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Immunology and Infection

Modèle murin du syndrome de détresse respiratoire aiguë induit par l’acide oléique

Published: June 2, 2022 doi: 10.3791/63566
Automatic Translation
*1,2,5, *1,2,6, 1,3,4, 1,3, 1,2,4,5,6
1Laboratório de Imunofarmacologia, Fundação Oswaldo Cruz, FIOCRUZ, 2Laboratório de Imunofarmacologia, Departamento de Bioquímica, Instituto Biomédico, Universidade Federal do Estado do Rio de Janeiro, 3Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e Molecular, Instituto Oswaldo Cruz, FIOCRUZ, 4Programa de Pós-Graduação em Biologia Molecular e Celular, Universidade Federal do Estado do Rio de Janeiro, 5Programa de Pós-Graduação em Ciências e Biotecnologia, Universidade Federal Fluminense, 6Programa de Pós-Graduação em Neurociências, Universidade Federal Fluminense
* These authors contributed equally

Summary

Le présent protocole décrit un modèle de lésion pulmonaire chez la souris utilisant de l’acide oléique pour imiter le syndrome de détresse respiratoire aiguë (SDRA). Ce modèle augmente les médiateurs inflammatoires de l’œdème et diminue la compliance pulmonaire. L’acide oléique est utilisé sous forme de sel (oléate) car cette forme physiologique évite le risque d’embolie.

Abstract

Le syndrome de détresse respiratoire aiguë (SDRA) est une menace importante pour les patients gravement malades avec un taux de mortalité élevé. L’exposition aux polluants, à la fumée de cigarette, aux agents infectieux et aux acides gras peut induire le SDRA. Les modèles animaux peuvent imiter le mécanisme pathologique complexe du SDRA. Cependant, chacun d’entre eux a des limites. Notamment, l’acide oléique (OA) est augmenté chez les patients gravement malades avec des effets nocifs sur les poumons. L’arthrose peut induire des lésions pulmonaires par embolie, perturbant les tissus, modifiant le pH et altérant la clairance de l’œdème. Le modèle de lésion pulmonaire induite par l’arthrose ressemble à diverses caractéristiques du SDRA avec des lésions endothéliales, une perméabilité alvéolaire accrue, une inflammation, la formation d’hyalines membranaires et la mort cellulaire. Dans ce document, l’induction d’une lésion pulmonaire est décrite par injection d’arthrose (sous forme de sel) directement dans le poumon et par voie intraveineuse chez une souris, car il s’agit de la forme physiologique de l’arthrose à pH 7. Ainsi, l’injection d’arthrose sous forme de sel est un modèle animal utile pour étudier les lésions pulmonaires/SDRA sans provoquer d’emboles ni modifier le pH, se rapprochant ainsi de ce qui se passe chez les patients gravement malades.

Introduction

Ashbaugh et al.1, en 1967, ont décrit pour la première fois le syndrome de détresse respiratoire aiguë (SDRA) et depuis lors, ils ont fait l’objet de multiples révisions. Selon la définition de Berlin, le SDRA est une inflammation pulmonaire qui entraîne une insuffisance respiratoire aiguë et une hypoxémie (PaO 2/FiO 2 > 300 mm Hg) en raison d’un déséquilibre du rapport ventilation/perfusion, d’une lésion alvéolaire bilatérale diffuse (DAD) et d’un infiltrat, d’une augmentation du poids pulmonaire et d’un œdème 2,3. Le parenchyme pulmonaire est un environnement cellulaire complexe composé de cellules épithéliales, endothéliales et autres. Ces cellules forment des barrières et des structures responsables des échanges gazeux et de l’homéostasie dans les alvéoles3. Les cellules les plus abondantes au sein de la barrière épithéliale sont les cellules alvéolaires de type I (AT1) avec une plus grande surface pour l’échange gazeux et la gestion des fluides par Na/K-ATPase. De plus, les cellules alvéolaires de type II (AT2) produisent un tensioactif, ce qui réduit la tension superficielle dans les alvéoles4. En dessous, les cellules endothéliales forment une barrière semi-perméable séparant la circulation pulmonaire de l’interstitium. Ses fonctions comprennent la détection des stimuli, la coordination des réponses inflammatoires et la transmigration cellulaire5. Les cellules endothéliales régulent également les échanges gazeux, le tonus vasculaire et la coagulation5. Par conséquent, les troubles de la fonction endothéliale et épithéliale peuvent exacerber un phénotype pro-inflammatoire, causant des lésions pulmonaires conduisant au SDRA5.

Le développement du SDRA est associé à un risque de pneumonie bactérienne et virale ou à des facteurs indirects tels que la septicémie non pulmonaire, les traumatismes, les transfusions sanguines et la pancréatite6. Ces conditions provoquent la libération de motifs moléculaires associés aux agents pathogènes (PAMP) et de motifs moléculaires associés aux dommages (DAMP), induisant des cytokines et des chimiokines pro-inflammatoires telles que le TNF-α, l’IL-1β, l’IL-6 et l’IL-85. Le TNF-α est lié à la dégradation de la cadhérine endothéliale vasculaire (VE-cadhérine) dans la perturbation de la barrière endothéliale et l’infiltration des leucocytes dans le parenchyme pulmonaire. Les neutrophiles sont les premières cellules à migrer, attirées par l’IL-8 et LTB4 5,7,8. Les neutrophiles augmentent encore les cytokines pro-inflammatoires, les espèces réactives de l’oxygène (ROS)9 et la formation de pièges extracellulaires neutrophiles (TNE), générant des dommages endothéliaux et épithéliaux supplémentaires10. Les lésions épithéliales provoquent l’inflammation et l’activation des récepteurs de type Toll dans les cellules AT2 et les macrophages résidents, induisant la libération de chimiokines attirant les cellules inflammatoires vers les poumons4. De plus, la production de cytokines comme l’interféron-β (INFβ) provoque des récepteurs inducteurs d’apoptose liés au TNF (TRAIL), conduisant les cellules ATII à l’apoptose, altérant le liquide et la clarté ionique4. La perturbation de la structure de la barrière endothéliale et épithéliale permet l’afflux de liquide, de protéines, de globules rouges et de leucocytes dans l’espace alvéolaire, provoquant un œdème. Une fois l’œdème établi, l’effort pulmonaire pour maintenir la respiration et les échanges gazeux sont altérés11. L’hypercapnie et l’hypoxémie induisent la mort cellulaire et la perturbation du transport du sodium, aggravant l’œdème alvéolaire dû à une faible capacité de clairance10. Le SDRA présente également des taux élevés d’IL-17A, associés à un dysfonctionnement des organes, à une augmentation du pourcentage de neutrophiles alvéolaires et à une perméabilité alvéolaire9.

Il y a eu des progrès continus dans la recherche sur la physiopathologie, l’épidémiologie et le traitement du SDRA au cours des dernières années12,13. Cependant, le SDRA est un syndrome hétérogène malgré les progrès de la recherche thérapeutique aboutissant à l’optimisation de la ventilation mécanique et de la fluidothérapie. Ainsi, un traitement pharmacologique direct plus efficace est encore nécessaire10, et les études animales peuvent aider à dévoiler les mécanismes du SDRA et les cibles d’intervention.

Les modèles actuels de SDRA ne sont pas en mesure de reproduire complètement la pathologie. Ainsi, les chercheurs choisissent souvent le modèle qui pourrait le mieux correspondre à leurs intérêts. Par exemple, le modèle d’induction des lipopolysaccharides (LPS) induit le SDRA par choc endotoxique déclenché principalement par TLR414. L’induction de HCl imite l’aspiration de l’acide, et les dommages sont neutrophies14. D’autre part, le modèle actuel d’oléate de sodium induit des lésions endothéliales qui augmentent la perméabilité vasculaire et l’œdème. De plus, l’utilisation d’oléate de sodium au lieu de l’acide oléique sous forme liquide permet d’éviter les risques d’embolie et d’altération du pH sanguin15.

Modèles d’animaux pour le SDRA
Les études précliniques sur des modèles animaux aident à comprendre la pathologie et sont essentielles pour la recherche sur les nouveaux traitements du SDRA. Le modèle animal idéal doit présenter des caractéristiques ressemblant à la situation clinique et une bonne reproductibilité des mécanismes de la maladie avec des caractéristiques physiopathologiques pertinentes pour chaque stade, évolution et réparation de la maladie14. Plusieurs modèles animaux sont utilisés pour évaluer les lésions pulmonaires aiguës dans le SDRA de manière préclinique. Cependant, comme tous les modèles ont des limites, ils ne reproduisent pas entièrement la pathologie humaine 6,14,16. Le SDRA induit par l’acide oléique est utilisé chez différentes espèces animales17. Les porcs18, les moutons19 et les chiens20 soumis à l’injection d’arthrose présentent de nombreuses caractéristiques cliniques de la maladie avec un dysfonctionnement de la membrane alvéolaire-capillaire et une perméabilité accrue avec l’infiltration des protéines et des cellules.

Par exemple, l’arthrose à 1,25 μM injectée par voie intraveineuse a bloqué le transport transépithélial, ce qui a conduit à un œdème alvéolaire15. Alternativement, dans le modèle in vitro utilisant des cellules A549, l’arthrose à une concentration de 10 μM n’a pas modifié le canal sodique épithélial (eNAC) ou l’expression de la Na/K-ATPase. Cependant, l’arthrose semble s’associer aux deux canaux, inhibant directement leur activité21. L’injection intraveineuse d’arthrose à raison de 0,1 mL/kg a provoqué une congestion et un gonflement des tissus pulmonaires, une réduction des espaces alvéolaires avec un épaississement des cloisons alvéolaires et une augmentation du nombre de globules inflammatoires et de globules rouges22. De plus, l’arthrose induit l’apoptose et la nécrose dans les cellules endothéliales et épithéliales du poumon15. L’injection d’une solution de tris-oléate, par voie intratrachéale chez la souris, a favorisé l’infiltration des neutrophiles et l’œdème dès 6 h après la stimulation23. L’injection d’arthrose à 24 h a augmenté les taux de cytokines pro-inflammatoires (c’est-à-dire le TNF-α, l’IL-6 et l’IL-1β)23. De plus, l’injection intraveineuse (plexus orbitaire) de 10 μM d’un tris-oléate inhibe l’activité pulmonaire de la Na/K-ATPase, similaire à celle de l’ouabaïne à 10-3 μM, un inhibiteur enzymatique sélectif. De plus, l’arthrose induit une inflammation avec infiltration cellulaire, formation de corps lipidiques et production de leucotriène B4 (LTB4) et de prostaglandine E2 (PGE2)22,24. Par conséquent, le SDRA induit par l’acide oléique génère un œdème, une hémorragie, une infiltration de neutrophiles, une augmentation de l’activité myéloperoxydase (MPO) et des ROS24. Par conséquent, l’administration d’arthrose est un modèle bien établi pour les lésions pulmonaires22,25. Tous les résultats présentés dans cet article qui contiennent de l’arthrose représentent la forme saline, l’oléate de sodium.

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Protocol

Les procédures utilisées dans cette étude ont été approuvées par le Comité d’éthique sur l’utilisation des animaux de la Fondation Oswaldo Cruz (licences CEUA n°002-08, 36/10 et 054/2015). Des souris Webster suisses mâles pesant entre 20 et 30 g, fournies par l’Institut des sciences et de la technologie des biomodèles (ICTB) de la Fondation Oswaldo Cruz (FIOCRUZ), ont été utilisées pour les expériences. Les animaux étaient gardés dans des isolateurs ventilés dans le vivarium du Pavilhão Ozório de Almeida, et de l’eau et de la nourriture étaient disponibles ad libitum. Ils ont été exposés à un cycle de lumière et d’obscurité de 12 h/12 h.

1. Préparation d’une solution d’oléate de sodium

  1. Utiliser de l’acide oléique pour préparer une solution mère d’oléate de sodium de 100 mmol/L dans un tube stérile ou une fiole en verre.
    NOTA : Une solution de 50 mL (volume final) a été préparée pour le présent travail, mais le volume doit être ajusté en fonction des besoins expérimentaux. La solution doit toujours être préparée dans des tubes stériles ou des récipients en verre.
    1. Tout d’abord, ajoutez des comprimés ou une solution de NaOH dans de l’eau ultra-pure pour élever le pH. Un pH de 12-13 est recommandé pour un volume de 25 mL.
      REMARQUE : Alternativement, la base Tris peut être utilisée pour préparer la solution de tris-oléate.
    2. Ajouter l’acide oléique (voir tableau des matériaux) très lentement, goutte à goutte, sous agitation constante dans un bain à ultrasons à 37 °C.
      REMARQUE : Si une précipitation d’acide oléique se produit, recommencez depuis le début.
    3. Une fois que l’acide oléique est complètement dissous, ajustez soigneusement le pH à 7,4, goutte à goutte sous agitation, avec du HCl dilué ultra-pur, puis ajustez au volume final de 50 ml.
      REMARQUE : Préparez fraîchement les solutions d’oléate de travail. Alternativement, la solution peut être aliquote, stockée et maintenue à -20 °C dans un environnement enrichi en azote pour éviter l’oxydation pendant un mois maximum. Évitez les cycles de congélation-recongélation.

2. Induction d’une lésion pulmonaire par l’acide oléique

  1. Effectuer l’administration intratrachéale d’acide oléique.
    1. Anesthésier les souris à l’aide d’isoflurane à 5 % avec 2 L/mind’O2 à l’aide d’un vaporisateur anesthésique vétérinaire (Figure 1A). Retirez la fourrure au niveau de la zone d’incision avec de la crème dépilatoire et désinfectez la zone avec trois cycles alternés de gommage à la bétadine et d’alcool à l’aide d’une gaze stérile. Confirmez la profondeur de l’anesthésie par pincement des orteils.
      REMARQUE : Utilisez des gants et des instruments stériles pendant la procédure. Utilisez un champ pour couvrir l’animal et n’exposer que le site d’incision. Réaliser l’expérience dans une enceinte de sécurité biologique pour éviter que l’isofluorane ne s’échappe dans l’environnement. Les analgésiques ne sont pas administrés car ils peuvent inhiber la réponse inflammatoire.
    2. Après l’anesthésie, allongez l’animal en position de décubitus dorsal et faites une incision (0,5 à 1 cm) en forme de V au niveau de la thyroïde. Déplacez doucement la thyroïde pour exposer la trachée (Figure 1B) et injectez 50 μL de la solution d’oléate préparée (étape 1).
      REMARQUE : Les souris ont été divisées en deux groupes, avec huit animaux dans chaque groupe. Le groupe lésionné pulmonaire reçoit une solution d’oléate de sodium à 25 mM (1,25 μmol) et le groupe témoin reçoit 50 μL de solution saline stérile par instillation dans la trachée de chaque souris à l’aide d’une seringue à insuline (volume 300 μL, 30 G) (Figure 1C).
    3. Suturez le site d’incision des souris avec une suture synthétique non résorbable, remettez-la dans leur cage et surveillez-la jusqu’à ce qu’elle se rétablisse complètement de la chirurgie. Pendant toutes les procédures, maintenez les animaux sur un coussin chauffant à 37 °C.
      REMARQUE : Les souris prennent généralement jusqu’à 15 minutes pour se remettre de la chirurgie.
  2. Effectuer l’administration intraveineuse d’acide oléique.
    1. Après l’anesthésie (étape 2.1.1, Figure 2A), injecter par voie intraveineuse dans le plexus orbitaire en insérant l’aiguille ultrafine (voir Tableau des matériaux) dans le canthus médial de l’orbite (Figure 2B).
      REMARQUE : Les souris ont été divisées en deux groupes, avec huit animaux dans chaque groupe. Chaque groupe reçoit 100 μL de solution d’oléate de sodium à raison de 10 μmol d’OA par animal, tandis que le groupe témoin reçoit 100 μL de solution saline stérile.
  3. Après l’opération, surveillez quotidiennement les animaux pour détecter tout effet indésirable. Les critères d’évaluation humains de l’euthanasie comprennent les effets indésirables, les convulsions et le coma.

3. Collecte de liquide de lavage broncho-alvéolaire (BALF)

  1. Euthanasier les souris avec une dose létale intrapéritonéale de kétamine (300 mg/kg) et de xylazine (30 mg/kg) (voir le tableau des matériaux).
  2. Posez l’animal en position de décubitus dorsal, faites une incision d’environ 1 cm avec des ciseaux chirurgicaux dans la région antérieure de l’animal, exposez la trachée et faites une petite incision pour introduire un cathéter intraveineux (20 G).
  3. Connectez le cathéter à une seringue stérile de 1 ml, injectez lentement et progressivement 0,5 mL de solution saline stérile dans les poumons, puis aspirez le liquide du BALF avec la même seringue. Répétez-le 3 à 5 fois et transférez-le dans un microtube stérile, en les plaçant dans de la glace.
    REMARQUE : Les échantillons peuvent être conservés à -20 °C jusqu’à 6 mois.

4. Analyse des cellules totales et différentielles dans le BALF

  1. Pour le nombre total de cellules, diluer 20 μL de BALF dans 180 μL (dilution 10x) de solution de Turk (voir le tableau des matériaux). Effectuez le comptage à l’aide d’une chambre Neubauer sous un microscope optique avec un objectif 40x.
  2. Pour la numération différentielle, mettre 100 μL de BALF dans l’entonnoir cellulaire contenant les lames et le centrifuger à 22,86 x g pendant 5 min à 4 °C dans un cytocentrifugeuse, et colorer avec May-Grunwald (15%, pH 7,2)-Giemsa (1 :10) (voir Table des matériaux). Procéder à la numération cellulaire dans un microscope optique avec objectif d’immersion.

5. Détermination de la teneur totale en protéines dans le BALF

  1. Déterminer la protéine surnageante totale de BALF à l’aide d’une trousse de quantification des protéines commerciale et lire l’absorbance à 562 nm à l’aide d’un spectrophotomètre en suivant les instructions du fabricant (voir le tableau des matériaux).

6. Dosages immuno-enzymatiques

  1. Centrifuger BALF à 1 200 x g pendant 10 min à 4 °C. Ensuite, prélever le surnageant à l’aide d’une pipette et le conserver à -80 °C pour les dosages de TNF-α, IL-1β, IL-6 et PGE215,23,25.
    REMARQUE : La centrifugation de l’étape 6.1 rend le BALF sans cellules.
    1. Effectuer les dosages de cytokines sur du BALF acellulaire à l’aide d’un kit ELISA commercial selon les instructions du fabricant. Effectuez le test PGE2 à l’aide d’un kit d’immunodosage enzymatique (EIA) en suivant les instructions du fabricant (voir le tableau des matériaux).

7. Coloration et comptage des lipides corporels

  1. Fixez les leucocytes sur des lames de cytospin en utilisant 3,7 % de formaldéhyde dans une solution saline tamponnée de Hank’s libre de Ca 2+, Mg2+ (HBSS, pH 7,4) et colorez avec 1,5 % d’OsO4 alors qu’elles sont encore humides3 (voir le tableau des matériaux). Ensuite, comptez les corps lipidiques par cellule dans 50 leucocytes consécutifs de chaque lame à l’aide de la lentille de l’objectif à immersion dans l’huile du microscope.

8. Analyse statistique

  1. Effectuer des analyses statistiques à l’aide d’un logiciel de représentation graphique et de statistiques (voir le tableau des matériaux). Exprimez les résultats sous forme de moyenne ± SEM et analysez-les par anova unidirectionnelle suivie d’un post-test Newman-Keuls-Student26. Considérez les différences significatives lorsque P < 0,05.

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Representative Results

Dans un poumon non blessé, la clairance du liquide alvéolaire se produit par le transport d’ions à travers la couche épithéliale alvéolaire intacte. Le gradient osmotique transporte le liquide des alvéoles vers l’interstitium pulmonaire, où il est drainé par les vaisseaux lymphatiques ou réabsorbé. La Na/K-ATPase pilote ce transport11. L’arthrose est un inhibiteur de la Na/K-ATPase27 et du canal sodique 21, ce qui peut contribuer à la formation d’œdèmes, comme nous l’avons déjà suggéré23. La réponse inflammatoire exacerbée dans le SDRA entraîne des lésions alvéolaires, une augmentation de la perméabilité endothéliale et épithéliale et une accumulation de liquide alvéolaire riche en protéines et en cellules inflammatoires, provoquant un œdème. L’œdème provoque une augmentation de la fréquence respiratoire des poumons en raison de l’accumulation de liquide interstitiel et d’une altération des échanges gazeux, entraînant une hypoxémie et une insuffisance respiratoire28. Les cytokines telles que le TNF-α et le facteur de croissance de l’endothélium vasculaire (VEGF) déstabilisent les liaisons VE-cadhérine, contribuant à l’augmentation de la perméabilité endothéliale et à l’accumulation de liquide alvéolaire7.

L’injection d’arthrose a augmenté le nombre total de leucocytes par voie intratrachéale et intraveineuse (Figure 3). Il était nécessaire d’induire l’arthrose pour les lésions pulmonaires par voie intraveineuse plutôt que par voie intratrachéale. Les présents travaux ont montré une augmentation du nombre de neutrophiles dans le BALF à 6 h, avec un pic à 24 h et une diminution à 48 h et 72 h. Une concentration plus élevée d’IL-6, d’IL-1β et de TNF-α dans le BALF a été observée après 24 h d’instillation intratrachéale d’arthrose23 (Figure 4). L’arthrose empêche la clairance de l’œdème et peut déclencher la formation d’un œdème riche en protéines par voie intraveineuse et intratrachéale15,23. L’œdème pulmonaire a été évalué par dosage des protéines totales dans le BALF, montrant que l’administration de protéines totales par voie intraveineuse et intraveineuse augmentait la concentration en protéines totales (figure 5). Les corps lipidiques sont des organites intracellulaires contenant un substrat et des enzymes pour la production d’eicosanoïdes 8,29. La formation de corps lipidiques améliore la production de médiateurs lipidiques et peut être utilisée pour accéder à l’activation cellulaire. L’injection intratrachéale et intraveineuse d’arthrose a amélioré la formation de corps lipidiques et la concentration de PGE2 23 après 24 h (Figure 6). L’injection d’arthrose a également induit une perturbation tissulaire, une hémorragie et une infiltration leucocytaire par voie intratrachéale et intraveineuse, comme le montre l’histologie de coloration de l’hématoxyline et de l’éosine (H&E) (Figure 7). De plus, l’arthrose provoque une altération de la fonction pulmonaire19. Ainsi, les lésions pulmonaires induites par l’acide oléique présentent de nombreuses caractéristiques du SDRA.

Figure 1
Figure 1 : Les différentes étapes du protocole d’administration intratrachéale. (A) Une souris est anesthésiée à l’aide de 5 % d’isofluorane et de 2 L/min d’O2. (B) Une incision trachéale avec des ciseaux chirurgicaux chez des souris en position de décubitus dorsal. (C) Instillation intratrachéale à l’aide d’une seringue à insuline. Créé avec BioRender.com. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : Les différentes étapes du protocole d’administration intraveineuse. (A) Une souris est anesthésiée avec 5 % d’isofluorane et 2 L/min d’O2. (B) Injection intraveineuse à l’aide d’une seringue à insuline par le canthus médial. Créé avec BioRender.com. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : L’administration de l’arthrose induit l’activation leucocytaire dans le BALF de la souris. Des leucocytes totaux en administration intraveineuse (i.v) et intratrachéale (i.t) (A) et une photomicrographie illustrative (grossissement 1000x) en administration intratrachéale (i.t.) colorés avec May-Grünwald-Giemsa (B) ont été réalisés 24 h après la provocation à l’arthrose. Barre d’échelle = 10 μm. Le même volume de solution saline stérile a été administré au groupe témoin. Chaque barre représente la moyenne ± MEB d’au moins sept animaux. *P < 0,05, par rapport aux témoins. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4 : L’administration intratrachéale (i.t) de l’arthrose induit la production de médiateurs inflammatoires dans le poumon de la souris. Le TNF-α (A), l’IL-6 (B) et l’IL-1β (C) ont été mesurés 24 h après le défi. Une solution saline stérile a été administrée au groupe témoin. Chaque barre représente la moyenne ± MEB pour au moins six animaux. *P < 0,05, par rapport aux témoins. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 5
Figure 5 : Teneur totale en protéines dans le BALF 24 h après l’injection d’arthrose. L’administration intratrachéale (i.t.) et intraveineuse (i.v.) d’arthrose augmente la teneur totale en protéines dans le BALF des souris. Le groupe témoin a reçu le même volume de sérum physiologique stérile. Les résultats sont des moyens ± MEB d’au moins six animaux différents. *P < 0,0001, par rapport aux témoins. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 6
Figure 6 : Formation des corps lipidiques dans les leucocytes et production de PGE2 dans le BALF de souris traitées à l’arthrose. L’administration intratrachéale (i.t) et intraveineuse (i.v) d’arthrose induit l’accumulation de médiateurs inflammatoires et de corps lipidiques dans le BALF des souris (A) et (B), respectivement. (C) Photomicrographie illustrative des corps lipidiques (grossissement 1000x) colorés dans les poumons des animaux avec du tétroxyde d’osmium (OsO4) 24 h après la provocation à l’arthrose. Les flèches pointent vers les corps lipidiques. Barre d’échelle = 10 μm. Les témoins ont reçu le même volume de solution saline. Les résultats sont des moyennes ± MEB de sept animaux. *P < 0,05, par rapport aux témoins. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 7
Figure 7 : Histologie pulmonaire illustrative chez la souris. (A) Souris témoins traitées avec une solution saline et aucun signe d’hémorragie. (B) Administration intraveineuse d’arthrose (i.v). (C) Administration intratrachéale (i.t) avec altérations tissulaires. Une coloration H&E a été effectuée. Grossissement, 1000x. Barre d’échelle = 50 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Discussion

La sélection du bon modèle de SDRA est essentielle pour mener à bien les études précliniques, et l’évaluateur doit tenir compte de toutes les variables possibles, telles que l’âge, le sexe, les méthodes d’administration et autres6. Le modèle choisi doit reproduire la maladie en fonction des facteurs de risque tels que la septicémie, l’embolie lipidique, l’ischémie-reperfusion du système vasculaire pulmonaire et d’autres risques cliniques14. Cependant, aucun modèle animal utilisé pour le SDRA ne peut recréer toutes les caractéristiques du syndrome humain. Les modèles d’agents nuisibles multiples comprennent le LPS, l’arthrose, l’acide chlorhydrique, les bactéries et les virus6. En outre, différentes méthodes d’administration sont utilisées, le plus souvent, intratrachéale, intranasale ou intraveineuse. Le modèle d’ischémie-reperfusion pulmonaire provoque une rupture capillaire et une accumulation de protéine intra-alvéolaire6. Les lésions pulmonaires induites par le LPS sont largement utilisées et entraînent des lésions aiguës des barrières épithéliales et endothéliales. Le LPS se lie au récepteur de type Toll 4 (TLR-4) dans l’épithélium des voies respiratoires, déclenchant l’activation de NF-κB, améliorant la production de cytokines et de chimiokines, attirant les cellules inflammatoires30, ce qui conduit à une alvéolite neutrophilique robuste6. Cependant, le modèle montre des variations entre les souches et les espèces animales, ce qui diminue la reproductibilité des résultats chez l’animal pour les patients humains atteints de SDRA30.

Le modèle de lésion HCl imite le SDRA par aspiration de contenu acide. Le pH bas dans les poumons induit une réponse inflammatoire aiguë suivie d’une lésion fibrotique tardive. Les dommages sont dépendants des neutrophiles, provoquant une hémorragie alvéolaire, un œdème et une altération de la clairance liquide. Cependant, l’homme n’aspire pas seulement du HCl mais un contenu gastrique complexe avec un pH souvent supérieur à 1,531. Ces modèles et d’autres modèles de SDRA ont fait l’objet d’un examen approfondi ailleurs31. Parmi tous les modèles utilisés, le modèle SDRA induit par l’acide oléique est le plus idéal14.

Le modèle d’oléate de sodium provoque des lésions pulmonaires, induit l’apoptose et la nécrose des cellules alvéolaires et améliore la production de cytokines telles que le TNFα, l’IL-8, l’IL-6, l’IL-1β et le MIP-1α19. L’arthrose induit également l’expression de protéases et d’élastases avec hémorragie causant de graves lésions pulmonaires25. L’arthrose reproduit la maladie en raison d’une embolie lipidique, d’une augmentation de la perméabilité vasculaire pulmonaire et d’un liquide extravasculaire avec infiltrats radiographiques32. De plus, les patients atteints de SDRA ont une concentration plasmatique d’arthrose plus élevée 15,22,24.

L’administration intratrachéale d’arthrose induit une production de médiateurs inflammatoires similaire à celle du SDRA clinique et diminue la compliance pulmonaire et les échanges gazeux25,32. L’injection intraveineuse d’arthrose favorise les aspects histomorphologiques et physiologiques de la maladie32. L’albumine sérique est un puissant ligand de l’arthrose, ce qui peut expliquer pourquoi cette voie nécessite une quantité d’arthrose plus élevée (10 μmol)15 que l’intratrachéal (1,25 μmol)23 pour induire des lésions pulmonaires. En effet, notre groupe a montré une corrélation entre le déséquilibre OA/albumine et un risque de décès plus élevé chez les patients atteints de leptospirose33.

Comme pour tous les autres modèles, le modèle présente certains inconvénients. Lorsqu’il n’est pas administré sous forme de sel, l’acide oléique peut provoquer des effets toxiques et des variations dues à l’émulsification du sang. Comme démontré dans cet article, l’utilisation de sa forme saline diminue les effets toxiques et évite deux problèmes : la formation d’emboles et la fluctuation du pH dans le sang et les poumons. En outre, il garantit que la lésion pulmonaire est causée par l’oléate et non par un effet secondaire15. De plus, la préparation de l’acide oléique sous forme de sel dans ce modèle ne nécessite pas de conjugaison avec l’albumine. Les recherches montrent les effets bénéfiques de l’albumine dans la réduction de l’inflammation et de la perméabilité vasculaire. De plus, l’albumine restaure l’hémodynamique et la respiration chez les patients atteints de lésions pulmonaires. Ainsi, la conjonction de l’albumine et de l’arthrose pourrait altérer son impact sur l’animal, réduisant ainsi la viabilité des modèles33,34.

Au niveau moléculaire, l’oléate de sodium inhibe l’ATPase sodium-potassium (NKA) et le canal sodique (eNac), qui altèrent le transport des ions, augmentant la perméabilité vasculaire et la formation d’œdèmes15. De plus, l’arthrose peut se lier au récepteur 1 des acides gras libres (FFAR1), augmentant la concentration intracellulaire de Ca 2+ , ce qui déclenche des protéines de signalisation des kinases telles que PI3K et MAPK, conduisant à l’activation du facteur nucléaire kappa-light-chain-enhancer des cellules B activées (NF-κB) et à l’amélioration de la réponse inflammatoire25.

En résumé, bien qu’aucun modèle ne puisse reproduire complètement les caractéristiques du SDRA, ce sont des outils précieux pour étudier la maladie. La recherche préclinique est cruciale pour comprendre la physiopathologie du SDRA et le développement de nouveaux traitements. L’administration intratrachéale et intraveineuse de l’arthrose, sous forme de sel, génère des modèles de SDRA fiables et reproductibles, ce qui en fait un modèle en or pour l’étude du SDRA.

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Disclosures

Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts.

Acknowledgments

Cette recherche a été financée par l’Instituto Oswaldo Cruz, la Fundação Oswaldo Cruz (FIOCRUZ), la Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) Grant 001, Programa de Biotecnologia da Universidade Federal Fluminense (UFF), Universidade Federal do Estado do Rio de Janeiro (UNIRIO), Fundação Carlos Chagas Filho de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro (FAPERJ), et le Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq). La figure 1 et la figure 2 sont créées avec BioRender.com.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Anesthetic vaporizer SurgiVet model 100
Braided slik thread with needle number 5 Shalon medical N/A
Cabinet vivarium Insight  Model EB273
Centrifuge Eppendorf 5430/5430R
Cytofunnel ThermoFisher 11-025-48
Drontal puppy Bayer N/A
Hank's balanced Salts Sigma-Aldrich H4981
Heatpad tkreprodução TK-500
Hydrocloric Acid Sigma-Aldrich 30721
Insulin syringe Ultrafine BD 328322
Isoforine 1mL/mL Cristália N/A
Ketamine Syntec N/A
May-Grunwald-Giemsa Sigma-Aldrich 205435
Micro BCA Protein Assay Kit ThermoFisher 23235
Microscope  PrimoStar Carl Zeiss
Mouse IL-1 beta duoSet ELISA R&D system DY401
Mouse IL-6 duoSet ELISA R&D system DY406
Mouse TNF-alpha duoSet ELISA R&D system DY410
Neubauer chamber improved bright-line Global optics
Oleic Acid (99%) Sigma-Aldrich O1008
Osmium tetroxide solution (4%) Sigma-Aldrich 75632
Peripheral Intravenous Catherter 20 G BD Angiocath 388333
Prism 8 (graphic and statistic software) Graphpad N/A
Prostaglandin E2 ELISA Kit -Monoclonal Cayman Chemical 514010
Shandon Cytospin 3 ThermoFisher N/A
Sodium hydroxide Merck 1,06,49,81,000
Spectrophotometer Molecular Devices SpectraMax ABS plus
Swiss webster mice ICTB/FIOCRUZ N/A
Syringe 1 mL BD 990189
Tris-base Bio Rad 161-0719 Electrophoresis purity reagent
Türk's solution Sigma-Aldrich 93770
Xilazine Syntec N/A

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References

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Modèle murin Syndrome de détresse respiratoire aiguë SDRA Exposition aux polluants Fumée de cigarette Agents infectieux Acides gras Modèles animaux Pathomécanisme Limitations Acide oléique (OA) Effets nocifs sur les poumons Lésions pulmonaires Embolies Perturbation des tissus Altération du PH Altération de la clairance de l’œdème Lésion endothéliale Perméabilité alvéolaire Inflammation Formation d’hyaline membranaire Mort cellulaire Injection d’OA (sous forme de sel) Forme physiologique de l’OA à PH 7
Modèle murin du syndrome de détresse respiratoire aiguë induit par l’acide oléique
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de Oliveira Rodrigues, S., Patricio de Almeida, M. A., Castro-Faria-Neto, H. C., Silva, A. R., Felippe Gonçalves-de-Albuquerque, C. Mouse Model of Oleic Acid-Induced Acute Respiratory Distress Syndrome. J. Vis. Exp. (184), e63566, doi:10.3791/63566 (2022).

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