Summary
CUT&RUN og dens varianter kan brukes til å bestemme protein belegg på kromatin. Denne protokollen beskriver hvordan du bestemmer proteinlokalisering på kromatin ved hjelp av encellet uliCUT&RUN.
Abstract
Å bestemme bindingsstedene til et protein på kromatin er avgjørende for å forstå funksjonen og potensielle regulatoriske mål. Kromatin immunoprecipitation (ChIP) har vært gullstandarden for å bestemme proteinlokalisering i over 30 år og er definert ved bruk av et antistoff for å trekke ut proteinet av interesse fra sonikert eller enzymatisk fordøyd kromatin. Mer nylig har antistoff tethering teknikker blitt populært for å vurdere protein lokalisering på kromatin på grunn av deres økte følsomhet. Cleavage Under Targets &release Under Nuclease (CUT&RUN) er det genom-brede derivatet av Kromatin Immunocleavage (ChIC) og benytter rekombinant protein A bundet til mikrokokkkjerne (pA-MNase) for å identifisere IgG konstant region av antistoffet rettet mot et protein av interesse, og muliggjør derfor stedsspesifikk spalting av DNA-flanken av proteinet av interesse. CUT&RUN kan brukes til å profilere histone modifikasjoner, transkripsjonsfaktorer og andre kromatinbindende proteiner som nukleosom ombyggingsfaktorer. Det er viktig at CUT&RUN brukes til å vurdere lokaliseringen av enten eukromatiske eller heterokromatiske assosierte proteiner og histone modifikasjoner. Av disse grunnene er CUT&RUN en kraftig metode for å bestemme bindingsprofilene til et bredt spekter av proteiner. Nylig har CUT&RUN blitt optimalisert for transkripsjonsfaktorprofilering i lave populasjoner av celler og enkeltceller, og den optimaliserte protokollen har blitt kalt ultra-lav input CUT&RUN (uliCUT&RUN). Her presenteres en detaljert protokoll for encellet faktorprofilering ved hjelp av uliCUT&RUN i et manuelt 96-brønns format.
Introduction
Mange kjerneproteiner fungerer ved å samhandle med kromatin for å fremme eller forhindre DNA-malaktiviteter. For å bestemme funksjonen til disse kromatin-interagerende proteinene, er det viktig å identifisere de genomiske stedene der disse proteinene er bundet. Siden utviklingen i 1985 har Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) vært gullstandarden for å identifisere hvor et protein binder seg til kromatin 1,2. Den tradisjonelle ChIP-teknikken har følgende grunnleggende arbeidsflyt: celler høstes og krysskobles (vanligvis med formaldehyd), kromatin skjæres (vanligvis med harde sonikeringsmetoder, nødvendig krysskobling), proteinet av interesse er immunoprecipitated ved hjelp av et antistoff som retter seg mot proteinet (eller merket protein) etterfulgt av et sekundært antistoff (koblet til agarose eller magnetiske perler), krysskobling er reversert, protein og RNA fordøyes for å rense DNA, og dette ChIP-beriket-DNA brukes som mal for analyse (ved hjelp av radiomerkede sonder 1,2, qPCR3, mikroarrays 5,6 eller sekvensering4). Med fremkomsten av mikroarrays og massivt parallell dyp sekvensering har ChIP-chip 5,6 og ChIP-seq4 nylig blitt utviklet og muliggjør genomomfattende identifisering av proteinlokalisering på kromatin. Crosslinking ChIP har vært en kraftig og pålitelig teknikk siden adventen med store fremskritt i oppløsning av ChIP-exo7 og ChIP-nexus8. Parallelt med utviklingen av ChIP-seq er det etablert innfødte (ikke-krysskoblingsprotokoller) for ChIP (N-ChIP), som bruker nuklease fordøyelse (ofte ved hjelp av mikrokokkkjerne eller MNase) for å fragmentere kromatinet, i motsetning til sonikering utført i tradisjonelle krysskoblings ChIP-teknikker9. Imidlertid har en stor ulempe med både krysskobling av ChIP- og N-ChIP-teknologier vært kravet til høye celletall på grunn av lavt DNA-utbytte etter eksperimentell manipulasjon. Derfor har mange de siste årene vært rettet mot å optimalisere ChIP-teknologier for lavcelleinndata. Dette arbeidet har resultert i utviklingen av mange kraftige ChIP-baserte teknologier som varierer i deres anvendbarhet og inngangskrav 10,11,12,13,14,15,16,17,18. Imidlertid har encellede ChIP-seq-baserte teknologier manglet, spesielt for ikke-histone proteiner.
I 2004 ble det utviklet en alternativ teknologi for å bestemme proteinbelegg på kromatin kalt Chromatin Endogenous Cleavage (ChEC) og Chromatin Immunocleavage (ChIC)19. Disse enkelt-locus teknikker bruker en fusjon av MNase til enten protein av interesse (ChEC) eller til protein A (ChIC) for direkte kutting av DNA ved siden av protein av interesse. I de senere år har både ChEC og ChIC blitt optimalisert for genomomfattende proteinprofilering på kromatin (henholdsvis ChEC-seq og CUT&RUN)20,21. Mens ChEC-seq er en kraftig teknikk for å bestemme faktorlokalisering, krever det å utvikle MNase-fusjonsproteiner for hvert mål, mens ChIC og dens genomomfattende variasjon, CUT&RUN, er avhengig av et antistoff rettet mot proteinet av interesse (som med ChIP) og rekombinant Protein A-MNase, hvor Protein A kan gjenkjenne IgG konstant region av antistoffet. Som et alternativ er det utviklet et fusjonsprotein A /Protein G-MNase (pA/G-MNase) som kan gjenkjenne et bredere spekter av antistoffkonstantregioner22. CUT&RUN har raskt blitt et populært alternativ til ChIP-seq for å bestemme proteinlokalisering på kromatingenomom-wide.
Ultra-low input CUT&RUN (uliCUT&RUN), en variant av CUT&RUN som muliggjør bruk av lave og encellede innganger, ble beskrevet i 201923. Her beskrives metodikken for en manuell 96-brønnsformat encellet applikasjon. Det er viktig å merke seg at siden utviklingen av uliCUT&RUN har to alternativer for histoneprofilering, CUT&Tag og iACT-seq blitt utviklet, noe som gir robust og svært parallell profilering av histoneproteiner 24,25. Videre har scCUT&Tag blitt optimalisert for profilering av flere faktorer i en enkelt celle (multiCUT&Tag) og for anvendelse på ikke-histone proteiner26. Sammen gir CUT&RUN et attraktivt alternativ til lav inngang ChIP-seq der uliCUT&RUN kan utføres i ethvert molekylærbiologisk laboratorium som har tilgang til en cellesortering og standardutstyr.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Etikkerklæring: Alle studier ble godkjent av Institutional Biosafety Office of Research Protections ved University of Pittsburgh.
1. Forbered magnetiske perler
MERK: Utfør før cellesortering og hold på isen til bruk.
- Pipette 30 μL kona-konjugerte paramagnetiske mikrosfærer per reaksjon på et friskt 1,5 ml mikrofugerør og tilsett 850 μL bindingsbuffer, pipettering forsiktig for å blande.
MERK: Konakonjugerte paramagnetiske mikrosfærer er lectin-belagte magnetiske perler som tillater lipidmembranbinding. - Plasser røret på et magnetisk stativ og la perlene magnetisere i 1-2 min. Når supernatanten har ryddet, fjern og kast supernatanten uten å forstyrre perlene.
- Fjern røret fra magnetstativet og vask perlene ved å resuspendere i 1 ml bindingsbuffer.
- Gjenta trinn 1.2 og 1.3.
- Magnetiser perlene i 2 min og fjern supernatanten som skal kastes.
- Fjern røret fra magnetstativet og resuspend perlene i 30 μL bindingsbuffer per reaksjon.
- Hold den vaskede perleblandingen på is til cellene er sortert.
2. Høst celler
MERK: Dette trinnet er skrevet for adhered celler og optimalisert for murine E14 embryonale stamceller. Dyrking og høsting av cellene avhenger av celletypen.
- Fjern cellene fra inkubatoren på 37 °C og undersøk dem under et mikroskop for å sikre kvalitet.
- Aspirer mediet fra celleplaten og skyll med 5 ml 1x PBS.
- Aspirer PBS fra platen og høst cellene (ved hjelp av tradisjonelle cellehøstingsmetoder som vil variere etter celletype). Oppnå encellet suspensjon ved å forsiktig pipettere opp og ned med en serologisk pipette mot kulturretten, om nødvendig.
- Overfør cellefjæringen til et konisk rør på 15 ml og spinn ned ved 200 x g i 5 minutter.
- Aspirer av mediet for å kaste og vaske cellepellet med 5 ml PBS + 1% FBS.
- Snurr ned cellene ved 200 x g i 5 minutter, kast supernatanten og resuspend cellepelleten i 5 ml PBS + 1% FBS.
- Tell cellene og overfør 1 ml 1 x 106 celler til et friskt 1,5 ml mikrofugerør.
- Tilsett 5 μL 7-Amino-Actinomycin D (7-AAD), snu røret godt for å blande, og bruk deretter prøven på cellesorteringen for å sortere levende enkeltceller i individuelle brønner på en 96-brønns plate.
MERK: 7-AAD fargestoff er utelukket fra levende celler, og kan derfor brukes i levende celle sortering.
3. Cellesortering og lysis
- Forbered en cellesorteringskompatibel 96-brønnsplate med 100 μL kjernefysisk ekstraksjonsbuffer (NE) i hver brønn før cellesortering.
- Sorter cellene i 96-brønnsplater i henhold til produsentens instruksjoner.
- Spinn platen raskt (600 x g i 30 s) for å sikre at cellene er i bufferen i brønnene.
MERK: Det er verdt å teste i et foreløpig eksperiment om cellene som brukes, på en pålitelig måte bringes til bunnen av brønnene. - Hold prøvene på is i 15 min.
- Spinn ned prøvene ved 600 x g i 5 min ved 4 °C og rør forsiktig for å fjerne supernatanten (etterlater 5 μL).
- Resuspend hver prøve i 55 μL NE buffer og tilsett 30 μL av de forhåndsvaskede ConA-konjugerte paramagnetiske mikrosfærene (fra trinn 1.7; i bindingsbuffer) til hver reaksjon.
- Inkuber ved romtemperatur i 10 min.
4. Pre-block prøver for å forhindre tidlig fordøyelse av MNase
- Plasser platen på et 96-brønns magnetisk stativ, la perlene binde seg i minst 5 minutter, og fjern og kast deretter supernatanten.
- Tilsett 100 μL blokkeringsbuffer i nukleusbundne perler og bland med skånsom pipettering.
- Inkuber i 5 min ved romtemperatur.
5. Tilsetning av primært antistoff
- Plasser platen på et 96-brønns magnetisk stativ, la supernatanten klare i minst 5 minutter, og fjern og kast deretter supernatanten uten å forstyrre perlene.
- Fjern platen fra magnetstativet og resuspend perlene i 100 μL vaskebuffer per reaksjon med skånsom pipettering.
- Plasser platen tilbake på det 96-brønns magnetiske stativet, la supernatanten tømme, og fjern og kast deretter supernatanten.
- Resuspend perlene i 25 μL vaskebuffer per reaksjon med skånsom pipettering.
- Lag en primær antistoff master mix: 25 μL vaskebuffer + 0,5 μL antistoff per reaksjon.
- Mens du forsiktig virveler nukleibundne perler, tilsett 25 μL av den primære antistoffmesterblandingen til hver prøve som behandles med et antistoff rettet mot proteinet av interesse (vanligvis 1:100 endelig fortynning). Tilsett 25 μL vaskebuffer uten antistoff, hvis du utfører en kontroll.
- Inkuber i 1 time ved romtemperatur.
- Plasser prøvene på et 96-brønns magnetisk stativ, la supernatanten fjerne i minst 5 minutter, og fjern og kast deretter supernatanten uten å forstyrre perlene.
- Fjern platen fra magnetstativet og vask perlene med 100 μL vaskebuffer, resuspending ved pipettering.
6. Tillegg av pA-MNase eller pA/G-MNase
MERK: Protein A har høy affinitet for IgG-molekyler fra visse arter som kaniner, men er ikke egnet for IgGs fra andre arter som mus eller rotter. Alternativt kan Protein A / G-MNase brukes. Denne hybrid binder kanin, mus og rotte IgGs, unngår behovet for sekundære antistoffer når mus eller rotte primære antistoffer brukes.
- Plasser platen tilbake på et 96-brønns magnetisk stativ, la supernatanten klare i minst 5 minutter, og fjern og kast deretter supernatanten uten å forstyrre perlene.
- Fjern platen fra magnetstativet og resuspender hver prøve i 25 μL vaskebuffer.
- Lag en pA-MNase master mix (25 μL vaskebuffer + optimalisert mengde pA-MNase per reaksjon).
- Mens du forsiktig virveler, tilsett 25 μL av pA-MNase-hovedblandingen i hver prøve, inkludert kontrollprøvene.
MERK: Konsentrasjonen av pA-MNase varierer ved tilberedning, hvis hjemmelaget, og bør testes før bruk på hver uavhengig rensing. For pA/G-MNase skal 2,5 μL av 20x-lageret brukes. - Inkuber prøvene i 30 min ved romtemperatur.
- Plasser platen på et 96-brønns magnetisk stativ, la supernatanten klare i minst 5 minutter, og fjern og kast deretter supernatanten uten å forstyrre perlene.
- Fjern platen fra magnetstativet og vask perlene med 100 μL vaskebuffer, resuspending ved skånsom pipettering.
7. Rettet DNA-fordøyelse
- Plasser platen på et 96-brønns magnetisk stativ, la supernatanten tømme i minst 5 minutter, og fjern og kast deretter supernatanten.
- Fjern prøvene fra magnetstativet og resuspend perlene i 50 μL vaskebuffer ved skånsom pipettering.
- Likevekt prøvene til 0 °C i en is-/vannblanding i 5 minutter.
- Fjern prøvene fra 0 °C is/vannbad og tilsett 1 μL 100 mM CaCl2 ved hjelp av en flerkanals pipette. Bland godt (3-5 ganger) med skånsom pipettering med en større volum flerkanals pipette, og returner deretter prøvene til 0 °C.
MERK: Det er viktig å blande godt her. CaCl2 er lagt til for å aktivere MNase fordøyelsen av DNA flankerer proteinet av interesse. - Start en 10 min timer så snart platen er tilbake i is/ vannbadet.
- Stopp reaksjonen ved å pipettere 50 μL 2XRSTOP+ buffer i hver brønn, i samme rekkefølge som CaCl2 ble lagt til.
MERK: Lag 2XRSTOP+-buffer før fordøyelsen på 10 minutter er over for å forhindre over fordøyelsen.
8. Eksempelfraksjonering
- Inkuber prøvene i 20 min ved 37 °C.
- Snurr platen ved 16 000 x g i 5 minutter ved 4 °C.
- Plasser platen på et 96-brønns magnetisk stativ, la supernatanten klare i minst 5 minutter, og overfør supernatanter til en frisk 96-brønnsplate. Kast perlene.
9. DNA-ekstraksjon
- Tilsett 1 μL 10 % natriumddecylsulfat (SDS) og 0,83 μL 20 mg/ml proteinase K i hver prøve.
FORSIKTIG: SDS-pulver er skadelig ved innånding. Brukere bør bruke i godt ventilerte rom iført briller, hansker og en åndedrettsvern i N95-klasse, og håndtere med forsiktighet. - Bland prøvene med skånsom pipettering.
- Inkuber prøvene i 10 min ved 70 °C.
- Returner platen til romtemperatur og tilsett 46,6 μL 5 M NaCl og 90 μL 50% PEG 4000. Bland med skånsom pipettering.
- Tilsett 33 μL polystyrenmagnetittperler til hver prøve og inkuber i 10 minutter ved romtemperatur.
MERK: Sørg for å bringe polystyrenmagnetittperler til romtemperatur (~ 30 min) og bland godt før bruk. - Plasser platen på et magnetisk stativ og la supernatanten klare i ~ 5 min, og kast deretter supernatanten forsiktig uten å forstyrre perlene.
- Skyll 2x med 150 μL 80% etanol uten å forstyrre perlene.
FORSIKTIG: Etanol er svært brannfarlig og forårsaker hud-, øye- og lungeirritasjon. Utfør dette trinnet med passende laboratorieklær og i en ventilert hette. - Snurr platen kort ved 1000 x g i 30 s. Plasser platen tilbake på et 96-brønns magnetisk stativ og fjern all gjenværende EtOH uten å forstyrre perlene.
- Lufttørk prøvene i ~2-5 min.
MERK: Ikke tørk perlene i mer enn 5 minutter. Hvis flittig om å fjerne EtOH, er 2-3 min tørking tilstrekkelig. - Resuspend perlene med 37.5 μL av 10 mM Tris-HCl (pH 8) og inkubere i 5 min ved romtemperatur.
- Plasser platen på et magnetisk stativ og la perlene binde seg i 5 minutter.
- Overfør 36,5 μL av supernatanten til en fersk termosirkuleringskompatibel 96-brønnsplate. Kast perlene.
MERK: Eksperimentet kan stoppes her ved å lagre prøver ved -20 °C eller fortsette med biblioteksbyggingen (trinn 10-15).
10. Sluttreparasjon, fosforylering, adenylering
MERK: Reagensene er hentet som referert i materialtabellen. Protokollen nedenfor følger en lignende metode som det kommersielle settet som NEBNext Ultra DNA II-settet.
- Fortynn 5 U/μL T4 DNA-polymerase 1:20 i 1x T4 DNA-ligasebuffer.
- Forbered en sluttreparasjon/3'A master mix: 2 μL 10x T4 DNA-ligasebuffer, 2,5 μL 10 mM dNTPer, 1,25 μL 10 mM ATP, 3,13 μL 40 % PEG 4000, 0,63 μL 10 U/μL T4 PNK, 0,5 μL fortynnet T4 DNA-polymerase, 0,5 μL 5U/μL Taq DNA-polymerase, med et totalt volum på 13,5 μL per reaksjon.
MERK: Sørg for å bringe 40% PEG 4000 til romtemperatur før pipettering. - Tilsett 13,5 μL sluttreparasjon/3'A master mix til 36,5 μL DNA.
- Bland reaksjonen med rask virvel, og deretter et raskt spinn (500 x g i 10 s).
- Inkuber ved hjelp av følgende reaksjonsforhold i en ferdigkjølt termosykler med oppvarmet lokk for temperaturer >20 °C. Bruk reaksjonsforholdene: 12 °C i 15 minutter, 37 °C i 15 minutter, 72 °C i 20 minutter, hold ved 4 °C.
11. Kort ligation
MERK: Hold prøvene på is mens du konfigurerer følgende reaksjon. La ligasebufferen komme til romtemperatur før pipettering. Fortynn adapteren (se Materialtabellen) i en oppløsning på 10 mM Tris-HCl som inneholder 10 mM NaCl (pH 7,5). På grunn av det lave utbyttet må du ikke forhånds-kvantifisere CUT&RUN-beriket DNA. Generer heller 25 ganger fortynning av adapteren ved hjelp av en endelig arbeidsadapterkonsentrasjon på 0,6 μM.
- Lag en ligation master mix: 55 μL av ligase buffer (2x), 5 μL T4 DNA ligase, og 5 μL fortynnet adapter, med et totalt volum på 65 μL per reaksjon.
- Tilsett 65 μL av mesterligasjonsblandingen til 50 μL DNA fra trinn 10,5.
- Bland med rask virveling, etterfulgt av rask spinning (500 x g i 10 s).
- Inkuber ved 20 °C i en termosykler (uten oppvarmet lokk) i 15 minutter.
MERK: Fortsett umiddelbart til følgende trinn.
12. BRUKER fordøyelse
- Tilsett 3 μL USER-enzym i hver prøve, virvel og spinn (500 x g i 10 s).
- Inkuber i termisk syklist ved 37 °C i 15 minutter (oppvarmet lokk satt til 50 °C).
13. Polystyren-magnetitt bead opprydding etter ligasjon reaksjon
MERK: La polystyrenmagnetittperler likevekte ved romtemperatur (~30 min). Virvel for å homogenisere perleoppløsningen før bruk. Utfør følgende trinn ved romtemperatur.
- Tilsett 39 μL (0,33x) polystyrenmagnetittperleløsning til hver brønn som inneholder adapter-ligated DNA.
- Bland grundig ved pipettering, og inkuber deretter prøvene ved romtemperatur i 15 minutter for å la DNA binde seg til perlene.
- Plasser prøvene på et 96-brønns magnetisk stativ og inkuber i 5 minutter til supernatanten er klar.
- Hold platen på magnetstativet og fjern og kast supernatanten forsiktig uten å forstyrre perlene.
- Skyll perlene med 200 μL 80% EtOH uten å forstyrre perlene.
- Inkuber i 30 s på et 96-brønns magnetisk stativ slik at løsningen kan fjernes.
- Fjern og kast supernatanten uten å forstyrre perlene.
- Gjenta trinn 13,5-13,7 for totalt to vasker.
- Snurr platen kort på 500 x g i 10 s, plasser platen tilbake på et 96-brønns magnetisk stativ, og fjern gjenværende EtOH uten å forstyrre perlene.
- Oppbevar platen på magnetstativet og lufttørk prøvene i 2 minutter.
MERK: Ikke tørk perlene for mye. - Fjern platen fra magnetstativet og resuspend perlene i 28,5 μL 10 mM Tris-HCl (pH 8).
FORSIKTIG: Saltsyre er svært etsende. Brukere bør håndtere det med forsiktighet i en kjemisk avtrekkshette iført briller, hansker og en labfrakk. - Resuspend perler grundig ved pipettering, pass på å ikke produsere bobler.
- Inkuber i 5 min ved romtemperatur.
- Plasser platen på et 96-brønns magnetisk stativ og la løsningen tømmes i 5 minutter.
- Overfør 27,5 μL supernatant til en ny PCR-plate og kast perlene.
14. Bibliotekberikelse
MERK: Primere fortynnes med samme oppløsning som adapteren. For denne bibliotekbyggingen, bruk en endelig fungerende primerkonsentrasjon på 0,6 μM.
- Tilsett 5 μL fortynnet indeksert primer (se Materialtabell) i hver prøve.
MERK: Hver prøve må identifiseres etter sekvensering. - Forbered en PCR-masterblanding: 10 μL 5x PCR-buffer med høy kvalitet, 1,5 μL 10 mM dNTPer, 5 μL fortynnet Universal primer, 1 μL 1 U hot start high fidelity polymerase, med et totalt mastermiksvolum på 17,5 μL per prøve.
- Tilsett 17,5 μL pf PCR-blanding til 32,5 μL renset adapter-ligated DNA (5 μL indeksert primer er inkludert i dette volumet).
- Bland løsningen ved pipettering.
- Inkuber i en termosykler ved hjelp av følgende reaksjonsforhold med en maksimal rampehastighet på 3 °C/s: 98 °C i 45 s, 98 °C i 45 s, 60 °C i 10 s, gjenta det andre og tredje trinn 21 ganger, 72 °C i 1 minutt, hold ved 4 °C.
MERK: Prøvene kan oppbevares ved 4 °C for korttidslagring eller -20 °C for langtidsoppbevaring.
15. Polystyren-magnetitt perle opprydding
- Tilsett 60 μL (1,2x) polystyrenmagnetittperler i hver prøve.
- Resuspend perlene ved pipettering og inkubere i 15 min ved romtemperatur.
- Plasser platen på et magnetisk stativ i 5 minutter til oppløsningen er klar.
- Kast supernatanten og skyll perlene med 200 μL 80% EtOH uten å forstyrre perlene.
- Gjenta vasketrinnet for totalt to 80% EtOH-vasker.
- Snurr platen på 500 x g i 10 s, plasser platen på et 96-brønns magnetisk stativ, og la perlene binde seg i 5 minutter.
- Pipette for å fjerne overflødig EtOH uten å forstyrre perlene og la perlene lufttørke i 2 minutter.
MERK: Ikke tørk perlene for mye. - Resuspend perlene i 21 μL nukleasefritt vann og inkubere i 5 min ved romtemperatur.
- Plasser platen på et magnetisk stativ og la løsningen tømmes i 5 minutter.
- Overfør 20 μL av supernatanten til en ny plate.
MERK: Eksperimentet kan stoppes her ved å lagre prøven ved -20 °C. - Kvantifisere bibliotekkonsentrasjoner med fluorometer (se Materialtabell), ved hjelp av et 1x HS-reagens.
- Hvis konsentrasjonen tillater det, kjør 30 ng prøve på 1,5% agarose gel med en lav molekylvekt stige for å visualisere. Alternativt kan du visualisere på en fragmentanalysator eller relatert instrument.
- Sekvensbiblioteker på en Illumina-plattform for å få ~50 000-100 000 unikt kartlagte leser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Her presenteres en detaljert protokoll for encellet proteinprofilering på kromatin ved hjelp av et 96-brønns manuelt format uliCUT&RUN. Mens resultatene vil variere basert på proteinet som profileres (på grunn av proteinoverflod og antistoffkvalitet), celletype og andre medvirkende faktorer, diskuteres forventede resultater for denne teknikken her. Cellekvalitet (celleutseende og prosent av levedyktige celler) og sortering med én celle bør vurderes før eller på tidspunktet for sortering av aktive celler i NE-bufferen. Et eksempel på ES-cellekolonier og cellesortering vises i figur 2A,B. Spesielt bør celler av lav kvalitet ikke brukes, og hvis kvaliteten er et problem, bør det tas hensyn til å følge retningslinjer for den spesifikke celletypen. I tillegg bør nøyaktig cellesortering etter cellesorteringsinstrument vurderes i forkant av eksperimentering. Testceller kan for eksempel sorteres og farges ved hjelp av Hoechst 33342 flekk og telles for å sikre at enten 0 eller 1 celle finnes i hver brønn. Hvis det ikke blir funnet enkeltceller, må sorteringsbetingelsene optimaliseres. Etter tilberedning av biblioteket kan prøver vurderes enten på en agarosegel (hvis konsentrasjonen tillater lasting på 30 ng eller mer, da det er en nedre grense for DNA-visualisering på en agarosegel) eller en fragmentanalysator (eller lignende enhet som en båndstasjon eller bioanalyse) før sekvensering og eksempelresultater vises i figur 2C, D. Spesielt er den forventede størrelsesfordelingen fra ~ 150 til ~ 500 bp. I høyere cellemengder vil CUT&RUN utført på store proteiner (som histoner) ha en høyresidet størrelsesfordeling, hvor flertallet av DNA vil bli sett ~ 270 bp; Denne skulderen observeres imidlertid vanligvis ikke i encellede eksperimenter.
Etter sekvensering bør kvaliteten på sekvenseringslesingene vurderes ved hjelp av FASTQC. Prosenten av unike tilordningslesninger bør bestemmes. Vanligvis observeres 0,5% -10% unikt tilordning av leseoperasjoner i enkeltcelleeksperimenter. Disse kartprosentene ligner på andre DNA-baserte encelleteknikker30. Deretter bør størrelsesfordelingen av lesingene etter tilordning bestemmes for å sikre at profilen ligner på sekvensering før sekvensering (med adaptersekvensen som ikke lenger bidrar til lesestørrelsene).
Etter at datakvaliteten er vurdert, kan proteinbelegg visualiseres ved hjelp av ulike metoder: Enkelt locus genome nettleserbilder kan visualiseres ved hjelp av UCSC genom nettleser eller IGV (Figur 3A) og genom-brede belegg mønstre over spesifikke genomkoordinater kan visualiseres ved hjelp av metaplots (Figur 3B, bunn), varmekart (Figur 3B, topp) eller 1D-varmekart (Figur 3C). For mer informasjon om dataanalyse, se studien av Patty og Hainer27. Encellede data fra en diploidcelle vil resultere i opptil fire lesninger som bidrar til hvert locus (fire leser hvis cellen var i mitose), men oftere leser en eller to. Derfor er dataene binære, og en høy bakgrunn kan lettere forveksles med belegg, i forhold til høye celleeksperimenter. Derfor anbefales det å utføre et parallelt CUT&RUN-eksperiment på et høyt cellenummer (5000 til 100 000 celler), om mulig, for å skaffe alle mulige bindingssteder for proteinet av interesse. Deretter kan data med én celle sammenlignes med mulige bindingsplasseringer. I eksemplene som vises i figur 3, sammenlignes enkeltcellede CTCF uliCUT&RUN-resultater med høycellet CTCF uliCUT&RUN (figur 3A) eller ChIP-seq (figur 3B, C). Som tidligere vist representerte CTCF-, SOX2- og NANOG-encellede uliCUT&RUN-topper i stor grad sterkere topper fra høycellede ChIP-seq-datasett23.
Figur 1: Skjematisk for uliCUT&RUN-protokollen. Celler høstes og sorteres i en 96-brønns plate som inneholder NE-buffer. Individuelle kjerner er da bundet til Kona-konjugede paramagnetiske mikrosfærer, og sekvensielt tilsettes et antistoff (rettet mot proteinet av interesse) og pA-MNase eller pA / G-MNase. Protein-tilstøtende DNA er spaltet via MNase, og DNA blir deretter renset for bruk i biblioteksforberedelse. Denne figuren ble opprettet med Biorender.com. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Eksempelresultater fra cellesortering og kvalitetskontroll av uliCUT&RUN-biblioteker. (A) Bilde av høykvalitets murin embryonale stamceller (ES). Skalalinje: 200 μm. (B) Utgang fra encellet sortering etter å ha lagt til 7AAD til høstede ES-celler og sortering på et FACS-instrument. (C) Ethidiumbromidfarget agarosegel som skildrer fullførte uliCUT&RUN-biblioteker. Lane 1 er en lavmolekylær stige og baner 2-21 er eksempler på vellykkede individuelle encellede uliCUT&RUN biblioteker før sekvensering. (D) Ethidiumbromidfarget agarosegel som viser sub-optimale og optimale fullførte uliCUT&RUN-biblioteker. Lane 1 er en lav molekylvekt stige, lane 2 er et sub-optimalt bibliotek på grunn av ineffektiv MNase fordøyelse, og lane 3 er et vellykket bibliotek med passende fordøyelse. (E) Fragmentanalysatordistribusjon av ett enkeltcellet uliCUT&RUN-bibliotek før sekvensering. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Eksempel på forventede resultater for enkelt ES-celle uliCUT&RUN-data. (A) Nettleserspor av høyt cellenummer (5000 celler) CTCF eller negativ kontroll (No Antibody, No Ab) uliCUT&RUN (topp to spor) og encellet CTCF uliCUT&RUN. Bildet er gjengitt, med tillatelse, fra Patty og Hainer27. (B) Varmekart (øverst) og metaplots (nederst) av encellet CTCF eller negativ kontroll (No Ab) uliCUT&RUN over tidligere publiserte CTCF ChIP-seq nettsteder (GSE11724). Bildet er gjengitt, med tillatelse, fra Hainer et al.23. (C) 1D-varmekart over encellede CTCF eller negativ kontroll (No Ab) uliCUT&RUN over tidligere publiserte CTCF ChIP-seq-nettsteder (GSE11724). Bildet er gjengitt, med tillatelse, fra Hainer et al.23. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Tabell 1: Sammensetning av ulike buffere som brukes i denne protokollen. Nødvendig lagervolum er oppført med endelig konsentrasjon skrevet i parentes. Klikk her for å laste ned denne tabellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
CUT&RUN er en effektiv protokoll for å bestemme proteinlokalisering på kromatin. Den har mange fordeler i forhold til andre protokoller, inkludert: 1) høyt signal-til-støy-forhold, 2) rask protokoll og 3) lav sekvensering lesedekning som kreves og dermed føre til kostnadsbesparelser. Bruken av Protein A- eller Protein A/G-MNase gjør det mulig å påføre CUT&RUN med alle tilgjengelige antistoffer; Derfor har den potensial til raskt og enkelt å profilere mange proteiner. Tilpasning til encellet for proteinprofilering på kromatin har imidlertid vært vanskelig, spesielt sammenlignet med encellet transkripsjon (dvs. scRNA-seq), på grunn av det lave kopinummeret av DNA i forhold til RNA (to til fire kopier av DNA versus mulige tusenvis av RNA-kopier).
I protokollen som er beskrevet ovenfor, bør flere kritiske trinn vurderes. For det første er riktig sortering av celler avhengig av celle (eller vev) type, og det bør tas hensyn til nøyaktig sortering. Det anbefales å teste hvor effektiv encellet sortering er med instrumentet i forkant av et eksperiment. For det andre er effektivt antistoffvalg viktig. Før du går videre til en encellet applikasjon, anbefales det å teste antistoffet i et høyt cellenummereksperiment (samt andre standard antistofftester, for eksempel å bekrefte spesifisitet ved hjelp av vestlig blot etter nedslag, titrering av antistoffet i CUT&RUN-eksperimenter, etc.). For det tredje, bruk en negativ kontroll, for eksempel IgG eller ikke noe primært antistoff, fordi en passende sammenligning med eksperimentelle prøver er avgjørende for tolkningen av datakvaliteten og biologiske resultater. Når du sammenligner eksperimentelle resultater med en datasett med ett celletall, bør den negative kontrollens enkeltcelleeksperimenter ha mindre lesedekning over de bindingsstedene som er identifisert i høycelleeksperimentet og heller ha en tilfeldig fordeling av lesninger på tvers av genomet (med en skjevhet for åpne områder av kromatin). For det fjerde bør det tas hensyn til når du legger til og aktiverer protein A- eller protein A / G-MNase for ikke å over fordøye kromatin: Ikke overopphet prøvene med hendene, oppretthold prøvene i en is / vannbadtemperatur (0 °C), og chelate reaksjonen på riktig tidspunkt. For det femte bør det tas hensyn til hele uliCUT&RUN-eksperimentet og biblioteksforberedelsene på grunn av lavt materiale. For eksempel er utvidet inkubasjon på magnetstativet under perlebinding for å sikre at supernatanten har ryddet og pass på at du ikke forstyrrer perlene når du fjerner supernatanten, er avgjørende for tilstrekkelig utbytte. For det sjette, avhengig av spørsmålene som blir adressert, er antall encellede eksperimenter som utføres en viktig vurdering. Noen av enkeltcelleeksperimentene vil mislykkes (som med alle eksperimenter med lav input), og derfor bør antall positive eksperimentelle resultater som kreves for passende tolkning vurderes i forkant av begynnelsen av eksperimentet. Antall celler som skal inkluderes i eksperimentet er avhengig av mengden eksperimentelle data som kreves av undersøkeren og kvaliteten på antistoffet. Legg til slutt merke til at tilsvarende resultater kan oppnås med reduserte volumer av mange aspekter av denne protokollen. Trinn der volumet ble redusert med 50% inkluderer volumet av NE-buffer, vaskebuffer, primær antistoffblanding (inkludert mengden primært antistoff), pA-MNase-blanding (inkludert mengden pA-MNase) og alle trinnene i bibliotekpreparatet.
Basert på den kompliserte karakteren av faktorprofilering på kromatin, er det mange potensielle kilder til problemer og steder der feilsøking kan bli nødvendig. Selv om det kan være mange trinn der problemer kan oppstå, har tre store problemer blitt observert: 1) lavt DNA-utbytte for innspill til bibliotekbygging; 2) høyt bakgrunnssignal i eksperimentelle prøver, og 3) lav avkastning etter bibliotekbygging. Hvis det ikke er tilstrekkelig DNA for bibliotekforberedelse og sekvensering (punkt 1), legg merke til følgende feilsøkingsråd: a) det kan ha vært ufullstendig membranlys, og derfor kan lysistiden med NE-buffer økes; b) det kan ha vært ineffektiv binding av kjernen til de kona-konjugede paramagnetiske mikrosfærene, og dette kan løses gjennom passende blanding ved tilsetning av disse perlene; c) det kan ha blitt tilsatt for lite antistoff, og derfor anbefales det å utføre en titrering av antistoff for å identifisere den mest effektive mengden; d) inkubasjonstider med enten det primære antistoffet eller Protein A- eller Protein A/G-MNase er enten for korte (dvs. ikke nok tid til å tillate binding) eller for lenge (disse er innfødte, ubkoblede prøver), og kan optimaliseres; e) samspillet mellom målproteinet og kromatin kan være for forbigående til å fange opp under opprinnelige forhold, og derfor kan krysskobling av CUT&RUN utføres28. Selv om datasett med én celle gir høy bakgrunn, kan det være for høy bakgrunn der signalet er vanskelig å tolke fra bakgrunnen (punkt 2). For dette problemet, legg merke til følgende råd: a) blokkeringstrinnet med EDTA for å forhindre forebyggende MNase-fordøyelse kan økes eller optimaliseres; b) hvis det er overdreven kutting, kan det skyldes å ha for mye protein A- eller protein A / G-MNase, og derfor kan en titrering av passende mengder utføres; c) over fordøyelsen av MNase kan resultere i høy bakgrunn, og derfor bør riktig blanding av kalsiumklorid ved tilsetning og optimalisering for MNase fordøyelsestid vurderes. Til slutt kan effektivt uliCUT&RUN-beriket DNA ha blitt gjenvunnet, men en lav mengde bibliotek kan gjenopprettes (punkt 3). For dette problemet anbefales følgende: a) passende håndtering og bruk av polystyrenmagnetittperler for å sikre riktig rensing og ingen DNA-tap; spesielt anbefales det å ha 15 min inkubasjoner og minst 5 min for å magnetisere perler for å forhindre tap; b) underforsterkning av biblioteket på PCR-stadiet vil resultere i lav avkastning, og derfor bør de aktuelle syklusene bestemmes ved hjelp av qPCR (som tidligere etablert for ATAC-seq biblioteker29).
Som med alle teknologier, er det begrensninger for uliCUT&RUN som bør vurderes før du starter eksperimentering. For det første er disse eksperimentene designet og optimalisert for innfødte forhold, og derfor hvis et protein bare samhandler forbigående med kromatin, kan det være nødvendig med en krysskoblingstilnærming for å sikre gjenoppretting av samspillet. For det andre, som med alle antistoffbaserte teknikker, er kvaliteten på antistoffet viktig. Det bør utvises forsiktighet for å sikre kvaliteten og konsistensen av antistoffet i forkant av å gjennomføre eksperimenter. For det tredje kan MNase bakgrunnsskjæring forekomme, og selv om det er et konsekvent lavere bakgrunnssignal i CUT&RUN i forhold til andre eksperimenter, kan bakgrunnssignalet være høyt i encellede eksperimenter og derfor bør passende kontroller og analyser utføres. Selv om den binære karakteren av encellede profileringsdata begrenser visualiseringen, kan mer avanserte beregningsgenomiske teknologier, for eksempel dimensjonsreduksjon og andre, utføres (som tidligere beskrevet27). Til slutt, mens encellet profilering har blitt utvidet her til 96-brønnsformat, er dette lav gjennomstrømning i forhold til andre encellede teknologier som bruker 10xGenomics eller andre formater.
Tethering-baserte profileringsteknologier som ChEC-seq20, CUT&Tag24, CUT&RUN21 og uliCUT&RUN23 kan bestemme faktorlokalisering på kromatin med en raskere eksperimentell tidslinje, lavere bakgrunn og lavere kostnader enn tradisjonelle profileringsteknologier, for eksempel ChIP-seq. Derfor er dette veldig spennende teknologier for bruk på dyrebare prøver som pasientprøver eller tidlige utviklingsprøver. Videre kan anvendelse på enkeltceller gi komplementære studier utført ved hjelp av andre encellede eksperimenter som scRNA-seq og scATAC-seq30. Som beskrevet ved hjelp av disse mer brukte encelleteknologiene, kan ny innsikt oppnås i forhold til bulkcelleeksperimenter. Encellet proteinprofilering på kromatin forventes å bli mer regelmessig brukt etter hvert som teknologiene fortsetter å forbedre og tillate mer parallellisering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen konkurrerende interesser knyttet til dette prosjektet.
Acknowledgments
Vi takker medlemmer av Hainer Lab for lesing og kommentarer til en tidligere versjon av dette manuskriptet. Dette prosjektet brukte NextSeq500 tilgjengelig ved University of Pittsburgh Health Sciences Sequencing Core ved UPMC Children's Hospital of Pittsburgh for sekvensering med spesiell takk til regissøren William MacDonald. Denne forskningen ble delvis støttet av University of Pittsburgh Center for Research Computing gjennom dataressursene som ble gitt. Dette arbeidet ble støttet av National Institutes of Health Grant Number R35GM133732 (til S.J.H.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL clear microfuge tubes | ThermoFisher Scientific | 90410 | |
| 1.5 mL tube magnetic rack | ThermoFisher Scientific | 12321D | |
| 1.5 mL tube-compatible cold centrifuge | Eppendorf | 5404000537 | |
| 10 cm sterile tissue culture plates | ThermoFisher Scientific | 150464 | |
| 10X T4 DNA Ligase buffer | New England Biolabs | B0202S | |
| 15 mL conical tubes | VWR | 89039-656 | |
| 1X TE buffer | ThermoFisher Scientific | 12090015 | |
| 200 µL PCR tubes | Eppendorf | 951010022 | |
| 2X quick ligase buffer | New England Biolabs | M2200 | Ligase Buffer |
| 5X KAPA HiFi buffer | Roche | 7958889001 | 5X high fidelity PCR buffer |
| 7-Amino-Actinomycin D (7-AAD) | Fisher Scientific | BDB559925 | |
| 96-well magnetic rack | ThermoFisher Scientific | 12027 or 12331D | |
| 96-well plate | VWR | 82006-636 | |
| AMPure XP beads | Beckman Coulter | A63881 | polystyrene-magnetite beads; Due to potential variability between AMPure XP bead lots, it is recommended that your AMPure bead solution be calibrated. See manufacturer’s instructions |
| Antibody to protein of interest | varies | ||
| ATP | ThermoFisher Scientific | R0441 | |
| BioMag Plus Concanavalin A beads | Polysciences | 86057-10 | ConA-conjugated paramagnetic microspheres |
| BSA | |||
| Calcium Chloride (CaCl2) | Fisher Scientific | AAJ62905AP | |
| Cell sorter | BD FACSAria II cell sorter | Requires training | |
| Cell-specific media for cell culture | Varies | ||
| Chloroform | ThermoFisher Scientific | C298-500 | Chloroform is a skin irritant and harmful if swallowed; handle in a chemical fume hood using gloves, a lab coat, and goggles |
| Computer with 64-bit processer and access to a super computing cluster | For computational analyses of resulting sequencing datasets | ||
| DNA spin columns | Epoch Life Sciences | 1920-250 | |
| dNTP set | New England Biolabs | N0446S | |
| EGTA | Sigma Aldrich | E3889 | |
| Electrophoresis equipment | varies | ||
| Ethanol | Fisher Scientific | 22032601 | 100% vol/vol ethanol is highly flammable; handle in a chemical fume hood using gloves, a lab coat, and goggles |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Fisher Scientific | BP2482100 | |
| FBS | Sigma Aldrich | F2442 | |
| Glycerol | Fisher Scientific | BP229-1 | |
| Glycogen | VWR | 97063-256 | |
| HEPES | Fisher Scientific | BP310-500 | |
| Heterologous S. cerevisiae DNA spike-in | homemade | Prepared from crosslinked, MNase-digested, and agarose gel extracted genomic DNA purified of protein/RNA and diluted to 10 ng/mL. We recommend yeast genomic DNA, but other organisms can be used if needed. | |
| Hydrochloric Acid (HCl) | Fisher Scientific | A144-212 | Hydrochloric Acid is very corrosive; handle in a chemical fume hood using gloves, a lab coat, and goggles |
| Ice Bucket | varies | ||
| Illumina Sequencing platform (e.g., NextSeq500) | Illumina | ||
| Incubator with temperature and atmosphere control | ThermoFisher Scientific | 51030284 | |
| KAPA HotStart HiFi DNA Polymerase with 5X KAPA HiFi buffer | Roche | 7958889001 | hotstart high fidelity polymerase |
| Laminar flow hood | Bakery Company | SG404 | |
| Manganese Chloride (MnCl2) | Sigma Aldrich | 244589 | |
| Micropipette set | Rainin | 30386597 | |
| Minifuge | Benchmark Scientific | C1012 | |
| NEB Adaptor | New England Biolabs | E6612AVIAL | Adaptor |
| NEB Universal primer | New England Biolabs | E6611AVIAL | Universal Primer |
| NEBNext Multiplex Oligos for Illumina kit | New England Biolabs | E7335S/L, E7500S/L, E7710S/L, E7730S/L | Indexed Primers |
| Negative control antibody | Antibodies-Online | ABIN101961 | |
| Nuclease Free water | New England Biolabs | B1500S | |
| PCR thermocycler | Eppendorf | 2231000666 | |
| Phase lock tubes | Qiagen | 129046 | |
| Phenol/Chloroform/Isoamyl Alcohol (PCI) | ThermoFisher Scientific | 15593049 | Phenol is harmful if swallowed or upon skin contact; handle in a chemical fume hood using gloves, a lab coat, and goggles |
| Phsophate buffered saline (PBS) | ThermoFisher Scientific | 10814010 | |
| Pipette aid | Drummond Scientific | # 4-000-100 | |
| Polyethylene glycol (PEG) 4000 | VWR | A16151 | |
| Potassium Chloride (KCl) | Sigma Aldrich | P3911 | |
| Potassium Hydroxide (KOH) | Fisher Scientific | P250-1 | CAUTION KOH is an eye/skin irritant as a solid and corrosive in solution. Handle in a chemical fume hood using gloves, a lab coat, and goggles |
| Protease Inhibitors | ThermoFisher Scientific | 78430 | |
| ProteinA/G-MNase | Epicypher | 15-1016 | pA/G-MNase |
| ProteinA-MNase, purified from pK19pA-MN | Addgene | 86973 | |
| Proteinase K | New England Biolabs | P8107S | |
| Qubit 1X dsDNA HS Assay Kit | ThermoFisher Scientific | Q33230 | |
| Qubit Assay tubes | ThermoFisher Scientific | Q32856 | |
| Qubit Fluorometer | ThermoFisher Scientific | Q33238 | |
| Quick Ligase with 2X Quick Ligase buffer | New England Biolabs | M2200S | |
| RNase A | New England Biolabs | T3010 | |
| Sodium Acetate (NaOAc) | ThermoFisher Scientific | BP333-500 | |
| Sodium Chloride (NaCl) | Sigma Aldrich | S5150-1L | |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | ThermoFisher Scientific | BP166-500 | SDS is poisonous if inhaled; handle with care in well ventilated spaces using gloves, eye protection, and an N95-grade respirator when handling |
| Sodium Hydroxide (NaOH) | Fisher Scientific | S318-1 | NaOH is an eye/skin irritant as a solid and corrosive in solution. Handle in a chemical fume hood using gloves, a lab coat, and goggles |
| Spermidine | Sigma Aldrich | S2626 | |
| Standard Inverted Light Microscope | Leica | 11526213 | |
| Standard lab agarose gel materials | Varies | ||
| Standard lab materials such as serological pipettes and pipette tips | Varies | ||
| T4 DNA Ligase | New England Biolabs | M0202S | |
| T4 DNA Polymerase | New England Biolabs | M0203S | |
| T4 PNK | New England Biolabs | M0201S | |
| Tabletop vortexer | Fisher Scientific | 2215414 | |
| Taq DNA Polymerase | New England Biolabs | M0273S | |
| Thermomixer | Eppendorf | 5384000020 | Alternatively, can use a waterbath |
| Tris base | Fisher Scientific | BP152-5 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | 9002-93-1 | Triton X-100 is hazardous; use a lab coat, gloves, and goggles when handling |
| Trypsin | Fisher Scientific | MT25052 | |
| Tube rotator | VWR | 10136084 | |
| USER enzyme | New England Biolabs | M5505S |
References
- Gilmour, D. S., Lis, J. T. In vivo interactions of RNA polymerase II with genes of Drosophila melanogaster. Molecular and Cellular Biology. 5 (8), 2009-2018 (1985).
- Solomon, M. J., Varshavsky, A. Formaldehyde-mediated DNA-protein crosslinking: a probe for in vivo chromatin structures. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 82 (19), 6470-6474 (1985).
- Irvine, R. A., Lin, I. G., Hsieh, C. -L. DNA methylation has a local effect on transcription and histone acetylation. Molecular and Cellular Biology. 22 (19), 6689-6696 (2002).
- Albert, I., et al. Translational and rotational settings of H2A.Z nucleosomes across the Saccharomyces cerevisiae genome. Nature. 446 (7135), 572-576 (2007).
- Blat, Y., Kleckner, N. Cohesins bind to preferential sites along yeast chromosome III, with differential regulation along arms versus the centric region. Cell. 98 (2), 249-259 (1999).
- Ren, B., et al. Genome-wide location and function of DNA binding proteins. Science. 290 (5500), 2306-2309 (2000).
- Rhee, H. S., Pugh, B. F. Comprehensive genome-wide protein-DNA interactions detected at single-nucleotide resolution. Cell. 147 (6), 1408-1419 (2011).
- He, Q., Johnston, J., Zeitlinger, J. ChIP-nexus enables improved detection of in vivo transcription factor binding footprints. Nature Biotechnology. 33 (4), 395-401 (2015).
- O'Neill, L. P., Turner, B. M.
- Schmidl, C., Rendeiro, A. F., Sheffield, N. C., Bock, C. ChIPmentation: fast, robust, low-input ChIP-seq for histones and transcription factors. Nature Methods. 12 (10), 963-965 (2015).
- Cao, Z., Chen, C., He, B., Tan, K., Lu, C. A microfluidic device for epigenomic profiling using 100 cells. Nature Methods. 12 (10), 959-962 (2015).
- Shankaranarayanan, P., et al. Single-tube linear DNA amplification (LinDA) for robust ChIP-seq. Nature Methods. 8 (7), 565-567 (2011).
- Rotem, A., et al. Single-cell ChIP-seq reveals cell subpopulations defined by chromatin state. Nature Biotechnology. 33 (11), 1165-1172 (2015).
- Grosselin, K., et al. High-throughput single-cell ChIP-seq identifies heterogeneity of chromatin states in breast cancer. Nature Genetics. 51 (6), 1060-1066 (2019).
- Adli, M., Bernstein, B. E. Whole-genome chromatin profiling from limited numbers of cells using nano-ChIP-seq. Nature Protocols. 6 (10), 1656-1668 (2011).
- Zwart, W., et al. A carrier-assisted ChIP-seq method for estrogen receptor-chromatin interactions from breast cancer core needle biopsy samples. BMC Genomics. 14, 232 (2013).
- Valensisi, C., Liao, J. L., Andrus, C., Battle, S. L., Hawkins, R. D. cChIP-seq: a robust small-scale method for investigation of histone modifications. BMC Genomics. 16, 1083 (2015).
- Brind'Amour, J., et al. An ultra-low-input native ChIP-seq protocol for genome-wide profiling of rare cell populations. Nature Communications. 6, 6033 (2015).
- Schmid, M., Durussel, T., Laemmli, U. K. C. hI. C. ChlC and ChEC; genomic mapping of chromatin proteins. Molecular Cell. 16 (1), 147-157 (2004).
- Zentner, G. E., Kasinathan, S., Xin, B., Rohs, R., Henikoff, S. ChEC-seq kinetics discriminates transcription factor binding sites by DNA sequence and shape in vivo. Nature Communications. 6, 8733 (2015).
- Skene, P. J., Henikoff, S. An efficient targeted nuclease strategy for high-resolution mapping of DNA binding sites. eLife. 6, 21856 (2017).
- Meers, M. P., Bryson, T. D., Henikoff, J. G., Henikoff, S.
- Hainer, S. J., Bošković, A., McCannell, K. N., Rando, O. J., Fazzio, T. G. Profiling of pluripotency factors in single cells and early embryos. Cell. 177 (5), 1319-1329 (2019).
- Kaya-Okur, H. S., et al. CUT&Tag for efficient epigenomic profiling of small samples and single cells. Nature Communications. 10 (1), 1930 (2019).
- Carter, B., et al. Mapping histone modifications in low cell number and single cells using antibody-guided chromatin tagmentation (ACT-seq). Nature Communications. 10 (1), 3747 (2019).
- Gopalan, S., Wang, Y., Harper, N. W., Garber, M., Fazzio, T. G. Simultaneous profiling of multiple chromatin proteins in the same cells. Molecular Cell. 81 (22), 4736-4746 (2021).
- Patty, B. J., Hainer, S. J. Transcription factor chromatin profiling genome-wide using uliCUT&RUN in single cells and individual blastocysts. Nature Protocols. 16 (5), 2633-2666 (2021).
- Zheng, X. -Y., Gehring, M. Low-input chromatin profiling in Arabidopsis endosperm using CUT&RUN. Plant Reproduction. 32 (1), 63-75 (2019).
- Buenrostro, J. D., Giresi, P. G., Zaba, L. C., Chang, H. Y., Greenleaf, W. J. Transposition of native chromatin for fast and sensitive epigenomic profiling of open chromatin, DNA-binding proteins and nucleosome position. Nature Methods. 10 (12), 1213-1218 (2013).
- Buenrostro, J. D., et al. Single-cell chromatin accessibility reveals principles of regulatory variation. Nature. 523 (7561), 486-490 (2015).
