13,5 μL slutreparation/3'En masterblandning till 36,5 μL DNA.
- Blanda reaktionen med snabb virvel och sedan en snabb snurrning (500 x g i 10 s).
- Inkubera med följande reaktionsbetingelser i en förkyld termocyklist med uppvärmt lock för temperaturer >20 °C. Använd reaktionsbetingarna: 12 °C i 15 min, 37 °C i 15 min, 72 °C i 20 min, håll vid 4 °C.
11. Adapter ligering
OBS: Håll proverna på is medan du ställer in följande reaktion. Låt ligasbufferten komma till rumstemperatur före pipettering. Späd adaptern (se Materialtabell) i en lösning av 10 mM Tris-HCl innehållande 10 mM NaCl (pH 7,5). På grund av det låga utbytet, förkvantifiera inte CUT & RUN-berikat DNA. Generera snarare 25-faldiga utspädningar av adaptern med hjälp av en slutlig arbetsadapterkoncentration på 0,6 μM.
- Gör en ligeringsmästarblandning: 55 μL ligasbuffert (2x), 5 μL T4 DNA-ligas och 5 μL utspädd adapter, med en total volym på 65 μL per reaktion.
- Tillsätt 65 μL av masterligeringsblandningen till 50 μL DNA från steg 10.5.
- Blanda genom snabbvirvlar, följt av snabb spinning (500 x g i 10 s).
- Inkubera vid 20 °C i en termocyklist (utan uppvärmt lock) i 15 min.
OBS: Fortsätt omedelbart till följande steg.
12. ANVÄNDARENS matsmältning
- Tillsätt 3 μL USER-enzym till varje prov, virvel och spinn (500 x g i 10 s).
- Inkubera i termisk cykler vid 37 °C i 15 min (uppvärmt lock inställt på 50 °C).
13. Rengöring av polystyrenmagnetitpärlade efter ligeringsreaktion
OBS: Låt polystyrenmagnetitpärlor balansera vid rumstemperatur (~ 30 min). Vortex för att homogenisera pärllösningen före användning. Utför följande steg vid rumstemperatur.
- Tillsätt 39 μL (0,33x) polystyrenmagnetitpärllösning till varje brunn som innehåller adapter-ligerat DNA.
- Blanda noggrant genom pipettering och inkubera sedan proverna vid rumstemperatur i 15 minuter så att DNA kan binda till pärlorna.
- Placera proverna på ett 96-brunns magnetställ och inkubera i 5 minuter tills supernatanten är klar.
- Håll plattan på magnetstället och ta försiktigt bort och kassera supernatanten utan att störa pärlorna.
- Skölj pärlorna med 200 μL 80% EtOH utan att störa pärlorna.
- Inkubera i 30 s på ett 96-brunns magnetställ så att lösningen kan rensas.
- Ta bort och kassera supernatanten utan att störa pärlorna.
- Upprepa steg 13.5-13.7 för totalt två tvättar.
- Snurra plattan kort vid 500 x g i 10 s, placera plattan tillbaka på ett 96-brunns magnetställ och ta bort kvarvarande EtOH utan att störa pärlorna.
- Håll plattan på magnetstället och lufttorka proverna i 2 min.
OBS: Torka inte pärlorna för mycket. - Ta bort plattan från magnetstället och återsuspendera pärlorna i 28,5 μL av 10 mM Tris-HCl (pH 8).
VARNING: Saltsyra är mycket frätande. Användare bör hantera det med försiktighet i en kemisk rökhuva med skyddsglasögon, handskar och en labbrock. - Resuspend pärlor noggrant genom pipettering, var noga med att inte producera bubblor.
- Inkubera i 5 min vid rumstemperatur.
- Placera plattan på ett 96-brunns magnetställ och låt lösningen rensas i 5 minuter.
- Överför 27,5 μL supernatant till en ny PCR-platta och kasta pärlorna.
14. Bibliotekets anrikning
OBS: Primers späds ut med samma lösning som adaptern. För den här biblioteksbyggnaden använder du en slutlig arbetsprimerkoncentration på 0,6 μM.
- Tillsätt 5 μL utspädd indexerad primer (se materialförteckningen) till varje prov.
OBS: Varje prov behöver ett annat index för att identifieras efter sekvensering. - Förbered en PCR-masterblandning: 10 μL 5x PCR-buffert med hög återgivning, 1,5 μL 10 mM dNTP, 5 μL utspädd Universal primer, 1 μL 1 U varmstartspolymeras med hög återgivning, med en total mastermixvolym på 17,5 μL per prov.
- Tillsätt 17,5 μL pf PCR-blandning till 32,5 μL renat adaptor-ligerat DNA (5 μL indexerad primer ingår i denna volym).
- Blanda lösningen genom pipettering.
- Inkubera i en termocyklist med följande reaktionsbetingelser med en maximal ramphastighet på 3 °C/s: 98 °C för 45 s, 98 °C för 45 s, 60 °C i 10 s, upprepa det andra och tredje steget 21 gånger, 72 °C i 1 min, håll vid 4 °C.
OBS: Proverna kan förvaras vid 4 °C för kortvarig lagring eller -20 °C för långtidsförvaring.
15. Rengöring av polystyrenmagnetit pärla
- Tillsätt 60 μL (1,2x) polystyrenmagnetitpärlor till varje prov.
- Resuspend pärlorna genom pipettering och inkubera i 15 min vid rumstemperatur.
- Placera plattan på ett magnetställ i 5 minuter tills lösningen är klar.
- Kassera supernatanten och skölj pärlorna med 200 μL 80% EtOH utan att störa pärlorna.
- Upprepa tvättsteget för totalt två 80% EtOH-tvättar.
- Snurra plattan vid 500 x g i 10 s, placera plattan på ett 96-brunns magnetställ och låt pärlorna binda i 5 minuter.
- Pipett för att ta bort överflödigt EtOH utan att störa pärlorna och låta pärlorna lufttorka i 2 min.
OBS: Torka inte pärlorna för mycket. - Resuspend pärlorna i 21 μL nukleasfritt vatten och inkubera i 5 min vid rumstemperatur.
- Placera plattan på ett magnetställ och låt lösningen rensa i 5 min.
- Överför 20 μL av supernatanten till en ny platta.
OBS: Experimentet kan stoppas här genom att lagra provet vid -20 ° C. - Kvantifiera bibliotekskoncentrationer med en fluorometer (se Materialtabell) med hjälp av ett 1x HS-reagens.
- Om koncentrationen tillåter, kör 30 ng prov på 1,5% agarosgel med en stege med låg molekylvikt för att visualisera. Du kan också visualisera på en Fragment Analyzer eller relaterat instrument.
- Sekvensbibliotek på en Illumina-plattform för att få ~ 50 000-100 000 unikt mappade läsningar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Här presenteras ett detaljerat protokoll för encellsproteinprofilering på kromatin med ett 96-brunns manuellt format uliCUT&RUN. Medan resultaten kommer att variera beroende på proteinet som profileras (på grund av proteinöverflöd och antikroppskvalitet), celltyp och andra bidragande faktorer, diskuteras förväntade resultat för denna teknik här. Cellkvalitet (cellutseende och procent av viabla celler) och encellssortering bör bedömas före eller vid tidpunkten för levande cellsortering i NE-bufferten. Ett exempel på ES-cellkolonier och cellsortering visas i figur 2A,B. Specifikt bör celler av låg kvalitet inte användas, och om kvaliteten är ett problem bör man se till att följa riktlinjer för den specifika celltypen. Dessutom bör noggrann cellsortering med cellsorteringsinstrumentet bedömas före experimentet. Till exempel kan testceller sorteras och färgas med Hoechst 33342-fläck och räknas för att säkerställa att antingen 0 eller 1 cell finns i varje brunn. Om enskilda celler inte hittas måste sorteringsförhållandena optimeras. Efter biblioteksberedning kan prover bedömas på antingen en agarosgel (om koncentrationen tillåter belastning på 30 ng eller mer, eftersom det finns en lägre gräns för DNA-visualisering på en agarosgel) eller en fragmentanalysator (eller liknande anordning såsom en bandstation eller bioanalysator) före sekvensering och exempelresultat visas i figur 2C, D. Specifikt är den förväntade storleksfördelningen från ~ 150 till ~ 500 bp. I högre cellmängder kommer CUT & RUN som utförs på stora proteiner (såsom histoner) att ha en högersidig storleksfördelning, där majoriteten av DNA kommer att ses ~ 270 bp; emellertid observeras denna axel vanligtvis inte i encellsexperiment.
Efter sekvensering bör kvaliteten på sekvenseringsläsningarna bedömas med fastqc. Procentandelen unika mappningsläsningar bör bestämmas. Vanligtvis observeras 0,5% -10% unikt kartläggningsläsningar i encellsexperiment. Dessa kartläggningsprocent liknar andra DNA-baserade encellstekniker30. Därefter bör storleksfördelningen för läsningarna efter mappningen bestämmas för att säkerställa att profilen liknar försekvensering (med adaptersekvensen som inte längre bidrar till lässtorlekarna).
Efter att datakvaliteten har bedömts kan proteinbeläggning visualiseras med olika metoder: webbläsarbilder med en enda locus genome kan visualiseras med UCSC genomwebbläsare eller IGV (figur 3A) och genomomfattande beläggningsmönster över specifika genomiska koordinater kan visualiseras med hjälp av metaplots (figur 3B, botten), värmekartor (figur 3B, överst) eller 1D-värmekartor (figur 3C). För mer information om dataanalys, se studien av Patty och Hainer27. Encellsdata från en diploid cell kommer att resultera i upp till fyra läsningar som bidrar till varje locus (fyra läser om cellen var i mitos), men oftare en eller två läsningar. Därför är data binära, och en hög bakgrund kan lättare misstas för beläggning i förhållande till högcelliga experiment. Därför rekommenderas att utföra ett parallellt CUT & RUN-experiment på ett högt cellantal (5 000 till 100 000 celler), om möjligt, för att förvärva alla möjliga bindningsplatser för proteinet av intresse. Sedan kan encellsdata jämföras med möjliga bindningsplatser. I exemplen som visas i figur 3 jämförs ctcf uliCUT&RUN-resultat med encelliga CTCF uliCUT&RUN (figur 3A) eller ChIP-seq (figur 3B,C). Som tidigare visats representerade CTCF-, SOX2- och NANOG-encelliga uliCUT&RUN-toppar till stor del starkare toppar från ChIP-seq-dataset med hög cell23.
Figur 1: Schematiskt över uliCUT&RUN-protokollet. Cellerna skördas och sorteras i en 96-brunnsplatta som innehåller NE-buffert. Enskilda kärnor binds sedan till ConA-konjugerade paramagnetiska mikrosfärer, och sekventiellt tillsätts en antikropp (riktad mot proteinet av intresse) och pA-MNas eller pA / G-MNas. Proteinintilliggande DNA klyvs via MNas, och DNA renas sedan för användning vid biblioteksberedning. Denna siffra skapades med Biorender.com. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Exempel på resultat från cellsortering och kvalitetskontroll av uliCUT&RUN-bibliotek. (A) Bild av högkvalitativa murina embryonala stamceller (ES). Skalstång: 200 μm. (B) Utdata från encellssortering efter tillsats av 7AAD till skördade ES-celler och sortering på ett FACS-instrument. (C) Etidiumbromidfärgad agarosgel som visar färdiga uliCUT&RUN-bibliotek. Lane 1 är en stege med låg molekylvikt och banorna 2-21 är exempel på framgångsrika enskilda encelliga uliCUT&RUN-bibliotek före sekvensering. (D) Etidiumbromidfärgad agarosgel som visar suboptimala och optimalt färdiga uliCUT&RUN-bibliotek. Lane 1 är en stege med låg molekylvikt, lane 2 är ett suboptimalt bibliotek på grund av ineffektiv MNase-matsmältning och lane 3 är ett framgångsrikt bibliotek med lämplig matsmältning. (E) Fragmentanalysatorfördelning av ett enda cell uliCUT &RUN-bibliotek före sekvensering. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Exempel på förväntade resultat för enstaka ES-cell uliCUT&RUN-data. (A) Webbläsarspår av högt celltal (5 000 celler) CTCF eller negativ kontroll (Ingen antikropp, No Ab) uliCUT &RUN (topp två spår) och encellig CTCF uliCUT & RUN. Bilden återges, med tillstånd, från Patty och Hainer27. (B) Värmekartor (överst) och metaplottar (botten) av encellig CTCF eller negativ kontroll (No Ab) uliCUT&RUN över tidigare publicerade CTCF ChIP-seq-platser (GSE11724). Bilden återges, med tillstånd, från Hainer et al.23. (C) 1D-värmekartor över encellig CTCF eller negativ kontroll (No Ab) uliCUT&RUN över tidigare publicerade CTCF ChIP-seq-platser (GSE11724). Bilden återges, med tillstånd, från Hainer et al.23. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Tabell 1: Sammansättning av olika buffertar som används i detta protokoll. Den erforderliga volymen av stamlösning anges med slutlig koncentration inom parentes. Klicka här för att ladda ner denna tabell.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
CUT &RUN är ett effektivt protokoll för att bestämma proteinlokalisering på kromatin. Det har många fördelar jämfört med andra protokoll, inklusive: 1) högt signal-brusförhållande, 2) snabbt protokoll och 3) låg sekvenseringstäckning som krävs, vilket leder till kostnadsbesparingar. Användningen av protein A- eller protein A/G-MNas gör det möjligt att applicera CUT&RUN med alla tillgängliga antikroppar; därför har den potential att snabbt och enkelt profilera många proteiner. Anpassning till encellig för någon proteinprofilering på kromatin har dock varit svårt, särskilt jämfört med encellstranskriptomik (dvs scRNA-seq), på grund av det låga antalet kopior av DNA i förhållande till RNA (två till fyra kopior av DNA kontra möjliga tusentals RNA-kopior).
I protokollet som beskrivs ovan bör flera kritiska steg övervägas. För det första är lämplig sortering av celler beroende av celltypen (eller vävnaden), och försiktighet bör vidtas för korrekt sortering. Det rekommenderas att testa hur effektiv encellssortering är med instrumentet före varje experiment. För det andra är ett effektivt antikroppsval viktigt. Innan du går vidare till en encellsapplikation rekommenderas att testa antikroppen i ett experiment med högt cellantal (liksom andra vanliga antikroppstester, såsom att bekräfta specificitet med western blot efter knockdown, titrering av antikroppen i CUT & RUN-experiment, etc.). För det tredje, använd en negativ kontroll, såsom IgG eller ingen primär antikropp, eftersom en lämplig jämförelse med de experimentella proverna är avgörande för tolkningen av datakvaliteten och biologiska resultat. När man jämför experimentella resultat med en enda cell med ett dataset med högt celltal bör de negativa kontrollexperimenten ha mindre lästäckning över de bindningsställen som identifierats i högcellsexperimentet och snarare ha en slumpmässig fördelning av läsningar över genomet (med en bias för öppna kromatinregioner). För det fjärde bör försiktighet iakttas vid tillsats och aktivering av protein A- eller protein A/G-MNase för att inte överröta kromatinet: överhetta inte proverna med händerna, håll proverna i en is-/vattenbadstemperatur (0 °C) och kelera reaktionen vid lämplig tidpunkt. För det femte bör man vara försiktig under hela uliCUT &RUN-experimentet och biblioteksberedningen på grund av lågt material. Till exempel är utökad inkubation på magnetstället under pärlbindning för att säkerställa att supernatanten har rensat och att vara försiktig så att du inte stör pärlorna när du tar bort supernatanten är avgörande för tillräcklig avkastning. För det sjätte, beroende på de frågor som behandlas, är antalet encellsexperiment som utförs ett viktigt övervägande. Några av encellsexperimenten kommer att misslyckas (som med alla experiment med låg ingång), och därför bör antalet positiva experimentella resultat som krävs för lämplig tolkning övervägas innan experimentet påbörjas. Antalet celler som ska inkluderas i experimentet är beroende av mängden experimentella data som krävs av prövaren och antikroppens kvalitet. Observera slutligen att likvärdiga resultat skulle kunna uppnås med minskade volymer av många aspekter av detta protokoll. Steg där volymen reducerades med 50% inkluderar volymen av NE-buffert, tvättbuffert, primär antikroppsblandning (inklusive mängden primär antikropp), pA-MNas-blandning (inklusive mängden pA-MNas) och alla steg i biblioteksberedningen.
Baserat på den komplicerade karaktären av faktorprofilering på kromatin finns det många potentiella källor till problem och platser där felsökning kan bli nödvändig. Även om det kan finnas många steg där problem kan uppstå, har tre stora problem observerats: 1) lågt DNA-utbyte för inmatning i biblioteksbyggnad; 2) hög bakgrundssignal i experimentella prover och 3) lågt utbyte efter biblioteksbyggnad. Om det inte finns tillräckligt med DNA för biblioteksberedning och sekvensering (punkt 1), notera följande felsökningsråd: a) det kan ha förekommit ofullständig membranlys och därför kan lystiden med NE-buffert ökas; b) det kan ha funnits ineffektiv bindning av kärnan till de KonA-konjugerade paramagnetiska mikrosfärerna och detta kan åtgärdas genom lämplig blandning vid tillsats av dessa pärlor; c) det kan ha tillsatts för lite antikroppar, och därför rekommenderas att utföra en titrering av antikroppar för att identifiera den mest effektiva mängden; d) Inkubationstiderna med antingen den primära antikroppen eller proteinet A- eller protein A/G-MNase är antingen för korta (dvs. inte tillräckligt med tid för att tillåta bindning) eller för långa (dessa är inhemska, okorsbundna prover) och kan optimeras. e) interaktionen mellan målproteinet och kromatin kan vara för övergående för att fångas under inhemska förhållanden och därför kan tvärbindning cut&run utföras28. Även om encellsdatauppsättningar ger hög bakgrund kan det finnas en alltför hög bakgrund där signalen är svår att tolka från bakgrunden (punkt 2). För det här problemet, notera följande råd: a) blockeringssteget med EDTA för att förhindra förebyggande MNase-matsmältning kan ökas eller optimeras; b) Om det finns överdriven skärning kan det bero på att man har för mycket protein A- eller protein A/G-MNas, och därför kan en titrering av lämpliga mängder utföras. c) över rötning med MNase kan resultera i den höga bakgrunden, och därför bör lämplig blandning av kalciumklorid vid tillsats och optimering för MNase-rötningstiden bedömas. Slutligen kan effektivt uliCUT&RUN-berikat DNA ha återvunnits, men en låg mängd bibliotek kan återvinnas (punkt 3). För denna fråga rekommenderas följande: a) lämplig hantering och användning av polystyrenmagnetitspårtor för att säkerställa korrekt rening och ingen DNA-förlust; specifikt rekommenderas att ha 15 minuters inkubationer och minst 5 minuter för att magnetisera pärlor för att förhindra förlust; b) underförstärkning av biblioteket i PCR-stadiet skulle resultera i lågt utbyte och därför bör lämpliga cykler bestämmas med qPCR (som tidigare fastställts för ATAC-seq-bibliotek29).
Som med all teknik finns det begränsningar för uliCUT &RUN som bör beaktas innan något experiment påbörjas. För det första är dessa experiment utformade och optimerade för inhemska förhållanden, och därför om ett protein endast tillfälligt interagerar med kromatin kan en tvärbindningsmetod vara nödvändig för att säkerställa återhämtning av interaktionen. För det andra, som med alla antikroppsbaserade tekniker, är antikroppens kvalitet viktig. Försiktighet bör iakttas för att säkerställa antikroppens kvalitet och konsistens innan några experiment genomförs. För det tredje kan MNase-bakgrundsskärning ske och även om det finns en konsekvent lägre bakgrundssignal i CUT & RUN i förhållande till andra experiment, kan bakgrundssignalen vara hög i encellsexperiment och därför bör lämpliga kontroller och analyser utföras. Medan den binära karaktären hos encellsprofileringsdata begränsar visualiseringen, kan mer avancerad beräkningsgenomisk teknik, såsom dimensionell reduktion och andra utföras (som tidigare beskrivits27). Slutligen, medan encellsprofilering har utökats här till 96-brunnsformat, är detta låg genomströmning i förhållande till andra encellstekniker som använder 10xGenomics eller andra format.
Tethering-baserade profileringstekniker som ChEC-seq20, CUT&Tag24, CUT&RUN21 och uliCUT&RUN23 kan bestämma faktorlokalisering på kromatin med en snabbare experimentell tidslinje, lägre bakgrund och lägre kostnad än traditionell profileringsteknik, till exempel ChIP-seq. Därför är dessa mycket spännande tekniker för tillämpning på värdefulla prover som patientprover eller tidiga utvecklingsprover. Vidare kan tillämpning på enskilda celler ge kompletterande studier utförda med hjälp av andra encellsexperiment såsom scRNA-seq och scATAC-seq30. Som beskrivs med hjälp av dessa mer allmänt använda encellstekniker kan nya insikter erhållas i förhållande till bulkcellexperiment. Encellsproteinprofilering på kromatin förväntas bli mer regelbundet använd eftersom teknikerna fortsätter att förbättras och möjliggöra mer parallellisering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar inga konkurrerande intressen relaterade till detta projekt.
Acknowledgments
Vi tackar medlemmar av Hainer Lab för att ha läst och kommenterat en tidigare version av detta manuskript. Detta projekt använde NextSeq500 som finns tillgänglig vid University of Pittsburgh Health Sciences Sequencing Core vid UPMC Children's Hospital of Pittsburgh för sekvensering med särskilt tack till dess chef, William MacDonald. Denna forskning stöddes delvis av University of Pittsburgh Center for Research Computing genom de datorresurser som tillhandahålls. Detta arbete stöddes av National Institutes of Health Grant Number R35GM133732 (till S.J.H.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL clear microfuge tubes | ThermoFisher Scientific | 90410 | |
| 1.5 mL tube magnetic rack | ThermoFisher Scientific | 12321D | |
| 1.5 mL tube-compatible cold centrifuge | Eppendorf | 5404000537 | |
| 10 cm sterile tissue culture plates | ThermoFisher Scientific | 150464 | |
| 10X T4 DNA Ligase buffer | New England Biolabs | B0202S | |
| 15 mL conical tubes | VWR | 89039-656 | |
| 1X TE buffer | ThermoFisher Scientific | 12090015 | |
| 200 µL PCR tubes | Eppendorf | 951010022 | |
| 2X quick ligase buffer | New England Biolabs | M2200 | Ligase Buffer |
| 5X KAPA HiFi buffer | Roche | 7958889001 | 5X high fidelity PCR buffer |
| 7-Amino-Actinomycin D (7-AAD) | Fisher Scientific | BDB559925 | |
| 96-well magnetic rack | ThermoFisher Scientific | 12027 or 12331D | |
| 96-well plate | VWR | 82006-636 | |
| AMPure XP beads | Beckman Coulter | A63881 | polystyrene-magnetite beads; Due to potential variability between AMPure XP bead lots, it is recommended that your AMPure bead solution be calibrated. See manufacturer’s instructions |
| Antibody to protein of interest | varies | ||
| ATP | ThermoFisher Scientific | R0441 | |
| BioMag Plus Concanavalin A beads | Polysciences | 86057-10 | ConA-conjugated paramagnetic microspheres |
| BSA | |||
| Calcium Chloride (CaCl2) | Fisher Scientific | AAJ62905AP | |
| Cell sorter | BD FACSAria II cell sorter | Requires training | |
| Cell-specific media for cell culture | Varies | ||
| Chloroform | ThermoFisher Scientific | C298-500 | Chloroform is a skin irritant and harmful if swallowed; handle in a chemical fume hood using gloves, a lab coat, and goggles |
| Computer with 64-bit processer and access to a super computing cluster | For computational analyses of resulting sequencing datasets | ||
| DNA spin columns | Epoch Life Sciences | 1920-250 | |
| dNTP set | New England Biolabs | N0446S | |
| EGTA | Sigma Aldrich | E3889 | |
| Electrophoresis equipment | varies | ||
| Ethanol | Fisher Scientific | 22032601 | 100% vol/vol ethanol is highly flammable; handle in a chemical fume hood using gloves, a lab coat, and goggles |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Fisher Scientific | BP2482100 | |
| FBS | Sigma Aldrich | F2442 | |
| Glycerol | Fisher Scientific | BP229-1 | |
| Glycogen | VWR | 97063-256 | |
| HEPES | Fisher Scientific | BP310-500 | |
| Heterologous S. cerevisiae DNA spike-in | homemade | Prepared from crosslinked, MNase-digested, and agarose gel extracted genomic DNA purified of protein/RNA and diluted to 10 ng/mL. We recommend yeast genomic DNA, but other organisms can be used if needed. | |
| Hydrochloric Acid (HCl) | Fisher Scientific | A144-212 | Hydrochloric Acid is very corrosive; handle in a chemical fume hood using gloves, a lab coat, and goggles |
| Ice Bucket | varies | ||
| Illumina Sequencing platform (e.g., NextSeq500) | Illumina | ||
| Incubator with temperature and atmosphere control | ThermoFisher Scientific | 51030284 | |
| KAPA HotStart HiFi DNA Polymerase with 5X KAPA HiFi buffer | Roche | 7958889001 | hotstart high fidelity polymerase |
| Laminar flow hood | Bakery Company | SG404 | |
| Manganese Chloride (MnCl2) | Sigma Aldrich | 244589 | |
| Micropipette set | Rainin | 30386597 | |
| Minifuge | Benchmark Scientific | C1012 | |
| NEB Adaptor | New England Biolabs | E6612AVIAL | Adaptor |
| NEB Universal primer | New England Biolabs | E6611AVIAL | Universal Primer |
| NEBNext Multiplex Oligos for Illumina kit | New England Biolabs | E7335S/L, E7500S/L, E7710S/L, E7730S/L | Indexed Primers |
| Negative control antibody | Antibodies-Online | ABIN101961 | |
| Nuclease Free water | New England Biolabs | B1500S | |
| PCR thermocycler | Eppendorf | 2231000666 | |
| Phase lock tubes | Qiagen | 129046 | |
| Phenol/Chloroform/Isoamyl Alcohol (PCI) | ThermoFisher Scientific | 15593049 | Phenol is harmful if swallowed or upon skin contact; handle in a chemical fume hood using gloves, a lab coat, and goggles |
| Phsophate buffered saline (PBS) | ThermoFisher Scientific | 10814010 | |
| Pipette aid | Drummond Scientific | # 4-000-100 | |
| Polyethylene glycol (PEG) 4000 | VWR | A16151 | |
| Potassium Chloride (KCl) | Sigma Aldrich | P3911 | |
| Potassium Hydroxide (KOH) | Fisher Scientific | P250-1 | CAUTION KOH is an eye/skin irritant as a solid and corrosive in solution. Handle in a chemical fume hood using gloves, a lab coat, and goggles |
| Protease Inhibitors | ThermoFisher Scientific | 78430 | |
| ProteinA/G-MNase | Epicypher | 15-1016 | pA/G-MNase |
| ProteinA-MNase, purified from pK19pA-MN | Addgene | 86973 | |
| Proteinase K | New England Biolabs | P8107S | |
| Qubit 1X dsDNA HS Assay Kit | ThermoFisher Scientific | Q33230 | |
| Qubit Assay tubes | ThermoFisher Scientific | Q32856 | |
| Qubit Fluorometer | ThermoFisher Scientific | Q33238 | |
| Quick Ligase with 2X Quick Ligase buffer | New England Biolabs | M2200S | |
| RNase A | New England Biolabs | T3010 | |
| Sodium Acetate (NaOAc) | ThermoFisher Scientific | BP333-500 | |
| Sodium Chloride (NaCl) | Sigma Aldrich | S5150-1L | |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | ThermoFisher Scientific | BP166-500 | SDS is poisonous if inhaled; handle with care in well ventilated spaces using gloves, eye protection, and an N95-grade respirator when handling |
| Sodium Hydroxide (NaOH) | Fisher Scientific | S318-1 | NaOH is an eye/skin irritant as a solid and corrosive in solution. Handle in a chemical fume hood using gloves, a lab coat, and goggles |
| Spermidine | Sigma Aldrich | S2626 | |
| Standard Inverted Light Microscope | Leica | 11526213 | |
| Standard lab agarose gel materials | Varies | ||
| Standard lab materials such as serological pipettes and pipette tips | Varies | ||
| T4 DNA Ligase | New England Biolabs | M0202S | |
| T4 DNA Polymerase | New England Biolabs | M0203S | |
| T4 PNK | New England Biolabs | M0201S | |
| Tabletop vortexer | Fisher Scientific | 2215414 | |
| Taq DNA Polymerase | New England Biolabs | M0273S | |
| Thermomixer | Eppendorf | 5384000020 | Alternatively, can use a waterbath |
| Tris base | Fisher Scientific | BP152-5 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | 9002-93-1 | Triton X-100 is hazardous; use a lab coat, gloves, and goggles when handling |
| Trypsin | Fisher Scientific | MT25052 | |
| Tube rotator | VWR | 10136084 | |
| USER enzyme | New England Biolabs | M5505S |
References
- Gilmour, D. S., Lis, J. T. In vivo interactions of RNA polymerase II with genes of Drosophila melanogaster. Molecular and Cellular Biology. 5 (8), 2009-2018 (1985).
- Solomon, M. J., Varshavsky, A. Formaldehyde-mediated DNA-protein crosslinking: a probe for in vivo chromatin structures. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 82 (19), 6470-6474 (1985).
- Irvine, R. A., Lin, I. G., Hsieh, C. -L. DNA methylation has a local effect on transcription and histone acetylation. Molecular and Cellular Biology. 22 (19), 6689-6696 (2002).
- Albert, I., et al. Translational and rotational settings of H2A.Z nucleosomes across the Saccharomyces cerevisiae genome. Nature. 446 (7135), 572-576 (2007).
- Blat, Y., Kleckner, N. Cohesins bind to preferential sites along yeast chromosome III, with differential regulation along arms versus the centric region. Cell. 98 (2), 249-259 (1999).
- Ren, B., et al. Genome-wide location and function of DNA binding proteins. Science. 290 (5500), 2306-2309 (2000).
- Rhee, H. S., Pugh, B. F. Comprehensive genome-wide protein-DNA interactions detected at single-nucleotide resolution. Cell. 147 (6), 1408-1419 (2011).
- He, Q., Johnston, J., Zeitlinger, J. ChIP-nexus enables improved detection of in vivo transcription factor binding footprints. Nature Biotechnology. 33 (4), 395-401 (2015).
- O'Neill, L. P., Turner, B. M.
- Schmidl, C., Rendeiro, A. F., Sheffield, N. C., Bock, C. ChIPmentation: fast, robust, low-input ChIP-seq for histones and transcription factors. Nature Methods. 12 (10), 963-965 (2015).
- Cao, Z., Chen, C., He, B., Tan, K., Lu, C. A microfluidic device for epigenomic profiling using 100 cells. Nature Methods. 12 (10), 959-962 (2015).
- Shankaranarayanan, P., et al. Single-tube linear DNA amplification (LinDA) for robust ChIP-seq. Nature Methods. 8 (7), 565-567 (2011).
- Rotem, A., et al. Single-cell ChIP-seq reveals cell subpopulations defined by chromatin state. Nature Biotechnology. 33 (11), 1165-1172 (2015).
- Grosselin, K., et al. High-throughput single-cell ChIP-seq identifies heterogeneity of chromatin states in breast cancer. Nature Genetics. 51 (6), 1060-1066 (2019).
- Adli, M., Bernstein, B. E. Whole-genome chromatin profiling from limited numbers of cells using nano-ChIP-seq. Nature Protocols. 6 (10), 1656-1668 (2011).
- Zwart, W., et al. A carrier-assisted ChIP-seq method for estrogen receptor-chromatin interactions from breast cancer core needle biopsy samples. BMC Genomics. 14, 232 (2013).
- Valensisi, C., Liao, J. L., Andrus, C., Battle, S. L., Hawkins, R. D. cChIP-seq: a robust small-scale method for investigation of histone modifications. BMC Genomics. 16, 1083 (2015).
- Brind'Amour, J., et al. An ultra-low-input native ChIP-seq protocol for genome-wide profiling of rare cell populations. Nature Communications. 6, 6033 (2015).
- Schmid, M., Durussel, T., Laemmli, U. K. C. hI. C. ChlC and ChEC; genomic mapping of chromatin proteins. Molecular Cell. 16 (1), 147-157 (2004).
- Zentner, G. E., Kasinathan, S., Xin, B., Rohs, R., Henikoff, S. ChEC-seq kinetics discriminates transcription factor binding sites by DNA sequence and shape in vivo. Nature Communications. 6, 8733 (2015).
- Skene, P. J., Henikoff, S. An efficient targeted nuclease strategy for high-resolution mapping of DNA binding sites. eLife. 6, 21856 (2017).
- Meers, M. P., Bryson, T. D., Henikoff, J. G., Henikoff, S.
- Hainer, S. J., Bošković, A., McCannell, K. N., Rando, O. J., Fazzio, T. G. Profiling of pluripotency factors in single cells and early embryos. Cell. 177 (5), 1319-1329 (2019).
- Kaya-Okur, H. S., et al. CUT&Tag for efficient epigenomic profiling of small samples and single cells. Nature Communications. 10 (1), 1930 (2019).
- Carter, B., et al. Mapping histone modifications in low cell number and single cells using antibody-guided chromatin tagmentation (ACT-seq). Nature Communications. 10 (1), 3747 (2019).
- Gopalan, S., Wang, Y., Harper, N. W., Garber, M., Fazzio, T. G. Simultaneous profiling of multiple chromatin proteins in the same cells. Molecular Cell. 81 (22), 4736-4746 (2021).
- Patty, B. J., Hainer, S. J. Transcription factor chromatin profiling genome-wide using uliCUT&RUN in single cells and individual blastocysts. Nature Protocols. 16 (5), 2633-2666 (2021).
- Zheng, X. -Y., Gehring, M. Low-input chromatin profiling in Arabidopsis endosperm using CUT&RUN. Plant Reproduction. 32 (1), 63-75 (2019).
- Buenrostro, J. D., Giresi, P. G., Zaba, L. C., Chang, H. Y., Greenleaf, W. J. Transposition of native chromatin for fast and sensitive epigenomic profiling of open chromatin, DNA-binding proteins and nucleosome position. Nature Methods. 10 (12), 1213-1218 (2013).
- Buenrostro, J. D., et al. Single-cell chromatin accessibility reveals principles of regulatory variation. Nature. 523 (7561), 486-490 (2015).
