Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Мышиная модель острого респираторного дистресс-синдрома, индуцированного олеиновой кислотой

Published: June 2, 2022 doi: 10.3791/63566
Automatic Translation
*1,2,5, *1,2,6, 1,3,4, 1,3, 1,2,4,5,6
1Laboratório de Imunofarmacologia, Fundação Oswaldo Cruz, FIOCRUZ, 2Laboratório de Imunofarmacologia, Departamento de Bioquímica, Instituto Biomédico, Universidade Federal do Estado do Rio de Janeiro, 3Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e Molecular, Instituto Oswaldo Cruz, FIOCRUZ, 4Programa de Pós-Graduação em Biologia Molecular e Celular, Universidade Federal do Estado do Rio de Janeiro, 5Programa de Pós-Graduação em Ciências e Biotecnologia, Universidade Federal Fluminense, 6Programa de Pós-Graduação em Neurociências, Universidade Federal Fluminense
* These authors contributed equally

Summary

Настоящий протокол описывает модель повреждения легких у мышей, использующих олеиновую кислоту для имитации острого респираторного дистресс-синдрома (ОРДС). Эта модель увеличивает медиаторы воспаления при отеке и снижает податливость легких. Олеиновая кислота используется в форме соли (олеата), так как эта физиологическая форма позволяет избежать риска эмболии.

Abstract

Острый респираторный дистресс-синдром (ОРДС) представляет значительную угрозу для тяжелобольных пациентов с высоким уровнем летальности. Воздействие загрязняющих веществ, сигаретный дым, инфекционные агенты и жирные кислоты могут вызвать ОРДС. Животные модели могут имитировать сложный патомеханизм ОРДС. Однако у каждого из них есть ограничения. Примечательно, что олеиновая кислота (ОА) повышена у пациентов в критическом состоянии с вредным воздействием на легкие. ОА может вызывать повреждение легких эмболией, разрушая ткани, изменяя pH и ухудшая клиренс отека. Модель ОА-индуцированного поражения легких напоминает различные особенности ОРДС с повреждением эндотелия, повышенной альвеолярной проницаемостью, воспалением, образованием мембранного гиалина и гиалиновой гибелью клеток. При этом индукция повреждения легких описывается путем введения ОА (в форме соли) непосредственно в легкие и внутривенно мыши, поскольку это физиологическая форма ОА при рН 7. Таким образом, инъекция ОА в солевой форме является полезной животной моделью для изучения повреждения легких/ОРДС, не вызывая эмболии и не изменяя рН, тем самым приближаясь к тому, что происходит у пациентов в критическом состоянии.

Introduction

Ashbaugh et al.1 в 1967 году впервые описали острый респираторный дистресс-синдром (ОРДС) и с тех пор претерпели множество пересмотров. Согласно берлинскому определению, ОРДС – это воспаление легких, которое приводит к острой дыхательной недостаточности и гипоксемии (PaO2/FiO 2 > 300 мм рт. ст.) из-за дисбаланса вентиляции и перфузии, диффузного двустороннего альвеолярного повреждения (DAD) и инфильтрата, увеличения массы легких и отека 2,3. Легочная паренхима представляет собой сложную клеточную среду, состоящую из эпителиальных, эндотелиальных и других клеток. Эти клетки образуют барьеры и структуры, отвечающие за газообмен и гомеостаз в альвеолах3. Наиболее распространенными клетками в эпителиальном барьере являются альвеолярные клетки I типа (AT1) с большей площадью поверхности для газообмена и управления жидкостью с помощью Na/K-АТФазы. Кроме того, альвеолярные клетки II типа (AT2) вырабатывают поверхностно-активное вещество, снижающее поверхностное натяжение в альвеолах4. Под ними эндотелиальные клетки образуют полупроницаемый барьер, отделяющий легочное кровообращение от интерстиция. Его функции включают обнаружение стимулов, координацию воспалительных реакций и клеточную трансмиграцию5. Эндотелиальные клетки также регулируют газообмен, сосудистый тонус и коагуляцию5. Таким образом, нарушения функции эндотелия и эпителия могут усугубить провоспалительный фенотип, вызывая повреждение легких, приводящее к ОРДС5.

Риск развития ОРДС связан с бактериальной и вирусной пневмонией или косвенными факторами, такими как нелегочный сепсис, травма, переливание крови и панкреатит6. Эти условия вызывают высвобождение молекулярных паттернов, ассоциированных с патогенами (PAMP) и молекулярных паттернов, связанных с повреждением (DAMP), индуцируя провоспалительные цитокины и хемокины, такие как TNF-α, IL-1β, IL-6 и IL-85. TNF-α связан с деградацией сосудисто-эндотелиального кадгерина (VE-кадгерина) при нарушении эндотелиального барьера и инфильтрации лейкоцитов в паренхиму легких. Нейтрофилы являются первыми клетками, которые мигрируют, привлекаемые IL-8 и LTB4 5,7,8. Нейтрофилы дополнительно увеличивают образование провоспалительных цитокинов, активных форм кислорода (АФК)9 и внеклеточных ловушек нейтрофилов (НВЛ), что приводит к дополнительному повреждению эндотелия и эпителия10. Повреждение эпителия вызывает воспаление и активацию Toll-подобных рецепторов в клетках AT2 и резидентных макрофагах, индуцируя высвобождение хемокинов, привлекающих воспалительные клетки в легкие. Кроме того, выработка цитокинов, таких как интерферон-β (INFβ), вызывает рецепторы, индуцирующие апоптоз (TRAIL), связанные с TNF, что приводит клетки ATII к апоптозу, ухудшая жидкость и ионный кларенс4. Нарушение структуры эндотелиального и эпителиального барьеров способствует притоку жидкости, белков, эритроцитов и лейкоцитов в альвеолярное пространство, вызывая отеки. При установлении отека изменяется легочное усилие для поддержания дыхания и газообмена11. Гиперкапния и гипоксемия индуцируют гибель клеток и нарушение транспорта натрия, усугубляя альвеолярный отек из-за плохой способности клиренса10. ОРДС также имеет повышенный уровень IL-17A, связанный с дисфункцией органов, повышенным процентом альвеолярных нейтрофилов и альвеолярной проницаемостью9.

В последние годы наблюдается постоянный прогресс в исследованиях патофизиологии, эпидемиологии и лечения ОРДС12,13. Тем не менее, ОРДС является гетерогенным синдромом, несмотря на прогресс в терапевтических исследованиях, приводящий к оптимизации искусственной вентиляции легких и инфузионной терапии. Таким образом, по-прежнемунеобходимо более эффективное прямое фармакологическое лечение, а исследования на животных могут помочь раскрыть механизмы ОРДС и мишени для вмешательства.

Современные модели ОРДС не способны полностью воспроизвести патологию. Таким образом, исследователи часто выбирают ту модель, которая могла бы лучше соответствовать их интересам. Например, модель индукции липополисахаридов (ЛПС) индуцирует ОРДС путем эндотоксического шока, вызванного в основном TLR414. Индукция HCl имитирует аспирацию кислоты, и повреждение является нейтрофильным14. С другой стороны, текущая модель олеата натрия индуцирует повреждение эндотелия, которое увеличивает проницаемость сосудов и отек. Кроме того, использование олеата натрия вместо олеиновой кислоты в жидкой форме позволяет избежать риска эмболии и изменения рНкрови 15.

Модели животных для ОРДС
Доклинические исследования на животных моделях помогают понять патологию и имеют важное значение для новых исследований методов лечения ОРДС. Идеальная животная модель должна обладать характеристиками, сходными с клинической ситуацией, и хорошей воспроизводимостью механизмов заболевания с соответствующими патофизиологическими особенностями каждой стадии заболевания, его эволюциии репарации. Для доклинической оценки острого повреждения легких при ОРДС используется несколько животных моделей. Однако, поскольку все модели имеют ограничения, они не могут полностью воспроизвести патологию человека 6,14,16. ОРДС, индуцированный олеиновой кислотой, применяется у различных видов животных17. У свиней18, овец19 исобак 20, которым была введена инъекция ОА, наблюдаются многочисленные клинические признаки заболевания с дисфункцией альвеолярно-капиллярной мембраны и повышенной проницаемостью с белковой и клеточной инфильтрацией.

Например, при ОА в дозе 1,25 мкМ внутривенно вводится заблокированный трансэпителиальный транспорт, приводящий к альвеолярному отеку15. В качестве альтернативы, в модели in vitro с использованием клеток А549, ОА в концентрации 10 мкМ не изменял эпителиальный натриевый канал (eNAC) или экспрессию Na/K-АТФазы. Тем не менее, ОА, по-видимому, ассоциируется с обоими каналами, непосредственно подавляя их активность21. Внутривенное введение ОА в дозе 0,1 мл/кг вызывало застой и отек легочной ткани, уменьшало альвеолярные пространства с утолщенными альвеолярными перегородками и увеличивало количество воспалительных и эритроцитов22. Кроме того, ОА индуцировал апоптоз и некроз в эндотелиальных и эпителиальных клетках легкого15. Введение раствора трис-олеата интратрахеально мышам усиливало инфильтрацию нейтрофилов и отек уже через 6 ч после стимуляции23. Инъекция ОА через 24 ч повышала уровень провоспалительных цитокинов (т.е. TNF-α, IL-6 и IL-1β)23. Кроме того, внутривенное (орбитальное сплетение) введение 10 мкМ трис-олеата ингибирует легочную активность Na/K-АТФазы, аналогично уабаину при 10-3 мкМ, селективному ингибитору фермента. Кроме того, ОА индуцирует воспаление с клеточной инфильтрацией, образованием липидных тел и выработкой лейкотриена В4 (ЛТБ4) и простагландина Е2 (ПГЕ2)22,24. Таким образом, ОРДС, индуцированный олеиновой кислотой, вызывает отек, кровоизлияние, инфильтрацию нейтрофилов, повышение активности миелопероксидазы (МПО) и АФК24. Таким образом, введение ОА является хорошо зарекомендовавшей себя моделью повреждения легких22,25. Все результаты, представленные в этой статье, в которых ОА представляет собой форму соли, олеат натрия.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Процедуры, использованные в данном исследовании, были одобрены Комитетом по этике использования животных Фонда Освальдо Круза (лицензии CEUA No 002-08, 36/10 и 054/2015). Для экспериментов использовались самцы швейцарских мышей Webster весом от 20 до 30 г, предоставленные Институтом науки и технологий в биомоделях (ICTB) Фонда Освальдо Круза (FIOCRUZ). Животные содержались в вентилируемых изоляторах в виварии Pavilhão Ozório de Almeida, а вода и еда были доступны ad libitum. Они подвергались воздействию 12-часового/12-часового цикла света и темноты.

1. Приготовление раствора олеата натрия

  1. Используйте олеиновую кислоту для приготовления 100 ммоль/л исходного раствора олеата натрия в любой стерильной пробирке или стеклянной колбе.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для данной работы был приготовлен раствор объемом 50 мл (окончательный объем), но объем должен быть отрегулирован в соответствии с экспериментальной необходимостью. Раствор нужно всегда готовить в стерильных пробирках или стеклянной таре.
    1. Во-первых, добавьте таблетки или раствор NaOH в сверхчистую воду, чтобы повысить pH. Значение рН 12-13 рекомендуется для объема 25 мл.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В качестве альтернативы для приготовления раствора Tris-oleate можно использовать основу Tris.
    2. Добавляйте олеиновую кислоту (см. Таблицу материалов) очень медленно, капля за каплей, при постоянном перемешивании в ультразвуковой ванне при 37 °C.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если выпадает олеиновая кислота в осадок, начните все сначала.
    3. После того, как олеиновая кислота полностью растворится, осторожно отрегулируйте pH до 7,4, капля за каплей при помешивании, сверхчистым разбавленным HCl, а затем доведите до конечного объема 50 мл.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Свежеприготовленные рабочие растворы олеата. В качестве альтернативы раствор можно аликвотировать, хранить и выдерживать при -20 °C в среде, обогащенной азотом, чтобы избежать окисления не более месяца. Избегайте циклов замораживания-повторного замораживания.

2. Индукция поражения легких олеиновой кислотой

  1. Выполняют интратрахеальное введение олеиновой кислоты.
    1. Обезболивайте мышей 5% изофлураном с 2 л/минO2 с помощью ветеринарного испарителя анестезии (рис. 1A). Удалите шерсть в области разреза с помощью крема для депиляции и продезинфицируйте область тремя чередующимися циклами скраба бетадина и спирта с использованием стерильной марли. Подтвердите глубину анестезии защемлением пальца ноги.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Во время процедуры используйте стерильные перчатки и инструменты. Используйте простыню, чтобы накрыть животное, и обнажите только место разреза. Проводите эксперимент в шкафу биологической безопасности, чтобы избежать утечки изофторана в окружающую среду. Анальгетики не назначаются, так как они могут подавлять воспалительную реакцию.
    2. После анестезии уложите животное в позу спинного пролежня и сделайте разрез (0,5-1 см) V-образной формы на уровне щитовидной железы. Осторожно сместите щитовидную железу, чтобы обнажить трахею (рис. 1B) и введите 50 мкл приготовленного раствора олеата (шаг 1).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Мыши были разделены на две группы, по восемь животных в каждой группе. Группа с повреждением легких получает раствор натрия-олеата в концентрации 25 мМ (1,25 мкмоль), а контрольная группа получает 50 мкл стерильного физиологического раствора путем закапывания в трахею каждой мыши с помощью инсулинового шприца (объем 300 мкл, 30 г) (рис. 1В).
    3. Зашить место разреза мыши синтетическим нерассасывающимся монофиламентным шовным материалом, вернуть его в клетку и наблюдать за ним до полного восстановления после операции. Во время всех процедур держите животных на грелке при температуре 37 °C.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Мышам обычно требуется до 15 минут, чтобы восстановиться после операции.
  2. Выполняют внутривенное введение олеиновой кислоты.
    1. После анестезии (шаг 2.1.1, рисунок 2A) введите внутривенно в орбитальное сплетение, введя ультратонкую иглу (см. таблицу материалов) в медиальный кантус глазницы (рисунок 2B).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Мыши были разделены на две группы, по восемь животных в каждой группе. Каждая группа получает 100 мкл натрий-олеатного раствора из расчета 10 мкмоль ОА на животное, в то время как контрольная группа получает 100 мкл стерильного физиологического раствора.
  3. После операции ежедневно наблюдайте за животными на предмет побочных реакций. Гуманные конечные точки эвтаназии включают побочные реакции, судороги и кому.

3. Сбор жидкости для бронхоальвеолярного лаважа (BALF)

  1. Усыпляют мышей внутрибрюшинной смертельной дозой кетамина (300 мг/кг) и ксилазина (30 мг/кг) (см. таблицу материалов).
  2. Уложите животное в положение спинного пролежня, сделайте хирургическим ножницами разрез примерно 1 см в передней области животного, обнажите трахею и сделайте небольшой надрез для введения внутривенного катетера (20 G).
  3. Подсоедините катетер к стерильному шприцу объемом 1 мл, медленно и постепенно введите в легкие 0,5 мл стерильного физиологического раствора, а затем тем же шприцем аспирируйте жидкость из BALF. Повторите его 3-5 раз, и переложите в стерильную микропробирку, поместив их в лед.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Образцы можно хранить при температуре -20 °C до 6 месяцев.

4. Общий и дифференциальный анализ клеток в BALF

  1. Для общего количества клеток разведите 20 мкл BALF в 180 мкл (10-кратное разведение) раствора Турка (см. таблицу материалов). Подсчет проводят с помощью камеры Нойбауэра под оптическим микроскопом с 40-кратным объективом.
  2. Для дифференциального подсчета помещают 100 мкл BALF в ячеистую воронку, содержащую предметные стекла, и центрифугируют его при 22,86 x g в течение 5 мин при 4 °C в цитоцентрифуге и окрашивают Мэй-Грюнвальд (15%, pH 7,2)-Гимза (1:10) (см. таблицу материалов). Продолжайте подсчет клеток в световом микроскопе с иммерсионным объективом.

5. Определение общего белка в BALF

  1. Определите общий надосадочный белок BALF с помощью коммерческого набора для количественного определения белка и считайте поглощение при длине волны 562 нм с помощью спектрофотометра в соответствии с инструкциями производителя (см. таблицу материалов).

6. Иммуноферментные анализы

  1. Центрифуга BALF при 1 200 x g в течение 10 мин при 4 °C. Затем соберите надосадочную жидкость пипеткой и храните ее при -80 °C для анализа TNF-α, IL-1β, IL-6 и PGE215,23,25.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Центрифугирование на этапе 6.1 делает BALF бесклеточным.
    1. Проведите анализ цитокинов на бесклеточном BALF с помощью коммерческого набора для ИФА в соответствии с инструкциями производителя. Проведите анализ PGE2 с помощью набора для иммуноферментного анализа (ИФА) в соответствии с инструкциями производителя (см. Таблицу материалов).

7. Окрашивание и подсчет липидов в организме

  1. Зафиксируйте лейкоциты на предметных стеклах цитоспина, используя 3,7% формальдегид в Ca 2+, буферный раствор соли Хэнка Mg2+ (HBSS, pH 7,4) и окрасьте 1,5% OsO4 во влажном состоянии3 (см. таблицу материалов). Затем подсчитайте липидные тела на клетку в 50 последовательных лейкоцитах из каждого предметного стекла с помощью линзы масляного объектива микроскопа.

8. Статистический анализ

  1. Выполняйте статистический анализ с помощью программного обеспечения для построения графиков и статистики (см. Таблицу материалов). Выразите результаты в виде среднего значения ± SEM и проанализируйте с помощью односторонней ановы с последующим пост-тестом Newman-Keuls-Student26. Считайте различия значимыми, когда P < 0,05.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

В неповрежденном легком очищение альвеолярной жидкости происходит за счет транспорта ионов через интактный альвеолярный эпителиальный слой. Осмотический градиент переносит жидкость из альвеол в легочный интерстиций, где она дренируется лимфатическими сосудами или реабсорбируется. Na/K-АТФаза управляет этим транспортом11. ОА является ингибитором Na/K-АТФазы27 и натриевого канала21, которые, как мыуже предположили, могут способствовать образованию отека. Обострение воспалительной реакции при ОРДС приводит к повреждению альвеоляров, повышению проницаемости эндотелия и эпителия, накоплению альвеолярной жидкости, богатой белком и воспалительными клетками, вызывая отек. Отек вызывает увеличение частоты дыхания в легких из-за накопления интерстициальной жидкости и нарушения газообмена, что приводит к гипоксемии и дыхательной недостаточности28. Цитокины, такие как ФНО-α и фактор роста эндотелия сосудов (VEGF), дестабилизируют связи VE-кадгерина, способствуя повышению проницаемости эндотелия и накоплению альвеолярной жидкости7.

Инъекция ОА увеличивала общее количество лейкоцитов при интратрахеальном и внутривенном путях (рис. 3). Необходимо было индуцировать ОА при повреждении легких внутривенным, а не интратрахеальным путем. Настоящая работа показала увеличение количества нейтрофилов в BALF через 6 ч, с пиком через 24 ч и снижением через 48 ч и 72 ч. Более высокая концентрация IL-6, IL-1β и TNF-α в BALF наблюдалась после 24 ч интратрахеальной инстилляции ОА23 (рис. 4). ОА препятствует клиренсу отека и может спровоцировать образование отека, богатого белком, как внутривенным, так и интратрахеальным путями15,23. Отек легких оценивали с помощью анализа общего белка в BALF, который показал, что внутривенное и внутривенное введение увеличивало концентрацию общего белка (рис. 5). Липидные тельца представляют собой внутриклеточные органеллы, содержащие субстрат и ферменты для продукции эйкозаноидов 8,29. Образование липидных тел усиливает выработку липидных медиаторов, и это может быть использовано для доступа к активации клеток. Интратрахеальное и внутривенное введение ОА усиливало образование липидных тел и концентрацию ПГЭ23 через24 ч (рис. 6). Инъекция ОА также индуцировала разрушение тканей, кровоизлияние и лейкоцитарную инфильтрацию интратрахеальным и внутривенным путями, как показано в гистологии окрашивания гематоксилином и эозином (H&E) (Рисунок 7). Кроме того, ОА вызывает изменение функции легких19. Таким образом, поражение легких, вызванное олеиновой кислотой, имеет многочисленные признаки ОРДС.

Figure 1
Рисунок 1: Отдельные этапы протокола интратрахеального введения . (А) Мышь обезболивают 5% изофтораном и 2 л/минO2. (Б) Разрез трахеи хирургическими ножницами у мышей в положении дорсального пролежня. (C) Интратрахеальная инстилляция с помощью инсулинового шприца. Создано с помощью BioRender.com. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 2
Рисунок 2: Отдельные этапы протокола внутривенного введения. (A) Мышь обезболивают 5% изофтораном и 2 л/мин O2. (B) Внутривенная инъекция с помощью инсулинового шприца через медиальный кантус. Создано с помощью BioRender.com. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 3
Рисунок 3: Введение ОА индуцирует активацию лейкоцитов в BALF мышей. Общее количество лейкоцитов при внутривенном (в/в) и интратрахеальном введении (А) (А) и иллюстративная микрофотография (1000-кратное увеличение) при интратрахеальном введении (ИТО), окрашенном методом Мэя-Грюнвальда-Гимзы (В), проводили через 24 ч после ОА. Масштабная линейка = 10 мкм. Такой же объем стерильного физиологического раствора был введен контрольной группе. Каждый столбец представляет собой среднюю ± SEM не менее семи животных. *P < 0,05 по сравнению с контрольной группой. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 4
Рисунок 4: Интратрахеальное введение ОА индуцирует выработку медиаторов воспаления в легких мышей. ФНО-α (А), ИЛ-6 (В), ИЛ-1β (С) измеряли через 24 ч после испытания. Контрольной группе вводили стерильный физиологический раствор. Каждая полоса представляет собой среднюю ± SEM по крайней мере для шести животных. *P < 0,05 по сравнению с контрольной группой. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 5
Рисунок 5: Содержание общего белка в BALF через 24 ч после инъекции ОА. Интратрахеальное (т.т.) и внутривенное (в/в) введение ОА увеличивает общий белок в BALF мышей. Контрольная группа получала такой же объем стерильного физиологического раствора. Результаты представляют собой средние ± SEM по крайней мере шести различных животных. *P < 0,0001 по сравнению с контрольной группой. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 6
Рисунок 6: Формирование липидных телец в лейкоцитах и продукция PGE2 у мышей, получавших BALF у мышей, получавших ОА. Интратрахеальное (i.t) и внутривенное (в/в) введение ОА индуцирует накопление медиаторов воспаления и липидных тел в BALF мышей (A) и (B) соответственно. (C) Иллюстративная микрофотография липидных тел (1000-кратное увеличение), окрашенных в легких животных тетраоксидом осмия (OsO4) через 24 ч после проявления ОА. Стрелки указывают на липидные тела. Масштабная линейка = 10 мкм. Контрольная группа получала одинаковый объем физиологического раствора. Полученные результаты представляют собой средние ± SEM от семи животных. *P < 0,05 по сравнению с контрольной группой. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 7
Рисунок 7: Иллюстративная гистология легких у мышей . (A) Контрольные мыши, получавшие физиологический раствор и не обнаруживавшие признаков кровоизлияния. (Б) Внутривенное введение ОА (в/в). (C) Интратрахеальное введение (т.т.) с изменениями в тканях. Выполнено окрашивание H&E. Увеличение, 1000х. Масштабная линейка = 50 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Выбор правильной модели ОРДС имеет важное значение для проведения доклинических исследований, и лицо, проводящее оценку, должно учитывать все возможные переменные, такие как возраст, пол, методы введения и другие6. Выбранная модель должна воспроизводить заболевание на основе таких факторов риска, как сепсис, липидная эмболия, ишемия-реперфузия легочной сосудистой сети и другие клинические риски14. Тем не менее, ни одна животная модель, используемая для ОРДС, не может воссоздать все черты человеческого синдрома. Несколько моделей повреждающих агентов включают ЛПС, ОА, соляную кислоту, бактерии и вирусы6. Также используются различные способы введения, чаще всего интратрахеальный, интраназальный или внутривенный. Модель ишемии-реперфузии легких вызывает разрыв капилляров и накопление внутриальвеолярного белка6. Широко используется ЛПС-индуцированное повреждение легких, приводящее к острому повреждению эпителиального и эндотелиального барьеров. ЛПС связывается с толл-подобным рецептором 4 (TLR-4) в эпителии дыхательных путей, вызывая активацию NF-κB, усиливая продукцию цитокинов и хемокинов, привлекая воспалительные клетки30, что приводит к устойчивому нейтрофильному альвеолиту6. Тем не менее, модель показывает различия между штаммами и видами животных, снижая воспроизводимость результатов на животных у пациентов с ОРДС30.

Модель HCl-повреждения имитирует ОРДС путем аспирации кислотного содержания. Низкий уровень рН в легких вызывает острую воспалительную реакцию с последующим поздним фиброзным повреждением. Повреждение является нейтрофилозависимым, вызывая альвеолярное кровоизлияние, отек и нарушение клиренса жидкости. Однако люди аспирируют не только HCl, но и сложный желудочный содержимое с рН, часто превышающим1,5,31. Эти и другие модели ОРДС были подробно рассмотрены в других источниках31. Среди всех используемых моделей модель ОРДС, индуцированная олеиновой кислотой, является самой идеальной14.

Модель олеата натрия вызывает повреждение легких, индуцирует апоптоз и некроз альвеолярных клеток и усиливает продукцию цитокинов, таких как TNFα, IL-8, IL-6, IL-1β и MIP-1α19. ОА также индуцирует экспрессию протеаз и эластазы с кровоизлиянием, вызывая тяжелое повреждение легких25. ОА воспроизводит заболевание за счет липидной эмболии, повышения проницаемости легочных сосудов и внесосудистой жидкости с рентгенологическими инфильтратами32. Также у пациентов с ОРДС отмечается более высокая плазматическая концентрация ОА 15,22,24.

Интратрахеальное введение ОА индуцирует продукцию медиаторов воспаления, аналогичную клиническому ОРДС, и снижает податливость легких и газообмен25,32. Внутривенное введение ОА способствует гистоморфологическим и физиологическим аспектам заболевания32. Сывороточный альбумин является мощным лигандом ОА, что может объяснить, почему этот путь требует более высокого количества ОА (10 мкмоль)15, чем интратрахеальный (1,25 мкмоль)23, чтобы вызвать повреждение легких. Действительно, наша группа показала корреляцию между дисбалансом ОА/альбумина и более высоким риском смерти у пациентов с лептоспирозом33.

Как и у любой другой модели, у модели есть некоторые недостатки. Олеиновая кислота не в форме соли может вызывать токсические эффекты и изменения из-за эмульгирования крови. Как показано в этой статье, использование его солевой формы снижает токсические эффекты и позволяет избежать двух проблем: образования эмболов и колебаний рН в крови и легких. Кроме того, это гарантирует, что повреждение легких вызвано олеатом, а не вторичным эффектом15. Кроме того, получение олеиновой кислоты в форме соли в этой модели не требует конъюгации с альбумином. Исследования показывают благотворное влияние альбумина на уменьшение воспаления и проницаемости сосудов. Кроме того, альбумин восстанавливает гемодинамику и дыхание у пациентов с повреждением легких. Таким образом, конъюгация альбумина с ОА может ослабить его воздействие на животное, снижая жизнеспособность моделей33,34.

На молекулярном уровне олеат натрия ингибирует натрий-калиевую АТФазу (NKA) и натриевый канал (eNac), которые ухудшают транспорт ионов, повышая проницаемость сосудов и образование отека15. Кроме того, ОА может связываться с рецептором свободных жирных кислот 1 (FFAR1), увеличивая внутриклеточную концентрациюCa2+ , что активирует киназы, сигнальные белки, такие как PI3K и MAPK, что приводит к активации ядерного фактора каппа-легкой цепи активированных В-клеток (NF-κB) и усилению воспалительной реакции25.

Подводя итог, можно сказать, что, хотя ни одна модель не может полностью воспроизвести особенности ОРДС, они являются ценными инструментами для изучения заболевания. Доклинические исследования имеют решающее значение для понимания патофизиологии ОРДС и разработки новых методов лечения. Интратрахеальное и внутривенное введение ОА в форме соли создает надежные и воспроизводимые модели ОРДС, что делает его золотой моделью для изучения ОРДС.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Acknowledgments

Это исследование было профинансировано Институтом Освальдо Круза, Фондом Освальдо Круза (FIOCRUZ), Грантом 001 Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES), Programa de Biotecnologia da Universidade Federal Fluminense (UFF), Федеральным университетом Рио-де-Жанейро (UNIRIO), Fundação Carlos Chagas Filho de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro (FAPERJ), и Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq). Рисунки 1 и 2 созданы с помощью BioRender.com.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Anesthetic vaporizer SurgiVet model 100
Braided slik thread with needle number 5 Shalon medical N/A
Cabinet vivarium Insight  Model EB273
Centrifuge Eppendorf 5430/5430R
Cytofunnel ThermoFisher 11-025-48
Drontal puppy Bayer N/A
Hank's balanced Salts Sigma-Aldrich H4981
Heatpad tkreprodução TK-500
Hydrocloric Acid Sigma-Aldrich 30721
Insulin syringe Ultrafine BD 328322
Isoforine 1mL/mL Cristália N/A
Ketamine Syntec N/A
May-Grunwald-Giemsa Sigma-Aldrich 205435
Micro BCA Protein Assay Kit ThermoFisher 23235
Microscope  PrimoStar Carl Zeiss
Mouse IL-1 beta duoSet ELISA R&D system DY401
Mouse IL-6 duoSet ELISA R&D system DY406
Mouse TNF-alpha duoSet ELISA R&D system DY410
Neubauer chamber improved bright-line Global optics
Oleic Acid (99%) Sigma-Aldrich O1008
Osmium tetroxide solution (4%) Sigma-Aldrich 75632
Peripheral Intravenous Catherter 20 G BD Angiocath 388333
Prism 8 (graphic and statistic software) Graphpad N/A
Prostaglandin E2 ELISA Kit -Monoclonal Cayman Chemical 514010
Shandon Cytospin 3 ThermoFisher N/A
Sodium hydroxide Merck 1,06,49,81,000
Spectrophotometer Molecular Devices SpectraMax ABS plus
Swiss webster mice ICTB/FIOCRUZ N/A
Syringe 1 mL BD 990189
Tris-base Bio Rad 161-0719 Electrophoresis purity reagent
Türk's solution Sigma-Aldrich 93770
Xilazine Syntec N/A

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ashbaugh, D. G., Bigelow, D. B., Petty, T. L., Levine, B. E. Acute respiratory distress in adults. Lancet. 2 (7511), 319-323 (1967).
  2. The ARDS Definition Task Force. Acute respiratory distress syndrome: The Berlin definition. JAMA. 307 (23), 2526-2533 (2012).
  3. Hewitt, R. J., Lloyd, C. M. Regulation of immune responses by the airway epithelial cell landscape. Nature Reviews Immunology. 21 (6), 347-362 (2021).
  4. Zepp, J. A., Morrisey, E. E. Cellular crosstalk in the development and regeneration of the respiratory system. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (9), 551-566 (2019).
  5. Millar, F. R., Summers, C., Griffiths, M. J., Toshner, M. R., Proudfoot, A. G. The pulmonary endothelium in acute respiratory distress syndrome: insights and therapeutic opportunities. Thorax. 71 (5), 462 (2016).
  6. D'Alessio, F. R. Mouse models of acute lung injury and ARDS. Methods in Molecular Biology. 1809, 341-350 (2018).
  7. Corada, M., et al. Vascular endothelial-cadherin is an important determinant of microvascular integrity in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (17), 9815-9820 (1999).
  8. Bozza, P. T., et al. Leukocyte lipid body formation and eicosanoid generation: cyclooxygenase-independent inhibition by aspirin. PNAS. 93 (20), 11091-11096 (1996).
  9. Mikacenic, C., et al. Interleukin-17A is associated with alveolar inflammation and poor outcomes in acute respiratory distress syndrome. Critical Care Medicine. 44 (3), 496-502 (2016).
  10. Matthay, M. A., et al. Acute respiratory distress syndrome. Nature Reviews Disease Primers. 5 (1), 18 (2019).
  11. Huppert, L. A., Matthay, M. A., Ware, L. B. Pathogenesis of acute respiratory distress syndrome. Seminars in Respiratory and Critical Care Medicine. 40 (1), 31-39 (2019).
  12. Matthay, M. A., McAuley, D. F., Ware, L. B. Clinical trials in acute respiratory distress syndrome: challenges and opportunities. The Lancet Respiratory Medicine. 5 (6), 524-534 (2017).
  13. Fan, E., Brodie, D., Slutsky, A. S. Acute respiratory distress syndrome: advances in diagnosis and treatment. JAMA. 319 (7), 698-710 (2018).
  14. Matute-Bello, G., Frevert, C. W., Martin, T. R. Animal models of acute lung injury. The American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 295 (3), 379-399 (2008).
  15. Gonçalves-de-Albuquerque, C. F., et al. Oleic acid inhibits lung Na/K-ATPase in mice and induces injury with lipid body formation in leukocytes and eicosanoid production. Journal of Inflammation. 10 (1), Lond. 34 (2013).
  16. Matthay, M. A., Ware, L. B., Zimmerman, G. A. The acute respiratory distress syndrome). Journal of Clinical Investigation. 122 (8), 2731-2740 (2012).
  17. Wang, H. M., Bodenstein, M., Markstaller, K. Overview of the pathology of three widely used animal models of acute lung injury. European Surgical Research. 40 (4), 305-316 (2008).
  18. Moriuchi, H., Zaha, M., Fukumoto, T., Yuizono, T. Activation of polymorphonuclear leukocytes in oleic acid-induced lung injury. Intensive Care Medicine. 24 (7), 709-715 (1998).
  19. Julien, M., Hoeffel, J. M., Flick, M. R. Oleic acid lung injury in sheep. Journal of Applied Physiology. 60 (2), 433-440 (1986).
  20. Hofman, W. F., Ehrhart, I. C. Permeability edema in dog lung depleted of blood components. Journal of Applied Physiology. 57 (1), 147-153 (1984).
  21. Vadász, I., et al. Oleic acid inhibits alveolar fluid reabsorption: a role in acute respiratory distress syndrome. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 171 (5), 469-479 (2005).
  22. Tenghao, S., et al. Keratinocyte growth factor-2 reduces inflammatory response to acute lung injury induced by oleic acid in rats by regulating key proteins of the wnt/β-catenin signaling pathway. Evidence-Based Complementary and Alternative. 2020, 8350579 (2020).
  23. Gonçalves-de-Albuquerque, C. F., et al. Oleic acid induces lung injury in mice through activation of the ERK pathway. Mediators of Inflammation. 2012, 956509 (2012).
  24. Huang, H., et al. Dipyrithione attenuates oleic acid-induced acute lung injury. Pulmonary Pharmacology & Therapeutics. 24 (1), 74-80 (2011).
  25. Goncalves-de-Albuquerque, C. F., Silva, A. R., Burth, P., Castro-Faria, M. V., Castro-Faria-Neto, H. C. acute respiratory distress syndrome: role of oleic acid-triggered lung injury and inflammation. Mediators of Inflammation. 2015, 260465 (2015).
  26. McHugh, M. L. Multiple comparison analysis testing in ANOVA. Biochemia Medica (Zagreb). 21 (3), 203-209 (2011).
  27. Swarts, H. G. P., Schuurmans Stekhoven, F. M. A. H., De Pont, J. J. H. H. M. Binding of unsaturated fatty acids to Na+,K+-ATPase leading to inhibition and inactivation. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1024 (1), 32-40 (1990).
  28. Swenson, K. E., Swenson, E. R. Pathophysiology of acute respiratory distress syndrome and COVID-19 lung injury. Critical Care Clinics. 37 (4), 749-776 (2021).
  29. Bozza, P. T., Magalhães, K. G., Weller, P. F. Leukocyte lipid bodies - Biogenesis and functions in inflammation. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Molecular and Cell Biology of Lipids. 1791 (6), 540-551 (2009).
  30. Chen, H., Bai, C., Wang, X. The value of the lipopolysaccharide-induced acute lung injury model in respiratory medicine. Expert Review of Respiratory Medicine. 4 (6), 773-783 (2010).
  31. Martin, T. R., Matute-Bello, G. Experimental models and emerging hypotheses for acute lung injury. Critical Care Clinics. 27 (3), 735-752 (2011).
  32. Schuster, D. P. ARDS: clinical lessons from the oleic acid model of acute lung injury. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 149 (1), 245-260 (1994).
  33. Martins, C. A., et al. The relationship of oleic acid/albumin molar ratio and clinical outcomes in leptospirosis. Heliyon. 7 (3), 06420 (2021).
  34. Yu, M. -yal, et al. Hypoalbuminemia at admission predicts the development of acute kidney injury in hospitalized patients: A retrospective cohort study. PLOS ONE. 12 (7), 0180750 (2017).

Tags

Мышиная модель Олеиновая кислота Острый респираторный дистресс-синдром ОРДС Воздействие загрязняющих веществ Сигаретный дым Инфекционные агенты Жирные кислоты Животные модели Патомеханизм Ограничения Олеиновая кислота (ОА) Вредное воздействие на легкие Повреждение легких Эмболия Разрушение тканей Изменение PH Ухудшение клиренса отека Повреждение эндотелия Альвеолярная проницаемость Воспаление Образование мембранной гиалина Гибель клеток Инъекция ОА (в форме соли) Физиологическая форма ОА при PH 7
Мышиная модель острого респираторного дистресс-синдрома, индуцированного олеиновой кислотой
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

de Oliveira Rodrigues, S., Patricio… More

de Oliveira Rodrigues, S., Patricio de Almeida, M. A., Castro-Faria-Neto, H. C., Silva, A. R., Felippe Gonçalves-de-Albuquerque, C. Mouse Model of Oleic Acid-Induced Acute Respiratory Distress Syndrome. J. Vis. Exp. (184), e63566, doi:10.3791/63566 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter