Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

توطين عامل الخلية الواحدة على الكروماتين باستخدام انقسام المدخلات المنخفض للغاية تحت الأهداف والإطلاق باستخدام Nuclease

Published: February 1, 2022 doi: 10.3791/63536
Automatic Translation
1, 1
1Department of Biological Sciences, University of Pittsburgh

Summary

يمكن استخدام CUT & RUN ومتغيراته لتحديد إشغال البروتين على الكروماتين. يصف هذا البروتوكول كيفية تحديد توطين البروتين على الكروماتين باستخدام uliCUT & RUN أحادي الخلية.

Abstract

يعد تحديد مواقع ربط البروتين على الكروماتين أمرا ضروريا لفهم وظيفته وأهدافه التنظيمية المحتملة. كان الترسيب المناعي للكروماتين (ChIP) هو المعيار الذهبي لتحديد توطين البروتين لأكثر من 30 عاما ويتم تعريفه من خلال استخدام جسم مضاد لسحب البروتين محل الاهتمام من الكروماتين الصوتي أو المهضوم إنزيميا. في الآونة الأخيرة ، أصبحت تقنيات ربط الأجسام المضادة شائعة لتقييم توطين البروتين على الكروماتين بسبب حساسيتها المتزايدة. الانقسام تحت الأهداف والإطلاق تحت النوكليز (CUT & RUN) هو مشتق على مستوى الجينوم من الانقسام المناعي للكروماتين (ChIC) ويستخدم البروتين المؤتلف A المربوط بالمكورات الدقيقة nuclease (pA-MNase) لتحديد منطقة ثابتة IgG من الجسم المضاد الذي يستهدف بروتينا ذا أهمية ، وبالتالي تمكين الانقسام الخاص بالموقع للحمض النووي المحيط بالبروتين محل الاهتمام. يمكن استخدام CUT & RUN لتحديد ملامح تعديلات الهيستون وعوامل النسخ وغيرها من البروتينات المرتبطة بالكروماتين مثل عوامل إعادة تشكيل النيوكليوسومات. الأهم من ذلك ، يمكن استخدام CUT & RUN لتقييم توطين البروتينات المرتبطة ب euchromatic أو heterochromatic وتعديلات الهيستون. لهذه الأسباب ، يعد CUT & RUN طريقة قوية لتحديد ملفات تعريف الارتباط لمجموعة واسعة من البروتينات. في الآونة الأخيرة ، تم تحسين CUT & RUN لتنميط عامل النسخ في مجموعات منخفضة من الخلايا والخلايا المفردة ، وقد أطلق على البروتوكول الأمثل اسم CUT & RUN منخفض للغاية (uliCUT & RUN). هنا ، يتم تقديم بروتوكول مفصل لتنميط عامل الخلية الواحدة باستخدام uliCUT & RUN بتنسيق يدوي 96-well.

Introduction

تعمل العديد من البروتينات النووية من خلال التفاعل مع الكروماتين لتعزيز أو منع الأنشطة التي يتم تشكيلها بواسطة الحمض النووي. لتحديد وظيفة هذه البروتينات المتفاعلة مع الكروماتين ، من المهم تحديد المواقع الجينومية التي ترتبط بها هذه البروتينات. منذ تطويره في عام 1985 ، كان الترسيب المناعي للكروماتين (ChIP) هو المعيار الذهبي لتحديد المكان الذي يرتبط فيه البروتين بالكروماتين 1,2. تحتوي تقنية ChIP التقليدية على سير العمل الأساسي التالي: يتم حصاد الخلايا وترابطها (عادة مع الفورمالديهايد) ، ويتم قص الكروماتين (عادة بطرق صوتنة قاسية ، مما يستلزم الربط المتبادل) ، ويتم ترسيب البروتين محل الاهتمام باستخدام جسم مضاد يستهدف البروتين (أو البروتين الموسوم) متبوعا بجسم مضاد ثانوي (مقترن بالأغاروز أو الخرز المغناطيسي) ، ويتم عكس الربط المتبادل ، يتم هضم البروتين والحمض النووي الريبي لتنقية الحمض النووي ، ويتم استخدام هذا الحمض النووي المخصب ChIP كقالب للتحليل (باستخدام المجسات المشعة1,2 أو qPCR3 أو المصفوفات الدقيقة 5,6 أو التسلسل4). مع ظهور المصفوفات الدقيقة والتسلسل العميق المتوازي على نطاق واسع ، تم تطوير ChIP-chip 5,6 و ChIP-seq4 مؤخرا والسماح بتحديد توطين البروتين على الكروماتين على نطاق الجينوم. لقد كان الربط المتقاطع ChIP تقنية قوية وموثوقة منذ ظهوره مع تقدم كبير في الدقة بواسطة ChIP-exo7 و ChIP-nexus8. بالتوازي مع تطوير ChIP-seq ، تم إنشاء بروتوكولات أصلية (غير متقاطعة) ل ChIP (N-ChIP) ، والتي تستخدم هضم النوكليز (غالبا باستخدام nuclease المكورات الدقيقة أو MNase) لتفتيت الكروماتين ، بدلا من الصوتنة التي يتم إجراؤها في تقنيات ChIP التقليدية المتشابكة9. ومع ذلك ، فإن أحد العيوب الرئيسية لكل من تقنيات ChIP و N-ChIP المتقاطعة هو الحاجة إلى أعداد عالية من الخلايا بسبب انخفاض إنتاجية الحمض النووي بعد التلاعب التجريبي. لذلك ، في السنوات الأخيرة ، كانت العديد من الجهود المبذولة نحو تحسين تقنيات ChIP لمدخلات الخلايا المنخفضة. وقد أسفرت هذه الجهود عن تطوير العديد من التقنيات القوية القائمة على ChIP والتي تختلف في قابلية تطبيقها ومتطلبات المدخلات 10،11،12،13،14،15،16،17،18. ومع ذلك ، كانت التقنيات القائمة على ChIP-seq أحادية الخلية غير موجودة ، خاصة بالنسبة للبروتينات غير الهيستونية.

في عام 2004 ، تم تطوير تقنية بديلة لتحديد إشغال البروتين على الكروماتين يسمى الانقسام الداخلي للكروماتين (ChEC) والانقسام المناعي للكروماتين (ChIC)19. تستخدم تقنيات الموضع الواحد هذه اندماج MNase إما مع البروتين محل الاهتمام (ChEC) أو البروتين A (ChIC) للقطع المباشر للحمض النووي المجاور للبروتين محل الاهتمام. في السنوات الأخيرة ، تم تحسين كل من ChEC و ChIC لتنميط البروتين على مستوى الجينوم على الكروماتين (ChEC-seq و CUT & RUN ، على التوالي) 20،21. في حين أن ChEC-seq هي تقنية قوية لتحديد توطين العوامل ، إلا أنها تتطلب تطوير بروتينات MNase-fusion لكل هدف ، في حين أن ChIC واختلافه على نطاق الجينوم ، CUT & RUN ، يعتمدان على جسم مضاد موجه نحو البروتين محل الاهتمام (كما هو الحال مع ChIP) والبروتين المؤتلف A-MNase ، حيث يمكن للبروتين A التعرف على المنطقة الثابتة IgG من الجسم المضاد. كبديل ، تم تطوير بروتين الانصهار A / Protein G-MNase (pA / G-MNase) الذي يمكنه التعرف على مجموعة أوسع من المناطق الثابتة للأجسام المضادة22. سرعان ما أصبح CUT & RUN بديلا شائعا ل ChIP-seq لتحديد توطين البروتين على مستوى جينوم الكروماتين.

تم وصف الإدخال المنخفض للغاية CUT & RUN (uliCUT & RUN) ، وهو شكل مختلف من CUT & RUN يتيح استخدام مدخلات منخفضة وأحادية الخلية ، في 201923. هنا ، يتم وصف منهجية تطبيق يدوي أحادي الخلية بتنسيق 96 بئرا. من المهم ملاحظة أنه منذ تطوير uliCUT & RUN ، تم تطوير بديلين لتنميط الهيستون ، CUT & Tag و iACT-seq ، مما يوفر تنميطا قويا ومتوازيا للغاية لبروتينات الهيستون24,25. علاوة على ذلك ، تم تحسين scCUT & Tag لتنميط عوامل متعددة في خلية واحدة (multiCUT & Tag) وللتطبيق على بروتينات غير هيستون26. معا ، يوفر CUT & RUN بديلا جذابا ل ChIP-seq منخفض الإدخال حيث يمكن إجراء uliCUT & RUN في أي مختبر للبيولوجيا الجزيئية يمكنه الوصول إلى فارز الخلايا والمعدات القياسية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

بيان الأخلاقيات: تمت الموافقة على جميع الدراسات من قبل المكتب المؤسسي لحماية البحوث في السلامة الأحيائية في جامعة بيتسبرغ.

1. إعداد الخرز المغناطيسي

ملاحظة: قم بإجراء عملية الفرز قبل فرز الخلايا واستمر في وضع الثلج حتى الاستخدام.

  1. ماصة 30 ميكرولتر من الميكروسفير المجهري شبه المغناطيسي المترافق مع ConA مزيج الطين الخرزة لكل تفاعل مع أنبوب microfuge جديد 1.5 مل وإضافة 850 ميكرولتر من المخزن المؤقت ملزمة ، سحب بلطف للخلط.
    ملاحظة: المجهرية البارامغناطيسية المترافقة مع ConA عبارة عن حبات مغناطيسية مغلفة بالليكتين تسمح بربط غشاء الدهون.
  2. ضع الأنبوب على رف مغناطيسي واسمح للخرز بالمغناطيس لمدة 1-2 دقيقة. بمجرد إزالة supernatant ، قم بإزالة والتخلص من supernatant دون إزعاج الخرز.
  3. قم بإزالة الأنبوب من الرف المغناطيسي واغسل الخرز عن طريق التعليق في 1 مل من المخزن المؤقت الملزم.
  4. كرر الخطوتين 1.2 و1.3.
  5. مغنطة الخرز لمدة 2 دقيقة وإزالة supernatant للتخلص منها.
  6. قم بإزالة الأنبوب من الرف المغناطيسي وأعد تعليق الخرز في 30 ميكرولتر من المخزن المؤقت للربط لكل تفاعل.
  7. امسك مزيج الخرز المغسول على الثلج حتى يتم فرز الخلايا.

2. خلايا الحصاد

ملاحظة: تمت كتابة هذه الخطوة للخلايا الملتصقة ومحسنة للخلايا الجذعية الجنينية الفئران E14. تعتمد زراعة الخلايا وحصادها على نوع الخلية.

  1. قم بإزالة الخلايا من الحاضنة التي تبلغ درجة حرارتها 37 درجة مئوية وفحصها تحت المجهر لضمان الجودة.
  2. استنشاق الوسائط من صفيحة الخلية وشطفها ب 5 مل من 1x PBS.
  3. استنشاق PBS من اللوحة وحصاد الخلايا (باستخدام طرق حصاد الخلايا التقليدية التي ستختلف حسب نوع الخلية). احصل على تعليق أحادي الخلية عن طريق السحب بلطف لأعلى ولأسفل باستخدام ماصة مصلية ضد طبق الزرع ، إذا لزم الأمر.
  4. انقل تعليق الخلية إلى أنبوب مخروطي 15 مل وقم بالدوران لأسفل عند 200 × g لمدة 5 دقائق.
  5. استنشق الوسائط للتخلص من حبيبات الخلايا وغسلها ب 5 مل من PBS + 1٪ FBS.
  6. قم بتدوير الخلايا عند 200 × g لمدة 5 دقائق ، وتخلص من supernatant ، وأعد تعليق حبيبات الخلية في 5 مل من PBS + 1٪ FBS.
  7. عد الخلايا وانقل 1 مل من 1 × 106 خلايا إلى أنبوب microfuge جديد 1.5 مل.
  8. أضف 5 ميكرولتر من 7-Amino-Actinomycin D (7-AAD) ، وقلب الأنبوب جيدا للخلط ، ثم ضع العينة على فارز الخلايا لفرز الخلايا المفردة الحية في آبار فردية من صفيحة 96 بئرا.
    ملاحظة: يتم استبعاد صبغة 7-AAD من الخلايا الحية ، وبالتالي يمكن استخدامها في فرز الخلايا الحية.

3. فرز الخلايا وتحللها

  1. قم بإعداد صفيحة 96 بئرا متوافقة مع فارز الخلايا مع 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت للاستخراج النووي (NE) في كل بئر قبل فرز الخلايا.
  2. فرز الخلايا إلى لوحات 96 بئر باتباع تعليمات الشركة المصنعة.
  3. قم بتدوير اللوحة بسرعة (600 × g لمدة 30 ثانية) لضمان وجود الخلايا في المخزن المؤقت داخل الآبار.
    ملاحظة: يجدر الاختبار في تجربة أولية ما إذا كانت الخلايا المستخدمة يتم إحضارها بشكل موثوق إلى قاع الآبار.
  4. امسك العينات على الجليد لمدة 15 دقيقة.
  5. قم بتدوير العينات عند 600 × g لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية وقم بماصة بعناية لإزالة supernatant (تاركة وراءها 5 ميكرولتر).
  6. أعد تعليق كل عينة في 55 ميكرولتر من المخزن المؤقت NE وأضف 30 ميكرولتر من الميكروسفير البارامغناطيسي المقترن ب ConA المغسول مسبقا (من الخطوة 1.7 ؛ في المخزن المؤقت الملزم) إلى كل تفاعل.
  7. احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق.

4. عينات ما قبل الكتلة لمنع الهضم المبكر بواسطة MNase

  1. ضع اللوحة على رف مغناطيسي بسعة 96 بئرا ، واسمح للخرز بالارتباط لمدة لا تقل عن 5 دقائق ، ثم قم بإزالة والتخلص من supernatant.
  2. أضف 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت المانع إلى الخرز المرتبط بالنواة واخلطه مع السحب اللطيف.
  3. احتضان لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.

5. إضافة الأجسام المضادة الأولية

  1. ضع اللوحة على رف مغناطيسي بسعة 96 بئرا ، واسمح لل supernatant بالتنظيف لمدة لا تقل عن 5 دقائق ، ثم قم بإزالة والتخلص من supernatant دون إزعاج الخرز.
  2. قم بإزالة اللوحة من الرف المغناطيسي وأعد تعليق الخرز في 100 ميكرولتر من Wash Buffer لكل تفاعل باستخدام السحب اللطيف.
  3. ضع اللوحة مرة أخرى على الرف المغناطيسي الذي يبلغ طوله 96 بئرا ، واسمح لل supernatant بالتنظيف ، ثم قم بإزالة السطح والتخلص منه.
  4. أعد تعليق الخرز في 25 ميكرولتر من Wash Buffer لكل تفاعل باستخدام السحب اللطيف.
  5. اصنع مزيجا رئيسيا أساسيا من الأجسام المضادة: 25 ميكرولتر من Wash Buffer + 0.5 ميكرولتر من الأجسام المضادة لكل تفاعل.
  6. أثناء تدوير الخرز المرتبط بالنوى بلطف ، أضف 25 ميكرولتر من المزيج الرئيسي الأساسي للأجسام المضادة إلى كل عينة يتم معالجتها بجسم مضاد يستهدف البروتين محل الاهتمام (عادة 1:100 التخفيف النهائي). أضف 25 ميكرولتر من Wash Buffer بدون جسم مضاد ، إذا كنت تقوم بإجراء عملية تحكم.
  7. حضانة لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
  8. ضع العينات على رف مغناطيسي بسعة 96 بئرا ، واسمح لل supernatant بالتنظيف لمدة لا تقل عن 5 دقائق ، ثم قم بإزالة والتخلص من supernatant دون إزعاج الخرز.
  9. قم بإزالة اللوحة من الرف المغناطيسي واغسل الخرز ب 100 ميكرولتر من Wash Buffer ، مع إعادة التعليق عن طريق السحب.

6. إضافة pA-MNase أو pA / G-MNase

ملاحظة: البروتين A لديه تقارب كبير مع جزيئات IgG من أنواع معينة مثل الأرانب ولكنه غير مناسب ل IgGs من الأنواع الأخرى مثل الفئران أو الجرذان. بدلا من ذلك ، يمكن استخدام البروتين A / G-MNase. يربط هذا الهجين الأرانب والفئران والفئران IgGs ، ويتجنب الحاجة إلى الأجسام المضادة الثانوية عند استخدام الأجسام المضادة الأولية للفئران أو الفئران.

  1. ضع اللوحة مرة أخرى على رف مغناطيسي بسعة 96 بئرا ، واسمح لل supernatant بالإزالة لمدة لا تقل عن 5 دقائق ، ثم قم بإزالة والتخلص من supernatant دون إزعاج الخرز.
  2. قم بإزالة اللوحة من الرف المغناطيسي وأعد تعليق كل عينة في 25 ميكرولتر من Wash Buffer.
  3. اصنع مزيجا رئيسيا من pA-MNase (25 ميكرولتر من المخزن المؤقت للغسيل + كمية محسنة من pA-MNase لكل تفاعل).
  4. أثناء الدوامة بلطف ، أضف 25 ميكرولتر من المزيج الرئيسي pA-MNase إلى كل عينة ، بما في ذلك عينات التحكم.
    ملاحظة: يختلف تركيز pA-MNase عند التحضير ، إذا كان محلي الصنع ، ويجب اختباره قبل استخدامه عند كل تنقية مستقلة. بالنسبة ل pA / G-MNase ، يجب استخدام 2.5 ميكرولتر من مخزون 20x.
  5. احتضان العينات لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
  6. ضع اللوحة على رف مغناطيسي بسعة 96 بئرا ، واسمح لل supernatant بالتنظيف لمدة لا تقل عن 5 دقائق ، ثم قم بإزالة والتخلص من supernatant دون إزعاج الخرز.
  7. قم بإزالة اللوحة من الرف المغناطيسي واغسل الخرز ب 100 ميكرولتر من Wash Buffer ، مع إعادة التعليق عن طريق السحب اللطيف.

7. هضم الحمض النووي الموجه

  1. ضع اللوحة على رف مغناطيسي بسعة 96 بئرا ، واسمح لل supernatant بالتنظيف لمدة لا تقل عن 5 دقائق ، ثم قم بإزالة والتخلص من supernatant.
  2. قم بإزالة العينات من الرف المغناطيسي وأعد تعليق الخرز في 50 ميكرولتر من Wash Buffer عن طريق السحب اللطيف.
  3. قم بموازنة العينات إلى 0 درجة مئوية في خليط ثلج / ماء لمدة 5 دقائق.
  4. قم بإزالة العينات من حمام الثلج / الماء 0 درجة مئوية وإضافة 1 ميكرولتر من 100 mM CaCl2 باستخدام ماصة متعددة القنوات. اخلطي جيدا (3-5 مرات) باستخدام ماصة متعددة القنوات أكبر حجما، ثم أعيدي العينات إلى 0 درجة مئوية.
    ملاحظة: الخلط جيدا هنا أمر ضروري. يضاف CaCl2 لتنشيط هضم MNase للحمض النووي المحيط بالبروتين محل الاهتمام.
  5. ابدأ تشغيل مؤقت لمدة 10 دقائق بمجرد عودة اللوحة إلى حمام الثلج / الماء.
  6. أوقف التفاعل عن طريق سحب 50 ميكرولتر من 2XRSTOP+ Buffer في كل بئر ، بنفس ترتيب إضافة CaCl2 .
    ملاحظة: اصنع 2XRSTOP+ Buffer قبل انتهاء عملية الهضم لمدة 10 دقائق لمنع الإفراط في الهضم.

8. تجزئة العينة

  1. احتضان العينات لمدة 20 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
  2. قم بتدوير اللوحة عند 16000 × g لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
  3. ضع اللوحة على رف مغناطيسي بسعة 96 بئرا ، واسمح لل supernatant بالتطهير لمدة لا تقل عن 5 دقائق ، وانقل الخارقين إلى صفيحة جديدة من 96 بئرا. تخلص من الخرز.

9. استخراج الحمض النووي

  1. أضف 1 ميكرولتر من 10٪ كبريتات دوديسيل الصوديوم (SDS) و 0.83 ميكرولتر من 20 ملغ / مل من بروتيناز K إلى كل عينة.
    تنبيه: مسحوق SDS ضار إذا تم استنشاقه. يجب على المستخدمين استخدامها في الأماكن جيدة التهوية مرتدين نظارات واقية وقفازات وجهاز تنفس من الدرجة N95 ، والتعامل معه بعناية.
  2. امزج العينات عن طريق السحب اللطيف.
  3. احتضان العينات لمدة 10 دقائق عند 70 درجة مئوية.
  4. أعد اللوحة إلى درجة حرارة الغرفة وأضف 46.6 ميكرولتر من 5 M NaCl و 90 ميكرولتر من 50٪ PEG 4000. اخلطيه عن طريق السحب اللطيف.
  5. أضف 33 ميكرولتر من حبات البوليسترين المغنطيسية إلى كل عينة واحتضنها لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
    ملاحظة: تأكد من إحضار حبات البوليسترين المغنطيسية إلى درجة حرارة الغرفة (~ 30 دقيقة) واخلطها جيدا قبل الاستخدام.
  6. ضع اللوحة على رف مغناطيسي واسمح لل supernatant بالتنظيف لمدة 5 دقائق تقريبا ، ثم تخلص بعناية من supernatant دون إزعاج الخرز.
  7. شطف 2x مع 150 ميكرولتر من 80 ٪ من الإيثانول دون إزعاج الخرز.
    تحذير: الإيثانول قابل للاشتعال للغاية ويسبب تهيج الجلد والعين والرئة. قم بتنفيذ هذه الخطوة بملابس المختبر المناسبة وفي غطاء رأس تنفيس.
  8. قم بتدوير اللوحة لفترة وجيزة عند 1000 × g لمدة 30 ثانية. ضع اللوحة مرة أخرى على رف مغناطيسي بسعة 96 بئرا وقم بإزالة جميع EtOH المتبقية دون إزعاج الخرز.
  9. تجفيف العينات في الهواء لمدة ~ 2-5 دقائق.
    ملاحظة: لا تجفف الخرز لمدة تزيد عن 5 دقائق. إذا كنت مجتهدا في إزالة EtOH ، فإن 2-3 دقائق من التجفيف كافية.
  10. أعد تعليق الخرز بسعة 37.5 ميكرولتر من 10 mM Tris-HCl (الرقم الهيدروجيني 8) واحتضنها لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
  11. ضع اللوحة على رف مغناطيسي واسمح للخرز بالارتباط لمدة 5 دقائق.
  12. انقل 36.5 ميكرولتر من المادة الفائقة إلى لوحة 96 بئر جديدة متوافقة مع جهاز تدوير الحرارة. تخلص من الخرز.
    ملاحظة: يمكن إيقاف التجربة هنا عن طريق تخزين العينات عند -20 درجة مئوية أو يمكن الاستمرار في إنشاء المكتبة (الخطوات من 10 إلى 15).

10. نهاية الإصلاح ، الفسفرة ، الأدينيل

ملاحظة: يتم الحصول على الكواشف كما هو مشار إليه في جدول المواد. يتبع البروتوكول أدناه طريقة مماثلة للمجموعة التجارية مثل مجموعة NEBNext Ultra DNA II.

  1. تمييع 5 U / ميكرولتر من بوليميراز الحمض النووي T4 1:20 في 1x T4 الحمض النووي ligase العازلة.
  2. قم بإعداد مزيج رئيسي من الإصلاح النهائي / 3'A: 2 ميكرولتر من 10x T4 DNA ligase buffer ، 2.5 ميكرولتر من 10 mM dNTPs ، 1.25 ميكرولتر من 10 mM ATP ، 3.13 μL من 40٪ PEG 4000 ، 0.63 μL من 10 U / μL T4 PNK ، 0.5 ميكرولتر من بوليميراز الحمض النووي T4 المخفف ، 0.5 ميكرولتر من 5U / μL Taq DNA polymerase ، مع حجم إجمالي قدره 13.5 ميكرولتر لكل تفاعل.
    ملاحظة: تأكد من إحضار 40٪ PEG 4000 إلى درجة حرارة الغرفة قبل السحب.
  3. أضف 13.5 ميكرولتر من المزيج الرئيسي للإصلاح النهائي / 3'A إلى 36.5 ميكرولتر من الحمض النووي.
  4. امزج التفاعل عن طريق الدوامة السريعة ، ثم قم بتدوير سريع (500 × g لمدة 10 ثوان).
  5. احتضان باستخدام ظروف التفاعل التالية في جهاز تدوير حراري مبرد مسبقا مع غطاء ساخن لدرجات حرارة >20 درجة مئوية. استخدم ظروف التفاعل: 12 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة ، 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة ، 72 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة ، مع الاستمرار عند 4 درجات مئوية.

11. ربط محول

ملاحظة: احتفظ بالعينات على الجليد أثناء إعداد التفاعل التالي. اسمح للمخزن المؤقت لليغاز بالوصول إلى درجة حرارة الغرفة قبل السحب. قم بتخفيف المحول (انظر جدول المواد) في محلول من 10 mM Tris-HCl يحتوي على 10 mM NaCl (الرقم الهيدروجيني 7.5). نظرا لانخفاض العائد ، لا تقم مسبقا بتحديد كمية الحمض النووي المخصب ب CUT & RUN. بدلا من ذلك ، قم بإنشاء تخفيفات 25 ضعفا للمحول ، باستخدام تركيز محول عمل نهائي يبلغ 0.6 ميكرومتر.

  1. قم بعمل مزيج رئيسي من الربط: 55 ميكرولتر من المخزن المؤقت لليغاز (2x) ، و 5 ميكرولتر من ليغاز الحمض النووي T4 ، و 5 ميكرولتر من المحول المخفف ، بحجم إجمالي قدره 65 ميكرولتر لكل تفاعل.
  2. أضف 65 ميكرولتر من مزيج الربط الرئيسي إلى 50 ميكرولتر من الحمض النووي من الخطوة 10.5.
  3. امزج عن طريق الدوامة السريعة ، تليها الغزل السريع (500 × g لمدة 10 ثوان).
  4. احتضان عند 20 درجة مئوية في دورة حرارية (بدون غطاء ساخن) لمدة 15 دقيقة.
    ملاحظة: انتقل فورا إلى الخطوة التالية.

12. هضم المستخدم

  1. أضف 3 ميكرولتر من إنزيم USER إلى كل عينة ودوامة ودوران (500 × g لمدة 10 ثوان).
  2. احتضن في دورة حرارية عند 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة (الغطاء الساخن مضبوط على 50 درجة مئوية).

13. البوليسترين المغنطيسية خرزة تنظيف بعد تفاعل الربط

ملاحظة: اسمح لخرز البوليسترين المغنطيسية بالتوازن في درجة حرارة الغرفة (~ 30 دقيقة). دوامة لتجانس حل الخرز قبل الاستخدام. نفذ الخطوات التالية في درجة حرارة الغرفة.

  1. أضف 39 ميكرولتر (0.33x) من محلول حبة البوليسترين المغنطيسية إلى كل بئر يحتوي على الحمض النووي المحول المربوط.
  2. اخلطي جيدا عن طريق السحب ، ثم احتضني العينات في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة للسماح للحمض النووي بالارتباط بالخرز.
  3. ضع العينات على رف مغناطيسي بسعة 96 بئرا واحتضنها لمدة 5 دقائق حتى يصبح السوبرناتانت صافيا.
  4. احتفظ باللوحة على الرف المغناطيسي وقم بإزالة والتخلص بعناية من supernatant دون إزعاج الخرز.
  5. شطف الخرز مع 200 ميكرولتر من 80 ٪ EtOH دون إزعاج الخرز.
  6. احتضن لمدة 30 ثانية على رف مغناطيسي بسعة 96 بئرا للسماح للمحلول بالمسح.
  7. قم بإزالة والتخلص من supernatant دون إزعاج الخرز.
  8. كرر الخطوات من 13.5 إلى 13.7 لما مجموعه غسلتين.
  9. قم بتدوير اللوحة لفترة وجيزة عند 500 × g لمدة 10 ثوان ، وضع اللوحة مرة أخرى على رف مغناطيسي بسعة 96 جيدا ، وقم بإزالة EtOH المتبقي دون إزعاج الخرز.
  10. احتفظ باللوحة على الرف المغناطيسي وجفف العينات في الهواء لمدة 2 دقيقة.
    ملاحظة: لا تفرط في تجفيف الخرز.
  11. قم بإزالة اللوحة من الرف المغناطيسي وأعد تعليق الخرز في 28.5 ميكرولتر من 10 mM Tris-HCl (الرقم الهيدروجيني 8).
    تحذير: حمض الهيدروكلوريك قابل للتآكل للغاية. يجب على المستخدمين التعامل معها بعناية في غطاء الدخان الكيميائي الذي يرتدي نظارات واقية وقفازات ومعطف مختبر.
  12. أعد تعليق الخرز تماما عن طريق السحب ، مع الحرص على عدم إنتاج فقاعات.
  13. احتضان لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
  14. ضع اللوحة على رف مغناطيسي بسعة 96 بئرا واسمح للمحلول بالإزالة لمدة 5 دقائق.
  15. انقل 27.5 ميكرولتر من supernatant إلى لوحة PCR جديدة وتخلص من الخرز.

14. إثراء المكتبة

ملاحظة: يتم تخفيف الاشعال بنفس الحل مثل المحول. لبناء هذه المكتبة ، استخدم تركيز تمهيدي نهائي للعمل يبلغ 0.6 ميكرومتر.

  1. أضف 5 ميكرولتر من التمهيدي المفهرس المخفف (انظر جدول المواد) إلى كل عينة.
    ملاحظة: تحتاج كل عينة إلى فهرس مختلف ليتم تحديده بعد التسلسل.
  2. تحضير مزيج رئيسي PCR: 10 ميكرولتر من 5x عالية الدقة PCR المخزن المؤقت، 1.5 ميكرولتر من 10 mM dNTPs، 5 ميكرولتر من التمهيدي العالمي المخفف، 1 ميكرولتر من 1 U بداية ساخنة عالية الدقة البوليميراز، مع إجمالي حجم المزيج الرئيسي من 17.5 ميكرولتر لكل عينة.
  3. أضف 17.5 ميكرولتر pf PCR إلى 32.5 ميكرولتر من الحمض النووي النقي المربوط بالمحول (يتم تضمين 5 ميكرولتر من التمهيدي المفهرس في هذا المجلد).
  4. خلط الحل عن طريق السحب.
  5. احتضن في جهاز تدوير حراري باستخدام ظروف التفاعل التالية بحد أقصى لمعدل المنحدر يبلغ 3 درجات مئوية / ثانية: 98 درجة مئوية لمدة 45 ثانية ، 98 درجة مئوية لمدة 45 ثانية ، 60 درجة مئوية لمدة 10 ثوان ، كرر الخطوتين الثانية والثالثة 21 مرة ، 72 درجة مئوية لمدة دقيقة واحدة ، امسك عند 4 درجات مئوية.
    ملاحظة: يمكن الاحتفاظ بالعينات عند 4 درجات مئوية للتخزين على المدى القصير أو -20 درجة مئوية للتخزين على المدى الطويل.

15. البوليسترين المغنطيسية خرزة تنظيف

  1. أضف 60 ميكرولتر (1.2x) من حبات البوليسترين المغنطيسية إلى كل عينة.
  2. أعد تعليق الخرز عن طريق السحب واحتضانه لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
  3. ضع اللوحة على رف مغناطيسي لمدة 5 دقائق حتى يصبح المحلول واضحا.
  4. تخلص من supernatant وشطف الخرز مع 200 ميكرولتر من 80 ٪ EtOH دون إزعاج الخرز.
  5. كرر خطوة الغسيل لما مجموعه غسلتين EtOH بنسبة 80٪.
  6. قم بتدوير اللوحة عند 500 × g لمدة 10 ثوان ، وضع اللوحة على رف مغناطيسي بسعة 96 جيدا ، واسمح للخرز بالارتباط لمدة 5 دقائق.
  7. ماصة لإزالة EtOH الزائدة دون إزعاج الخرز والسماح للحبات لتجف في الهواء لمدة 2 دقيقة.
    ملاحظة: لا تفرط في تجفيف الخرز.
  8. أعد تعليق الخرز في 21 ميكرولتر من الماء الخالي من النوكليز واحتضنه لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
  9. ضع اللوحة على رف مغناطيسي واسمح للمحلول بالمسح لمدة 5 دقائق.
  10. نقل 20 ميكرولتر من supernatant إلى لوحة جديدة.
    ملاحظة: يمكن إيقاف التجربة هنا عن طريق تخزين العينة عند -20 درجة مئوية.
  11. حدد تركيزات المكتبة باستخدام مقياس الفلورومتر (انظر جدول المواد) ، باستخدام كاشف HS 1x.
  12. إذا سمح التركيز ، فقم بتشغيل 30 نانوغرام من العينة على هلام الأغاروز بنسبة 1.5٪ مع سلم منخفض الوزن الجزيئي للتصور. بدلا من ذلك ، تصور على محلل الأجزاء أو أداة ذات صلة.
  13. مكتبات التسلسل على منصة Illumina للحصول على حوالي 50,000-100,000 قراءة تم تعيينها بشكل فريد.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

هنا ، يتم تقديم بروتوكول مفصل لتنميط البروتين أحادي الخلية على الكروماتين باستخدام تنسيق يدوي 96-well uliCUT & RUN. في حين أن النتائج ستختلف بناء على البروتين الذي يتم تعريفه (بسبب وفرة البروتين وجودة الأجسام المضادة) ، ونوع الخلية ، والعوامل المساهمة الأخرى ، تتم مناقشة النتائج المتوقعة لهذه التقنية هنا. يجب تقييم جودة الخلية (مظهر الخلية والنسبة المئوية للخلايا القابلة للحياة) والفرز أحادي الخلية قبل أو في وقت فرز الخلايا الحية في المخزن المؤقت NE. ويرد مثال على مستعمرات الخلايا الجذعية الجنينية وفرز الخلايا في الشكل 2A,B. على وجه التحديد ، لا ينبغي استخدام الخلايا منخفضة الجودة ، وإذا كانت الجودة تمثل مشكلة ، فيجب توخي الحذر لاتباع الإرشادات الخاصة بنوع الخلية المحدد. بالإضافة إلى ذلك ، يجب تقييم الفرز الدقيق للخلايا بواسطة أداة فرز الخلايا قبل التجريب. على سبيل المثال ، يمكن فرز خلايا الاختبار وتلوينها باستخدام صبغة Hoechst 33342 وحسابها لضمان العثور على خلية 0 أو 1 في كل بئر. إذا لم يتم العثور على خلايا مفردة، فيجب تحسين شروط الفرز. بعد إعداد المكتبة ، يمكن تقييم العينات إما على هلام الأغاروز (إذا كان التركيز يسمح بتحميل 30 نانوغرام أو أكثر ، حيث يوجد حد أدنى لتصور الحمض النووي على هلام الأغاروز) أو محلل الشظايا (أو جهاز مماثل مثل التشريح أو المحلل الحيوي) قبل التسلسل وتظهر نتائج الأمثلة في الشكل 2C ، D. على وجه التحديد ، توزيع الحجم المتوقع هو من ~ 150 إلى ~ 500 نقطة أساس. في كميات الخلايا الأعلى ، سيكون ل CUT & RUN الذي يتم إجراؤه على البروتينات الكبيرة (مثل الهيستونات) توزيع حجم على الجانب الأيمن ، حيث سيتم رؤية غالبية الحمض النووي ~ 270 نقطة أساس. ومع ذلك ، لا يلاحظ هذا الكتف عادة في تجارب الخلية الواحدة.

بعد التسلسل ، يجب تقييم جودة قراءات التسلسل باستخدام FASTQC. يجب تحديد النسبة المئوية لقراءات الخرائط الفريدة. عادة ، يتم ملاحظة قراءات رسم الخرائط الفريدة بنسبة 0.5٪ -10٪ في تجارب الخلية الواحدة. تشبه نسب رسم الخرائط هذه تقنيات الخلية الواحدة الأخرى القائمة على الحمض النووي30. بعد ذلك ، يجب تحديد توزيع حجم القراءات بعد التعيين للتأكد من أن ملف التعريف مشابه للتسلسل المسبق (مع عدم مساهمة تسلسل المحول في أحجام القراءة).

بعد تقييم جودة البيانات، يمكن تصور إشغال البروتين باستخدام طرق مختلفة: يمكن تصور صور متصفح الجينوم أحادي الموضع باستخدام متصفح الجينوم UCSC أو IGV (الشكل 3A) ويمكن تصور أنماط الإشغال على مستوى الجينوم على إحداثيات جينومية محددة باستخدام مخططات التعريف (الشكل 3B، أسفل)، الخرائط الحرارية (الشكل 3B، أعلى)، أو الخرائط الحرارية 1D (الشكل 3C). لمزيد من المعلومات حول تحليل البيانات ، راجع الدراسة التي أجرتها Patty and Hainer27. ستؤدي بيانات الخلية الواحدة من خلية ثنائية الصبغيات إلى ما يصل إلى أربع قراءات تساهم في كل موضع (أربع قراءات إذا كانت الخلية في الانقسام الخيطي) ، ولكن في كثير من الأحيان قراءة واحدة أو اثنتين. لذلك ، فإن البيانات ثنائية ، ويمكن بسهولة الخلط بين الخلفية العالية والإشغال ، مقارنة بتجارب الخلايا العالية. لذلك ، يوصى بإجراء تجربة CUT & RUN موازية على عدد خلايا مرتفع (5000 إلى 100000 خلية) ، إن أمكن ، للحصول على جميع مواقع الربط المحتملة للبروتين محل الاهتمام. بعد ذلك ، يمكن مقارنة بيانات الخلية الواحدة بمواقع الربط المحتملة. في الأمثلة الموضحة في الشكل 3 ، تتم مقارنة نتائج CTCF uliCUT & RUN أحادية الخلية ب CTCF uliCUT & RUN عالي الخلية (الشكل 3A) أو ChIP-seq (الشكل 3B ، C). كما هو موضح سابقا ، مثلت قمم CTCF و SOX2 و NANOG أحادية الخلية uliCUT & RUN إلى حد كبير قمم أقوى من مجموعات بيانات ChIP-seq عالية الخلايا23.

Figure 1
الشكل 1: مخطط بروتوكول uliCUT & RUN. يتم حصاد الخلايا وفرزها في صفيحة من 96 بئرا تحتوي على مخزن مؤقت NE. ثم ترتبط النوى الفردية بالميكروسفير البارامغناطيسي المترافق ، ويتم إضافة جسم مضاد (يستهدف البروتين محل الاهتمام) و pA-MNase أو pA / G-MNase بالتتابع. يتم شق الحمض النووي المجاور للبروتين عبر MNACE ، ثم يتم تنقية الحمض النووي للاستخدام في إعداد المكتبة. تم إنشاء هذا الرقم مع Biorender.com. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: نتائج المثال من فرز الخلايا ومراقبة الجودة لمكتبات uliCUT & RUN . (أ) صورة لخلايا جذعية جنينية (ES) عالية الجودة. شريط المقياس: 200 ميكرومتر (ب) الناتج من الفرز أحادي الخلية بعد إضافة 7AAD إلى الخلايا ES المحصودة والفرز على أداة FACS. (ج) هلام الأغاروز الملطخ ببروميد الإيثيوم الذي يصور مكتبات uliCUT & RUN المكتملة. Lane 1 هو سلم منخفض الوزن الجزيئي والممرات 2-21 هي أمثلة على مكتبات uliCUT & RUN الفردية الناجحة أحادية الخلية قبل التسلسل. (د) هلام الأغاروز الملطخ ببروميد الإيثيديوم الذي يصور مكتبات uliCUT & RUN المكتملة دون المستوى الأمثل والأمثل. Lane 1 هو سلم منخفض الوزن الجزيئي ، و lane 2 هي مكتبة دون المستوى الأمثل بسبب عدم كفاءة هضم MNase ، و lane 3 هي مكتبة ناجحة مع الهضم المناسب. (ه) توزيع محلل الأجزاء لمكتبة uliCUT & RUN أحادية الخلية قبل التسلسل. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: مثال على النتائج المتوقعة لبيانات uliCUT & RUN أحادية الخلية ES. (أ) تتبع المتصفح لعدد الخلايا العالية (5000 خلية) CTCF أو التحكم السلبي (بدون جسم مضاد ، لا Ab) uliCUT & RUN (أعلى مسارين) و CTCF uliCUT & RUN أحادي الخلية. تم إعادة إنتاج الصورة ، بإذن ، من Patty و Hainer27. (ب) الخرائط الحرارية (أعلى) ومخططات التعريف (أسفل) ل CTCF أحادي الخلية أو التحكم السلبي (No Ab) uliCUT & RUN على مواقع CTCF ChIP-seq المنشورة سابقا (GSE11724). يتم إعادة إنتاج الصورة ، بإذن ، من Hainer et al.23. (C) خرائط حرارية 1D ل CTCF أحادي الخلية أو التحكم السلبي (No Ab) uliCUT & RUN على مواقع CTCF ChIP-seq المنشورة سابقا (GSE11724). يتم إعادة إنتاج الصورة ، بإذن ، من Hainer et al.23. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الجدول 1: تكوين مختلف المخازن المؤقتة المستخدمة في هذا البروتوكول. يتم سرد حجم محلول المخزون المطلوب مع التركيز النهائي المكتوب بين قوسين. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الجدول.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

CUT & RUN هو بروتوكول فعال لتحديد توطين البروتين على الكروماتين. لديها العديد من المزايا بالنسبة للبروتوكولات الأخرى ، بما في ذلك: 1) نسبة الإشارة إلى الضوضاء العالية ، 2) البروتوكول السريع ، و 3) تغطية قراءة التسلسل المنخفض المطلوبة مما يؤدي إلى توفير التكاليف. يتيح استخدام البروتين A أو البروتين A / G-MNase تطبيق CUT & RUN مع أي جسم مضاد متاح. لذلك ، لديها القدرة على تحديد ملامح العديد من البروتينات بسرعة وسهولة. ومع ذلك ، كان التكيف مع خلية واحدة لأي تنميط بروتين على الكروماتين أمرا صعبا ، خاصة عند مقارنته بالنسخ أحادي الخلية (أي scRNA-seq) ، بسبب انخفاض عدد نسخ الحمض النووي بالنسبة للحمض النووي الريبي (نسختان إلى أربع نسخ من الحمض النووي مقابل الآلاف المحتملة من نسخ الحمض النووي الريبي).

في البروتوكول المفصل أعلاه ، ينبغي النظر في عدة خطوات حاسمة. أولا ، يعتمد الفرز المناسب للخلايا على نوع الخلية (أو الأنسجة) ، ويجب توخي الحذر للفرز الدقيق. يوصى باختبار مدى فعالية الفرز أحادي الخلية باستخدام الأداة قبل أي تجربة. ثانيا، اختيار الأجسام المضادة الفعال أمر ضروري. قبل الشروع في تطبيق خلية واحدة ، يوصى باختبار الجسم المضاد في تجربة عدد خلايا عالية (بالإضافة إلى اختبارات الأجسام المضادة القياسية الأخرى ، مثل تأكيد الخصوصية باستخدام اللطخة الغربية بعد الضربة القاضية ، ومعايرة الجسم المضاد في تجارب CUT & RUN ، وما إلى ذلك). ثالثا ، استخدم ضابطا سلبيا ، مثل IgG أو لا يوجد جسم مضاد أولي ، لأن المقارنة المناسبة مع العينات التجريبية ضرورية لتفسير جودة البيانات والنتائج البيولوجية. عند مقارنة النتائج التجريبية أحادية الخلية بمجموعة بيانات عالية الخلية ، يجب أن يكون لتجارب الخلية الواحدة ذات التحكم السلبي تغطية قراءة أقل على تلك المواقع الملزمة المحددة في تجربة الخلية العالية وبدلا من ذلك يكون لها توزيع عشوائي للقراءات عبر الجينوم (مع تحيز للمناطق المفتوحة من الكروماتين). رابعا ، يجب توخي الحذر عند إضافة وتنشيط البروتين A أو البروتين A / G-MNase حتى لا تفرط في هضم الكروماتين: لا تسخن العينات بيديك ، وحافظ على العينات في درجة حرارة حمام ثلجي / مائي (0 درجة مئوية) ، وقم بتخليب التفاعل في الوقت المناسب. خامسا ، يجب توخي الحذر طوال تجربة uliCUT & RUN وإعداد المكتبة ، بسبب انخفاض المواد. على سبيل المثال ، الحضانة الموسعة على الرف المغناطيسي أثناء ربط الخرز للتأكد من أن السوبرناتانت قد تم تطهيرها والحرص على عدم إزعاج الخرز عند إزالة supernatant ضرورية للحصول على عائد كاف. سادسا، اعتمادا على الأسئلة التي يجري تناولها، فإن عدد التجارب أحادية الخلية التي يجري إجراؤها هو اعتبار مهم. ستفشل بعض تجارب الخلية الواحدة (كما هو الحال مع جميع التجارب منخفضة المدخلات) ، وبالتالي ، ينبغي النظر في عدد النتائج التجريبية الإيجابية المطلوبة للتفسير المناسب قبل بدء التجربة. يعتمد عدد الخلايا التي يجب تضمينها في التجربة على كمية البيانات التجريبية المطلوبة من قبل الباحث وجودة الجسم المضاد. وأخيرا، لاحظ أنه يمكن تحقيق نتائج مكافئة بتخفيض حجم العديد من جوانب هذا البروتوكول. تشمل الخطوات التي تم فيها تقليل الحجم بنسبة 50٪ حجم المخزن المؤقت NE ، ومخزن الغسيل المؤقت ، وخليط الأجسام المضادة الأولية (بما في ذلك كمية الأجسام المضادة الأولية) ، وخليط pA-MNase (بما في ذلك كمية pA-MNase) ، وجميع الخطوات في إعداد المكتبة.

استنادا إلى الطبيعة المعقدة لتنميط العوامل على الكروماتين ، هناك العديد من المصادر المحتملة للمشكلات والأماكن التي قد يصبح فيها استكشاف الأخطاء وإصلاحها ضروريا. وفي حين أنه قد تكون هناك العديد من الخطوات التي يمكن أن تنشأ فيها مشكلات، فقد لوحظت ثلاث قضايا رئيسية: 1) انخفاض إنتاجية الحمض النووي للمدخلات في بناء المكتبات؛ و 1) انخفاض إنتاج الحمض النووي للمدخلات في بناء المكتبات؛ و 1) انخفاض إنتاج الحمض النووي للمدخلات في بناء المكتبات؛ و 1) انخفاض إنتاج الحمض النووي للمدخلات في بناء المكتبات؛ و 1) انخفاض 2) إشارة خلفية عالية في العينات التجريبية ، و 3) انخفاض العائد بعد بناء المكتبة. إذا لم يكن هناك ما يكفي من الحمض النووي لإعداد المكتبة وتسلسلها (النقطة 1) ، فلاحظ نصيحة استكشاف الأخطاء وإصلاحها التالية: أ) ربما كان هناك تحلل غشائي غير مكتمل وبالتالي يمكن زيادة وقت التحلل باستخدام المخزن المؤقت NE ؛ ب) قد يكون هناك ارتباط غير فعال للنواة بالميكروسفير المجهري البارامغناطيسي المترافق مع ConA ويمكن علاج ذلك من خلال الخلط المناسب عند إضافة هذه الخرز ؛ ج) قد يكون هناك القليل جدا من الأجسام المضادة المضافة ، وبالتالي يوصى بإجراء معايرة للأجسام المضادة لتحديد الكمية الأكثر فعالية ؛ د) أوقات الحضانة إما مع الجسم المضاد الأساسي أو البروتين A أو البروتين A / G-MNase إما قصيرة جدا (أي ليست كافية من الوقت للسماح بالربط) أو طويلة جدا (هذه عينات أصلية غير مترابطة) ، ويمكن تحسينها ؛ ه) يمكن أن يكون تفاعل البروتين المستهدف مع الكروماتين عابرا جدا بحيث لا يمكن التقاطه في الظروف الأصلية ، وبالتالي يمكن إجراء ربط CUT & RUN28. في حين أن مجموعات البيانات أحادية الخلية ستؤدي إلى خلفية عالية ، فقد تكون هناك خلفية عالية بشكل مفرط حيث يصعب تفسير الإشارة من الخلفية (النقطة 2). بالنسبة لهذه المسألة ، لاحظ النصيحة التالية: أ) يمكن زيادة أو تحسين خطوة الحظر مع EDTA لمنع هضم MNase الوقائي ؛ ب) إذا كان هناك قطع مفرط ، فقد يكون ذلك بسبب وجود الكثير من البروتين A أو البروتين A / G-MNase ، وبالتالي يمكن إجراء معايرة بالكميات المناسبة ؛ ج) يمكن أن يؤدي الإفراط في الهضم بواسطة MNase إلى خلفية عالية ، وبالتالي يجب تقييم الخلط المناسب لكلوريد الكالسيوم عند الإضافة والتحسين لوقت هضم MNase. وأخيرا، قد يكون الحمض النووي الفعال المخصب ب uliCUT & RUN قد تم استرداده، ولكن قد يتم استرداد كمية منخفضة من المكتبة (النقطة 3). وفيما يتعلق بهذه المسألة، يوصى بما يلي: (أ) مناولة واستخدام حبات البوليسترين - المغنطيسية على النحو المناسب لضمان التنقية الصحيحة وعدم فقدان الحمض النووي؛ (ب) و (ب) استخدام حبات البوليسترين - المغنطيسية لضمان التنقية الصحيحة وعدم فقدان الحمض النووي؛ و (ب) المناولة والاستخدام المناسبين لخرز البوليسترين - المغنطيسية لضمان التنقية الصحيحة وعدم فقدان الحمض النووي؛ و (ب) المناولة والاستخدام على وجه التحديد ، يوصى بالحصول على حضانات لمدة 15 دقيقة وما لا يقل عن 5 دقائق لجذب الخرز لمنع الخسارة ؛ ب) سيؤدي التضخيم الناقص للمكتبة في مرحلة تفاعل البوليميراز المتسلسل إلى انخفاض العائد وبالتالي ينبغي تحديد الدورات المناسبة باستخدام qPCR (كما هو محدد سابقا لمكتبات ATAC-seq29).

كما هو الحال مع جميع التقنيات ، هناك قيود على uliCUT & RUN يجب مراعاتها قبل البدء في أي تجربة. أولا ، تم تصميم هذه التجارب وتحسينها للظروف الأصلية ، وبالتالي إذا كان البروتين يتفاعل بشكل عابر فقط مع الكروماتين ، فقد يكون من الضروري اتباع نهج الربط المتبادل لضمان استعادة التفاعل. ثانيا ، كما هو الحال مع جميع التقنيات القائمة على الأجسام المضادة ، فإن جودة الجسم المضاد مهمة. يجب توخي الحذر لضمان جودة واتساق الجسم المضاد قبل إجراء أي تجارب. ثالثا ، يمكن أن يحدث قطع خلفية MNase ، وفي حين أن هناك إشارة خلفية أقل باستمرار في CUT & RUN مقارنة بالتجارب الأخرى ، يمكن أن تكون إشارة الخلفية عالية في تجارب الخلية الواحدة ، وبالتالي يجب إجراء الضوابط والتحليلات المناسبة. في حين أن الطبيعة الثنائية لبيانات التنميط أحادية الخلية تحد من التصور ، يمكن إجراء تقنيات جينومية حسابية أكثر تقدما ، مثل تقليل الأبعاد وغيرها (كما هو موضح سابقا27). وأخيرا، في حين تم توسيع التنميط أحادي الخلية هنا إلى تنسيق 96 بئرا، فإن هذه الإنتاجية منخفضة مقارنة بتقنيات الخلية الواحدة الأخرى التي تستخدم 10xGenomics أو تنسيقات أخرى.

يمكن لتقنيات التنميط القائمة على الربط مثل ChEC-seq 20 و CUT & Tag 24 و CUT & RUN21 و uliCUT & RUN23 ، تحديد توطين العوامل على الكروماتين مع جدول زمني تجريبي أسرع وخلفية أقل وتكلفة أقل من تقنيات التنميط التقليدية ، مثل ChIP-seq. لذلك ، هذه تقنيات مثيرة للغاية للتطبيق على العينات الثمينة مثل عينات المرضى أو عينات النمو المبكرة. علاوة على ذلك ، يمكن أن يوفر التطبيق على الخلايا المفردة دراسات تكميلية يتم إجراؤها باستخدام تجارب خلية واحدة أخرى مثل scRNA-seq و scATAC-seq30. كما هو موضح باستخدام هذه التقنيات أحادية الخلية المستخدمة على نطاق أوسع ، يمكن الحصول على رؤى جديدة مقارنة بتجارب الخلايا السائبة. ومن المتوقع أن يصبح تنميط البروتين أحادي الخلية على الكروماتين أكثر انتظاما مع استمرار التقنيات في التحسن والسماح بمزيد من التوازي.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

يعلن المؤلفون عدم وجود مصالح متنافسة تتعلق بهذا المشروع.

Acknowledgments

نشكر أعضاء مختبر هاينر على قراءتهم وتعليقاتهم على نسخة سابقة من هذه المخطوطة. استخدم هذا المشروع NextSeq500 المتوفر في مركز تسلسل العلوم الصحية بجامعة بيتسبرغ في مستشفى UPMC للأطفال في بيتسبرغ للتسلسل مع شكر خاص لمديره ويليام ماكدونالد. تم دعم هذا البحث جزئيا من قبل مركز جامعة بيتسبرغ للحوسبة البحثية من خلال موارد الكمبيوتر المقدمة. تم دعم هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة رقم المنحة R35GM133732 (إلى S.J.H).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.5 mL clear microfuge tubes ThermoFisher Scientific 90410
1.5 mL tube magnetic rack ThermoFisher Scientific 12321D
1.5 mL tube-compatible cold centrifuge Eppendorf 5404000537
10 cm sterile tissue culture plates ThermoFisher Scientific 150464
10X T4 DNA Ligase buffer New England Biolabs B0202S
15 mL conical tubes VWR 89039-656
1X TE buffer ThermoFisher Scientific 12090015
200 µL PCR tubes Eppendorf 951010022
2X quick ligase buffer New England Biolabs M2200 Ligase Buffer
5X KAPA HiFi buffer Roche 7958889001 5X high fidelity PCR buffer
7-Amino-Actinomycin D (7-AAD) Fisher Scientific BDB559925
96-well magnetic rack ThermoFisher Scientific 12027 or 12331D
96-well plate VWR 82006-636
AMPure XP beads Beckman Coulter A63881 polystyrene-magnetite beads; Due to potential variability between AMPure XP bead lots, it is recommended that your AMPure bead solution be calibrated. See manufacturer’s instructions
Antibody to protein of interest varies
ATP ThermoFisher Scientific R0441
BioMag Plus Concanavalin A beads Polysciences 86057-10 ConA-conjugated paramagnetic microspheres
BSA
Calcium Chloride (CaCl2) Fisher Scientific AAJ62905AP
Cell sorter BD FACSAria II cell sorter Requires training
Cell-specific media for cell culture Varies
Chloroform ThermoFisher Scientific C298-500 Chloroform is a skin irritant and harmful if swallowed; handle in a chemical fume hood using gloves, a lab coat, and goggles
Computer with 64-bit processer and access to a super computing cluster For computational analyses of resulting sequencing datasets
DNA spin columns Epoch Life Sciences 1920-250
dNTP set New England Biolabs N0446S
EGTA Sigma Aldrich E3889
Electrophoresis equipment varies
Ethanol Fisher Scientific 22032601 100% vol/vol ethanol is highly flammable; handle in a chemical fume hood using gloves, a lab coat, and goggles
Ethylenediaminetetraacetic acid  (EDTA) Fisher Scientific BP2482100
FBS Sigma Aldrich F2442
Glycerol Fisher Scientific BP229-1
Glycogen VWR 97063-256
HEPES Fisher Scientific BP310-500
Heterologous S. cerevisiae DNA spike-in homemade Prepared from crosslinked, MNase-digested, and agarose gel extracted genomic DNA purified of protein/RNA and diluted to 10 ng/mL. We recommend yeast genomic DNA, but other organisms can be used if needed.
Hydrochloric Acid  (HCl) Fisher Scientific A144-212 Hydrochloric Acid is very corrosive; handle in a chemical fume hood using gloves, a lab coat, and goggles
Ice Bucket varies
Illumina Sequencing platform (e.g., NextSeq500) Illumina
Incubator with temperature and atmosphere control ThermoFisher Scientific 51030284
KAPA HotStart HiFi DNA Polymerase with 5X KAPA HiFi buffer Roche 7958889001 hotstart high fidelity polymerase
Laminar flow hood Bakery Company SG404
Manganese Chloride (MnCl2) Sigma Aldrich 244589
Micropipette set Rainin 30386597
Minifuge Benchmark Scientific C1012
NEB Adaptor New England Biolabs E6612AVIAL Adaptor
NEB Universal primer New England Biolabs E6611AVIAL Universal Primer
NEBNext Multiplex Oligos for Illumina kit New England Biolabs E7335S/L, E7500S/L, E7710S/L, E7730S/L Indexed Primers
Negative control antibody Antibodies-Online ABIN101961
Nuclease Free water New England Biolabs B1500S
PCR thermocycler Eppendorf 2231000666
Phase lock tubes Qiagen 129046
Phenol/Chloroform/Isoamyl Alcohol (PCI) ThermoFisher Scientific 15593049 Phenol is harmful if swallowed or upon skin contact; handle in a chemical fume hood using gloves, a lab coat, and goggles
Phsophate buffered saline (PBS) ThermoFisher Scientific 10814010
Pipette aid Drummond Scientific # 4-000-100
Polyethylene glycol (PEG) 4000 VWR A16151
Potassium Chloride (KCl) Sigma Aldrich P3911
Potassium Hydroxide (KOH) Fisher Scientific P250-1 CAUTION KOH is an eye/skin irritant as a solid and corrosive in solution. Handle in a chemical fume hood using gloves, a lab coat, and goggles
Protease Inhibitors ThermoFisher Scientific 78430
ProteinA/G-MNase Epicypher 15-1016 pA/G-MNase
ProteinA-MNase, purified from pK19pA-MN Addgene 86973
Proteinase K New England Biolabs P8107S
Qubit 1X dsDNA HS Assay Kit ThermoFisher Scientific Q33230
Qubit Assay tubes ThermoFisher Scientific Q32856
Qubit Fluorometer ThermoFisher Scientific Q33238
Quick Ligase with 2X Quick Ligase buffer New England Biolabs M2200S
RNase A New England Biolabs T3010
Sodium Acetate  (NaOAc) ThermoFisher Scientific BP333-500
Sodium Chloride (NaCl) Sigma Aldrich S5150-1L
Sodium dodecyl sulfate (SDS) ThermoFisher Scientific BP166-500 SDS is poisonous if inhaled; handle with care in well ventilated spaces using gloves, eye protection, and an N95-grade respirator when handling
Sodium Hydroxide (NaOH) Fisher Scientific S318-1 NaOH is an eye/skin irritant as a solid and corrosive in solution. Handle in a chemical fume hood using gloves, a lab coat, and goggles
Spermidine Sigma Aldrich S2626
Standard Inverted Light Microscope Leica 11526213
Standard lab agarose gel materials Varies
Standard lab materials such as serological pipettes and pipette tips Varies
T4 DNA Ligase New England Biolabs M0202S
T4 DNA Polymerase New England Biolabs M0203S
T4 PNK New England Biolabs M0201S
Tabletop vortexer Fisher Scientific 2215414
Taq DNA Polymerase New England Biolabs M0273S
Thermomixer Eppendorf 5384000020 Alternatively, can use a waterbath
Tris base Fisher Scientific BP152-5
Triton X-100 Sigma Aldrich 9002-93-1 Triton X-100 is hazardous; use a lab coat, gloves, and goggles when handling
Trypsin Fisher Scientific MT25052
Tube rotator VWR 10136084
USER enzyme New England Biolabs M5505S

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gilmour, D. S., Lis, J. T. In vivo interactions of RNA polymerase II with genes of Drosophila melanogaster. Molecular and Cellular Biology. 5 (8), 2009-2018 (1985).
  2. Solomon, M. J., Varshavsky, A. Formaldehyde-mediated DNA-protein crosslinking: a probe for in vivo chromatin structures. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 82 (19), 6470-6474 (1985).
  3. Irvine, R. A., Lin, I. G., Hsieh, C. -L. DNA methylation has a local effect on transcription and histone acetylation. Molecular and Cellular Biology. 22 (19), 6689-6696 (2002).
  4. Albert, I., et al. Translational and rotational settings of H2A.Z nucleosomes across the Saccharomyces cerevisiae genome. Nature. 446 (7135), 572-576 (2007).
  5. Blat, Y., Kleckner, N. Cohesins bind to preferential sites along yeast chromosome III, with differential regulation along arms versus the centric region. Cell. 98 (2), 249-259 (1999).
  6. Ren, B., et al. Genome-wide location and function of DNA binding proteins. Science. 290 (5500), 2306-2309 (2000).
  7. Rhee, H. S., Pugh, B. F. Comprehensive genome-wide protein-DNA interactions detected at single-nucleotide resolution. Cell. 147 (6), 1408-1419 (2011).
  8. He, Q., Johnston, J., Zeitlinger, J. ChIP-nexus enables improved detection of in vivo transcription factor binding footprints. Nature Biotechnology. 33 (4), 395-401 (2015).
  9. O'Neill, L. P., Turner, B. M. Immunoprecipitation of native chromatin: NChIP. Methods. 31 (1), 76-82 (2003).
  10. Schmidl, C., Rendeiro, A. F., Sheffield, N. C., Bock, C. ChIPmentation: fast, robust, low-input ChIP-seq for histones and transcription factors. Nature Methods. 12 (10), 963-965 (2015).
  11. Cao, Z., Chen, C., He, B., Tan, K., Lu, C. A microfluidic device for epigenomic profiling using 100 cells. Nature Methods. 12 (10), 959-962 (2015).
  12. Shankaranarayanan, P., et al. Single-tube linear DNA amplification (LinDA) for robust ChIP-seq. Nature Methods. 8 (7), 565-567 (2011).
  13. Rotem, A., et al. Single-cell ChIP-seq reveals cell subpopulations defined by chromatin state. Nature Biotechnology. 33 (11), 1165-1172 (2015).
  14. Grosselin, K., et al. High-throughput single-cell ChIP-seq identifies heterogeneity of chromatin states in breast cancer. Nature Genetics. 51 (6), 1060-1066 (2019).
  15. Adli, M., Bernstein, B. E. Whole-genome chromatin profiling from limited numbers of cells using nano-ChIP-seq. Nature Protocols. 6 (10), 1656-1668 (2011).
  16. Zwart, W., et al. A carrier-assisted ChIP-seq method for estrogen receptor-chromatin interactions from breast cancer core needle biopsy samples. BMC Genomics. 14, 232 (2013).
  17. Valensisi, C., Liao, J. L., Andrus, C., Battle, S. L., Hawkins, R. D. cChIP-seq: a robust small-scale method for investigation of histone modifications. BMC Genomics. 16, 1083 (2015).
  18. Brind'Amour, J., et al. An ultra-low-input native ChIP-seq protocol for genome-wide profiling of rare cell populations. Nature Communications. 6, 6033 (2015).
  19. Schmid, M., Durussel, T., Laemmli, U. K. C. hI. C. ChlC and ChEC; genomic mapping of chromatin proteins. Molecular Cell. 16 (1), 147-157 (2004).
  20. Zentner, G. E., Kasinathan, S., Xin, B., Rohs, R., Henikoff, S. ChEC-seq kinetics discriminates transcription factor binding sites by DNA sequence and shape in vivo. Nature Communications. 6, 8733 (2015).
  21. Skene, P. J., Henikoff, S. An efficient targeted nuclease strategy for high-resolution mapping of DNA binding sites. eLife. 6, 21856 (2017).
  22. Meers, M. P., Bryson, T. D., Henikoff, J. G., Henikoff, S. Improved CUT&RUN chromatin profiling tools. eLife. 8, 46314 (2019).
  23. Hainer, S. J., Bošković, A., McCannell, K. N., Rando, O. J., Fazzio, T. G. Profiling of pluripotency factors in single cells and early embryos. Cell. 177 (5), 1319-1329 (2019).
  24. Kaya-Okur, H. S., et al. CUT&Tag for efficient epigenomic profiling of small samples and single cells. Nature Communications. 10 (1), 1930 (2019).
  25. Carter, B., et al. Mapping histone modifications in low cell number and single cells using antibody-guided chromatin tagmentation (ACT-seq). Nature Communications. 10 (1), 3747 (2019).
  26. Gopalan, S., Wang, Y., Harper, N. W., Garber, M., Fazzio, T. G. Simultaneous profiling of multiple chromatin proteins in the same cells. Molecular Cell. 81 (22), 4736-4746 (2021).
  27. Patty, B. J., Hainer, S. J. Transcription factor chromatin profiling genome-wide using uliCUT&RUN in single cells and individual blastocysts. Nature Protocols. 16 (5), 2633-2666 (2021).
  28. Zheng, X. -Y., Gehring, M. Low-input chromatin profiling in Arabidopsis endosperm using CUT&RUN. Plant Reproduction. 32 (1), 63-75 (2019).
  29. Buenrostro, J. D., Giresi, P. G., Zaba, L. C., Chang, H. Y., Greenleaf, W. J. Transposition of native chromatin for fast and sensitive epigenomic profiling of open chromatin, DNA-binding proteins and nucleosome position. Nature Methods. 10 (12), 1213-1218 (2013).
  30. Buenrostro, J. D., et al. Single-cell chromatin accessibility reveals principles of regulatory variation. Nature. 523 (7561), 486-490 (2015).

Tags

علم الأحياء ، العدد 180 ،
توطين عامل الخلية الواحدة على الكروماتين باستخدام انقسام المدخلات المنخفض للغاية تحت الأهداف والإطلاق باستخدام Nuclease
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Lardo, S. M., Hainer, S. J.… More

Lardo, S. M., Hainer, S. J. Single-Cell Factor Localization on Chromatin using Ultra-Low Input Cleavage Under Targets and Release using Nuclease. J. Vis. Exp. (180), e63536, doi:10.3791/63536 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter