Den foreliggende protokollen beskriver en lungeskademodell hos mus som bruker oljesyre for å etterligne akutt respiratorisk nødsyndrom (ARDS). Denne modellen øker de inflammatoriske mediatorene på ødem og reduserer lungeoverensstemmelse. Oljesyre brukes i saltformen (oleat), siden denne fysiologiske formen unngår risikoen for emboli.
Akutt lungesviktsyndrom (ARDS) er en betydelig trussel mot kritisk syke pasienter med høy dødelighet. Eksponering av forurensende stoffer, sigarettrøyk, smittestoffer og fettsyrer kan indusere ARDS. Dyremodeller kan etterligne den komplekse patomekanismen til ARDS. Hver av dem har imidlertid begrensninger. Spesielt er oljesyre (OA) økt hos kritisk syke pasienter med skadelige effekter på lungene. OA kan indusere lungeskade ved emboli, forstyrre vev, endre pH og svekke ødemclearance. OA-indusert lungeskademodell ligner ulike trekk ved ARDS med endotelskade, økt alveolær permeabilitet, inflammasjon, membranhyalindannelse og celledød. Her beskrives induksjon av lungeskade ved å injisere OA (i saltform) direkte i lungen og intravenøst i en mus siden det er den fysiologiske formen for OA ved pH 7. Dermed er injeksjon av OA i saltform en nyttig dyremodell for å studere lungeskade / ARDS uten å forårsake emboli eller endre pH, og dermed komme nær det som skjer hos kritisk syke pasienter.
Ashbaugh et al.1, i 1967, beskrev først akutt respiratorisk nødsyndrom (ARDS) og har siden da vært gjennom flere revisjoner. I henhold til Berlin-definisjonen er ARDS en lungebetennelse som fører til akutt respirasjonssvikt og hypoksemi (PaO 2/FiO 2 > 300 mm Hg) på grunn av ubalanse i forholdet mellom ventilasjon og perfusjon, diffus bilateral alveolær skade (DAD) og infiltrat, økt lungevekt og ødem 2,3. Pulmonal parenchyma er et komplekst cellulært miljø sammensatt av epitel-, endotel- og andre celler. Disse cellene danner barrierer og strukturer som er ansvarlige for gassutveksling og homeostase i alveolene3. De mest tallrike cellene i epitelbarrieren er alveolære type I-celler (AT1) med større overflateareal for gassutveksling og væskestyring gjennom Na / K-ATPase. De alveolære type II-cellene (AT2) produserer også overflateaktivt middel, noe som reduserer overflatespenningen i alveolene4. Under danner endotelceller en semipermeabel barriere som skiller lungesirkulasjonen fra interstitium. Funksjonene inkluderer å oppdage stimuli, koordinere inflammatoriske responser og cellulær transmigrasjon5. Endotelcellene regulerer også gassutveksling, vaskulær tonus og koagulasjon5. Derfor kan endotel- og epitelfunksjonsforstyrrelser forverre en proinflammatorisk fenotype og forårsake lungeskade som fører til ARDS5.
ARDS-utvikling er risikoforbundet med bakteriell og viral lungebetennelse eller indirekte faktorer som ikke-pulmonal sepsis, traumer, blodtransfusjoner og pankreatitt6. Disse forholdene forårsaker frigjøring av patogenassosierte molekylære mønstre (PAMP) og skadeassosierte molekylære mønstre (DAMPs), som induserer proinflammatoriske cytokiner og kjemokiner som TNF-α, IL-1β, IL-6 og IL-85. TNF-α er knyttet til vaskulær-endotelial cadherin (VE-cadherin) nedbrytning ved forstyrrelse av endotelbarrieren og leukocyttinfiltrasjon i lungeparenkymet. Neutrofiler er de første cellene som migrerer, tiltrukket av IL-8 og LTB4 5,7,8. Nøytrofiler øker ytterligere proinflammatoriske cytokiner, reaktive oksygenarter (ROS)9 og dannelse av nøytrofile ekstracellulære feller (NET) som genererer ekstra endotel- og epitelskade10. Epitelskader ber om betennelse og aktivering av Toll-lignende reseptorer i AT2-celler og bosatt makrofager, indusere frigjøring av kjemokiner som tiltrekker inflammatoriske celler til lungene4. Også produksjonen av cytokiner som interferon-β (INFβ) forårsaker TNF-relaterte apoptoseinduserende reseptorer (TRAIL), som fører ATII-celler til apoptose, svekker væske og ionklarhet4. Forstyrrelsen av endotel- og epitelbarrierestrukturen tillater tilstrømning av væske, proteiner, røde blodlegemer og leukocytter inn i alveolarrommet og forårsaker ødem. Med edema etablert, er lungeinnsatsen for å opprettholde pust og gassutveksling endret11. Hyperkapni og hypoksemi induserer celledød og natriumtransportforstyrrelser, forverrende alveolær ødem på grunn av dårlig klaringskapasitet10. ARDS har også forhøyede nivåer av IL-17A, assosiert med organdysfunksjon, økt prosentandel av alveolære nøytrofiler og alveolær permeabilitet9.
Det har vært pågående fremskritt i forskning på patofysiologi, epidemiologi og behandling av ARDS de siste årene12,13. Imidlertid er ARDS et heterogent syndrom til tross for fremdriften i terapeutisk forskning som resulterer i mekanisk ventilasjon og optimalisering av væsketerapi. Dermed er det fortsatt behov for en mer effektiv direkte farmakologisk behandling10, og dyreforsøk kan bidra til å avdekke ARDS-mekanismer og mål for intervensjon.
Nåværende ARDS-modeller er ikke i stand til å replikere patologien fullt ut. Dermed velger forskere ofte den modellen som passer bedre til deres interesser. For eksempel induserer lipopolysakkarid (LPS) induksjonsmodellen ARDS ved endotoksisk sjokk utløst hovedsakelig av TLR414. HCl-induksjon etterligner syreaspirasjon, og skaden er nøytrofilavhengig14. På den annen side induserer den nåværende natriumoleatmodellen endotelskader som øker vaskulær permeabilitet og ødem. Videre unngår bruk av natriumoleat i stedet for oljesyre i flytende form embolirisiko og endring i blodets pH15.
Dyremodeller for ARDS
Prekliniske studier i dyremodeller bidrar til å forstå patologien og er avgjørende for ny ARDS-behandlingsforskning. Den ideelle dyremodellen må ha egenskaper som ligner den kliniske situasjonen og god reproduserbarhet av sykdomsmekanismer med relevante patofysiologiske trekk ved hvert sykdomsstadium, evolusjon og reparasjon14. Flere dyremodeller brukes til å vurdere akutt lungeskade i ARDS preklinisk. Men da alle modeller har begrensninger, reproduserer de ikke fullt ut den menneskelige patologien 6,14,16. Oljesyreindusert ARDS brukes i forskjellige dyrearter17. Gris18, sau19 og hunder20 sendt til OA-injeksjon presenterer mange kliniske trekk ved sykdommen med alveolar-kapillær membrandysfunksjon og økt permeabilitet med protein- og celleinfiltrasjon.
For eksempel injiserte OA ved 1,25 μM intravenøst blokkert transepitelial transport som førte til alveolær ødem15. Alternativt, i in vitro-modellen ved bruk av A549-celler, endret OA i en konsentrasjon på 10 μM ikke epitelial natriumkanal (eNAC) eller ekspresjonen av Na/K-ATPase. OA ser imidlertid ut til å assosiere seg med begge kanalene, noe som direkte hemmer deres aktivitet21. OA intravenøs injeksjon på 0,1 ml / kg forårsaket lungevevsbelastning og hevelse, reduserte alveolære rom med fortykket alveolær septa og økt inflammatorisk og rødt blodcelletall22. OA induserte også apoptose og nekrose i endotel- og epitelceller i lungen15. Injeksjon av en tris-oleatløsning, intratrakealt hos mus, forbedret nøytrofil infiltrasjon og ødem så tidlig som 6 timer etter stimulering23. OA-injeksjon ved 24 timer økte proinflammatoriske cytokinnivåer (dvs. TNF-α, IL-6 og IL-1β)23. I tillegg hemmer intravenøs (orbital plexus) injeksjon av 10 μM av et tris-oleat pulmonal Na / K-ATPase-aktivitet, lik ouabain ved 10-3 μM, en selektiv enzymhemmer. OA induserer også betennelse med celleinfiltrasjon, dannelse av lipidlegemer og produksjon av leukotrien B4 (LTB4) og prostaglandin E2 (PGE2) 22,24. Derfor genererer oljesyreindusert ARDS ødem, blødning, nøytrofil infiltrasjon, økt myeloperoksidase (MPO) aktivitet og ROS24. Derfor er OA-administrasjon en veletablert modell for lungeskade22,25. Alle resultatene som presenteres i denne artikkelen som har OA representerer saltformen, natriumoleat.
Å velge riktig ARDS-modell er avgjørende for å gjennomføre de prekliniske studiene, og evaluatoren må vurdere alle mulige variabler, for eksempel alder, kjønn, administrasjonsmetoder og andre6. Den valgte modellen må reprodusere sykdommen basert på risikofaktorer som sepsis, lipidemboli, iskemi-reperfusjon av lungevaskulaturen og andre kliniske risikoer14. Imidlertid kan ingen dyremodell som brukes til ARDS gjenskape alle egenskapene til det menneskelige syndromet. …
The authors have nothing to disclose.
Denne forskningen ble finansiert av Instituto Oswaldo Cruz, Fundação Oswaldo Cruz (FIOCRUZ), Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) Grant 001, Programa de Biotecnologia da Universidade Federal Fluminense (UFF), Universidade Federal do Estado do Rio de Janeiro (UNIRIO), Fundação Carlos Chagas Filho de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro (FAPERJ), og Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq). Figur 1 og figur 2 er laget med BioRender.com.
Anesthetic vaporizer | SurgiVet | model 100 | |
Braided slik thread with needle number 5 | Shalon medical | N/A | |
Cabinet vivarium | Insight | Model EB273 | |
Centrifuge | Eppendorf | 5430/5430R | |
Cytofunnel | ThermoFisher | 11-025-48 | |
Drontal puppy | Bayer | N/A | |
Hank's balanced Salts | Sigma-Aldrich | H4981 | |
Heatpad | tkreprodução | TK-500 | |
Hydrocloric Acid | Sigma-Aldrich | 30721 | |
Insulin syringe Ultrafine | BD | 328322 | |
Isoforine 1mL/mL | Cristália | N/A | |
Ketamine | Syntec | N/A | |
May-Grunwald-Giemsa | Sigma-Aldrich | 205435 | |
Micro BCA Protein Assay Kit | ThermoFisher | 23235 | |
Microscope PrimoStar | Carl Zeiss | ||
Mouse IL-1 beta duoSet ELISA | R&D system | DY401 | |
Mouse IL-6 duoSet ELISA | R&D system | DY406 | |
Mouse TNF-alpha duoSet ELISA | R&D system | DY410 | |
Neubauer chamber improved bright-line | Global optics | ||
Oleic Acid (99%) | Sigma-Aldrich | O1008 | |
Osmium tetroxide solution (4%) | Sigma-Aldrich | 75632 | |
Peripheral Intravenous Catherter 20 G | BD Angiocath | 388333 | |
Prism 8 (graphic and statistic software) | Graphpad | N/A | |
Prostaglandin E2 ELISA Kit -Monoclonal | Cayman Chemical | 514010 | |
Shandon Cytospin 3 | ThermoFisher | N/A | |
Sodium hydroxide | Merck | 1,06,49,81,000 | |
Spectrophotometer | Molecular Devices | SpectraMax ABS plus | |
Swiss webster mice | ICTB/FIOCRUZ | N/A | |
Syringe 1 mL | BD | 990189 | |
Tris-base | Bio Rad | 161-0719 | Electrophoresis purity reagent |
Türk's solution | Sigma-Aldrich | 93770 | |
Xilazine | Syntec | N/A |