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JoVE Journal Immunology and Infection
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Immunology and Infection

Mausmodell des Ölsäure-induzierten akuten Atemnotsyndroms

Published: June 2, 2022 doi: 10.3791/63566
Automatic Translation
*1,2,5, *1,2,6, 1,3,4, 1,3, 1,2,4,5,6
1Laboratório de Imunofarmacologia, Fundação Oswaldo Cruz, FIOCRUZ, 2Laboratório de Imunofarmacologia, Departamento de Bioquímica, Instituto Biomédico, Universidade Federal do Estado do Rio de Janeiro, 3Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e Molecular, Instituto Oswaldo Cruz, FIOCRUZ, 4Programa de Pós-Graduação em Biologia Molecular e Celular, Universidade Federal do Estado do Rio de Janeiro, 5Programa de Pós-Graduação em Ciências e Biotecnologia, Universidade Federal Fluminense, 6Programa de Pós-Graduação em Neurociências, Universidade Federal Fluminense
* These authors contributed equally

Summary

Das vorliegende Protokoll beschreibt ein Lungenverletzungsmodell bei Mäusen, bei dem Ölsäure verwendet wird, um das akute Atemnotsyndrom (ARDS) nachzuahmen. Dieses Modell erhöht die Entzündungsmediatoren auf Ödeme und verringert die Lungencompliance. Ölsäure wird in der Salzform (Oleat) verwendet, da diese physiologische Form das Risiko einer Embolie vermeidet.

Abstract

Das akute Atemnotsyndrom (ARDS) stellt eine erhebliche Bedrohung für kritisch kranke Patienten mit einer hohen Sterblichkeitsrate dar. Schadstoffbelastung, Zigarettenrauch, Infektionserreger und Fettsäuren können ARDS auslösen. Tiermodelle können den komplexen Pathomechanismus des ARDS nachahmen. Jeder von ihnen hat jedoch seine Grenzen. Bemerkenswert ist, dass Ölsäure (OA) bei kritisch kranken Patienten mit schädlichen Auswirkungen auf die Lunge erhöht ist. Arthrose kann Lungenschäden durch Embolien, Zerstörung des Gewebes, Veränderung des pH-Werts und Beeinträchtigung der Ödembeseitigung induzieren. Das OA-induzierte Lungenverletzungsmodell ähnelt verschiedenen Merkmalen des ARDS mit Endothelschädigung, erhöhter alveolärer Permeabilität, Entzündung, Membranhyalinbildung und Zelltod. Hier wird die Induktion einer Lungenschädigung beschrieben, indem OA (in Salzform) direkt in die Lunge und intravenös in eine Maus injiziert wird, da es sich um die physiologische Form von OA bei pH 7 handelt. Daher ist die Injektion von OA in Salzform ein hilfreiches Tiermodell, um Lungenverletzungen/ARDS zu untersuchen, ohne Embolien zu verursachen oder den pH-Wert zu verändern, und so nahe an das heranzukommen, was bei kritisch kranken Patienten passiert.

Introduction

Ashbaugh et al.1 beschrieben erstmals 1967 das akute Atemnotsyndrom (ARDS) und haben seitdem mehrere Revisionen durchlaufen. Nach der Berliner Definition handelt es sich bei ARDS um eine Lungenentzündung, die aufgrund eines Ungleichgewichts im Verhältnis von Ventilation zu Perfusion, diffuser bilateraler alveolärer Schädigung (DAD) und Infiltrat, erhöhtem Lungengewicht und Ödemen zu einer akuten Ateminsuffizienz und Hypoxämie (PaO 2/FiO2 > 300 mm Hg) führt. Das Lungenparenchym ist eine komplexe zelluläre Umgebung, die aus Epithel-, Endothel- und anderen Zellen besteht. Diese Zellen bilden Barrieren und Strukturen, die für den Gasaustausch und die Homöostase in den Alveolen verantwortlichsind 3. Die am häufigsten vorkommenden Zellen innerhalb der Epithelbarriere sind alveoläre Typ-I-Zellen (AT1) mit einer größeren Oberfläche für den Gasaustausch und das Flüssigkeitsmanagement durch Na/K-ATPase. Außerdem produzieren die alveolären Typ-II-Zellen (AT2) Tensid, wodurch die Oberflächenspannung in den Alveolen reduziertwird 4. Darunter bilden Endothelzellen eine semipermeable Barriere, die den Lungenkreislauf vom Interstitium trennt. Zu seinen Funktionen gehören die Erkennung von Reizen, die Koordination von Entzündungsreaktionen und die zelluläre Transmigration5. Die Endothelzellen regulieren auch den Gasaustausch, den Gefäßtonus und die Gerinnung5. Daher können Endothel- und Epithelfunktionsstörungen einen proinflammatorischen Phänotyp verschlimmern und Lungenschäden verursachen, die zu ARDS5 führen.

Die Entwicklung eines ARDS ist risikoassoziiert mit einer bakteriellen und viralen Lungenentzündung oder indirekten Faktoren wie nicht-pulmonaler Sepsis, Trauma, Bluttransfusionen und Pankreatitis6. Diese Bedingungen verursachen die Freisetzung von pathogen-assoziierten molekularen Mustern (PAMPs) und schadensassoziierten molekularen Mustern (DAMPs), die proinflammatorische Zytokine und Chemokine wie TNF-α, IL-1β, IL-6 und IL-85 induzieren. TNF-α ist mit dem Abbau von vaskulär-endothelialem Cadherin (VE-Cadherin) bei der Störung der endothelialen Barriere und der Leukozyteninfiltration in das Lungenparenchym verbunden. Neutrophile Granulozyten sind die ersten Zellen, die von IL-8 und LTB4 5,7,8 angezogen werden. Neutrophile Granulozyten erhöhen die Bildung von proinflammatorischen Zytokinen, reaktiven Sauerstoffspezies (ROS)9 und neutrophilen extrazellulären Fallen (NETs), die zusätzliche Endothel- und Epithelschäden verursachen10. Eine epitheliale Schädigung führt zu einer Entzündung und Aktivierung von Toll-like-Rezeptoren in AT2-Zellen und residenten Makrophagen, die die Freisetzung von Chemokinen induzieren, die Entzündungszellen in die Lunge locken4. Auch die Produktion von Zytokinen wie Interferon-β (INFβ) verursacht TNF-verwandte Apoptose-induzierende Rezeptoren (TRAIL), die ATII-Zellen zur Apoptose führen und die Flüssigkeits- und Ionenclarenz beeinträchtigen4. Die Störung der endothelialen und epithelialen Barrierestruktur ermöglicht den Einstrom von Flüssigkeit, Proteinen, roten Blutkörperchen und Leukozyten in den Alveolarraum, was zu Ödemen führt. Wenn sich ein Ödem etabliert hat, ist die pulmonale Anstrengung zur Aufrechterhaltung der Atmung und des Gasaustauschs verändert11. Hyperkapnie und Hypoxämie induzieren den Zelltod und eine Störung des Natriumtransports, was das Alveolarödem aufgrund der schlechten Clearance-Kapazität verschlimmert10. ARDS weist auch erhöhte IL-17A-Spiegel auf, die mit Organfunktionsstörungen, einem erhöhten Prozentsatz alveolärer Neutrophilen und einer alveolären Permeabilität verbundensind 9.

In den letzten Jahren gab es kontinuierliche Fortschritte in der Forschung zur Pathophysiologie, Epidemiologie und Behandlung von ARDS12,13. ARDS ist jedoch ein heterogenes Syndrom, trotz der Fortschritte in der therapeutischen Forschung, die zu einer Optimierung der mechanischen Beatmung und der Flüssigkeitstherapie führen. Daher ist nach wie vor eine wirksamere direkte pharmakologische Behandlung erforderlich10, und Tierversuche können dazu beitragen, ARDS-Mechanismen und -Ziele für die Intervention zu enthüllen.

Derzeitige ARDS-Modelle sind nicht in der Lage, die Pathologie vollständig zu replizieren. Daher wählen Forscher oft das Modell, das ihren Interessen besser entsprechen könnte. Zum Beispiel induziert das Lipopolysaccharid (LPS)-Induktionsmodell ARDS durch einen endotoxischen Schock, der hauptsächlich durch TLR414 ausgelöst wird. Die HCl-Induktion ahmt die Säureaspiration nach, und die Schädigung ist neutrophil-abhängig14. Auf der anderen Seite induziert das derzeitige Natriumoleat-Modell eine Endothelschädigung, die die Gefäßpermeabilität und das Ödem erhöht. Darüber hinaus vermeidet die Verwendung von Natriumoleat anstelle von Ölsäure in flüssiger Form Embolierisiken und Veränderungen des Blut-pH-Werts15.

Tiermodelle für ARDS
Präklinische Studien in Tiermodellen helfen, die Pathologie zu verstehen und sind für die Erforschung neuer ARDS-Behandlungen unerlässlich. Das ideale Tiermodell muss Merkmale aufweisen, die der klinischen Situation ähneln, und eine gute Reproduzierbarkeit der Krankheitsmechanismen mit relevanten pathophysiologischen Merkmalen jedes Krankheitsstadiums, jeder Evolution und jeder Reparaturaufweisen 14. Mehrere Tiermodelle werden verwendet, um eine akute Lungenschädigung bei ARDS präklinisch zu beurteilen. Da jedoch alle Modelle Einschränkungen aufweisen, reproduzieren sie die menschliche Pathologie nicht vollständig 6,14,16. Das Ölsäure-induzierte ARDS wird bei verschiedenen Tierarten eingesetzt17. Schweine18, Schafe19 und Hunde20, die einer OA-Injektion unterzogen wurden, weisen zahlreiche klinische Merkmale der Erkrankung mit Dysfunktion der alveolären Kapillarmembran und erhöhter Permeabilität mit Protein- und Zellinfiltration auf.

Zum Beispiel blockierte die intravenös injizierte OA bei 1,25 μM den transepithelialen Transport, was zu einem Alveolarödemführte 15. Im In-vitro-Modell mit A549-Zellen veränderte OA in einer Konzentration von 10 μM weder den epithelialen Natriumkanal (eNAC) noch die Expression der Na/K-ATPase. OA scheint jedoch mit beiden Kanälen zu assoziieren und ihre Aktivität direkt zu hemmen21. Die intravenöse Injektion von OA in einer Dosierung von 0,1 ml/kg verursachte eine Stauung und Schwellung des Lungengewebes, reduzierte Alveolarräume mit verdickten Alveolarsepten und erhöhte entzündliche und rote Blutkörperchenzahlen22. Außerdem induzierte OA Apoptose und Nekrose in Endothel- und Epithelzellen in der Lunge15. Die intratracheale Injektion einer Tris-Oleat-Lösung bei Mäusen verstärkte die Infiltration und das Ödem von Neutrophilen bereits 6 Stunden nach der Stimulation23. Die OA-Injektion nach 24 Stunden erhöhte die proinflammatorischen Zytokinspiegel (d. h. TNF-α, IL-6 und IL-1β)23. Darüber hinaus hemmt die intravenöse Injektion (orbitaler Plexus) von 10 μM eines Tris-Oleats die pulmonale Na/K-ATPase-Aktivität, ähnlich wie Ouabain bei 10-3 μM, einem selektiven Enzyminhibitor. Außerdem induziert OA Entzündungen mit Zellinfiltration, Bildung von Lipidkörpern und Produktion von Leukotrien-B4 (LTB4) und Prostaglandin E2 (PGE2)22,24. Daher erzeugt Ölsäure-induziertes ARDS Ödeme, Blutungen, Neutrophileninfiltration, erhöhte Myeloperoxidase (MPO)-Aktivität und ROS24. Daher ist die OA-Verabreichung ein etabliertes Modell für Lungenverletzungen22,25. Alle in diesem Artikel vorgestellten Ergebnisse, die OA enthalten, repräsentieren die Salzform Natriumoleat.

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Protocol

Die in dieser Studie verwendeten Verfahren wurden von der Ethikkommission für die Verwendung von Tieren der Oswaldo-Cruz-Stiftung genehmigt (CEUA-Lizenzen Nr. 002-08, 36/10 und 054/2015). Für die Experimente wurden männliche Schweizer Webster-Mäuse mit einem Gewicht zwischen 20 und 30 g verwendet, die vom Institute of Science and Technology in Biomodels (ICTB) der Oswaldo-Cruz-Stiftung (FIOCRUZ) zur Verfügung gestellt wurden. Die Tiere wurden in belüfteten Isolatoren im Vivarium des Pavilhão Ozório de Almeida gehalten, Wasser und Futter standen ad libitum zur Verfügung. Sie wurden einem 12 h/12 h alten Hell-Dunkel-Zyklus ausgesetzt.

1. Herstellung einer Natriumoleatlösung

  1. Verwenden Sie Ölsäure, um eine 100 mmol/l Natriumoleat-Stammlösung in einem sterilen Röhrchen oder Glaskolben herzustellen.
    HINWEIS: Für die vorliegende Arbeit wurde eine 50-ml-Lösung (Endvolumen) hergestellt, aber das Volumen muss je nach experimentellem Bedarf angepasst werden. Die Lösung muss immer in sterilen Röhrchen oder Glasbehältern zubereitet werden.
    1. Fügen Sie zunächst NaOH-Tabletten oder -Lösung in Reinstwasser hinzu, um den pH-Wert zu erhöhen. Ein pH-Wert von 12-13 wird für ein Volumen von 25 ml empfohlen.
      HINWEIS: Alternativ kann Tris-Base zur Herstellung der Tris-Oleat-Lösung verwendet werden.
    2. Die Ölsäure (siehe Materialtabelle) wird sehr langsam, Tropfen für Tropfen, unter ständigem Rühren in einem Ultraschallbad bei 37 °C zugegeben.
      HINWEIS: Wenn eine Ölsäureausfällung auftritt, beginnen Sie von vorne.
    3. Sobald die Ölsäure vollständig aufgelöst ist, stellen Sie den pH-Wert unter Rühren mit hochreinem verdünntem HCl Tropfen für Tropfen vorsichtig auf 7,4 ein und stellen Sie ihn dann auf das Endvolumen von 50 ml ein.
      HINWEIS: Bereiten Sie die Arbeitsoleatlösungen frisch vor. Alternativ kann die Lösung aliquotiert, gelagert und bei -20 °C in einer mit Stickstoff angereicherten Umgebung aufbewahrt werden, um eine Oxidation nicht länger als einen Monat zu vermeiden. Vermeiden Sie gefrorene und wieder eingefrorene Zyklen.

2. Induktion einer Lungenschädigung durch Ölsäure

  1. Führen Sie die intratracheale Verabreichung von Ölsäure durch.
    1. Betäubung der Mäuse mit 5% Isofluran mit 2 l/minO2 unter Verwendung eines veterinärmedizinischen Anästhesie-Verdampfers (Abbildung 1A). Entfernen Sie das Fell an der Einschnittsstelle mit Enthaarungscreme und desinfizieren Sie den Bereich mit drei abwechselnden Runden Betadin-Peeling und Alkohol mit steriler Gaze. Bestätigen Sie die Tiefe der Anästhesie, indem Sie die Zehen zusammendrücken.
      HINWEIS: Verwenden Sie während des Eingriffs sterile Handschuhe und Instrumente. Verwenden Sie ein Tuch, um das Tier abzudecken und legen Sie nur die Einschnittsstelle frei. Führen Sie das Experiment in einer biologischen Sicherheitswerkbank durch, um zu vermeiden, dass Isofluoran in die Umwelt entweicht. Analgetika werden nicht verabreicht, da sie die Entzündungsreaktion hemmen können.
    2. Nach der Narkose legen Sie das Tier in eine dorsale Dekubitusposition und machen einen V-förmigen Schnitt (0,5-1 cm) auf Schilddrüsenhöhe. Verschieben Sie vorsichtig die Schilddrüse, um die Luftröhre freizulegen (Abbildung 1B), und injizieren Sie 50 μl der zubereiteten Oleatlösung (Schritt 1).
      HINWEIS: Die Mäuse wurden in zwei Gruppen mit jeweils acht Tieren aufgeteilt. Die Lungenverletzungsgruppe erhält Natrium-Oleat-Lösung in einer Menge von 25 mM (1,25 μmol), und die Kontrollgruppe erhält 50 μl sterile Kochsalzlösung durch Instillation in die Luftröhre jeder Maus mit einer Insulinspritze (Volumen 300 μl, 30 g) (Abbildung 1C).
    3. Vernähen Sie die Inzisionsstelle der Mäuse mit einem synthetischen, nicht resorbierbaren monofilen Nahtmaterial, führen Sie es in ihren Käfig zurück und überwachen Sie es bis zur vollständigen Genesung von der Operation. Halten Sie die Tiere während aller Eingriffe auf einem Heizkissen bei 37 °C.
      HINWEIS: Mäuse brauchen in der Regel bis zu 15 Minuten, um sich von der Operation zu erholen.
  2. Führen Sie die intravenöse Verabreichung von Ölsäure durch.
    1. Nach der Anästhesie (Schritt 2.1.1, Abbildung 2A) intravenös in den Plexus orbitalis injizieren, indem die ultrafeine Nadel (siehe Materialtabelle) in den medialen Kanthus der Augenhöhle eingeführt wird (Abbildung 2B).
      HINWEIS: Die Mäuse wurden in zwei Gruppen mit jeweils acht Tieren aufgeteilt. Jede Gruppe erhält 100 μl der Natrium-Oleat-Lösung mit 10 μmol OA pro Tier, während die Kontrollgruppe 100 μl sterile Kochsalzlösung erhält.
  3. Überwachen Sie die Tiere nach der Operation täglich auf Nebenwirkungen. Humane Endpunkte für Euthanasie sind Nebenwirkungen, Krämpfe und Koma.

3. Sammlung von bronchoalveolärer Lavageflüssigkeit (BALF)

  1. Euthanasieren Sie die Mäuse mit einer intraperitonealen letalen Dosis von Ketamin (300 mg/kg) und Xylazin (30 mg/kg) (siehe Materialtabelle).
  2. Legen Sie das Tier in die dorsale Dekubitusposition, machen Sie mit einer chirurgischen Schere einen Schnitt von ca. 1 cm im vorderen Bereich des Tieres, legen Sie die Luftröhre frei und machen Sie einen kleinen Schnitt, um einen intravenösen Katheter (20 g) einzuführen.
  3. Schließen Sie den Katheter an eine sterile 1-ml-Spritze an, injizieren Sie langsam und schrittweise 0,5 ml sterile Kochsalzlösung in die Lunge und saugen Sie dann die Flüssigkeit aus dem BALF mit derselben Spritze ab. Wiederholen Sie es 3-5 Mal und geben Sie es in ein steriles Mikroröhrchen, das Sie in Eis legen.
    HINWEIS: Die Proben können bis zu 6 Monate bei -20 °C gelagert werden.

4. Gesamt- und Differentialzellanalyse bei BALF

  1. Für die Gesamtzellzahl werden 20 μl BALF in 180 μl (10-fache Verdünnung) Turk-Lösung verdünnt (siehe Materialtabelle). Führen Sie die Zählung mit einer Neubauer-Kammer unter einem optischen Mikroskop mit einem 40-fach-Objektiv durch.
  2. Für die Differenzialzählung werden 100 μl BALF in den Zelltrichter mit den Objektträgern gegeben und bei 22,86 x g für 5 Minuten bei 4 °C in einer Zytozentrifuge zentrifugiert und mit May-Grunwald (15%, pH 7,2)-Giemsa (1:10) gefärbt (siehe Materialtabelle). Fahren Sie mit der Zellzählung in einem Lichtmikroskop mit Immersionsobjektiv fort.

5. Bestimmung des Gesamtproteins in BALF

  1. Bestimmen Sie das gesamte BALF-Überstandsprotein mit einem handelsüblichen Proteinquantifizierungskit und lesen Sie die Absorption bei 562 nm mit einem Spektralphotometer gemäß den Anweisungen des Herstellers ab (siehe Materialtabelle).

6. Enzym-Immunosorbent-Assays

  1. BALF bei 1.200 x g für 10 min bei 4 °C zentrifugieren. Dann wird der Überstand mit einer Pipette aufgefangen und bei -80 °C gelagert, um TNF-α, IL-1β, IL-6 und PGE215,23,25 zu testen.
    HINWEIS: Durch die Zentrifugation in Schritt 6.1 wird der BALF zellfrei.
    1. Führen Sie die Zytokin-Assays an zellfreiem BALF mit einem handelsüblichen ELISA-Kit gemäß den Anweisungen des Herstellers durch. Führen Sie den PGE2-Assay mit einem Enzymimmunoassay-Kit (EIA) gemäß den Anweisungen des Herstellers durch (siehe Materialtabelle).

7. Färbung und Zählung von Lipidkörpern

  1. Fixieren Sie die Leukozyten auf Cytospin-Objektträgern mit 3,7 % Formaldehyd inCa2+, Mg2+ freier gepufferter Hank's-Salzlösung (HBSS, pH 7,4) und färben Sie sie mit 1,5 % OsO4, während sie noch feuchtsind 3 (siehe Materialtabelle). Zählen Sie dann die Lipidkörper pro Zelle in 50 aufeinanderfolgenden Leukozyten von jedem Objektträger mit der Ölimmersionsobjektivlinse des Mikroskops.

8. Statistische Analyse

  1. Führen Sie statistische Analysen mit Hilfe von Grafik- und Statistiksoftware durch (siehe Materialtabelle). Drücken Sie die Ergebnisse als Mittelwert ± SEM aus und analysieren Sie sie mittels One-Way-Anova, gefolgt von einem Newman-Keuls-Student26 nach dem Test. Betrachten Sie die Unterschiede, die signifikant sind, wenn P 0,05 <.

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Representative Results

In einer unverletzten Lunge erfolgt die Clearance der Alveolarflüssigkeit durch den Transport von Ionen durch die intakte Alveolarepithelschicht. Der osmotische Gradient transportiert Flüssigkeit aus den Lungenbläschen in das pulmonale Interstitium, wo sie von Lymphgefäßen abgeleitet oder resorbiert wird. Na/K-ATPase steuert diesen Transport11. OA ist ein Inhibitor der Na/K-ATPase27 und des Natriumkanals21, der, wie wir bereits vorgeschlagen haben, zur Bildung von Ödemen beitragenkann 23. Die verschärfte Entzündungsreaktion bei ARDS führt zu Alveolarschäden, erhöhter Endothel- und Epithelpermeabilität und Ansammlung von Alveolarflüssigkeit, die reich an Proteinen und Entzündungszellen ist, was zu Ödemen führt. Das Ödem führt dazu, dass die Lunge aufgrund der Ansammlung von interstitieller Flüssigkeit und der Beeinträchtigung des Gasaustauschs die Atemfrequenz erhöht, was zu Hypoxämie und Atemversagen führt28. Zytokine wie TNF-α und der vaskuläre endotheliale Wachstumsfaktor (VEGF) destabilisieren VE-Cadherin-Bindungen und tragen zu einer erhöhten endothelialen Permeabilität und Alveolarflüssigkeitsakkumulation bei7.

Die OA-Injektion erhöhte die Gesamtzahl der Leukozyten auf intratrachealen und intravenösen Wegen (Abbildung 3). Es war notwendig, eine OA für Lungenschäden auf intravenösem Weg und nicht auf intratrachealem Weg zu induzieren. Die vorliegende Arbeit zeigte einen Anstieg der Neutrophilenzahl bei BALF nach 6 h, wobei der Peak nach 24 h und nach 48 h und 72 h abnahm. Eine höhere Konzentration von IL-6, IL-1β und TNF-α im BALF wurde nach 24 h intratrachealer OA-Instillation beobachtet23 (Abbildung 4). OA verhindert die Ödembeseitigung und kann die Bildung von proteinreichen Ödemen sowohl auf intravenösem als auch auf intratrachealem Weg auslösen15,23. Das Lungenödem wurde mittels Gesamtprotein-Assay in BALF beurteilt und zeigte, dass die intravenöse und i.t.-Verabreichung die Gesamtproteinkonzentration erhöhte (Abbildung 5). Lipidkörper sind intrazelluläre Organellen, die Substrat und Enzyme zur Produktion von Eicosanoiden enthalten 8,29. Die Bildung von Lipidkörpern fördert die Produktion von Lipidmediatoren und kann für den Zugang zur Zellaktivierung verwendet werden. Die intratracheale und intravenöse OA-Injektion erhöhte die Bildung von Lipidkörpern und die PGE2-Konzentration 23 nach 24 h (Abbildung 6). Die OA-Injektion induzierte auch Gewebeaufschluss, Blutungen und Leukozyteninfiltration auf intratrachealen und intravenösen Wegen, wie in der Histologie der Hämatoxylin- und Eosinfärbung (H&E) gezeigt wird (Abbildung 7). Außerdem verursacht Arthrose eine Veränderung der Lungenfunktion19. Daher weist eine Ölsäure-induzierte Lungenschädigung zahlreiche ARDS-Merkmale auf.

Figure 1
Abbildung 1: Die einzelnen Schritte im intratrachealen Verabreichungsprotokoll . (A) Eine Maus wird mit 5% Isofluoran und 2 l/minO2 betäubt. (B) Ein trachealer Schnitt mit einer chirurgischen Schere bei Mäusen in dorsaler Dekubitusposition. (C) Intratracheale Instillation mit einer Insulinspritze. Erstellt mit BioRender.com. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 2
Abbildung 2: Die einzelnen Schritte im intravenösen Verabreichungsprotokoll. (A) Eine Maus wird mit 5% Isofluoran und 2 l/min O2 betäubt. (B) Intravenöse Injektion mit einer Insulinspritze durch den medialen Kanthus. Erstellt mit BioRender.com. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 3
Abbildung 3: Die Verabreichung von OA induziert eine Leukozytenaktivierung im BALF von Mäusen. Die Gesamtleukozyten in intravenöser (i.v) und intratrachealer Verabreichung (i.t) (A) sowie eine illustrative mikroskopische Aufnahme (1000-fache Vergrößerung) in intratrachealer Verabreichung (i.t.), gefärbt mit May-Grünwald-Giemsa (B), wurden 24 h nach der OA-Provokation durchgeführt. Maßstabsleiste = 10 μm. Die gleiche Menge steriler Kochsalzlösung wurde der Kontrollgruppe verabreicht. Jeder Balken stellt den Mittelwert ± SEM von mindestens sieben Tieren dar. *P < 0,05 im Vergleich zu Kontrollen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 4
Abbildung 4: Die intratracheale Verabreichung (i.t.) von OA induziert die Produktion von Entzündungsmediatoren in der Lunge von Mäusen. TNF-α (A), IL-6 (B), IL-1β (C) wurden 24 Stunden nach der Provokation gemessen. Der Kontrollgruppe wurde sterile Kochsalzlösung verabreicht. Jeder Balken stellt den Mittelwert ± SEM für mindestens sechs Tiere dar. *P < 0,05 im Vergleich zu Kontrollen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 5
Abbildung 5: Gesamtproteingehalt in BALF 24 h nach OA-Injektion. Die intratracheale (i.t.) und intravenöse (i.v.) Verabreichung von OA erhöht das Gesamtprotein im BALF von Mäusen. Die Kontrollgruppe erhielt die gleiche Menge steriler Kochsalzlösung. Die Ergebnisse sind Mittel ± SEM von mindestens sechs verschiedenen Tieren. *P < 0,0001 im Vergleich zu Kontrollen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 6
Abbildung 6: Lipidkörperbildung in Leukozyten und PGE 2-Produktion in BALF vonOA-behandelten Mäusen. Die intratracheale (i.t.) und intravenöse (i.v.) Verabreichung von OA induziert die Akkumulation von Entzündungsmediatoren und Lipidkörpern im BALF von Mäusen (A) bzw. (B). (C) Illustrative mikroskopische Aufnahme von Lipidkörpern (1000-fache Vergrößerung), die in der Lunge der Tiere mit Osmiumtetroxid (OsO4) 24 h nach OA-Provokation gefärbt wurden. Die Pfeile zeigen auf die Lipidkörper. Maßstabsleiste = 10 μm. Die Kontrollen erhielten die gleiche Menge an Kochsalzlösung. Die Ergebnisse sind Mittel ± SEM von sieben Tieren. *P < 0,05 im Vergleich zu Kontrollen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 7
Abbildung 7: Illustrative pulmonale Histologie bei Mäusen . (A) Kontrollmäuse, die mit Kochsalzlösung behandelt wurden und keine Anzeichen von Blutungen zeigten. (B) Intravenöse Verabreichung von OA (i.v.). (C) Intratracheale Verabreichung (i.t.) mit Gewebeveränderungen. Es wurde eine H&E-Färbung durchgeführt. Vergrößerung, 1000x. Maßstabsbalken = 50 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Discussion

Die Auswahl des richtigen ARDS-Modells ist für die Durchführung der präklinischen Studien von entscheidender Bedeutung, und der Bewerter muss alle möglichen Variablen wie Alter, Geschlecht, Verabreichungsmethoden und andere berücksichtigen6. Das gewählte Modell muss die Erkrankung auf der Grundlage von Risikofaktoren wie Sepsis, Lipidembolie, Ischämie-Reperfusion des Lungengefäßsystems und anderen klinischen Risiken reproduzieren14. Allerdings kann kein Tiermodell, das für ARDS verwendet wird, alle Merkmale des menschlichen Syndroms nachbilden. Zu den Modellen mit mehreren Verletzungsmitteln gehören LPS, OA, Salzsäure, Bakterien und Viren6. Außerdem werden verschiedene Verabreichungsmethoden verwendet, häufiger intratracheal, intranasal oder intravenös. Das pulmonale Ischämie-Reperfusionsmodell verursacht eine Kapillarruptur und eine Akkumulation des intraalveolären Proteins6. Die LPS-induzierte Lungenschädigung ist weit verbreitet und führt zu einer akuten Verletzung der epithelialen und endothelialen Barrieren. LPS bindet an den Toll-like-Rezeptor 4 (TLR-4) im Atemwegsepithel und löst eine NF-κB-Aktivierung aus, die die Produktion von Zytokinen und Chemokinen erhöht und Entzündungszellen anzieht30, was zu einer robusten neutrophilen Alveolitis führt6. Das Modell zeigt jedoch Variationen zwischen Stämmen und Tierarten, was die Reproduzierbarkeit der Ergebnisse bei menschlichen Patienten mit ARDS30 in Tieren verringert.

Das HCl-Verletzungsmodell ahmt ARDS durch Aspiration des Säuregehalts nach. Der niedrige pH-Wert in der Lunge induziert eine akute Entzündungsreaktion, gefolgt von einer späten fibrotischen Verletzung. Die Schädigung ist neutrophilenabhängig und führt zu alveolären Blutungen, Ödemen und einer beeinträchtigten Flüssigkeitsclearance. Der Mensch aspiriert jedoch nicht nur HCl, sondern einen komplexen Mageninhalt mit einem pH-Wert, der oft höher als 1,5ist 31. Diese und andere ARDS-Modelle wurden an anderer Stelle ausführlich überprüft31. Unter allen verwendeten Modellen ist das Ölsäure-induzierte ARDS-Modell das idealste14.

Das Natriumoleat-Modell verursacht Lungenschäden, induziert Apoptose und Nekrose von Alveolarzellen und erhöht die Produktion von Zytokinen wie TNFα, IL-8, IL-6, IL-1β und MIP-1α19. OA induziert auch Proteasen und Elastase-Expression mit Blutungen, die zu schweren Lungenschäden führen25. Die Arthrose reproduziert die Erkrankung aufgrund einer Lipidembolie, einer erhöhten pulmonalen Gefäßpermeabilität und extravaskulärer Flüssigkeit mit röntgenologischen Infiltraten32. Außerdem haben Patienten mit ARDS eine höhere plasmatische OA-Konzentration 15,22,24.

Die intratracheale Verabreichung von OA induziert eine Produktion von Entzündungsmediatoren, ähnlich wie bei klinischem ARDS, und verringert die Lungencompliance und den Gasaustausch25,32. Die intravenöse Injektion von OA fördert die histomorphologischen und physiologischen Aspekte der Erkrankung32. Serumalbumin ist ein potenter OA-Ligand, was erklären kann, warum dieser Weg eine höhere OA-Menge (10 μmol)15 erfordert als intratracheale (1,25 μmol)23, um Lungenschäden zu induzieren. Tatsächlich zeigte unsere Gruppe eine Korrelation zwischen einem OA/Albumin-Ungleichgewicht und einem höheren Sterberisiko bei Patienten mit Leptospirose33.

Wie bei jedem anderen Modell gibt es auch hier einige Nachteile. Wenn Ölsäure nicht in Salzform verabreicht wird, kann sie toxische Wirkungen und Schwankungen aufgrund der Blutemulgierung verursachen. Wie in diesem Artikel gezeigt, verringert die Verwendung seiner Salzform die toxischen Wirkungen und vermeidet zwei Probleme: Embolienbildung und pH-Schwankungen im Blut und in der Lunge. Außerdem stellt es sicher, dass die Lungenschädigung durch das Oleat und nicht durch eine Nebenwirkung verursacht wird15. Darüber hinaus erfordert die Herstellung von Ölsäure in Salzform in diesem Modell keine Konjugation mit Albumin. Forschungen zeigen die positiven Wirkungen von Albumin bei der Verringerung von Entzündungen und Gefäßpermeabilität. Darüber hinaus stellt Albumin die Hämodynamik und die Atmung bei Patienten mit Lungenverletzungen wieder her. Daher könnte die Konjugation von Albumin mit OA die Wirkung auf das Tier beeinträchtigen und die Lebensfähigkeit der Modelle verringern33,34.

Auf molekularer Ebene hemmt Natriumoleat die Natrium-Kalium-ATPase (NKA) und den Natriumkanal (eNac), was den Ionentransport beeinträchtigt und die Gefäßpermeabilität und Ödembildung erhöht15. Außerdem kann OA an den freien Fettsäurerezeptor 1 (FFAR1) binden, wodurch die intrazelluläre Ca2+ -Konzentration erhöht wird, was Kinasen auslöst, die Proteine wie PI3K und MAPK signalisieren, was zu einer Aktivierung des Kernfaktors Kappa-Light-Chain-Enhancer der aktivierten B-Zellen (NF-κB) führt und die Entzündungsreaktion verstärkt25.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass, obwohl kein Modell die Merkmale von ARDS vollständig reproduzieren kann, sie wertvolle Werkzeuge zur Untersuchung der Krankheit sind. Präklinische Forschung ist entscheidend für das Verständnis der Pathophysiologie von ARDS und die Entwicklung neuer Behandlungen. Die intratracheale und intravenöse Verabreichung von OA in Salzform erzeugt zuverlässige und reproduzierbare ARDS-Modelle, was sie zu einem goldenen Modell für die Untersuchung von ARDS macht.

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Disclosures

Die Autoren erklären, dass kein Interessenkonflikt besteht.

Acknowledgments

Diese Forschung wurde finanziert durch das Instituto Oswaldo Cruz, Fundação Oswaldo Cruz (FIOCRUZ), Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) Grant 001, Programa de Biotecnologia da Universidade Federal Fluminense (UFF), Universidade Federal do Estado do Rio de Janeiro (UNIRIO), Fundação Carlos Chagas Filho de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro (FAPERJ), und dem Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq). Abbildung 1 und Abbildung 2 werden mit BioRender.com erstellt.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Anesthetic vaporizer SurgiVet model 100
Braided slik thread with needle number 5 Shalon medical N/A
Cabinet vivarium Insight  Model EB273
Centrifuge Eppendorf 5430/5430R
Cytofunnel ThermoFisher 11-025-48
Drontal puppy Bayer N/A
Hank's balanced Salts Sigma-Aldrich H4981
Heatpad tkreprodução TK-500
Hydrocloric Acid Sigma-Aldrich 30721
Insulin syringe Ultrafine BD 328322
Isoforine 1mL/mL Cristália N/A
Ketamine Syntec N/A
May-Grunwald-Giemsa Sigma-Aldrich 205435
Micro BCA Protein Assay Kit ThermoFisher 23235
Microscope  PrimoStar Carl Zeiss
Mouse IL-1 beta duoSet ELISA R&D system DY401
Mouse IL-6 duoSet ELISA R&D system DY406
Mouse TNF-alpha duoSet ELISA R&D system DY410
Neubauer chamber improved bright-line Global optics
Oleic Acid (99%) Sigma-Aldrich O1008
Osmium tetroxide solution (4%) Sigma-Aldrich 75632
Peripheral Intravenous Catherter 20 G BD Angiocath 388333
Prism 8 (graphic and statistic software) Graphpad N/A
Prostaglandin E2 ELISA Kit -Monoclonal Cayman Chemical 514010
Shandon Cytospin 3 ThermoFisher N/A
Sodium hydroxide Merck 1,06,49,81,000
Spectrophotometer Molecular Devices SpectraMax ABS plus
Swiss webster mice ICTB/FIOCRUZ N/A
Syringe 1 mL BD 990189
Tris-base Bio Rad 161-0719 Electrophoresis purity reagent
Türk's solution Sigma-Aldrich 93770
Xilazine Syntec N/A

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References

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Mausmodell Ölsäure-induziert akutes Atemnotsyndrom ARDS Schadstoffexposition Zigarettenrauch Infektionserreger Fettsäuren Tiermodelle Pathomechanismus Einschränkungen Ölsäure (OA) schädliche Auswirkungen auf die Lunge Lungenverletzung Embolie Störung des Gewebes Veränderung des pH-Werts Beeinträchtigung der Ödemclearance Endothelverletzung Alveolarpermeabilität Entzündung Bildung von Membranhyalin Zelltod Injektion von OA (in Salzform) physiologische Form von OA bei PH 7
Mausmodell des Ölsäure-induzierten akuten Atemnotsyndroms
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de Oliveira Rodrigues, S., Patricio de Almeida, M. A., Castro-Faria-Neto, H. C., Silva, A. R., Felippe Gonçalves-de-Albuquerque, C. Mouse Model of Oleic Acid-Induced Acute Respiratory Distress Syndrome. J. Vis. Exp. (184), e63566, doi:10.3791/63566 (2022).

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